Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

מדידת נוגדנים הרום Phagocytosis-באופן טבעי כדי Plasmodium falciparum טפילי על ידי אסאי מבוסס ציטומטריה זרימה

Published: August 6, 2020 doi: 10.3791/61538
Automatic Translation
1, 1,2,3, 1,4
1Centre for Medical Parasitology, Department of Immunology and Microbiology, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2West African Centre for Cell Biology of Infectious Pathogens, Department of Biochemistry, Cell and Molecular Biology, University of Ghana, 3Department of Immunology, Noguchi Memorial Institute for Medical Research, 4Centre for Medical Parasitology, Department of Infectious Diseases, Rigshospitalet

Summary

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק הוראה כיצד למדוד את היכולת של נוגדנים הנוכחי סרה או פלזמה של אנשים, באופן טבעי חשוף Plasmodium זיהום falciparum, כדי opsonize ו לגרום phagocytosis של אריתרוציטים נגועים טפילים (IEs).

Abstract

הפרוטוקול מתאר כיצד להגדיר ולהפעיל זרימה ציטומטריה מבוססי phagocytosis אסייג של Plasmodium falciparum-נגוע אריתרוציטים (IEs) opsonized על ידי נוגדנים IgG שנרכשו באופן טבעי ספציפי עבור VAR2CSA. VAR2CSA הוא אנטיגן טפיל המתווכת את ההפרדה הסלקטיבית של IEs שליה שיכול לגרום לצורה חמורה של מלריה בנשים בהריון, הנקרא מלריה שליה (PM). הגנה מפני PM מתווך על ידי נוגדנים ספציפיים VAR2CSA כי הם האמינו לתפקד על ידי עיכוב ההשתה שליה ו / או על ידי opsonizing IEs עבור phagocytosis. ה-assay משתמש IEs בשלב מאוחר מסונכרן in vitro שנבחרו במבחנה לבטא VAR2CSA, פלזמה / סרום-נוגדנים מנשים עם חסינות ספציפית PM שנרכש באופן טבעי, ואת קו התא הפוגוציצי THP-1. עם זאת, ניתן לשנות את הפרוטוקול בקלות כדי לומר את הפונקציונליות של נוגדנים לכל אנטיגן טפיל קיים על פני השטח IE, אם מושרה על ידי חשיפה טבעית או על ידי חיסון. ההסכם מציע הערכה פשוטה ותפוקה גבוהה, עם רבייה טובה, של היבט תפקודי חשוב של חסינות בתיווך נוגדנים במלריה. זה, לכן, שימושי בעת הערכת חסינות קלינית P. falciparum מלריה, גורם מרכזי של תלודים ותמותה באזורים הטרופיים, במיוחד באפריקה שמדרום לסהרה.

Introduction

מלריה היא מחלה הנישנת על ידי וקטור הנגרמת בבני אדם על זיהום עם חמישה מינים שונים של סוג Plasmodium. המינים הנפוצים ביותר הם P. falciparum, שאחראי גם על התפלואה והתמותה הגבוהותביותר 1. מצגת קלינית מלריה משתנה מזיהומים א-תסמינים או שפירים למחלה מסובכת/חמורה, האחרונה מתרחשת בעיקר בילדים מתחת לגיל חמש שנים. חשיפה P. falciparum אינה לגרום חסינות סטרילית, אבל אנשים החיים באזורים אנדמיים לאט לפתח חסינות מפני המחלה הקלינית. הגנה היא גיל / חשיפה תלויה חסינות נרכשת בדרך כלל במהלך 5-10 השנים הראשונות שלהחיים 2. נשים בוגרות הן יוצא מן הכלל חשוב, כמו מלריה חמורה יכולה להתרחש במהלך ההריון במצגת קלינית המכונה מלריה שליה (PM). ראש הממשלה היא סיבה חשובה להפלות, לידה מתות, לידה מוקדמת, משקל לידה נמוך, מוות עוברי ואנמיה אימהית. התנגדות לראש הממשלה מתפתחת על הריונות רצופים3. הגנה מפני PM קשורה לרכישת נוגדנים נגד PfEMP1 מסוג VAR2CSA4,5, אנטיגן אריתרושייט נגוע (IE) החייב לכונדרויטין גופרתי A (CSA) המאפשר IE סירוקציה שליה. נוגדנים לתווך הגנה ביצוע פעילויותפונקציונליות שונות (נבדק ב 6,,7)כולל opsonization של IEs כדי לגרום phagocytosis. מחקרים מוקדמים במבחנה הראו כי נוגדנים יכולים להגביל את צמיחת P. falciparum בנוכחות של מונוציטים באמצעות phagocytosis8,9. מחקרים עדכניים יותר הראו כי רמות גבוהות יותר של נוגדנים הזורמים פוגוציטוזיס קשורים לתוצאות הריון טובות יותר (בהקשר של HIV שיתוף זיהום)10,,11, המציין את הרלוונטיות של פונקציה זו אפקט בתגובה חיסונית שנרכשה באופן טבעי.

