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Immunology and Infection

एक फ्लो साइटोमेट्री-आधारित परख द्वारा प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम परजीवी के लिए स्वाभाविक रूप से अधिग्रहीत फागोसाइटोसिस-इंड्यूरिंग एंटीबॉडी को मापने

Published: August 6, 2020 doi: 10.3791/61538
Automatic Translation
1, 1,2,3, 1,4
1Centre for Medical Parasitology, Department of Immunology and Microbiology, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2West African Centre for Cell Biology of Infectious Pathogens, Department of Biochemistry, Cell and Molecular Biology, University of Ghana, 3Department of Immunology, Noguchi Memorial Institute for Medical Research, 4Centre for Medical Parasitology, Department of Infectious Diseases, Rigshospitalet

Summary

इस प्रोटोकॉल का समग्र लक्ष्य यह है कि व्यक्तियों के सेरा या प्लाज्मा में मौजूद एंटीबॉडी की क्षमता को मापने के तरीके पर निर्देश प्रदान किया जाए, स्वाभाविक रूप से प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम संक्रमण के संपर्क में, परजीवी संक्रमित एरिथ्रोसाइट्स (आईईएस) के फागोसिटोसिस को उजागर करने के लिए।

Abstract

प्रोटोकॉल का वर्णन करता है कि वीएआर2सीएसए के लिए विशिष्ट स्वाभाविक रूप से अधिग्रहीत आईजीजी एंटीबॉडी द्वारा अनुमानित प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम-संक्रमितएरिथ्रोसाइट्स (आईईएस) के प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित फैगोसाइटोसिस परख को कैसे स्थापित किया जाए और चलाया जाए। VAR2CSA परजीवी एंटीजन है जो प्लेसेंटा में आईईएस के चयनात्मक ज़ब्ती का मध्यस्थता करता है जो गर्भवती महिलाओं में मलेरिया के गंभीर रूप का कारण बन सकता है, जिसे अपरा मलेरिया (पीएम) कहा जाता है। प्रधानमंत्री से सुरक्षा VAR2CSA-विशिष्ट एंटीबॉडी द्वारा मध्यस्थता की जाती है जो अपरा ज़ब्ती को रोककर कार्य करने के लिए माना जाता है और/या phagocytosis के लिए iEs opsonizing द्वारा । परख देर से मंच सिंक्रोनाइज्ड आईईएस को रोजगार देती है जिसे वीआर2सीएसए, प्लाज्मा/सीरम-एंटीबॉडी को स्वाभाविक रूप से अधिग्रहीत पीएम-विशिष्ट प्रतिरक्षा और फैगोसाइटिक सेल लाइन टीएचपी-1 के साथ महिलाओं से व्यक्त करने के लिए विट्रो में चुना गया है । हालांकि, प्रोटोकॉल को आसानी से आईई सतह पर मौजूद किसी भी परजीवी एंटीजन के लिए एंटीबॉडी की कार्यक्षमता को परखने के लिए संशोधित किया जा सकता है, चाहे वह प्राकृतिक जोखिम से प्रेरित हो या टीकाकरण द्वारा। परख मलेरिया में एंटीबॉडी-मध्यस्थता प्रतिरक्षा के एक महत्वपूर्ण कार्यात्मक पहलू के अच्छे प्रजनन क्षमता के साथ सरल और उच्च थ्रूपुट मूल्यांकन प्रदान करती है। इसलिए, यह उपयोगी है जब पी फाल्सीपेरम मलेरिया के लिए नैदानिक प्रतिरक्षा का मूल्यांकन, विशेष रूप से उप सहारा अफ्रीका में उष्णकटिबंधीय में रुग्णता और मृत्यु दर का एक प्रमुख कारण है ।

Introduction

मलेरिया एक वेक्टर जनित रोग है जो मनुष्यों में प्लाज्मोडियमजीनस की पांच विभिन्न प्रजातियों के साथ संक्रमण पर होता है । सबसे प्रचलित प्रजाति पी फाल्सीपेरमहै , जो सबसे अधिक रुग्णता और मृत्यु दर के लिए भी जिम्मेदार है1. मलेरिया नैदानिक प्रस्तुति स्पर्शोन्मुख या सौम्य संक्रमण से जटिल/गंभीर बीमारी के लिए बदलता है, बाद में ज्यादातर पांच साल से कम आयु के बच्चों में होने वाली । पी फाल्सीपेरम के संपर्क में आने से बाँझ प्रतिरक्षा पैदा नहीं होती है, लेकिन स्थानिक क्षेत्रों में रहने वाले व्यक्ति धीरे-धीरे नैदानिक रोग के खिलाफ प्रतिरक्षा विकसित करते हैं। संरक्षण आयु/जोखिम निर्भर है और प्रतिरक्षा आम तौर पर जीवन के पहले 5-10 वर्षों के दौरान प्राप्त की है2। वयस्क महिलाएं एक महत्वपूर्ण अपवाद हैं, क्योंकि गर्भावस्था के दौरान एक नैदानिक प्रस्तुति में गंभीर मलेरिया हो सकता है जिसे अपरा मलेरिया (पीएम) के रूप में जाना जाता है। पीएम गर्भपात, प्रसव, समय से पहले प्रसव, जन्म के समय में कम वजन, भ्रूण मृत्यु और मातृ एनीमिया का एक महत्वपूर्ण कारण है। प्रधानमंत्री के प्रति प्रतिरोध लगातार गर्भधारण पर विकसित3. प्रधानमंत्री से सुरक्षा VAR2CSA-प्रकार PfEMP14,,5,एक संक्रमित एरिथ्रोसाइट (आईई) सतह एंटीजन के खिलाफ एंटीबॉडी के अधिग्रहण से जुड़ी हुई है जो कोनड्रोइटिन सल्फेट ए (सीएसए) को बांधती है जो प्लेसेंटा में आईई ज़ब्ती को सक्षम करती है। एंटीबॉडी विभिन्न कार्यात्मक गतिविधियों(6,,7में समीक्षा) प्रदर्शन करने वाले सुरक्षा में मध्यस्थता करते हैं, जिसमें फागोसाइटोसिस को प्रेरित करने के लिए आईईएस का opsonization शामिल है। शुरुआती विट्रो अध्ययनों से पता चला है कि एंटीबॉडी फागोसाइटोसिस 8,9के माध्यम से मोनोसाइट्स की उपस्थिति में पी फाल्सीपेरम वृद्धि को सीमित करसकतेहैं। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि फागोसिटोसिस-उत्प्रेरण एंटीबॉडी के उच्च स्तर बेहतर गर्भावस्था परिणामों (एचआईवी सह-संक्रमण के संदर्भ में)10, 11,से जुड़ेहोतेहैं, जो स्वाभाविक रूप से अधिग्रहीत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में इस प्रभावक कार्य की प्रासंगिकता को दर्शाता है।

