Summary
Det övergripande målet med detta protokoll är att ge instruktioner om hur man mäter kapaciteten hos antikroppar som finns i sera eller plasma av individer, naturligt utsatt för Plasmodium falciparum infektion, att opsonize och inducera fagocytos av parasitinfekterade erytrocyter (IEs).
Abstract
Protokollet beskriver hur man ställer in och kör ett flöde cytometry-baserade fagocytos analys av Plasmodium falciparum-infekterade erytrocyter (IEs) opsonized av naturligt förvärvade IgG antikroppar specifika för VAR2CSA. VAR2CSA är parasiten antigen som förmedlar selektiv kvarstad av IEs i moderkakan som kan orsaka en allvarlig form av malaria hos gravida kvinnor, kallas placenta malaria (PM). Skydd från PM medieras av VAR2CSA-specifika antikroppar som tros fungera genom att hämma placentabindning och/eller genom att opsonisera IEs för fagocytos. Analysen sysselsätter sent stadium-synkroniserade IEs som har valts in vitro för att uttrycka VAR2CSA, plasma/serum-antikroppar från kvinnor med naturligt förvärvade PM-specifika immunitet, och den fagocytic cellinje THP-1. Protokollet kan dock lätt modifieras för att analysera funktionaliteten hos antikroppar mot någon parasitantigen som finns på IE-ytan, oavsett om den framkallas genom naturlig exponering eller genom vaccination. Analysen erbjuder enkel och hög genomströmning utvärdering, med god reproducerbarhet, av en viktig funktionell aspekt av antikropp-medierad immunitet i malaria. Det är därför användbart vid utvärdering av klinisk immunitet mot P. falciparum malaria, en viktig orsak till sjuklighet och dödlighet i tropikerna, särskilt i Afrika söder om Sahara.
Introduction
Malaria är en vektorburen sjukdom som orsakas hos människor vid infektion med fem olika arter av släktet Plasmodium. Den mest förhärskande arten är P. falciparum, som också är ansvarig för den mest sjuklighet och dödlighet1. Malaria klinisk presentation varierar från asymtomatiska eller godartade infektioner till komplicerade/svår sjukdom, den senare förekommer mestadels hos barn under fem års ålder. Exponering för P. falciparum inducerar inte steril immunitet, men individer som lever i endemiska områden utvecklar långsamt immunitet mot den kliniska sjukdomen. Skydd är ålder/exponeringsberoende och immunitet förvärvas normalt under de första 5-10 åren i livet2. Vuxna kvinnor är ett viktigt undantag, som svår malaria kan uppstå under graviditeten i en klinisk presentation som kallas placenta malaria (PM). PM är en viktig orsak till abort, dödföddhet, för tidig leverans, låg födelsevikt, fosterdöd, och moderns anemi. Resistens mot PM utvecklas under på varandra följande graviditeter3. Skydd från PM är associerad med förvärv av antikroppar mot VAR2CSA-typ PfEMP14,5, en infekterad erytrocyt (IE) ytantigen som binder till kondroitinsulfat A (CSA) som möjliggör IE-kvarstad i moderkakan. Antikroppar medla skydd utför olika funktionella aktiviteter (ses överi 6,7) inklusive opsonization av IEs att inducera fagocytos. Tidiga in vitro-studier visade att antikroppar kan begränsa P. falciparumtillväxt i närvaro av monocyter via fagocytos8,9. Nyare studier har visat att högre nivåer av fagocytos-inducerande antikroppar är associerade med bättre graviditetsutfall (i samband med HIV-co-infektion)10,11, som anger relevansen av denna effektorfunktion i det naturligt förvärvade immunsvaret.
Här presenterar vi ett protokoll för att mäta denna funktion av antikroppar som finns i humant plasma/serum, med hjälp av in vitro odlade IEs uttrycker VAR2CSA tillsammans med monocyte linjen THP-1. Analysen har tidigare använts11,12,13,14,15,16,17,18 och anses vara en förbättrad och enklare metod jämfört med tidigare mikroskopbaserade protokoll8, eftersom det möjliggör testning av ett större antal antikroppsprover i en enda körning med mindre volymer av antikropp och undvika tråkiga och sneda mikroskopiräkning. Även om analysen har använts av flera laboratorier och dess utförande är enkelt nog, det kräver noggrann planering och förberedelser, därför skulle ett detaljerat protokoll tillåta dess tillämpning av laboratorier och forskare saknar tidigare erfarenhet. Vi använder, som ett exempel, sent stadium-synkroniserade IEs uttrycker VAR2CSA opsonized med antikroppar som finns i serum som samlats in från kvinnor med naturligt förvärvade PM-specifika immunitet. Protokollet kan dock lätt modifieras för att analysera funktionaliteten hos antikroppar mot någon parasitantigen som finns på IE-ytan, oavsett om den framkallas genom naturlig exponering eller genom vaccination.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De humana serumprover som användes för de resultat som presenteras här samlades in i en separat studie19. Collection godkändes av Den institutionella granskningsnämnden för Noguchi Memorial Institute for Medical Research, University of Ghana (studie 038/10-11), och av de regionala forskningsetiska kommittéerna, Huvudstadsregionen i Danmark (protokoll H-4-2013-083).