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי למדוד פונקציה זו של נוגדנים נוכחים פלזמה אנושית / סרום, באמצעות IEs מתורבתת חוץ חוץ להביע VAR2CSA יחד עם קו מונוצייט THP-1. ההסכם שימש בעבר11,12,13,14,15,16,17,18 והואנחשב גישה משופרת וקלה יותר בהשוואהפרוטוקולים מבוססי מיקרוסקופ קודם 8, שכן הוא מאפשר בדיקה של מספר גדול יותר של דגימות נוגדנים בריצה אחת באמצעות כמויות קטנות יותר של נוגדנים ונמנע ספירת מיקרוסקופים מייגעים ומוטה. למרות שהאסא היה בשימוש על ידי מעבדות מרובות וביצועו הוא פשוט מספיק, זה דורש תכנון והכנה זהירים, לכן, פרוטוקול מפורט יאפשר את יישומו על ידי מעבדות וחוקרים חסר ניסיון קודם. אנו משתמשים, כדוגמה, IEs בשלב מאוחר מסונכרן לבטא VAR2CSA opsonized עם נוגדנים נוכחים בסרום שנאספו מנשים עם חסינות ספציפית PM שנרכש באופן טבעי. עם זאת, ניתן לשנות את הפרוטוקול בקלות כדי לומר את הפונקציונליות של נוגדנים לכל אנטיגן טפיל קיים על פני השטח IE, אם מושרה על ידי חשיפה טבעית או על ידי חיסון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

דגימות הנסיוב האנושי המשמשות לתוצאות המוצגות כאן נאספו במחקר נפרד19. האוסף אושר על ידי ועדת הביקורת המוסדית של מכון נוגוצ'י למחקר רפואי, אוניברסיטת גאנה (מחקר 038/10-11), ועל ידי ועדות האתיקה של המחקר האזורי, אזור הבירה של דנמרק (פרוטוקול H-4-2013-083).

1. תרבות טפילים

הערה: בצע את התקנות המקומיות לטיפול בפתוגנים אנושיים.