यहां हम मानव प्लाज्मा/सीरम में मौजूद एंटीबॉडी के इस कार्य को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, इन विट्रो सुसंस्कृत आईईएस का उपयोग करके मोनोसाइट लाइन टीएचपी-1 के साथ VAR2CSA व्यक्त करते हैं । परख का उपयोग पहले,11, 12,,13,,14, 15,13,16,,17,,,18किया गया है और इसे पहले के माइक्रोस्कोप-आधारित प्रोटोकॉल8की तुलना में एक बेहतर और आसान दृष्टिकोण माना जाता है, क्योंकि यह एंटीबॉडी की छोटी मात्रा का उपयोग करके एक ही रन में बड़ी संख्या में एंटीबॉडी नमूनों के परीक्षण की अनुमति देता है और थकाऊ पूर्वाग्रह और सूक्ष्मकॉपी गणना से बचता है।18 हालांकि परख कई प्रयोगशालाओं द्वारा इस्तेमाल किया गया है और इसके निष्पादन काफी सरल है, यह सावधान योजना और तैयारी की आवश्यकता है, इसलिए, एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रयोगशालाओं और पिछले अनुभव की कमी शोधकर्ताओं द्वारा अपने आवेदन की अनुमति होगी । हम एक उदाहरण के रूप में, देर से चरण-सिंक्रोनाइज्ड आईईएस का उपयोग करते हैं, जो स्वाभाविक रूप से अधिग्रहीत पीएम-विशिष्ट प्रतिरक्षा के साथ महिलाओं से एकत्र सीरम में मौजूद एंटीबॉडी के साथ OPsonized VAR2CSA व्यक्त करते हैं । हालांकि, प्रोटोकॉल को आसानी से आईई सतह पर मौजूद किसी भी परजीवी एंटीजन के लिए एंटीबॉडी की कार्यक्षमता को परखने के लिए संशोधित किया जा सकता है, चाहे वह प्राकृतिक जोखिम से प्रेरित हो या टीकाकरण द्वारा।

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Protocol

यहां प्रस्तुत परिणामों के लिए उपयोग किए जाने वाले मानव सीरम के नमूने एक अलगअध्ययनमें एकत्र किए गए थे । संग्रह को नोगुची मेमोरियल इंस्टीट्यूट फॉर मेडिकल रिसर्च, घाना विश्वविद्यालय (अध्ययन 038/10-11) और क्षेत्रीय अनुसंधान आचार समितियों, डेनमार्क के राजधानी क्षेत्र (प्रोटोकॉल एच-4-2013-083) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. परजीवी संस्कृति

