Summary
Het algemene doel van dit protocol is om instructies te geven over het meten van de capaciteit van antilichamen aanwezig in sera of plasma van individuen, van nature blootgesteld aan Plasmodium falciparum infectie, om fagocytose van de parasiet-geïnfecteerde erytrocyten (IEs) te opsoniseren en induceren.
Abstract
Het protocol beschrijft hoe een op stroom gebaseerde phagocytosetest van Plasmodium falciparum-geïnfecteerdeerytrocyten (IEs) op te zetten en uit te voeren, opmeting door natuurlijk verworven IgG-antilichamen die specifiek zijn voor VAR2CSA. VAR2CSA is het parasietantgeen dat bemiddelt bij de selectieve inbeslagname van IE's in de placenta die een ernstige vorm van malaria kan veroorzaken bij zwangere vrouwen, placentamalaria (PM). Bescherming tegen PM wordt bemiddeld door VAR2CSA-specifieke antilichamen die vermoedelijk functioneren door het remmen van placenta-inname en/of door het opsoniseren van IE's voor fagocytose. De test maakt gebruik van laat-stadium-gesynchroniseerde IEs die zijn geselecteerd in vitro om VAR2CSA, plasma / serum-antilichamen uit te drukken van vrouwen met natuurlijk verworven PM-specifieke immuniteit, en de fagocytische cel lijn THP-1. Het protocol kan echter eenvoudig worden gewijzigd om de functionaliteit van antilichamen tegen parasietantigeen op het IE-oppervlak te testen, hetzij veroorzaakt door natuurlijke blootstelling of door vaccinatie. De test biedt eenvoudige en hoge doorvoer evaluatie, met een goede reproduceerbaarheid, van een belangrijk functioneel aspect van antilichaam-gemedieerde immuniteit in malaria. Het is daarom nuttig bij de evaluatie van de klinische immuniteit tegen P. falciparum malaria, een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit in de tropen, met name in Afrika bezuiden de Sahara.
Introduction
Malaria is een door vector overgedragen ziekte die bij de mens wordt veroorzaakt bij infectie met vijf verschillende soorten van het geslacht Plasmodium. De meest voorkomende soort is P. falciparum, dat ook verantwoordelijk is voor de meest morbiditeit en mortaliteit1. Malaria klinische presentatie varieert van asymptomatische of goedaardige infecties tot gecompliceerde / ernstige ziekte, de laatste komt meestal voor bij kinderen jonger dan vijf jaar. Blootstelling aan P. falciparum leidt niet tot steriele immuniteit, maar personen die in endemische gebieden leven, ontwikkelen langzaam immuniteit tegen de klinische ziekte. Bescherming is afhankelijk van leeftijd/blootstelling en de immuniteit wordt normaal gesproken verworven tijdens de eerste 5-10 jaar van het leven2. Volwassen vrouwen zijn een belangrijke uitzondering, omdat ernstige malaria kan optreden tijdens de zwangerschap in een klinische presentatie bekend als placentamalaria (PM). PM is een belangrijke oorzaak van abortus, doodgeboorte, vroegtijdige bevalling, laag geboortegewicht, foetale dood, en moederbloedarmoede. Weerstand tegen PM ontwikkelt zich over opeenvolgende zwangerschappen3. Bescherming tegen PM wordt geassocieerd met de verwerving van antilichamen tegen VAR2CSA-type PfEMP14,5, een besmet erythrocyte (IE) oppervlakteantigenen dat zich bindt aan chondroitin sulfaat A (CSA) waardoor IE-sekwestratie in de placenta mogelijk wordt. Antilichamen bemiddelen bescherming bij het uitvoeren van verschillende functionele activiteiten (beoordeeld in6,7) waaronder opsonisatie van IEs om fagocytose te induceren. Vroege in vitro studies toonden aan dat antilichamen de groei van P. falciparum kunnen beperken in aanwezigheid van monocyten via fagocytose8,9. Recentere studies hebben aangetoond dat hogere niveaus van fagocytose-inducerende antilichamen worden geassocieerd met betere zwangerschapsresultaten (in de context van HIV-co-infectie)10,11, wat de relevantie van deze effectorfunctie in de natuurlijk verworven immuunrespons aangeeft.
Hier presenteren we een protocol om deze functie van antilichamen aanwezig in menselijk plasma / serum te meten, met behulp van in vitro gekweekte IT's uitdrukken VAR2CSA samen met de monocyten lijn THP-1. De test is eerder gebruikt11,12,13,14,15,16,17,18 en wordt beschouwd als een verbeterde en gemakkelijkere aanpak in vergelijking met eerdere microscopie gebaseerde protocollen8, omdat het mogelijk maakt het testen van een groter aantal antilichaam monsters in een enkele run met behulp van kleinere volumes van antilichamen en het vermijden van vervelende en bevooroordeelde microscopie tellen. Hoewel de test is gebruikt door meerdere laboratoria en de uitvoering ervan is eenvoudig genoeg, het vereist een zorgvuldige planning en voorbereiding, daarom, een gedetailleerd protocol zou de toepassing ervan door laboratoria en onderzoekers ontbreekt eerdere ervaring. We gebruiken als voorbeeld laat-stadium-gesynchroniseerde IEs uitdrukken VAR2CSA opsonized met antilichamen aanwezig in serum verzameld van vrouwen met natuurlijk verworven PM-specifieke immuniteit. Het protocol kan echter eenvoudig worden gewijzigd om de functionaliteit van antilichamen tegen parasietantigeen op het IE-oppervlak te testen, hetzij veroorzaakt door natuurlijke blootstelling of door vaccinatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De menselijke serummonsters die voor de hier gepresenteerde resultaten werden gebruikt, werden verzameld in een afzonderlijke studie19. De collectie werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van Noguchi Memorial Institute for Medical Research, Universiteit van Ghana (studie 038/10-11), en door de Regional Research Ethics Committees, Capital Region of Denmark (protocol H-4-2013-083).