  1. שמור על טפילי P. falciparum על פי הפרוטוקול הסטנדרטי כמתוארלפני 20 במדיום תרבות טפילים (ראה טבלת חומרים).
  2. שמור את הטפילים מסונכרנים היטב באמצעות טיפול סורביטול כפי שתואר קודםלכן 21.
  3. כדי להבטיח ביטוי VAR2CSA על פני השטח של IE, לבצע סיבובים חוזרים ונשנים של בחירה חיסונית-מגנטית באמצעות נוגדן נגד VAR2CSA (למשל, PAM1.4 נוגדן, CROSS-תגובתי אנושי מונוקלוני ספציפי IgG22)יחד עם חלבון G-מגנטיחרוזים 23.
    1. בקצרה, דגירה בשלב מאוחר trophozoite-IEs עם חרוזים מגנטיים יחד עם נוגדן ANTI-VAR2CSA ולבחור באופן חיובי באמצעות מגנט.
    2. להרחיב את הטפילים שנבחרו בתרבות לכמה מחזורים עד parasitemia הוא לפחות 5%.
    3. לחלופין, בחר טפילים המאגדים ל- CSA ללא תנועה מפלסטיק (הקולטן עבור VAR2CSA) כפי שתואר קודםלכן 24.
  4. כדי לוודא ביטוי VAR2CSA על הטפילים שנבחרו לבצע ציטומיה זרימה כפי שתואר קודםלכן 25.
    1. בקצרה, לתייג את trophozoite-IEs בשלב מאוחר עם אותו נוגדן המשמש לבחירה מגנטית (שלב 1.3) ואחריו נוגדן משני תיוג פלורסנט.
    2. מדוד את יהוכית פני השטח של IE על-ידי ציתום זרימה. בחירת נוגדנים מוצלחת גורמת בדרך כלל לאוכלוסיית טפילים המבטאת VAR2CSA ברוב הטפילים (≈80%).
  5. לתסיסה של הפוגוציטוזיס, השתמשו בטרופוזואיט-IEs מטוהרים באמצע עד שלב מאוחר. בצע טיהור באמצעות הפרדה מגנטית כפי שתואר קודםלכן 26.
    הערה: כדי לקבוע במדויק את השלב של הטפילים, לבצע הכתמת Giemsa על כתמי דם ואחריו תצפית מיקרוסקופית אור. פעל בהתאם לנוהלי הנהלים הסטנדרטיים ולהנחיות המורפולוגיות כמתוארלפני 27. ניתן לבצע טיהור בשלב מאוחר גם באמצעות צפיפות הדרגתית בינונית. עם זאת, תפוקת ה-IE מניסיוןינו נמוכה יותר, ולכן עדיף טיהור מגנטי.
    1. להפרדה מגנטית, סובבו את תרבות הטפילים (5-10% טפילים) ב-500 x g ל-10 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את supernatant ולהשעות מחדש את גלולת התא ב 10 מ"ל של תרבות טפילים בינוני.
    2. הוסף את מתלה הטפיל לעמודת CS בשילוב עם מגנט (ראה טבלת חומרים)ותן לו לעבור באיטיות דרך העמודה. Trophozoite-IEs הם paramagnetic (בשל הנוכחות של המוזוין) ותישאר לתוך רשת הטור.
    3. לשטוף את העמודה עם 50 מ"ל של תרבות טפילים בינוני ולך את IEs מהעמוד המגנטי באמצעות 50 מ"ל של תרבות טפילים בינוני.
  6. סובבו את ההברטה מ-1.5.3 ב-500 x g ל-10 דקות בטמפרטורת החדר. בזהירות להשליך את supernatant ולהשעות מחדש ב 1 מ"ל של תרבות טפילים בינוני.
  7. באמצעות hemocytometer, לספור את מספר IEs (מזוהה בקלות על ידי מיקרוסקופיה אור כמו אריתוציטים עם פיגמנט המוזוין כהה) ומספר תא הכולל כדי לחשב את parasitemia הסופי (אחוז של IEs).
    הערה: השתמש רק טפילים עם לפחות 80% טוהר (80% IEs).
  8. בהתבסס על מספר דגימות הסרום/נוגדן המתוכננות לבדיקה, העריך את הכמות הכוללת של ה-IEs הדרושה וצמצם את תרביות הטפילים בהתאם. בקבוקון תרבות 75 ס"מ2 עם 25 מ"ל של תרבות ב 5% המטוקריט ו 5-10% parasitemia צריך להניב מספיק IEs כדי להפעיל צלחת מלאה 96 באר. עבור לוח מלא (42 דגימות ועוד 6 פקדים בכפילויות), יש צורך בהשעיית טפילים של 1.5 מ"ל לפחות ב- 3.3 x 107 IEs/mL.