नोट: मानव रोगजनकों से निपटने के लिए स्थानीय नियमों का पालन करें ।

  1. परजीवी संस्कृति माध्यम (सामग्रीकी तालिका देखें) में20 से पहले वर्णित मानक प्रोटोकॉल के अनुसार पी फाल्सीपेरम परजीवी बनाए रखें।
  2. पहलेवर्णितसोर्बिटोल उपचार का उपयोग करके परजीवी को कसकर सिंक्रोनाइज्ड रखें ।
  3. IE की सतह पर VAR2CSA अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए, एक विरोधी VAR2CSA एंटीबॉडी (जैसे, PAM1.4 एंटीबॉडी, एक क्रॉस-प्रतिक्रियाशील मानव मोनोक्लोनल VAR2CSA-विशिष्ट आईजीजी22)का उपयोग करके प्रतिरक्षा-चुंबकीय चयन के दोहराया दौर प्रदर्शन 23 प्रोटीन जी-चुंबकीय मोती23के साथ मिलकर ।
    1. संक्षेप में, चुंबकीय मोतियों के साथ देर से चरण ट्रोफोजोइट-आईईएस को एक एंटी-VAR2CSA एंटीबॉडी के साथ मिलकर और चुंबक का उपयोग करके सकारात्मक रूप से चुनें।
    2. कुछ चक्रों के लिए संस्कृति में चयनित परजीवी का विस्तार करें जब तक कि परजीवी कम से कम 5% न हो जाए।
    3. वैकल्पिक रूप से, परजीवी का चयन करें जो प्लास्टिक-स्थिर सीएसए (VAR2CSA के लिए रिसेप्टर) से बांधते हैं जैसा कि पहले24वर्णित है।
  4. चयनित परजीवी पर VAR2CSA अभिव्यक्ति को सत्यापित करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री प्रदर्शन के रूप में पहले25वर्णित है ।
    1. संक्षेप में, चुंबकीय चयन (चरण 1.3) के लिए उपयोग किए जाने वाले एक ही एंटीबॉडी के साथ देर से चरण के ट्रोफोजोइट-आईईएस को लेबल करें जिसके बाद फ्लोरोसेंटली लेबल द्वितीयक एंटीबॉडी है।
    2. प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा आईई सतह प्रतिक्रियाशीलता को मापें। सफल एंटीबॉडी चयन आम तौर पर परजीवी आबादी में परिणाम देता है जो अधिकांश परजीवी (≈80%) में VAR2CSA व्यक्त करता है।
  5. फैगोसाइटोसिस परख के लिए, शुद्ध मध्य से देर से चरण ट्रोफोजोइट-आईईएस का उपयोग करें। चुंबकीय पृथक्करण का उपयोग करके शुद्धि करें जैसा कि पहले26वर्णित है ।
    नोट: परजीवी के चरण को सही ढंग से निर्धारित करने के लिए, हल्के माइक्रोस्कोपी अवलोकन के बाद रक्त स्मीयरों पर गिमसा धुंधला करें। 27से पहले वर्णित मानक प्रक्रियाओं और रूपात्मक दिशा - निर्देशों का पालन करें । घनत्व ढाल माध्यम का उपयोग करके देर से चरण शुद्धि भी की जा सकती है। हालांकि, हमारे अनुभव में आईई यील्ड कम है और इसलिए चुंबकीय शुद्धि बेहतर है ।
    1. चुंबकीय पृथक्करण के लिए, परजीवी संस्कृति (5-10% परजीवी) को कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर स्पिन करें। सुपरनेट को हटा दें और परजीवी संस्कृति माध्यम के 10 एमएल में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें।
    2. परजीवी निलंबन को एक चुंबक (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ मिलकर सीएस-कॉलम में जोड़ें और इसे धीरे-धीरे कॉलम से गुजरने दें। ट्रोफोजोइट-आईईएस पैरामैग्नेटिक (हीमोज़ोइन की उपस्थिति के कारण) हैं और कॉलम जाल में रहेंगे।
    3. परजीवी संस्कृति माध्यम के 50 एमएल के साथ कॉलम को धोएं और परजीवी संस्कृति माध्यम के 50 एमएल का उपयोग करके चुंबकीय स्तंभ से आईईएस को एल्यूट करें।
  6. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर 1.5.3 से एलुएट स्पिन करें। परजीवी संस्कृति माध्यम के 1 मिलीएल में सुपरनेट को सावधानीपूर्वक त्यागें और फिर से निलंबित करें।
  7. हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके, अंतिम परजीवी (आईईएस का प्रतिशत) की गणना करने के लिए आईईएस (आसानी से अंधेरे हीमोजोइन वर्णक के साथ एरिथ्रोसाइट्स के रूप में प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा पहचाने जाने वाले) की संख्या और कुल सेल संख्या की गणना करें।
    नोट: केवल कम से कम 80% शुद्धता (80% आईई) के साथ परजीवी का उपयोग करें।
  8. परीक्षण के लिए नियोजित सीरम/एंटीबॉडी नमूनों की संख्या के आधार पर, आवश्यक आईईएस की कुल राशि का अनुमान लगाएं और तदनुसार परजीवी संस्कृतियों को बढ़ाएं । 5% हेमेटोक्रिट और 5-10% परजीवी पर संस्कृति के 25 एमएल के साथ 75 सेमी2 संस्कृति फ्लास्क को पूर्ण 96 अच्छी प्लेट चलाने के लिए पर्याप्त आईईएस उत्पीड़ित करना चाहिए। एक पूर्ण प्लेट (डुप्लीकेट में 42 नमूनों के अलावा 6 नियंत्रण) के लिए, 3.3 x 10 7 आईईएस/एमएल पर न्यूनतम1.5 एमएल परजीवी निलंबन की आवश्यकता होती है।

2. टीएचपी-1 कोशिकाएं

नोट: इस परख में टीएचपी-1 सेल लाइन का उपयोग किया जाता है। यह मोनोसाइट सेल लाइन मोनोसाइट ल्यूकेमिया28 वाले रोगी से ली गई है और इसे एटीसीसी से खरीदा जा सकता है। THP-1 संस्कृति माध्यम में प्रदाता के निर्देशों के अनुसार सेल लाइन बनाए रखें (सामग्री की तालिकादेखें)।

  1. नियमित रखरखाव के लिए, 2-4 x 105 कोशिकाओं/एमएल और उपसंस्कृति पर टीएचपी-1 सेल कल्चर शुरू करें जब सेल एकाग्रता 8 x 105 कोशिकाओं/एमएल तक पहुंच जाए ।
    नोट: कोशिका एकाग्रता को 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल से अधिक न होने दें और मार्ग संख्या का ट्रैक रखें । 25 मार्ग से परे हैं कि कोशिकाओं के उपयोग से बचें। टीएचपी-1 सेल लाइन का औसत दोहरीकरण समय 19-50 घंटे के बीच होता है। फैगोसाइटोसिस प्रयोग शुरू करने से पहले सेल बैच के दोगुना समय निर्धारित करें। यह लगभग सीरम नमूनों की एक निर्धारित संख्या के लिए आवश्यक संस्कृति का अनुमान लगाने में मदद करेगा परीक्षण किया जाना है (उदाहरण के लिए, एक पूर्ण ९६ अच्छी तरह से थाली के लिए, 5 x 105 कोशिकाओं/एमएल पर संस्कृति के 10 एमएल की जरूरत है) ।
  2. समय-समय पर Fcγ रिसेप्टर्स I (CD64), II (CD32) और III (CD16) की सतह अभिव्यक्ति के लिए टीएचपी-1 कोशिकाओं की जांच करें जैसा कि पहले15वर्णित है।
    1. संक्षेप में, टीएचपी-1 कोशिकाओं (अलग से) के साथ एंटी-सीडी 64, एंटी-सीडी 32 और एंटी-सीडी 16 फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबॉडी(सामग्री की तालिका)कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए (पीबीएस में 2% एफबीएस में तैयार 1:100 कमजोर पड़ने) ।
    2. पीबीएस में 2% एफबीएस के साथ तीन बार धोएं और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा सतह धुंधला उपाय।
      नोट: THP-1 कोशिकाओं CD16 के लिए नकारात्मक और CD32 और CD64 के लिए सकारात्मक के रूप में पहले29,,30 (चित्रा 1)की सूचना दी है ।
  3. फागोसिटोसिस परख के लिए, परख के दिन लगभग 5 x 10 5 कोशिकाओं/एमएल उपज के लिए प्रयोग से पहले दिन२.५ x 105 कोशिकाओं/एमएल के साथ एक THP-1 सेल संस्कृति फ्लास्क की स्थापना की ।
    नोट: सुनिश्चित करें 4-6 x10 5 कोशिकाओं/एमएल परख के दिन मौजूद हैं ।