1. Parasietcultuur
OPMERKING: Volg de lokale regelgeving voor de behandeling van menselijke ziekteverwekkers.
- Behoud P. falciparumparasieten volgens het standaardprotocol zoals beschreven vóór20 in parasietencultuurmedium (zie Tabel van Materialen).
- Houd de parasieten strak gesynchroniseerd met behulp van sorbitol behandeling zoals eerder beschreven21.
- Om de VAR2CSA-expressie op het oppervlak van de IE te garanderen, voert u herhaalde rondes van immuunmagnetische selectie uit met behulp van een anti-VAR2CSA-antilichaam (bijvoorbeeld PAM1.4-antilichaam, een kruisreactieve menselijke monoklonale VAR2CSA-specifieke IgG22) gekoppeld aan eiwit G-magnetische kralen23.
- In het kort, incubeer laat-stadium trophozoite-IEs met magnetische kralen gekoppeld aan een anti-VAR2CSA antilichaam en positief selecteren met behulp van een magneet.
- Breid de geselecteerde parasieten in de cultuur uit voor een paar cycli tot parasitemia minstens 5% is.
- U ook parasieten selecteren die zich binden aan de door plastic geïmmobiliseerde CSA (de receptor voor VAR2CSA) zoals eerder beschreven24.
- Om var2CSA expressie op de geselecteerde parasieten te verifiëren voer flow cytometrie zoals eerder beschreven25.
- In het kort, label de laat-stadium trophozoite-IEs met hetzelfde antilichaam gebruikt voor de magnetische selectie (stap 1.3) gevolgd door een fluorescerend gelabeld secundair antilichaam.
- Meet de IE oppervlaktereactiviteit door stromingscytometrie. Succesvolle antilichaamselectie resulteert normaal gesproken in een parasietpopulatie die VAR2CSA uitdrukt bij de meeste parasieten (≈80%).
- Voor de fagocytose test, gebruik gezuiverde mid- tot laat stadium trophozoite-IEs. Voer zuivering uit met behulp van magnetische scheiding zoals eerder beschreven26.
OPMERKING: Om het stadium van de parasieten nauwkeurig te bepalen, voert u Giemsa-vlekken uit op bloeduitstrijkjes, gevolgd door lichte microscopieobservatie. Volg standaardprocedures en morfologische richtlijnen zoals beschreven vóór27. Late-stage zuivering kan ook worden uitgevoerd met behulp van dichtheid gradiënt medium. De IE-opbrengst is in onze ervaring echter lager en daarom heeft magnetische zuivering de voorkeur.- Voor magnetische scheiding, draai de parasietcultuur (5-10% parasitemia) op 500 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de supernatant en schort de celpellet opnieuw op in 10 mL parasietcultuurmedium.
- Voeg de parasietsuspensie toe aan een CS-kolom gekoppeld aan een magneet (zie Tabel met materialen)en laat deze langzaam door de kolom gaan. Trophozoite-IEs zijn paramagnetisch (door de aanwezigheid van hemozoïne) en blijven in het kolomgaas.
- Was de kolom met 50 mL parasiet cultuur medium en elute de IEs uit de magnetische kolom met behulp van 50 mL van parasiet cultuur medium.
- Draai het eluaat van 1,5,3 op 500 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant voorzichtig weg en schort opnieuw op in 1 mL van het parasietcultuurmedium.
- Met behulp van een hemocytometer, tel het aantal IEs (gemakkelijk te herkennen aan lichtmicroscopie als erytrocyten met donker hemozoïnepigment) en totaal celnummer om de uiteindelijke parasieten te berekenen (percentage IE's).
OPMERKING: Gebruik alleen parasieten met ten minste 80% zuiverheid (80% IEs). - Op basis van het aantal serum/antilichaammonsters dat voor het testen gepland is, schat u de totale benodigde hoeveelheid IE's en schaalt u de parasietculturen dienovereenkomstig op. Een 75 cm2 kweekkolf met 25 mL cultuur bij 5% hematocriet en 5-10% parasitemia moet voldoende IEs opleveren om een volledige 96 putplaat te draaien. Voor een volledige plaat (42 monsters plus 6 controles in duplicaat) is minimaal 1,5 mL parasietsuspensie nodig bij 3,3 x 107 IEs/mL.