1. Parasitkultur
OBS: Följ de lokala föreskrifterna för hantering av mänskliga patogener.
- Underhåll P. falciparum parasiter enligt standardprotokollet enligt beskrivningen före20 i parasitkulturmedium (se Tabell över material).
- Håll parasiterna tätt synkroniserade med hjälp av sorbitolbehandling som tidigare beskrivits21.
- För att säkerställa VAR2CSA-uttryck på ytan av IE, utför upprepade rundor av immun-magnetiska urval med hjälp av en anti-VAR2CSA antikropp (t.ex. PAM1.4 antikropp, en korsreaktiv människa monoklonal VAR2CSA-specifika IgG22) kopplade till protein G-magnetiska pärlor23.
- I korthet, inkubera sent stadium trophozoite-IEs med magnetiska pärlor kopplade till en anti-VAR2CSA antikropp och positivt välja med hjälp av en magnet.
- Expandera de valda parasiterna i kultur för några cykler tills parasitemia är minst 5%.
- Alternativt väljer du parasiter som binder till plast-immobiliserade CSA (receptorn för VAR2CSA) som tidigare beskrivits24.
- För att verifiera VAR2CSA uttryck på de valda parasiterna utföra flöde cytometri som tidigare beskrivits25.
- I korthet, märka sena stadiet trophozoite-IEs med samma antikropp som används för det magnetiska urvalet (steg 1.3) följt av en fluorescently märkt sekundär antikropp.
- Mät IE-ytans reaktivitet genom flödescytometri. Framgångsrik antikroppsval resulterar normalt i en parasitpopulation som uttrycker VAR2CSA i de flesta av parasiterna (≈80%).
- För phagocytosis analysen, använd renad mitten- till sent stadium trofozoit-IEs. Utför rening med hjälp av magnetisk separation som tidigarebeskrivits 26.
OBS: För att exakt bestämma parasiternas stadium, utför Giemsa-färgning på blodutstryk följt av ljusmikroskopiobservation. Följ standardrutiner och morfologiska riktlinjer enligt beskrivningen före27. Sent stadium rening kan också utföras med hjälp av densitet gradient medium. IE-avkastningen är dock enligt vår erfarenhet lägre och därför är magnetisk rening att föredra.- För magnetisk separation, snurra parasitkulturen (5-10% parasitmi) vid 500 x g i 10 min vid rumstemperatur. Ta bort supernatanten och åter upphäva cellpelleten i 10 mL av parasitkulturmedium.
- Lägg till parasiten suspension i en CS-kolumn kopplade till en magnet (se Tabell över material) och låt den sakta passera genom kolonnen. Trophozoite-IEs är paramagnetiska (på grund av närvaron av hemozoin) och kommer att stanna i kolonnnätet.
- Tvätta kolonnen med 50 mL av parasitkulturmedium och elute IEs från den magnetiska kolonnen med hjälp av 50 mL av parasitkulturmedium.
- Snurra eluatet från 1.5.3 vid 500 x g i 10 min vid rumstemperatur. Kassera försiktigt supernatanten och återstänga i 1 mL av parasitkulturmedium.
- Med hjälp av en hemocytometer, räkna antalet IEs (lätt identifieras genom ljusmikroskopi som erytrocyter med mörkt hemozoin pigment) och totalt cellnummer för att beräkna den slutliga parasitemia (procent av IEs).
OBS: Använd endast parasiter med minst 80 % renhet (80 % IE). - Baserat på antalet serum-/antikroppsprover som planeras för testning, uppskatta den totala mängden IEs som behövs och skala upp parasitkulturerna därefter. En 75 cm2 odling kolv med 25 mL av kultur vid 5% hematokrit och 5-10% parasitemia bör ge tillräckligt IEs att köra en full 96 väl platta. För en full platta (42 prover plus 6 kontroller i två exemplar) behövs minst 1,5 mL parasitupphängning vid 3,3 x10 7 IEs/mL.
2. THP-1 celler
OBS: THP-1-cellinjen används i denna analys. Denna monocytecell linje härrör från en patient med monocytisk leukemi28 och kan köpas från ATCC. Underhåll cellinjen enligt providerns anvisningar i THP-1 odlingsmedium (se Tabell över material).