3. फागोसाइटोसिस परख (चित्रा S1)

  1. परख शुरू करने से पहले, ब्लॉक (>1 h) दो गोल-नीचे 96 अच्छी प्लेटें (एक opsonization के लिए और एक और phagocytosis के लिए) PBS में बाँझ 2% FBS के 150 माइक्रोल प्रति अच्छी तरह का उपयोग कर.
    नोट: प्लेट 1 को ओपसोनाइजेशन प्लेट के रूप में लेबल करें और इसे एथिडियम ब्रोमाइड (ईटीबी) धुंधला और ओपसोनाइजेशन दोनों के लिए उपयोग करें। लेबल प्लेट 2 फागोसिटोसिस प्लेट के रूप में और टीएचपी-1 सेल प्लेटिंग के लिए और फागोसिटोसिस चरण के लिए दोनों का उपयोग करें।
  2. परजीवी धुंधला और opsonization
    1. 1.6 में तैयार आईई निलंबन लें और 0.1 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक से 2.5 माइक्रोग्राम/एमएल (1:40 कमजोर पड़ने) की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए परजीवी संस्कृति माध्यम और इट्बर जोड़कर सेल काउंट को 3.3 x 107 आईईएस/एमएल में समायोजित करें।
      नोट: EtBr परजीवी डीएनए दाग, प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा पता लगाने की अनुमति ।
      सावधानी: EtBr एक म्यूटेन और त्वचा, आंख, और श्वसन परेशान है। उचित सुरक्षा का उपयोग करें और स्थानीय नियमों के अनुसार कचरे का निपटान करें।
    2. 96 अच्छी प्लेटों (opsonization प्लेट) में से एक से अवरुद्ध समाधान निकालें, प्लेट को फ़्लिक कर रहे हैं और तौलिया कागज के एक टुकड़े पर तरल अतिरिक्त को हटा दें।
    3. प्लेट के ऊपरी आधे हिस्से में ऊपर तैयार आईई निलंबन के प्रति कुएं में 30 μL जोड़ें। एक अच्छी तरह से खाली छोड़ दें और परजीवी संस्कृति माध्यम के 30 माइक्रोन जोड़ें (टीएचपी-1 अकेले नियंत्रण के लिए आईई के बिना)। (चित्रा S2A)। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट और प्रकाश से संरक्षित।
    4. परजीवी संस्कृति माध्यम के प्रति अच्छी तरह से 170 μL जोड़ें। कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर प्लेट स्पिन करें और एक उपयुक्त अपशिष्ट कंटेनर पर प्लेट को फ्लिकिंग करके सुपरनैंट को हटा दें।
    5. कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर प्लेट कताई परजीवी संस्कृति माध्यम के 200 माइक्रोन प्रति अच्छी तरह से उपयोग करके ईटीबीआर-लेबल वाले आईईएस को दो बार धोएं। पहले वॉश से सुपरनिटेंट को प्लेट को फ्लिक करके हटाया जा सकता है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि वाशिंग माध्यम की पूरी मात्रा हटा दी गई है, एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके दूसरे वॉश से सुपरनेट को ध्यान से हटा दें। गोली को परेशान न करें।
    6. परजीवी संस्कृति माध्यम में वांछित सांद्रता पर तैयार एंटीबॉडी/प्लाज्मा/सीरम समाधान के 30 माइक्रोन में EtBr लेबल IEs को फिर से निलंबित करें ।
    7. हमेशा निम्नलिखित नियंत्रण(चित्रा S2B):आईईएस/टीएचपी-1 कोशिका नियंत्रण (परजीवी संस्कृति माध्यम) के बिना एक नियंत्रण शामिल करें; किसी भी एंटीबॉडी या प्लाज्मा/सीरम (अन-ओपोनाइज्ड कंट्रोल) के बिना एक नियंत्रण; 1:100 कमजोर पड़ने पर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध खरगोश विरोधी मानव एरिथ्रोसाइट एंटीबॉडी का उपयोग करके एक सकारात्मक नियंत्रण (सामग्री की तालिकादेखें); 1:5 कमजोर पड़ने पर दो नकारात्मक प्लाज्मा/सीरम नियंत्रण (एक मलेरिया-भोले पूल और मलेरिया से उजागर पुरुषों से एक पूल); और 1:5 कमजोर पड़ने पर एक सकारात्मक सीरम नियंत्रण (मलेरिया से उजागर महिलाओं से एक पूल, जो पहले गर्भवती (अधिमानतः मल्टीग्रैविटी)) रही हैं।
      नोट: सकारात्मक नियंत्रण के लिए 1:100 कमजोर पड़ने से खरीदे गए एंटीबॉडी (डेटा नहीं दिखाए गए) के विभिन्न बैचों में लगातार काम करने लगता है। हालांकि, हर बार एंटीबॉडी के नए बैच का उपयोग किए जाने पर कई कमजोर पड़ने का परीक्षण करके बैचों के बीच विविधताओं को समाप्त करने की सिफारिश की जाती है।
    8. 37 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 45 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  3. THP-1 कोशिकाओं की तैयारी और फैगोसाइटोसिस
    1. जबकि IEs (३.२.८) opsonized किया जा रहा है, THP-1 कोशिकाओं की तैयारी शुरू करते हैं ।
    2. संस्कृति फ्लास्क से टीएचपी-1 कोशिकाओं को हटाएं, उन्हें नीचे स्पिन करें (कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम), सुपरनैंट को डिकंट करें और टीएचपी-1 सेल कल्चर माध्यम में गोली को फिर से निलंबित करें।
    3. फिर से स्पिन करें (कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम), सुपरनैंट को डिकंट करें और टीएचपी-1 सेल कल्चर माध्यम के 1 एमएल में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें।
    4. ऊपर तैयार समाधान में सेल गिनती निर्धारित करें और 5 x 105 कोशिकाओं/एमएल की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए अधिक माध्यम जोड़ें।
    5. प्लेट को फ्लिक करके और तौलिया कागज के एक टुकड़े पर तरल अतिरिक्त को हटाकर शेष 96 वेल प्लेट (फैगोसाइटोसिस प्लेट) से अवरुद्ध समाधान निकालें।