2. THP-1 cellen
LET OP: De THP-1 cellijn wordt gebruikt in deze test. Deze monocytcellijn is afgeleid van een patiënt met monocytische leukemie28 en kan worden gekocht bij ATCC. Onderhoud de cellijn volgens de instructies van de aanbieder in THP-1 kweekmedium (zie Tabel van Materialen).
- Voor regulier onderhoud start u de THP-1 celkweek op 2-4 x 105 cellen/mL en subcultuur wanneer de celconcentratie 8 x 105 cellen/mL bereikt.
OPMERKING: Sta niet toe dat de celconcentratie meer dan 1 x 106 cellen/mL bedraagt en houd het passagenummer bij. Vermijd het gebruik van cellen die voorbij passage 25. De gemiddelde verdubbelingstijd van de THP-1 cellijn varieert tussen 19-50 uur. Bepaal de verdubbelingstijd van de celbatch voordat u met de fagocytose-experimenten begint. Dit zal helpen om ruwweg de noodzakelijke hoeveelheid cultuur te schatten die nodig is om een bepaald aantal serummonsters te testen (bijvoorbeeld voor een volledige 96 putplaat is 10 mL cultuur op 5 x 105 cellen/mL nodig). - Controleer periodiek de THP-1 cellen op de oppervlakteexpressie van de Fcγ-receptoren I (CD64), II (CD32) en III (CD16) zoals eerder beschreven15.
- Kortom, bevlek de THP-1 cellen (afzonderlijk) met anti-CD64, anti-CD32 en anti-CD16 fluorescerend gelabelde antilichamen(Tabel van materialen) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (1:100 verdunning bereid in 2% FBS in PBS).
- Was drie maal met 2% FBS in PBS en meet oppervlaktevlekken door middel van stromingscytometrie.
OPMERKING: De THP-1 cellen zijn negatief voor CD16 en positief voor CD32 en CD64 zoals eerder gemeld29,30 ( Figuur1).
- Voor de fagocytosetest, het opzetten van een THP-1 cel kweekkolf met 2,5 x 105 cellen / mL de dag voor het experiment te leveren ongeveer 5 x 105 cellen / mL op de dag van de test.
OPMERKING: Zorg ervoor dat 4-6 x 105 cellen/mL aanwezig zijn op de dag van de test.
3. Phagocytosetest (figuur S1)
- Voor aanvang van de test blokkeren (>1 h) twee ronde-bodem 96 putplaten (een voor de opsonisatie en een voor de fagocytose) met behulp van 150 μL per put van steriele 2% FBS in PBS.
LET OP: Label plaat 1 als opsonisatieplaat en gebruik deze zowel voor ethidium bromide (EtBr) kleuring en opsonisatie. Label plaat 2 als fagocytose plaat en gebruik zowel voor THP-1 celbeplating als voor de fagocytosestap. - Parasiet kleuring en opsonisatie
- Neem de IE-suspensie die in 1,6 is opgesteld en pas het aantal cellen aan tot 3,3 x 107 IEs/mL door het toevoegen van parasietcultuurmedium en EtBr om een uiteindelijke concentratie van 2,5 μg/mL (1:40 verdunning, uit een 0,1 mg/mL-voorraad) te bereiken.
OPMERKING: EtBr bevlekt het parasiet-DNA, waardoor detectie door stromingscytometrie mogelijk is.
LET OP: EtBr is een mutageen en huid, oog en ademhalingsirritatie. Gebruik de juiste bescherming en gooi afval volgens de lokale regelgeving. - Verwijder de blokkerende oplossing van een van de 96 putplaten (opsonisatieplaat), veeg de plaat en verwijder vloeibaar overtollig over een stuk handdoekpapier.
- Voeg 30 μL per put van de IE-suspensie hierboven in de bovenste helft van de plaat toe. Laat een goed leeg en voeg 30 μL van parasiet cultuur medium (zonder IEs voor de THP-1 alleen controle). (Figuur S2A). Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en beschermd tegen licht.
- Voeg 170 μL per put van parasiet cultuur medium. Draai de plaat op 500 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur en verwijder de supernatant door de plaat over een geschikte afvalcontainer te vegen.
- Was de EtBr-gelabelde IE's nog twee keer met behulp van 200 μL per put van parasiet cultuur medium spinnen van de plaat op 500 x g gedurende 3 min bij kamertemperatuur. De supernatant van de eerste was kan worden verwijderd door het vegen van de plaat. Verwijder de supernatant voorzichtig uit de tweede wasbeurt met behulp van een meerkanaals pipet om ervoor te zorgen dat het volledige volume wasmiddel wordt verwijderd. Verstoor de pellet niet.
- Schort de EtBr-gelabelde IE's opnieuw op in 30 μL antilichaam/plasma/serumoplossing bereid bij de gewenste concentraties in het parasietcultuurmedium.