- För regelbundet underhåll, starta THP-1 cellodling vid 2-4 x 105 celler/mL och subkultur när cellkoncentrationen når 8 x 105 celler/mL.
OBS: Låt inte cellkoncentrationen överskrida 1 x 106 celler/mL och håll koll på passagenummer. Undvik användning av celler som är bortom passage 25. Den genomsnittliga fördubblingstiden för THP-1-cellinjen varierar mellan 19-50 h. Bestäm cellsatsens fördubblingstid innan man startar fagocytosexperimenten. Detta kommer att bidra till att grovt uppskatta den nödvändiga mängd kultur som behövs för ett bestämt antal serumprover som ska testas (t.ex. för en full 96 brunnsplatta behövs 10 mL av odling vid 5 x10 5 celler/mL). - Kontrollera med jämna mellanrum THP-1-cellerna för ytuttrycket av fcγ-receptorerna I (CD64), II (CD32) och III (CD16) enligt tidigarebeskrivet 15.
- I korthet, fläcka THP-1 cellerna (separat) med anti-CD64, anti-CD32 och anti-CD16 fluorescerande märkta antikroppar (Tabell of Materials) för 30 min vid rumstemperatur (1:100 utspädning beredd i 2% FBS i PBS).
- Tvätta tre gånger med 2% FBS i PBS och mät ytfärgning genom flödescytometri.
OBS: THP-1-cellerna är negativa för CD16 och positiva för CD32 och CD64 som tidigarerapporterats 29,30 ( Bild1).
- För phagocytosis analysen, inrätta en THP-1 cell kultur kolv med 2,5 x 105 celler/mL dagen före experimentet att ge runt 5 x 105 celler/mL på dagen för analysen.
OBS: Se till att 4-6 x10 5 celler/mL är närvarande på analysens dag.
3. Phagocytosis analys (Figur S1)
- Innan analysen startas, block (>1 h) två rundbottens 96 brunnsplattor (en för opsoniseringen och en annan för fagocytosen) med användning av 150 μL per brunn av sterila 2% FBS i PBS.
OBS: Etikettplatta 1 som opsoneringsplatta och använd den både för ethidiumbromid (EtBr) färgning och opsonisering. Etikettplatta 2 som fagocytosplatta och använd både för THP-1-cellplätering och för fagocytossteget. - Parasitfärgning och opsonisering
- Ta IE-suspensionen som bereds i 1,6 och justera celltalet till 3,3 x 107 IEs/mL genom att tillsätta parasitodlingsmedium och EtBr för att uppnå en slutlig koncentration på 2,5 μg/mL (1:40 utspädning, från ett 0,1 mg/mL-lager).
OBS: EtBr fläckar parasiten DNA, vilket möjliggör upptäckt genom flödescytometri.
VARNING: EtBr är en mutagen och hud, öga, och andningsirriterande. Använd lämpligt skydd och bortskaffa avfall enligt lokala föreskrifter. - Ta bort den blockerande lösningen från en av de 96 brunnsplattorna (opsoniseringsplattan), snärta plattan och ta bort flytande överskott över en bit handdukspapper.
- Tillsätt 30 μL per brunn av IE-suspensionen som beretts ovan i plattans övre halva. Lämna en brunn tom och tillsätt 30 μL av parasitkulturmedium (utan IEs för THP-1 ensam kontroll). (Figur S2A). Inkubera i 10 min i rumstemperatur och skyddas mot ljus.
- Tillsätt 170 μL per brunn av parasitkulturmedium. Snurra plattan i 500 x g i 3 min i rumstemperatur och ta bort supernatanten genom att snärta plattan över en lämplig avfallsbehållare.
- Tvätta EtBr-märkta IEs ytterligare två gånger med 200 μL per brunn av parasitkultur medium spinning plattan på 500 x g i 3 min vid rumstemperatur. Supernatanten från första tvättningen kan tas bort genom att snärta på plattan. Ta försiktigt bort supernatanten från den andra tvätten med hjälp av en flerkanalig pipett för att se till att hela volymen av tvättmedium tas bort. Stör inte pelleten.
- Åter upphäva etbr-märkta IEs i 30 μL av antikropp/plasma/serum lösning beredd vid de önskade koncentrationerna i parasitodlingsmedium.