    6. 3.3.4 में तैयार टीएचपी-1 सेल सस्पेंशन के प्रति कुएं में 100 माइक्रोल जोड़ें और सेल कल्चर इनक्यूबेटर(चित्रा S2C)में वापस डाल दें।
    7. एक बार एंटीबॉडी/प्लाज्मा/सीरम इनक्यूबेशन समय समाप्त हो गया है, परजीवी संस्कृति माध्यम के अच्छी तरह से प्रति १७० μL जोड़ें । कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर प्लेट स्पिन करें और एक उपयुक्त अपशिष्ट कंटेनर पर प्लेट को फ्लिकिंग करके सुपरनैंट को हटा दें।
    8. परजीवी संस्कृति माध्यम के प्रति कुएं 200 माइक्रोन का उपयोग करके ओपोनाइज्ड आईईएस को दो बार धोएं, कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर प्लेट कताई करें। पहले वॉश से सुपरनिटेंट को प्लेट को फ्लिक करके हटाया जा सकता है। दूसरे वॉश से सुपरनेट को ध्यान से हटा दें, मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके यह सुनिश्चित करने के लिए कि वाशिंग माध्यम की पूरी मात्रा हटा दी गई है। गोली को परेशान न करें।
    9. अंत में पूर्व गर्म THP-1 सेल संस्कृति माध्यम के १०० μL में opsonized IEs फिर से निलंबित । फागोसिटोसिस प्लेट में प्रत्येक कुएं में opsonized IE निलंबन के 50 μL स्थानांतरित करें। चूंकि आईईएस की कुल 100 माइक्रोन है, इसलिए प्रत्येक एंटीबॉडी/सीरम कमजोर पड़ने को फागोसिटोसिस प्लेट(चित्रा S2D)में डुप्लिकेट में चलाया जा सकता है।
      नोट: परख में उपयोग किए जाने वाले आईईएस और टीएचपी-1 कोशिकाओं की मात्रा 10:1 अनुपात के अनुरूप है।
    10. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर अंधेरे में 40 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
      नोट: फैगोसाइटोसिस को 40 मिनट से अधिक समय तक आगे बढ़ने की अनुमति न दें।
    11. 4 डिग्री सेल्सियस (500 x g,5 मिनट) पर अपकेंद्रित्र द्वारा फागोसिटोसिस बंद करो और प्लेट को फ्लिक करके सुपरनॉट को त्याग दें। कमरे के 150 माइक्रोन जोड़ें-तापमान अमोनियम क्लोराइड lysing समाधान(सामग्री की मेज)और पाइपिंग द्वारा मिश्रण, ठीक 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
      नोट: यह कदम उन एरिथ्रोसाइट्स को lyse करेगा जिन्हें टीएचपी-1 कोशिकाओं द्वारा phagocytosed नहीं किया गया है।
    12. पीबीएस में 100 माइक्रोन आइस-कोल्ड 2% एफबीएस जोड़कर लाइसिस बंद करें। प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस (3 मिनट के लिए 500 x ग्राम) पर स्पिन करें और एक उपयुक्त अपशिष्ट कंटेनर पर प्लेट को फ्लिकिंग करके सुपरनैंट को हटा दें।
    13. पीबीएस में 200 माइक्रोन प्रति अच्छी तरह से 4 डिग्री सेल्सियस (3 मिनट के लिए 500 x ग्राम) पर प्लेट कताई का उपयोग करके तीन बार धोएं। अंतिम धोने के बाद, पीबीएस में बर्फ-ठंड 2% एफबीएस के 200 माइक्रोन में फिर से निलंबित करें और तुरंत प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण करें।
      नोट: पिछले प्रकाशनों ने साइटोमेट्री31प्रवाह से पहले 2% पैराफॉर्मल्डिहाइड में सेल निर्धारण का उपयोग किया है, लेकिन यहां प्रस्तुत परिणाम परख पूरा होने के तुरंत बाद प्राप्त किए गए थे। 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को संग्रहीत करके प्रवाह साइटोमेट्री डेटा अधिग्रहण को स्थगित करने की सिफारिश नहीं की जाती है, क्योंकि ईटीबी+ टीएचपी-1 कोशिकाओं का प्रतिशत तेजी से क्षय होता है(चित्रा S3)।
  4. फ्लो साइटोमेट्री अधिग्रहण और विश्लेषण
    नोट: किसी भी प्रवाह साइटोमीटर ९६ अच्छी तरह से थाली प्रारूप का समर्थन और उपयुक्त पराबैंगनीकिरण होने/
    1. अधिग्रहण के लिए, एक रैखिक फॉरवर्ड-स्कैटर (एफएससी) बनाम रैखिक साइड-स्कैटर (एसएससी) कुएं का उपयोग करके भूखंड का उपयोग करके टीएचपी-1 कोशिकाओं पर गेट कोई आईईएस(चित्रा 2A)नहीं जोड़ा गया था और इस गेट पर 10,000 घटनाओं का अधिग्रहण किया गया था।
    2. एक हिस्टोग्राम प्लॉट का उपयोग करके टीएचपी-1 गेट पर ईटीबीआर (FL3-लॉग) के लिए फ्लोरेसेंस तीव्रता को मापें।
    3. गेटिंग के लिए, एफएससी बनाम एसएससी घनत्व भूखंड में टीएचपी-1 कोशिकाओं पर पहला गेट, कुओं का उपयोग करके कोई आईईएस(चित्रा 2 ए)नहीं जोड़ा गया था। फिर THP-1 कोशिकाओं (कोई आईईएस जोड़ा) और संयुक्त राष्ट्र-opsonized नियंत्रण(चित्रा 2B)का उपयोग कर, एक FL3 (EtBr) हिस्टोग्राम में एक सकारात्मक गेट स्थापित करें।
    4. एक ही प्लेट में परीक्षण किए गए अन्य सभी नमूनों में इन गेटों की प्रतिलिपि बनाएं और ईटीबीआर-पॉजिटिव टीएचपी-1 कोशिकाओं (टीएचपी-1 कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित करें जिन्होंने कम से कम एक आईई) को फगोसाइट किया है। परीक्षण किए गए प्रत्येक नमूने के लिए, फागोसिटोसिस को+ पूर्ण मूल्यों (ईटीबी + टीएचपी-1 कोशिकाओं का प्रतिशत) या अधिकतम के रूप में सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग करके प्रतिशत के रूप में गणना किए गए सापेक्ष फागोसिटोसिस के रूप में सूचित किया जा सकता है।