- Vermeld altijd de volgende besturingselementen(Figuur S2B):een controle zonder IEs/THP-1-cellencontrole (parasietcultuurmedium); een controle zonder antilichamen of plasma/serum (niet-gesoniseerde controle); een positieve controle met behulp van het commercieel verkrijgbaar konijn anti-menselijke erythrocyten antilichaam bij 1:100 verdunning (zie tabel van materialen); twee negatieve plasma/serumcontroles bij 1:5 verdunning (een malaria-naïeve pool en een pool van malaria-blootgestelde mannetjes); en een positieve serumcontrole bij 1:5 verdunning (een pool van malaria-blootgestelde vrouwen, die eerder zwanger waren (bij voorkeur multigravidae)).
OPMERKING: Een verdunning van 1:100 voor de positieve controle lijkt consistent te werken in verschillende batches van gekocht antilichaam (gegevens die niet worden weergegeven). Het wordt echter aanbevolen om variaties tussen batches uit te sluiten door meerdere verdunningen te testen telkens wanneer een nieuwe partij antilichaam wordt gebruikt. - Incubeer gedurende 45 minuten in het donker bij 37 °C.
- Neem de IE-suspensie die in 1,6 is opgesteld en pas het aantal cellen aan tot 3,3 x 107 IEs/mL door het toevoegen van parasietcultuurmedium en EtBr om een uiteindelijke concentratie van 2,5 μg/mL (1:40 verdunning, uit een 0,1 mg/mL-voorraad) te bereiken.
- THP-1 cellen preparatentie en fagocytose
- Terwijl de IE's worden opsonized (3.2.8), beginnen met de voorbereiding van de THP-1 cellen.
- Haal de THP-1 cellen uit de kweekkolf, draai ze naar beneden (500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur), decanteer de supernatant en hang de pellet opnieuw op in THP-1 celkweekmedium.
- Spin opnieuw (500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur), decanteer de supernatant en hang de celpellet opnieuw op in 1 mL THP-1 celkweekmedium.
- Bepaal het aantal cellen in de hierboven voorbereide oplossing en voeg meer medium toe om een uiteindelijke concentratie van 5 x 105 cellen/mL te verkrijgen.
- Verwijder de blokkerende oplossing van de resterende 96 putplaat (fagocytoseplaat) door de plaat te vegen en vloeibaar overtollig over een stuk handdoekpapier te verwijderen.
- Voeg 100 μL per put van de THP-1 celsuspensie toe die in 3.3.4 is bereid en teruggezet in de celkweek incubator(Figuur S2C).
- Zodra de incubatietijd van het antilichaam/plasma/serum is verstreken, voegt u 170 μL per put van het parasietcultuurmedium toe. Draai de plaat op 500 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur en verwijder de supernatant door de plaat over een geschikte afvalcontainer te vegen.
- Was de opsonized IE's nog twee keer met behulp van 200 μL per put van parasiet cultuur medium, spinnen de plaat op 500 x g gedurende 3 min bij kamertemperatuur. De supernatant van de eerste was kan worden verwijderd door het vegen van de plaat. Verwijder de supernatant voorzichtig uit de tweede wasbeurt, met behulp van een meerkanaals pipet om ervoor te zorgen dat het volledige volume wasmiddel wordt verwijderd. Verstoor de pellet niet.
- Ten slotte opnieuw op te schorten de opsonized IEs in 100 μL van voorverwarmde THP-1 cel cultuur medium. Breng 50 μL opsonized IE-suspensie over naar elke put in de fagocytoseplaat. Aangezien er in totaal 100 μL IEs is, kan elke verdunning van antilichamen/serum worden uitgevoerd in duplicaten in de fagocytoseplaat(figuur S2D)
OPMERKING: De hoeveelheid IE's en THP-1 cellen die in de test worden gebruikt, komt overeen met een 10:1-verhouding. - Incubeer gedurende 40 minuten in het donker bij 37 °C, 5% CO2.
LET OP: Laat de fagocytose niet langer dan 40 minuten doorgaan. - Stop de fagocytose door centrifugatie bij 4 °C (500 x g, 5 min) en gooi het supernatant weg door de plaat te vegen. Voeg 150 μL ammoniumchloridelysingoplossing(Tabel van materialen) toeen meng door pipetteren, incubeer gedurende precies 3 min.
LET OP: Deze stap zal lyse de erythrocyten die niet zijn fagocytosed door de THP-1 cellen. - Stop de lysis door 100 μL ijskoude 2% FBS in PBS toe te voegen. Draai de plaat op 4 °C (500 x g gedurende 3 minuten) en verwijder de supernatant door de plaat over een geschikte afvalcontainer te vegen.
- Was drie maal met 200 μL per put ijskoude 2% FBS in PBS die de plaat op 4°C (500 x g gedurende 3 min) draait. Na de laatste wasbeurt, opnieuw op te schorten in 200 μL van ijskoude 2% FBS in PBS en onmiddellijk analyseren door stroom cytometrie.
OPMERKING: Eerdere publicaties hebben celfixatie gebruikt in 2% paraformaldehyde voorafgaand aan flow cytometrie31, maar de hier gepresenteerde resultaten werden onmiddellijk na de voltooiing van de test verworven. Het uitstellen van stroomcytometriegegevensverwerving door de plaat op te slaan bij 4°C wordt niet aanbevolen, omdat het percentage EtBr+ THP-1 cellen snel vervalt(figuur S3).