- Inkludera alltid följande kontroller (Figur S2B): en kontroll utan IEs/THP-1-celler kontroll (parasit odlingsmedium); en kontroll utan någon antikropp eller plasma/serum (un-opsonized kontroll); en positiv kontroll med användning av den kommersiellt tillgängliga kaninen anti-human erytrocytantikropp vid 1:100 utspädning (se Tabell över material); två negativa plasma/serumkontroller vid 1:5-utspädning (en malaria-naiv pool och en pool från malariaexponerade hanar); och en positiv serumkontroll vid 1:5 utspädning (en pool från malariaexponerade kvinnor, som tidigare varit gravida (helst multigravidae)).
OBS: A 1:100 utspädning för den positiva kontrollen verkar fungera konsekvent över olika partier av köpt antikropp (data visas inte). Det rekommenderas dock att utesluta variationer mellan satser genom att testa flera spädningar varje gång en ny sats av antikroppar används. - Inkubera i 45 min i mörker vid 37 °C.
- Ta IE-suspensionen som bereds i 1,6 och justera celltalet till 3,3 x 107 IEs/mL genom att tillsätta parasitodlingsmedium och EtBr för att uppnå en slutlig koncentration på 2,5 μg/mL (1:40 utspädning, från ett 0,1 mg/mL-lager).
- THP-1 celler förberedelse och fagocytos
- Medan IEs håller på att opsonized (3.2.8), börja förbereda THP-1 celler.
- Ta bort THP-1-cellerna från odlingskolven, snurra ner dem (500 x g i 5 min vid rumstemperatur), dekantera supernatanten och åter upphäva pelleten i THP-1 cellodlingsmedium.
- Snurra igen (500 x g i 5 min vid rumstemperatur), dekantera supernatanten och åter upphäva cellpelleten i 1 mL av THP-1 cellkulturmedium.
- Bestäm cellantal i lösningen som beretts ovan och lägg till mer medium för att få en slutkoncentration på 5 x 105 celler/mL.
- Ta bort blockeringslösningen från den återstående 96 brunnsplattan (fagocytosplatta) genom att snärta på plattan och avlägsna flytande överskott över en bit handdukspapper.
- Tillsätt 100 μL per brunn av THP-1-cellsupphängningen som beretts i 3.3.4 och sätts tillbaka i cellodlingsinkubatorn (Figur S2C).
- När inkubationstiden för antikropp/plasma/serum har avslutats, tillsätt 170 μL per brunn av parasitodlingsmedium. Snurra plattan i 500 x g i 3 min i rumstemperatur och ta bort supernatanten genom att snärta plattan över en lämplig avfallsbehållare.
- Tvätta opsonized IEs ytterligare två gånger med 200 μL per brunn av parasitkultur medium, spinning plattan på 500 x g i 3 min vid rumstemperatur. Supernatanten från första tvättningen kan tas bort genom att snärta på plattan. Ta försiktigt bort supernatanten från den andra tvätten, med hjälp av en flerkanalig pipett för att se till att hela volymen av tvättmediet tas bort. Stör inte pelleten.
- Slutligen åter upphäva opsonized IEs i 100 μL av förvärga THP-1 cell odling medium. Överför 50 μL av opsoniserad IE suspension till varje brunn i fagocytosplattan. Eftersom det finns totalt 100 μL IE, kan varje antikropp/serumspädning köras i dubbletter i fagocytosplattan (Figur S2D)
OBS: Mängden IEs och THP-1 celler som används i analysen motsvarar ett 10:1-förhållande. - Inkubera i 40 min i mörker vid 37 °C, 5% CO2.
OBS: Låt inte fagocytosen fortsätta i mer än 40 min. - Stoppa fagocytosen genom centrifugering vid 4 °C (500 x g, 5 min) och kassera supernatanten genom att snärta på plattan. Tillsätt 150 μL av rumstemperatur ammoniumkloridlysningslösning (Tabell of Materials) och blanda genom pipettering, inkubera för exakt 3 min.
OBS: Detta steg kommer att lysa de erytrocyter som inte har fagocytosed av THP-1 celler. - Stoppa lysen genom att tillsätta 100 μL iskall 2% FBS i PBS. Snurra plattan i 4 °C (500 x g i 3 min) och ta bort supernatanten genom att snärta plattan över en lämplig avfallsbehållare.
- Tvätta tre gånger med 200 μL per brunn av iskall 2% FBS i PBS snurrar plattan vid 4 ° C (500 x g för 3 min). Efter den slutliga tvätten, åter avbryta i 200 μL av iskall 2% FBS i PBS och omedelbart analysera genom flödescytometri.
OBS: Tidigare publikationer har använt cellfixering i 2% paraformaldehyd före flödescytometri31, men resultaten som presenteras här förvärvades omedelbart efter assay slutförande. Att skjuta upp flödescytometridatainhämtning genom att lagra plattan vid 4°C rekommenderas inte, eftersom andelen EtBr+ THP-1-celler sönderfaller snabbt (Figur S3).