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Representative Results

यहां हम विस्तार से एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसे पहले15,14,13,31 वर्णित किया गया है और टीएचपी-1 कोशिकाओं द्वारा ओपोनाइजेशन और फैगोसाइटोसिस को प्रेरित करने के लिए11, पी फाल्सीपेरम आईईएस की सतह को लक्षित करने के लिए,11, 12, 13, 14, 16, 17,,18 का उपयोग किया गया है।16,12

परख विशेष रूप से एंटीबॉडी-मध्यस्थता फैगोसाइटोसिस को मापता है और इसलिए, टीएचपी-1 कोशिकाओं की सतह पर उपयुक्त एफसी-रिसेप्टर्स के साथ बातचीत की आवश्यकता होती है। इस कारण से, और जैसा कि प्रोटोकॉल में उल्लेख किया गया है, हम समय-समय पर प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा टीएचपी-1 कोशिकाओं की सतह पर Fcγ-रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति की जांच करने की सलाह देते हैं। कोशिकाओं CD16(चित्रा 1A)के लिए नकारात्मक और CD32 और CD64(चित्रा 1बी, सी)के लिए सकारात्मक होना चाहिए ।

परख के लिए, शुद्ध देर चरण IEs EtBr के साथ लेबल और फिर प्लाज्मा में मौजूद एंटीबॉडी के साथ opsonized/मलेरिया के सीरम-भोली या मलेरिया से उजागर व्यक्तियों । फागोसिटोटोसिस को फ्लो साइटोमेट्री द्वारा मापा गया था, जोईटीबीआर-लेबल और एंटीबॉडी-ओपोनाइज्ड आईईएस के साथ 40 मिनट के सह-इनक्यूबेशन के बाद ईटीबी + टीएचपी-1 कोशिकाओं के प्रतिशत की मात्रा निर्धारित करता था। प्रारंभ में, टीएचपी-1 कोशिकाओं को एफएससी बनाम एसएससी घनत्व भूखंड(चित्रा 2 ए)का उपयोग करके गेट किया गया था। फिर, एक EtBr+ मार्कर बनाया गया था, THP-1 कोशिकाओं और संयुक्त राष्ट्र के opsonized IEs(चित्रा 2B)पर एक FL3 हिस्टोग्राम का उपयोग कर । इसके बाद इन गेटों का इस्तेमाल अन्य सभी नियंत्रणों का विश्लेषण करने और नमूनों का परीक्षण करने के लिए किया गया ।

नकारात्मक नियंत्रण (अकेले THP-1 कोशिकाओं सहित, संयुक्त राष्ट्र opsonized IE नियंत्रण, और मलेरिया के साथ नियंत्रण-भोले और मलेरिया उजागर पुरुषों) सभी FL3 चैनल में एक नकारात्मक चोटी उत्पन्न करना चाहिए(चित्रा 3A)ETBr+ मार्कर में केवल कुछ घटनाओं के साथ । तदनुसार, मतलब फैगोसाइटोसिस दोनों पूर्ण ईटीबी+ टीएचपी-1 कोशिकाओं के रूप में और सापेक्ष फैगोसाइटोसिस प्रतिशत के रूप में बहुत कम होना चाहिए(चित्र 3बी, सी,सामान्य रूप से सभी मामलों के लिए 2% से कम)। इसके विपरीत, सकारात्मक नियंत्रण (खरगोश विरोधी मानव एरिथ्रोसाइट एंटीबॉडी और मलेरिया से उजागर महिला पूल सहित) दो चोटियों(चित्रा 3A)के साथ निशान उत्पन्न करना चाहिए: एक नकारात्मक एक (मोटे तौर पर सभी नकारात्मक नियंत्रणों द्वारा उत्पन्न एक के साथ ओवरलैपिंग) और एक स्पष्ट रूप से सकारात्मक और अच्छी तरह से अलग एक EtBr मार्करके अंदर स्थित + । एक सकारात्मक नमूना, प्रस्तुत उदाहरण के रूप में (मलेरिया से उजागर मल्टीग्रैविड महिला/NF20 से नमूना) सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक समान प्रोफ़ाइल उत्पन्न करना चाहिए । मतलब phagocytosis मूल्यों, निरपेक्ष EtBr+ THP-1 कोशिकाओं के रूप में मापा और रिश्तेदार phagocytosis के रूप में, आम तौर पर सकारात्मक नियंत्रण के लिए सबसे अधिक थे (58%/100%), मलेरिया उजागर महिला पूल (29%/53%), और फिर एकल मलेरिया उजागर महिला (23%/40%) जैसा कि चित्र 3बी, सीमें देखा गया है, जहां तीन स्वतंत्र प्रयोग प्रस्तुत किए जाते हैं, प्रयोगों के बीच काफी परिवर्तनशीलता थी और इसलिए हम एक ही प्रयोग में तुलना के लिए उद्देश्य वाले नमूनों को चलाने की सलाह देते हैं। हमारे हाथों में, कम से कम चार पूर्ण 96 अच्छी तरह से प्लेटों को एक अनुभवी शोधकर्ता द्वारा संभाला जा सकता है। परख के बीच परिवर्तनशीलता भी स्पष्ट रूप से देखा गया था जब मलेरिया से उजागर महिलाओं से कई सीरम नमूनों का परीक्षण दो समान प्रयोगों को एक साथ किया गया । एक ही परजीवी तैयारी (देर से चरण IEs के चुंबकीय शुद्धिकरण के बाद) और सीरम कमजोर पड़ने का उपयोग किया गया था। THP-1 कोशिकाओं को दो अलग फ्लास्क में रखा गया था, लेकिन एक ही प्रारंभिक फ्लास्क से वरीयता प्राप्त है और प्रयोगों दो अलग शोधकर्ताओं द्वारा प्रदर्शन किया गया । यद्यपि परख अलग-अलग प्रदर्शन करने पर लगातार परिणाम उत्पन्न करने लगती है, तंग रैखिक सहसंबंधों (पूर्ण और सापेक्ष फैगोसाइटोसिस मूल्यों दोनों के लिए आरएंडजी;0.9) के साथ दो प्रयोगों में मापा जाता है, समायोजित लाइनों का ढलान गुणांक एक से भटक जाता है, जो विभिन्न प्रयोगों में उत्पन्न मूल्यों को दर्शाता है समान नहीं था। सापेक्ष मूल्यों (ढलान गुणांक आत्मविश्वास अंतराल 0.68-1)(चित्र 4)की तुलना में पूर्ण मूल्यों (ढलान गुणांक आत्मविश्वास अंतराल 0.55-0.72) के लिए यह विचलन अधिक स्पष्ट था। इसलिए, हम सापेक्ष मूल्यों का उपयोग करने की सलाह देते हैं, खासकर यदि किसी कारण से (उदाहरण के लिए, पर्याप्त शुद्ध आईई, 4 से अधिक पूर्ण प्लेटें आदि) एक ही प्रयोग में सभी नमूनों को चलाना संभव नहीं है। हम कम से कम समय के भीतर तुलनात्मक विश्लेषण के लिए उद्देश्य वाले प्रयोगों को चलाने की भी सलाह देते हैं, ताकि पीएफईएमपी 1 अभिव्यक्ति (साथ ही अन्य एंटीजन) में बहती हुई अतिरिक्त भिन्नता शुरू करने से बचा जा सके और संस्कृति में विस्तारित समय पर टीएचपी-1 कोशिकाओं पर सूक्ष्म अंतर के कारण।