- Stroom cytometrie acquisitie en analyse
OPMERKING: Elke stroomcytometer die 96 putplaatformaat ondersteunt en de juiste lasers/filters heeft om EtBr-fluorescentie te meten, kan worden gebruikt.- Voor de overname, poort op THP-1 cellen met behulp van een lineaire forward-scatter (FSC) vs lineaire side-scatter (SSC) plot met behulp van de putten waren geen IEs werden toegevoegd (Figuur 2A) en verwerven 10.000 gebeurtenissen op deze poort.
- Meet fluorescentieintensiteit voor EtBr (FL3-Log) op de THP-1 poort met behulp van een histogram plot.
- Voor gating, eerste poort op THP-1 cellen in een FSC vs SSC dichtheid plot, met behulp van de putten waren geen IEs werden toegevoegd (Figuur 2A). Zet vervolgens een positieve poort in een FL3 (EtBr) histogram, met behulp van de THP-1 cellen (geen IEs toegevoegd) en de niet-opsonized controle (Figuur 2B).
- Kopieer deze poorten in alle andere monsters getest in dezelfde plaat en bepalen het percentage etbr-positieve THP-1 cellen (THP-1 cellen die hebben gefagocytized ten minste een IE). Voor elk van de geteste monsters kan fagocytose worden gerapporteerd als de absolute waarden (percentage EtBr+ THP-1 cellen) of als relatieve fagocytose berekend als percentage met behulp van de positieve controle als maximum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier presenteren we in detail een protocol dat eerder is beschreven31 en gebruikt11,12,13,14,15,16,17,18 om de capaciteit van antilichamen gericht op het oppervlak van P. falciparum II's te meten tot opsonisatie en fagocytose door THP-1 cellen te meten.
De test meet specifiek antilichaam-gemedieerde fagocytose en daarom is interactie met de juiste Fc-receptoren op het oppervlak van de THP-1 cellen vereist. Om deze reden, en zoals vermeld in het protocol, raden we aan om periodiek de expressie van Fcγ-receptoren op het oppervlak van de THP-1 cellen te controleren door flow cytometrie. De cellen moeten negatief zijn voor CD16 (figuur 1A) en positief voor CD32 en CD64 (figuur 1B,C).
Voor de test, gezuiverd late-stadium IEs werden gelabeld met EtBr en vervolgens opsonized met antilichamen aanwezig in het plasma / serum van malaria-naïeve of malaria-blootgestelde individuen. Phagocytose werd gemeten door stromingscytometrie, waarbij het percentage EtBr+ THP-1 cellen werd gekwantificeerd na 40 min co-incubatie met EtBr-gelabelde en antilichaam-opsonized IEs. Aanvankelijk werden THP-1 cellen omheind met behulp van een FSC vs. SSC density plot(figuur 2A). Vervolgens werd een EtBr+ marker gemaakt, met behulp van een FL3 histogram op de THP-1 cellen en niet-gesoniseerde IEs (Figuur 2B). Deze poorten werden vervolgens gebruikt om alle andere controles te analyseren en monsters te testen.
De negatieve controles (met inbegrip van de THP-1 cellen alleen, de niet-gesoniseerde IE controle, en de controles met malaria-naïeve en malaria-blootgestelde mannen) moeten allemaal genereren een enkele negatieve piek in de FL3 kanaal (Figuur 3A) met slechts enkele gebeurtenissen in de EtBr+ marker. Daarom moeten de gemiddelde phagocytosewaarden zowel als absolute EtBr+ THP-1 cellen als als relatieve fagocytosepercentages zeer laag zijn(figuur 3B,C, normaal gesproken minder dan 2% voor alle gevallen). Daarentegen moeten de positieve controles (met inbegrip van het anti-menselijke erythrocytenantilichaam van het konijn en de malaria-blootgestelde vrouwelijke pool) sporen genereren met twee pieken(figuur 3A):een negatieve (grotendeels overlappend met die gegenereerd door alle negatieve controles) en een duidelijk positieve en goed gescheiden een in de EtBr+ marker. Een positieve steekproef, zoals het gepresenteerde voorbeeld (monster van een aan malaria blootgestelde multigravid vrouw/NF20) een vergelijkbaar profiel moet genereren als de positieve controles. De gemiddelde phgocytosewaarden, gemeten als absolute EtBr+ THP-1 cellen en als relatieve fagocytose, waren normaal gesproken het hoogst voor de positieve controle (58%/100%), gevolgd door de malaria-blootgestelde vrouwelijke pool (29%/53%), en vervolgens de alleenstaande malaria-blootgestelde vrouw (23%/40%). Zoals waargenomen in figuur 3B,C, waar drie onafhankelijke experimenten worden gepresenteerd, was er een aanzienlijke variabiliteit tussen experimenten en daarom raden we aan om monsters te nemen die in hetzelfde experiment voor vergelijking zijn bedoeld. In onze handen, ten minste vier volledige 96 goed platen kunnen worden behandeld door een enkele ervaren onderzoeker. De variabiliteit tussen de testen werd ook duidelijk waargenomen toen twee identieke experimenten die verschillende serummonsters van aan malaria blootgestelde vrouwen testten tegelijkertijd werden uitgevoerd. Dezelfde parasietvoorbereiding (na magnetische zuivering