- Flödescytometri förvärv och analys
OBS: Varje flödescytometer som stöder 96 väl plåtformat och som har lämpliga lasrar/filter för att mäta EtBr fluorescens kan användas.- För förvärv, gate på THP-1 celler med hjälp av en linjär framåt-scatter (FSC) vs. linjär sida-scatter (SSC) tomt med hjälp av brunnarna var inga IEs lades till (Figur 2A) och förvärva 10.000 händelser på denna grind.
- Mät fluorescensintensitet för EtBr (FL3-Log) på THP-1-porten med hjälp av en histogramtomt.
- För gating, första grinden på THP-1 celler i en FSC vs SSC densitet tomt, med hjälp av brunnarna var inga IEs lades till (Figur 2A). Ställ sedan upp en positiv grind i ett FL3 (EtBr) histogram, med hjälp av THP-1-cellerna (inga IEs tillagd) och den oopsonerade kontrollen (Bild 2B).
- Kopiera dessa grindar i alla andra prover som testats i samma platta och bestämma andelen EtBr-positiva THP-1-celler (THP-1-celler som har fagocytiserat minst en IE). För vart och ett av de testade proverna kan fagocytos rapporteras som de absoluta värdena (procent av EtBr+ THP-1-celler) eller som relativ fagocytos beräknad som procentuell med hjälp av den positiva kontrollen som maximum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här presenterar vi i detalj ett protokoll som tidigare harbeskrivits 31 och används11,12,13,14,15,16,17,18 för att mäta kapaciteten hos antikroppar som riktar sig till ytan av P. falciparum IEs att inducera opsonization och fagocytos av THP-1 celler.
Analysen mäter specifikt antikroppsmedierad fagocytos och, därför, interaktion med lämpliga Fc-receptorer på ytan av THP-1 cellerna krävs. Av denna anledning, och som nämns i protokollet, rekommenderar vi att regelbundet kontrollera uttrycket av Fcγ-receptorer på ytan av THP-1 cellerna genom flödescytometri. Cellerna ska vara negativa för CD16 (bild 1A) och positiva för CD32 och CD64 (Bild 1B,C).
För analysen, renat sent stadium IEs var märkt med EtBr och sedan opsonized med antikroppar som finns i plasma/serum av malaria-naiva eller malaria-utsatta individer. Phagocytosis mättes genom flöde cytometry, kvantifiera andelen EtBr+ THP-1 celler efter 40 min co-inkubation med EtBr-märkt och antikropp-opsonized IEs. Initialt var THP-1 celler gated med hjälp av en FSC vs SSC densitet tomt (Figur 2A). Sedan skapades en EtBr+ markör, med hjälp av ett FL3-histogram på cellerna THP-1 och un-opsonized IEs (Figur 2B). Dessa grindar användes sedan för att analysera alla andra kontroller och provprover.
De negativa kontrollerna (inklusive THP-1-cellerna ensam, den un-opsonized IE kontroll, och kontrollerna med malaria-naiva och malaria-utsatta hanar) bör alla generera en enda negativ topp i FL3-kanalen (Figur 3A) med endast få händelser i EtBr+ markör. I enlighet med detta bör medelvärdet av fagocytosvärdena både som absoluta EtBr+ THP-1-celler och som relativa fagocytosprocenttal vara mycket låga (Figur 3B,C, normalt mindre än 2% för alla fall). Däremot bör de positiva kontrollerna (inklusive den kanin anti-mänskliga erytrocytantikroppen och den malaria-exponerade kvinnliga poolen) generera spår med två toppar (Figur 3A): en negativ (till stor del överlappande med den som genereras av alla negativa kontroller) och en klart positiv och väl åtskilda en som ligger inuti EtBr+ markör. Ett positivt prov, som det presenterade exemplet (prov från en malaria-exponerad multigravid kvinna/NF20) bör generera en liknande profil som de positiva kontrollerna. Medelvärdet av fagocytosvärdena, mätt som absoluta EtBr+ THP-1-celler och som relativ fagocytos, var normalt högst för den positiva kontrollen (58%/100%), följt av den malariaexponerade kvinnliga poolen (29%/53%), och därefter den enda malariaexponerade kvinnan (23%/40%). Som observerats i figur 3B,C, där tre oberoende experiment presenteras, fanns en avsevärd variation mellan experiment och vi rekommenderar därför att man kör prover avsedda för jämförelse i samma experiment. I våra händer kan minst fyra hela 96 brunnsplåtar hanteras av en enda erfaren forskare. Variabiliteten mellan analyser observerades också tydligt när två identiska experiment testa flera serumprov från malaria-utsatta kvinnor utfördes samtidigt. Samma parasitberedning (efter magnetisk rening av sena IEs) och serum utspädningar