Figure 1
चित्रा 1: THP-1 सेल सतह पर व्यक्त एफसी रिसेप्टर्स।
(A)Fcγ-रिसेप्टर III/सीडी16 (लाल) । (ख)Fcγ-रिसेप्टर II/CD32 (हरा) । सी. Fcγ-रिसेप्टर I/CD64 (नारंगी) । अन-लेबल कोशिकाओं को नीले रंग में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: फ्लो साइटोमेट्री गेटिंग रणनीति।
(A)एफएससी/एसएससी पर टीएचपी-1 सेल( बी)एथिडियम ब्रोमाइड पॉजिटिव (ईटीबीआर+)टीएचपी-1 कोशिकाओं को FL3 हिस्टोग्राम में । अकेले THP-1 कोशिकाओं/कोई IEs जोड़ा (नीला), THP-1 कोशिकाओं संयुक्त राष्ट्र के साथ इनक्यूबेटेड-opsonized IEs (हरे), और THP-1 कोशिकाओं को एक सकारात्मक नियंत्रण (लाल) के साथ opsonized IEs के साथ इनक्यूबेटेड दिखाया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: THP-1 कोशिकाओं द्वारा IT4VAR04-IEs के Phagocytosis ।
(A)बी में प्रस्तुत प्रयोगों में से एक के प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री हिस्टोग्राम (बड़े प्रतीकों द्वारा पहचाना गया)। (ख)ईटीबी + टीएचपी-1 कोशिकाओं का प्रतिशत (तीन स्वतंत्र प्रयोगों का साधन और मानक विचलन)। (ग)संबंधित सकारात्मक नियंत्रण के विरुद्ध सामान्यीकरण के बाद बी में समान आंकड़े । रंग कोडिंग सभी पैनलों में एक ही है: THP-अकेले (काला), संयुक्त राष्ट्र opsonized/कोई एंटीबॉडी नियंत्रण (नीला), मलेरिया-भोली नियंत्रण (सियान), मलेरिया से उजागर पुरुष पूल (हरा), मलेरिया उजागर महिला पूल (नारंगी), एक मलेरिया उजागर महिला दाता (गुलाबी), और सकारात्मक नियंत्रण/खरगोश विरोधी मानव erythrocytes (लाल) । मतलब और मानक विचलन दिखाए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: 10 मलेरिया से उजागर महिलाओं से सीरम के साथ opsonization पर THP-1 कोशिकाओं द्वारा IT4VAR04 IEs के Phagocytosis ।
भूखंडों वर्तमान रैखिक प्रतिगमन विश्लेषण दो समान प्रयोगों के लिए एक ही दिन पर प्रदर्शन किया है, लेकिन विभिन्न शोधकर्ताओं द्वारा। (A)डेटा निरपेक्ष मूल्यों के रूप में प्रस्तुत किया गया है और(बी)सापेक्ष फैगोसाइटोसिस मूल्यों के रूप में प्रस्तुत किया गया है । सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया गया विश्लेषण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा S1: Phagocytosis परख प्रवाह चार्ट। परख के मुख्य चरणों को दर्शाती प्रवाह चार्ट। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा S2: 96 अच्छी तरह से प्लेट प्रयोग लेआउट। (A)आईईएस इट्बआर लेबलिंग के लिए लेआउट। (ख)ओपोनाइजेशन के लिए लेआउट; 6 कुएं हमेशा नियंत्रण के लिए आरक्षित होते हैं। (ग)टीएचपी-कोशिकाओं चढ़ाना के लिए लेआउट । (घ) फागोसिटोसिस के लिए लेआउट। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा S3: चित्रा 3 में के रूप में रंग कोडिंग। (ए)भंडारण से पहले और बाद में मापा गया 12 घंटे(सी)इट्बर+ टीएचपी-1 कोशिकाओं का प्रतिशत के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के बाद तुरंत अधिग्रहीत एक प्रयोग का फ्लो साइटोमेट्री हिस्टोग्राम ओवरले ।B NF ## विभिन्न मलेरिया से उजागर महिला दाताओं का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल को पहले वर्णित किया गया है और12,15, 17,,31 का उपयोग किया गया है ताकि टीएचपी-1 कोशिकाओं द्वारा opsonization और फैगोसाइटोसिस को प्रेरित करने के लिए पी फाल्सीपेरम आईईएस की सतह को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी की क्षमता को मापने के लिए 12, 15,,17,,31 का उपयोग किया जा सके । यहां प्रस्तुत परिणाम एक पी फाल्सीपेरम स्थानिक क्षेत्र में रहने वाली महिलाओं के प्लाज्मा/सीरम में स्वाभाविक रूप से अधिग्रहीत VAR2CSA-विशिष्ट एंटीबॉडी पर ध्यान केंद्रित । VAR2CSA एक प्रकार का PfEMP1 है जो आईईएस के अपरा ज़ब्ती में शामिल है, और प्रधानमंत्री के रोगजनन में एक प्रमुख निर्धारक है।