van laatstadium-IT's) en serumverdunningen werden gebruikt. THP-1 cellen werden bewaard in twee afzonderlijke kolven, maar gezaaid uit dezelfde eerste fles en de experimenten werden uitgevoerd door twee verschillende onderzoekers. Hoewel de test consistente resultaten lijkt te genereren wanneer deze afzonderlijk wordt uitgevoerd, met strakke lineaire correlaties (r>0,9 voor zowel absolute als relatieve fagocytosewaarden) tussen fagocytosewaarden gemeten in de twee experimenten, wijkt de hellingscoëfficiënt van de aangepaste lijnen af van één, wat aangeeft dat de waarden die in verschillende experimenten worden gegenereerd, niet identiek waren. Deze afwijking was duidelijker voor de absolute waarden (hellingscoëfficiëntvertrouwensinterval 0,55-0,72) in vergelijking met de relatieve waarden (interval 0,68-1 (figuur 4). Wij raden daarom aan relatieve waarden te gebruiken, vooral als het om de een of andere reden (bijvoorbeeld niet genoeg gezuiverde IE's, meer dan 4 volle platen, enz.) niet mogelijk is om alle monsters in één experiment uit te voeren. We raden ook aan om experimenten uit te voeren die bedoeld zijn voor vergelijkende analyse binnen de kortste tijd, om te voorkomen dat er extra variatie wordt geïntroduceerd als gevolg van drifting in pfemp1-expressie (evenals andere antigenen) en vanwege subtiele verschillen op de THP-1 cellen na langere tijd in cultuur.
Figuur 1: Fc-receptoren uitgedrukt op het THP-1 celoppervlak.
aA) Fcγ-receptor III/CD16 (rood). (B) Fcγ-receptor II/CD32 (groen). C. Fcγ-receptor I/CD64 (oranje). Cellen met een niet-label worden blauw weergegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Flow cytometrie gating strategie.
(A) THP-1 cellen die zijn gesloten op FSC/SSC. (B) Ethidium bromide positieve (EtBr+) THP-1 cellen in een FL3 histogram. THP-1 cellen alleen / geen IEs toegevoegd (blauw), THP-1 cellen geïncubeerd met niet-gesoniseerde IEs (groen), en THP-1 cellen geïncubeerd met IEs opsonized met een positieve controle (rood) worden getoond. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Phagocytose van IT4VAR04-IEs door THP-1 cellen.
aA) Representatieve stroomcytometrie histogrammen van een van de in B gepresenteerde experimenten (aangeduid met grotere symbolen). (B) Percentage EtBr+ THP-1 cellen (middelen en standaarddeviaties van drie onafhankelijke experimenten). cC) Dezelfde gegevens als in B, na normalisatie tegen de overeenkomstige positieve controle. Kleurcodering is hetzelfde in alle panelen: THP-alone (zwart), niet-gesoniseerd / geen antilichaam controle (blauw), malaria-naïeve controle (cyaan), malaria blootgesteld mannelijke zwembad (groen), malaria-blootgestelde vrouwelijke zwembad (oranje), een malaria-blootgestelde vrouwelijke donor (roze), en positieve controle / konijn anti-menselijke erytrocyten (rood). Er worden gemiddelde en standaarddeviaties weergegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Phagocytose van IT4VAR04 IEs door THP-1 cellen bij opsonisatie met serum van 10 malaria-blootgestelde vrouwen.
De percelen presenteren lineaire regressieanalyse voor twee identieke experimenten die op dezelfde dag worden uitgevoerd, maar door verschillende onderzoekers. (A) Gegevens gepresenteerd als absolute waarden en als (B)relatievefagocytosewaarden. Analyse uitgevoerd met behulp van statistische analysesoftware. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur S1: Phagocytose test stroomgrafiek. Stroomdiagram met de belangrijkste stappen van de test. Klik hier om dit cijfer te downloaden.
Figuur S2: 96 goed plaat experiment lay-out. (A) Indeling voor IEs EtBr-etikettering. bB) indeling voor opsonisatie; 6 putten zijn altijd gereserveerd voor besturingselementen. (C) Indeling voor THP-cellen beplating. (D) Indeling voor fagocytose. Klik hier om dit cijfer te downloaden.
Figuur S3: Kleurcodering zoals in figuur 3. (A) Stroomcytometrie histogram overlay van een experiment verworven onmiddellijk en (B) na opslag bij 4 °C voor 12 uur (C) Percentage EtBr+ THP-1 cellen gemeten voor en na opslag. NF## vertegenwoordigen verschillende malaria-blootgestelde vrouwelijke donoren. Klik hier om dit cijfer te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hier gepresenteerde protocol is eerder beschreven en gebruikt12,15,17,31 om de capaciteit van antilichamen te meten die gericht zijn op het oppervlak van P. falciparum-II's om opsonisatie en fagocytose te induceren door THP-1-cellen. De hier gepresenteerde resultaten richten zich op natuurlijk verworven VAR2CSA-specifieke antilichamen in het plasma/serum van vrouwen die in een P. falciparum endemische regio wonen. VAR2CSA is een type PfEMP1 dat betrokken is bij placenta-opslag van IE's en een belangrijke determinant is in de pathogenese van PM.