användes. THP-1 celler hölls i två separata kolvar men seedade från samma initialkolv och experimenten utfördes av två olika forskare. Även om analysen verkar generera konsekventa resultat när de utförs separat, med snäva linjära korrelationer (r>0,9 för både absoluta och relativa fagocytosvärden) mellan fagocytosvärden mätt i de två experimenten, avviker lutningskoefficienten för de justerade linjerna från en, vilket indikerar att de värden som genereras i olika experiment inte var identiska. Denna avvikelse var mer uppenbar för de absoluta värdena (lutningskoefficientens konfidensintervall 0,55-0,72) jämfört med de relativa värdena (lutningskoefficientens konfidensintervall 0,68-1) (Figur 4). Vi rekommenderar därför att använda relativa värden, särskilt om det av någon anledning (t.ex. inte tillräckligt renad IEs, mer än 4 fulla plattor, etc.) är det inte möjligt att köra alla prover i ett enda experiment. Vi rekommenderar också att köra experiment som är avsedda för jämförande analys inom kortast tid, för att undvika att införa extra variation på grund av drifting i PfEMP1 uttryck (liksom andra antigener) och på grund av subtila skillnader på THP-1 cellerna vid förlängd tid i kultur.
Bild 1: Fc-receptorer uttryckta på cellytan THP-1.
(A) Fcγ-receptor III/CD16 (röd). (B) Fcγ-receptor II/CD32 (grön). C. Fcγ-receptor I/CD64 (orange). Icke-märkta celler visas i blått. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Flödescytometri gating strategi.
(A) THP-1 celler gated på FSC/SSC. (B) Ethidium bromid positiva (EtBr+) THP-1 celler i en FL3 histogram. THP-1 celler ensam/inga IEs till (blå), THP-1 celler inkuberas med un-opsonized IEs (grön), och THP-1 celler inkuberas med IEs opsonized med en positiv kontroll (röd) visas. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Fagocytos av IT4VAR04-IEs av THP-1 celler.
(A) Representativa flödescytometrihistogram för ett av de experiment som presenteras i B (identifieras med större symboler). (B) Procent av EtBr+ THP-1-celler (betyder och standardavvikelser av tre oberoende experiment). (C) Samma data som i B, efter normalisering mot motsvarande positiv kontroll. Färgkodning är densamma i alla paneler: THP-ensam (svart), un-opsonized/no antikroppskontroll (blå), malaria-naiv kontroll (cyan), malaria-exponerade manliga pool (grön), malaria-exponerade kvinnliga pool (orange), en malaria-exponerade kvinnliga givare (rosa), och positiv kontroll / kanin anti-mänskliga erytrocyter (röd). Medelvärde och standardavvikelser visas. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Fagocytos av IT4VAR04 IEs av THP-1 celler vid opsonisering med serum från 10 malaria-utsatta kvinnor.
De tomter presentera linjär regressionsanalys för två identiska experiment utförs på samma dag, men av olika forskare. (A) Data presenteras som absoluta värden och som (B)relativa fagocytosvärden. Analys utförd med hjälp av programvara för statistisk analys. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild S1: Phagocytosis assay flödesschema. Flödesdiagram som avbildar de viktigaste stegen i analysen. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Bild S2: 96 väl platta experiment layout. (A) Layout för IEs EtBr-märkning. (B) Layout för opsonisering; 6 brunnar är alltid reserverade för kontroller. (C) Layout för THP-celler bordläggning. (D) Layout för fagocytos. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Bild S3: Färgkodning som i figur 3. (A) Flödescytometri histogram överlagring av ett experiment som förvärvats omedelbart och (B) efter lagring vid 4 °C i 12 h. (C) Andel av EtBr+ THP-1 celler mätt före och efter lagring. NF## representerar olika malariaexponerade kvinnliga givare. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som presenteras här har tidigare beskrivits ochanvänts 12,15,17,31 för att mäta kapaciteten hos antikroppar som riktar sig mot ytan av P. falciparum IEs att inducera opsonization och fagocytos av THP-1 celler. De resultat som presenteras här fokusera på naturligt förvärvade VAR2CSA-specifika antikroppar i plasma/serum av kvinnor som lever i en P. falciparum endemisk region. VAR2CSA är en typ av PfEMP1 som deltar i placenta kvarstad av IEs, och en viktig avgörande faktor i patogenesen vid PM.