परख का उपयोग प्रतिरक्षण द्वारा प्रेरित एंटीबॉडी के लिए किया जा सकता है और/या आईई सतह पर मौजूद अन्य PfEMP1 वेरिएंट या किसी अन्य परजीवी एंटीजन को लक्षित करना, बशर्ते एंटीबॉडी का परीक्षण टीएचपी-1 कोशिकाओं (सीडी 32 और सीडी 64) द्वारा व्यक्त मानव Fcγ-रिसेप्टर्स के साथ बातचीत करे। परख सरल, उच्च थ्रूपुट (बड़े नमूना सेट के विश्लेषण की अनुमति) है और एक दिन में किया जा सकता है। फागोसिटोटोसिस को प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मापा जाता है, जो ईटीबीलेबल और एंटीबॉडी-ओपोनाइज्ड आईईएस के साथ 40 मिनट के सह-इनक्यूबेशन के बाद ईटीबी + टीएचपी-1 कोशिकाओं के प्रतिशत की मात्रा निर्धारित करता है।

हालांकि परख प्रयोगात्मक प्रतिकृति पर लगातार परिणाम देता है, वहां निरपेक्ष मापा मूल्यों के बीच परिवर्तनशीलता है और इसलिए, हम एक सकारात्मक नियंत्रण है कि हमेशा शामिल किया जाना चाहिए का उपयोग कर सापेक्ष मूल्यों की गणना की सलाह देते हैं । हम ऊपर चर्चा किए गए अंतर-परख भिन्नता से बचने के लिए, एक ही प्रयोग में परीक्षण किए जाने के लिए सभी नमूनों को चलाने की भी सलाह देते हैं। पी फाल्सीपेरम संक्रमण के संपर्क में आने वाले व्यक्तियों से एकत्र सीरम नमूनों का परीक्षण करते समय, हम हमेशा भोले व्यक्तियों के नमूनों का एक सेट शामिल करने की सलाह देते हैं ताकि एक नियंत्रण समूह के रूप में उपयोग किया जा सके। इस नियंत्रण समूह का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए एक सीमा निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि आपके परीक्षण नमूनों में से किसे सकारात्मक माना जाना है ।

हमने पहले विभिन्न मलेरिया नैदानिक प्रस्तुतियों (गंभीर बनाम हल्के)17के साथ बच्चों से एकत्र किए गए सेरा की फागोसिटोसिस-उत्प्रेरण क्षमता की तुलना करने के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग किया है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

मैकेन विस्ती को उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद दिया जाता है। इस कार्य को आंशिक रूप से डेनमार्क के विदेश मंत्रालय से अनुदान (MAVARECA II; 17-02-केयू) द्वारा वित्त पोषित किया गया था और दानिडा फैलोशिप सेंटर द्वारा प्रशासित किया गया था । फंडर का अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने या पांडुलिपि तैयार करने के निर्णय में कोई भूमिका नहीं थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well cell culture plates, round bottom with lid Corning 3799 Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use
AlbuMAX-II Gibco 11021-037
AlbuMAX-II (5%) - - 5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886)
Anti-Red Blood Cells antibody Abcam ab34858 Prepare 2μl aliquots and freeze a -20°C. Use one aliquot per experiment.
DPBS Sigma P8622
Dynabeads Protein G Invitrogen 10003D
Ethidium bromide solution Sigma E1510 Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light
FC500 flow cytometer Beckman Coulter Any flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used.
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10099-141 Heat inactivate before use.
FITC mouse anti-human CD16 BD Biosciences 555406 or 556618
FITC mouse anti-human CD32 BD Biosciences 552883
FITC mouse anti-human CD64 BD Biosciences 555527
FlowLogic software Inivai technologies Any flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist
Gentamicin (10mg/mL) Sigma G1272
Hypoxanthine Sigma H9377
L-glutamine (200mM) Sigma G7513
Lysing solution - - 15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA
MACS CS-column and accesories Miltenyi Biotec 130-041-305
Parasite culture medium - - 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50µg/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886)
Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL) Sigma P0781
RPMI-1640 medium Sigma R5886
THP-1 culture medium - - 10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886)
Vario MACS magnet Miltenyi Biotec

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 162 फैगोसाइटोसिस ओपोनाइजेशन एंटीबॉडी अपरा मलेरिया परजीवी संक्रमित एरिथ्रोसाइट्स आईईएस वीएआर2सीएसए
एक फ्लो साइटोमेट्री-आधारित परख द्वारा <em>प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम</em> परजीवी के लिए स्वाभाविक रूप से अधिग्रहीत फागोसाइटोसिस-इंड्यूरिंग एंटीबॉडी को मापने
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