De test kan worden gebruikt voor antilichamen die worden geïnduceerd door immunisatie en/of gericht op andere PfEMP1-varianten of andere parasietantigeen die op het IE-oppervlak aanwezig is, mits het geteste antilichaam interageert met de menselijke Fcγ-receptoren uitgedrukt door de THP-1 cellen (CD32 en CD64). De test is eenvoudig, hoge doorvoer (waardoor de analyse van grote sample sets) en kan worden uitgevoerd in een dag. Phagocytose wordt gemeten door stromingscytometrie, waarbij het percentage EtBr+ THP-1 cellen wordt gekwantificeerd na 40 min co-incubatie met EtBr-gelabelde en antilichaam-opsonized IEs.
Hoewel de test consistente resultaten geeft ten opzichte van experimentele replica's, is er variabiliteit tussen de gemeten absolute waarden en daarom raden we aan relatieve waarden te berekenen met behulp van een positieve controle die altijd moet worden opgenomen. We raden ook aan om alle monsters uit te voeren die in één experiment moeten worden getest, om variatie tussen de tests te voorkomen zoals hierboven besproken. Bij het testen van serummonsters die zijn verzameld van personen die zijn blootgesteld aan P. falciparum-infectie, raden we aan om altijd een set monsters van naïeve personen op te nemen die als controlegroep moeten worden gebruikt. Deze controlegroep kan worden gebruikt om een drempelwaarde in te stellen om te bepalen welke van uw testmonsters als positief moeten worden beschouwd.
We hebben deze aanpak eerder gebruikt om de fagocytose-inducerende capaciteit van sera verzameld bij kinderen met verschillende malaria klinische presentaties (ernstig versus mild) te vergelijken17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Maiken Visti wordt bedankt voor uitstekende technische bijstand. Dit werk werd deels gefinancierd door een subsidie (MAVARECA II; 17-02-KU) van het Ministerie van Buitenlandse Zaken van Denemarken en beheerd door Danida Fellowship Centre. De financier had geen rol in het ontwerp van de studie, het verzamelen en analyseren van gegevens, het besluit om het manuscript te publiceren of de voorbereiding van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well cell culture plates, round bottom with lid | Corning | 3799 | Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use |
| AlbuMAX-II | Gibco | 11021-037 | |
| AlbuMAX-II (5%) | - | - | 5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Anti-Red Blood Cells antibody | Abcam | ab34858 | Prepare 2μl aliquots and freeze a -20°C. Use one aliquot per experiment. |
| DPBS | Sigma | P8622 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10003D | |
| Ethidium bromide solution | Sigma | E1510 | Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light |
| FC500 flow cytometer | Beckman Coulter | Any flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used. | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099-141 | Heat inactivate before use. |
| FITC mouse anti-human CD16 | BD Biosciences | 555406 or 556618 | |
| FITC mouse anti-human CD32 | BD Biosciences | 552883 | |
| FITC mouse anti-human CD64 | BD Biosciences | 555527 | |
| FlowLogic software | Inivai technologies | Any flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist | |
| Gentamicin (10mg/mL) | Sigma | G1272 | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9377 | |
| L-glutamine (200mM) | Sigma | G7513 | |
| Lysing solution | - | - | 15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA |
| MACS CS-column and accesories | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | |
| Parasite culture medium | - | - | 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50µg/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL) | Sigma | P0781 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R5886 | |
| THP-1 culture medium | - | - | 10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Vario MACS magnet | Miltenyi Biotec |
References
- World Health Organization. World Malaria Report - 2018. World Health Organization. , (2018).
- Pierce, S. K., Miller, L. H. World Malaria Day 2009: What malaria knows about the immune system that immunologists still do not. Journal of Immunology. 182 (9), 5171-5177 (2009).
- Gamain, B., Smith, J. D., Viebig, N. K., Gysin, J., Scherf, A. Pregnancy-associated malaria: Parasite binding, natural immunity and vaccine development. International Journal for Parasitology. 37 (3-4), 273-283 (2007).
- Staalsoe, T., et al. Variant surface antigen-specific IgG and protection against clinical consequences of pregnancy-associated Plasmodium falciparum malaria. Lancet. 363 (9405), 283-289 (2004).
- Feng, G., et al. Antibodies to variant surface antigens of plasmodium falciparum -Infected erythrocytes are associated with protection from treatment failure and the development of anemia in pregnancy. The Journal of Infectious Diseases. 200 (2), 299-306 (2009).
- Teo, A., Feng, G., Brown, G. V., Beeson, J. G., Rogerson, S. J. Functional Antibodies and Protection against Blood-stage Malaria. Trends in Parasitology. 32 (11), 1-12 (2016).