Analysen kan användas för antikroppar som framkallas genom immunisering och/eller inriktning på andra PfEMP1-varianter eller något annat parasitantigen som finns på IE-ytan, förutsatt att den antikropp som testas interagerar med de mänskliga Fcγ-receptorerna uttryckta av THP-1-cellerna (CD32 och CD64). Analysen är enkel, hög genomströmning (möjliggör analys av stora provuppsättningar) och kan utföras på en dag. Phagocytosis mäts genom flödescytometri, kvantifiera andelen Av EtBr+ THP-1 celler efter 40 min co-inkubation med EtBr-märkt och antikropp-opsonized IEs.
Även om analysen ger konsekventa resultat över experimentella replikat, finns det variationer mellan de absoluta värden som mäts och, därför, rekommenderar vi att beräkna relativa värden med hjälp av en positiv kontroll som alltid måste inkluderas. Vi rekommenderar också att köra alla prover som ska testas i ett enda experiment, för att undvika inter-assay variation som diskuterats ovan. Vid testning av serumprover som samlats in från individer som exponerats för P. falciparum-infektion rekommenderar vi att alltid inkludera en uppsättning prover från naiva individer som ska användas som kontrollgrupp. Denna kontrollgrupp kan användas för att ställa in ett tröskelvärde för att avgöra vilka av dina testprover som ska anses vara positiva.
Vi har tidigare använt detta tillvägagångssätt för att jämföra fagocytos-inducerande kapacitet sera samlas in från barn med olika malaria kliniska presentationer (svår vs. mild)17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Maiken Visti tackas för utmärkt tekniskt bistånd. Detta arbete finansierades delvis genom ett bidrag (MAVARECA II; 17-02-KU) från Danmarks utrikesdepartement och administrerades av Danida Fellowship Centre. Finansiären hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller utarbetande av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well cell culture plates, round bottom with lid | Corning | 3799 | Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use |
| AlbuMAX-II | Gibco | 11021-037 | |
| AlbuMAX-II (5%) | - | - | 5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Anti-Red Blood Cells antibody | Abcam | ab34858 | Prepare 2μl aliquots and freeze a -20°C. Use one aliquot per experiment. |
| DPBS | Sigma | P8622 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10003D | |
| Ethidium bromide solution | Sigma | E1510 | Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light |
| FC500 flow cytometer | Beckman Coulter | Any flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used. | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099-141 | Heat inactivate before use. |
| FITC mouse anti-human CD16 | BD Biosciences | 555406 or 556618 | |
| FITC mouse anti-human CD32 | BD Biosciences | 552883 | |
| FITC mouse anti-human CD64 | BD Biosciences | 555527 | |
| FlowLogic software | Inivai technologies | Any flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist | |
| Gentamicin (10mg/mL) | Sigma | G1272 | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9377 | |
| L-glutamine (200mM) | Sigma | G7513 | |
| Lysing solution | - | - | 15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA |
| MACS CS-column and accesories | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | |
| Parasite culture medium | - | - | 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50µg/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL) | Sigma | P0781 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R5886 | |
| THP-1 culture medium | - | - | 10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Vario MACS magnet | Miltenyi Biotec |
References
- World Health Organization. World Malaria Report - 2018. World Health Organization. , (2018).
- Pierce, S. K., Miller, L. H. World Malaria Day 2009: What malaria knows about the immune system that immunologists still do not. Journal of Immunology. 182 (9), 5171-5177 (2009).
- Gamain, B., Smith, J. D., Viebig, N. K., Gysin, J., Scherf, A. Pregnancy-associated malaria: Parasite binding, natural immunity and vaccine development. International Journal for Parasitology. 37 (3-4), 273-283 (2007).
- Staalsoe, T., et al. Variant surface antigen-specific IgG and protection against clinical consequences of pregnancy-associated Plasmodium falciparum malaria. Lancet. 363 (9405), 283-289 (2004).
- Feng, G., et al. Antibodies to variant surface antigens of plasmodium falciparum -Infected erythrocytes are associated with protection from treatment failure and the development of anemia in pregnancy. The Journal of Infectious Diseases. 200 (2), 299-306 (2009).
- Teo, A., Feng, G., Brown, G. V., Beeson, J. G., Rogerson, S. J. Functional Antibodies and Protection against Blood-stage Malaria. Trends in Parasitology. 32 (11), 1-12 (2016).
- Aitken, E. H., Mahanty, S., Rogerson, S. J. Antibody effector functions in malaria and other parasitic diseases: a few needles and many haystacks. Immunology & Cell Biology. 98 (4), 264-275 (2020).
- Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. Opsonic activity of human immune serum on in vitro phagocytosis of Plasmodium falciparum infected red blood cells by monocytes. Clinical and Experimental Immunology. 47 (3), 635-644 (1982).
- Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. Phagocytosis of Plasmodium falciparum-Parasitized Erythrocytes by Human Polymorphonuclear Leukocytes. The Journal of Parasitology. 69 (1), 49-53 (1983).
- Jaworowski, A., et al. Relationship between human immunodeficiency virus type 1 coinfection, anemia, and levels and function of antibodies to variant surface antigens in pregnancy-associated malaria. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (3), 312-319 (2009).
- Ataíde, R., Mwapasa, V., Molyneux, M. E., Meshnick, S. R., Rogerson, S. J. Antibodies that induce phagocytosis of malaria infected erythrocytes: Effect of HIV infection and correlation with clinical outcomes. PLoS One. 6 (7), 22491 (2011).
- Ghumra, A., et al. Immunisation with recombinant PfEMP1 domains elicits functional rosette-inhibiting and phagocytosis-inducing antibodies to Plasmodium falciparum. PloS One. 6 (1), 0016414 (2011).
- Ghumra, A., et al. Induction of strain-transcending antibodies against Group A PfEMP1 surface antigens from virulent malaria parasites. PLoS Pathogens. 8 (4), 1002665 (2012).
- Chan, J. A., et al. Targets of antibodies against erythrocytes in malaria immunity. J Clin Invest. 122 (9), 3227-3238 (2012).
- Quintana, M. P., Angeletti, D., Moll, K., Chen, Q., Wahlgren, M. Phagocytosis inducing antibodies to Plasmodium falciparum upon immunization with a recombinant PfEMP1 NTS DBL1α domain. Malaria Journal. 1, 1-9 (2016).
- Chan, J. A., et al. A single point in protein trafficking by Plasmodium falciparum determines the expression of major antigens on the surface of infected erythrocytes targeted by human antibodies. Cellular and Molecular Life Sciences. 73, 4141-4158 (2016).
- Quintana, M. P., et al. Antibodies in children with malaria to PfEMP1, RIFIN and SURFIN expressed at the Plasmodium falciparum parasitized red blood cell surface. Scientific Reports. 8 (1), 3262 (2018).
- Hommel, M., et al. Evaluating antibody functional activity and strain-specificity of vaccine candidates for malaria in pregnancy using in vitro phagocytosis assays. Parasites & Vectors. 11 (69), 1-7 (2018).
- Ampomah, P., Stevenson, L., Ofori, M. F., Barfod, L., Hviid, L. B-cell responses to pregnancy-restricted and -unrestricted Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 antigens in Ghanaian women naturally exposed to malaria parasites. Infection and Immunity. 82 (5), 1860-1871 (2014).
- Cranmer, S. L., Magowan, C., Liang, J., Coppel, R. L., Cooke, B. M. An alternative to serum for cultivation of Plasmodium falciparum in vitro. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (3), 363-365 (1997).
- Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. Journal of Parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).
- Barfod, L., et al. Human pregnancy-associated malaria-specific B cells target polymorphic, conformational epitopes in VAR2CSA. Molecular Microbiology. 63 (2), 335-347 (2007).
- Staalsoe, T., et al. In vitro selection of Plasmodium falciparum 3D7 for expression of variant surface antigens associated with severe malaria in African children. Parasite Immunology. 25 (8-9), 421-427 (2003).
- Chan, S., et al. Regulation of PfEMP1-VAR2CSA translation by a Plasmodium translation-enhancing factor. Nature Microbiology. 2, 17068 (2017).
- Barfod, L., et al. Evasion of immunity to Plasmodium falciparum malaria by IgM masking of protective IgG epitopes in infected erythrocyte surface-exposed PfEMP1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12485-12490 (2011).
- Moll, K., Kaneko, A., Scherf, A., Wahlgren, M. Methods in Malaria Research. , MR4/ATCC. Manassas, Virginia. (2013).
- WHO. Basic malaria microscopy. Part I. Learner's Guide. World Health Organization. , (1991).
- Tsuchiya, S. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). International Journal of Cancer. Journal International Du Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Fleit, H. B., Kobasiuk, C. D. The human monocyte-like cell line THP-1 expresses FcyRl and Fc'yRIl. Journal of Leukocyte Biology. 49, 556-565 (1991).
- Auwerx, J., Staels, B., Van Vaeck, F., Ceuppens, J. L. Changes in IgG Fc receptor expression induced by phorbol 12-myristate 13-acetate treatment of THP-1 monocytic leukemia cells. Leukemia research. 16 (3), 317-327 (1992).
- Ataíde, R., et al. Using an improved phagocytosis assay to evaluate the effect of HIV on specific antibodies to pregnancy-associated malaria. PloS One. 5 (5), 10807 (2010).