- Aitken, E. H., Mahanty, S., Rogerson, S. J. Antibody effector functions in malaria and other parasitic diseases: a few needles and many haystacks. Immunology & Cell Biology. 98 (4), 264-275 (2020).
- Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. Opsonic activity of human immune serum on in vitro phagocytosis of Plasmodium falciparum infected red blood cells by monocytes. Clinical and Experimental Immunology. 47 (3), 635-644 (1982).
- Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. Phagocytosis of Plasmodium falciparum-Parasitized Erythrocytes by Human Polymorphonuclear Leukocytes. The Journal of Parasitology. 69 (1), 49-53 (1983).
- Jaworowski, A., et al. Relationship between human immunodeficiency virus type 1 coinfection, anemia, and levels and function of antibodies to variant surface antigens in pregnancy-associated malaria. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (3), 312-319 (2009).
- Ataíde, R., Mwapasa, V., Molyneux, M. E., Meshnick, S. R., Rogerson, S. J. Antibodies that induce phagocytosis of malaria infected erythrocytes: Effect of HIV infection and correlation with clinical outcomes. PLoS One. 6 (7), 22491 (2011).
- Ghumra, A., et al. Immunisation with recombinant PfEMP1 domains elicits functional rosette-inhibiting and phagocytosis-inducing antibodies to Plasmodium falciparum. PloS One. 6 (1), 0016414 (2011).
- Ghumra, A., et al. Induction of strain-transcending antibodies against Group A PfEMP1 surface antigens from virulent malaria parasites. PLoS Pathogens. 8 (4), 1002665 (2012).
- Chan, J. A., et al. Targets of antibodies against erythrocytes in malaria immunity. J Clin Invest. 122 (9), 3227-3238 (2012).
- Quintana, M. P., Angeletti, D., Moll, K., Chen, Q., Wahlgren, M. Phagocytosis inducing antibodies to Plasmodium falciparum upon immunization with a recombinant PfEMP1 NTS DBL1α domain. Malaria Journal. 1, 1-9 (2016).
- Chan, J. A., et al. A single point in protein trafficking by Plasmodium falciparum determines the expression of major antigens on the surface of infected erythrocytes targeted by human antibodies. Cellular and Molecular Life Sciences. 73, 4141-4158 (2016).
- Quintana, M. P., et al. Antibodies in children with malaria to PfEMP1, RIFIN and SURFIN expressed at the Plasmodium falciparum parasitized red blood cell surface. Scientific Reports. 8 (1), 3262 (2018).
- Hommel, M., et al. Evaluating antibody functional activity and strain-specificity of vaccine candidates for malaria in pregnancy using in vitro phagocytosis assays. Parasites & Vectors. 11 (69), 1-7 (2018).
- Ampomah, P., Stevenson, L., Ofori, M. F., Barfod, L., Hviid, L. B-cell responses to pregnancy-restricted and -unrestricted Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 antigens in Ghanaian women naturally exposed to malaria parasites. Infection and Immunity. 82 (5), 1860-1871 (2014).
- Cranmer, S. L., Magowan, C., Liang, J., Coppel, R. L., Cooke, B. M. An alternative to serum for cultivation of Plasmodium falciparum in vitro. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (3), 363-365 (1997).
- Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. Journal of Parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).
- Barfod, L., et al. Human pregnancy-associated malaria-specific B cells target polymorphic, conformational epitopes in VAR2CSA. Molecular Microbiology. 63 (2), 335-347 (2007).
- Staalsoe, T., et al. In vitro selection of Plasmodium falciparum 3D7 for expression of variant surface antigens associated with severe malaria in African children. Parasite Immunology. 25 (8-9), 421-427 (2003).
- Chan, S., et al. Regulation of PfEMP1-VAR2CSA translation by a Plasmodium translation-enhancing factor. Nature Microbiology. 2, 17068 (2017).
- Barfod, L., et al. Evasion of immunity to Plasmodium falciparum malaria by IgM masking of protective IgG epitopes in infected erythrocyte surface-exposed PfEMP1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12485-12490 (2011).
- Moll, K., Kaneko, A., Scherf, A., Wahlgren, M. Methods in Malaria Research. , MR4/ATCC. Manassas, Virginia. (2013).
- WHO. Basic malaria microscopy. Part I. Learner's Guide. World Health Organization. , (1991).
- Tsuchiya, S. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). International Journal of Cancer. Journal International Du Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Fleit, H. B., Kobasiuk, C. D. The human monocyte-like cell line THP-1 expresses FcyRl and Fc'yRIl. Journal of Leukocyte Biology. 49, 556-565 (1991).
- Auwerx, J., Staels, B., Van Vaeck, F., Ceuppens, J. L. Changes in IgG Fc receptor expression induced by phorbol 12-myristate 13-acetate treatment of THP-1 monocytic leukemia cells. Leukemia research. 16 (3), 317-327 (1992).
- Ataíde, R., et al. Using an improved phagocytosis assay to evaluate the effect of HIV on specific antibodies to pregnancy-associated malaria. PloS One. 5 (5), 10807 (2010).