2. תאי THP-1

הערה: קו התא THP-1 משמש בהודעה זו. קו תא מונוציט זה נגזר ממטופל עם לוקמיהמונוציטית 28, ניתן לרכוש מ ATCC. שמור על קו התא בהתאם להוראות הספק במדיום תרבות THP-1 (ראה טבלת חומרים).

  1. לצורך תחזוקה שוטפת, הפעל את תרבות התא THP-1 ב- 2-4 x10 5 תאים/מ"ל ותת-תרבות כאשר ריכוז התא מגיע ל- 8 x 105 תאים/מ"ל.
    הערה: אל תאפשר לריכוז התא לחרוג מ- 1 x10 6 תאים/מ"ל ולעקוב אחר מספר המעבר. הימנע משימוש בתאים שהם מעבר למעבר 25. זמן ההכפלה הממוצע של קו התא THP-1 משתנה בין 19-50 שעות. לקבוע את זמן ההכפלה של אצווה התא לפני תחילת ניסויי phagocytosis. זה יעזור בערך להעריך את הכמות הנדרשת של תרבות הדרושה עבור מספר נחוש של דגימות סרום להיבדק (למשל, עבור צלחת מלאה 96 באר, 10 מ"ל של תרבות ב 5 x 105 תאים / מ"ל נדרשים).
  2. בדוק מעת לעת את תאי THP-1 לקבלת ביטוי פני השטח של קולטני Fcơ-I (CD64), II (CD32) ו- III (CD16) כמתוארקודם לכן 15.
    1. בקצרה, הכתים את תאי THP-1 (בנפרד) עם אנטי CD64, אנטי CD32 ואנטי CD16 פלואורסצנטית מסומן נוגדנים(טבלת חומרים)במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (1:100 דילול הוכן 2% FBS ב PBS).
    2. לשטוף שלוש פעמים עם 2% FBS ב PBS ומדד כתמים פני השטח על ידי ציתום זרימה.
      הערה: תאי THP-1 שליליים עבור CD16 וחיוביים עבור CD32 ו- CD64 כפי שדווחבעבר 29,30 ( איור1).
  3. עבור תסיסת phagocytosis, להגדיר בקבוקון תרבות תא THP-1 עם 2.5 x10 5 תאים / מ"ל יום לפני הניסוי להניב סביב 5 x 105 תאים / מ"ל ביום של ציון.
    הערה: ודא 4-6 x10 5 תאים / מ"ל נוכחים ביום של ההסכם.

3. תסיסה Phagocytosis (איור S1)

  1. לפני תחילת ההתארגנות, לחסום (>1 h) שתי עגול-התחתון 96 לוחות גם (אחד עבור opsonization ועוד עבור phagocytosis) באמצעות 150 μL לכל באר של סטרילי 2% FBS ב PBS.
    הערה: תווית צלחת 1 כמו לוח opsonization ולהשתמש בו גם עבור אתידיום ברומיד (EtBr) כתמימה opsonization. תווית צלחת 2 כמו לוח phagocytosis ולהשתמש הן עבור ציפוי תא THP-1 עבור שלב phagocytosis.
  2. כתמים טפילים ואופוזוניזציה
    1. קח את השעיית IE מוכן 1.6 ולהתאים את ספירת התאים 3.3 x10 7 IEs / מ"ל על ידי הוספת תרבות טפילים בינוני EtBr כדי להשיג ריכוז סופי של 2.5 μg/mL (1:40 דילול, מתוך 0.1 מ"ג/ מ"ל).
      הערה: EtBr מכתים את ה-DNA הטפיל, המאפשר זיהוי על ידי ציתום זרימה.
      התראה: EtBr הוא מוטגן ועור, עין, וגירוי נשימתי. השתמש בהגנה המתאימה והשלך פסולת בהתאם לתקנות המקומיות.
    2. הסר את תמיסת החסימה מאחת מ-96 לוחות הבאר (לוח האופוסוניזציה), העיף את הצלחת והסרת עודף נוזלים על חתיכת נייר מגבת.
    3. הוסף 30 μL לכל באר של מתלי IE שהוכנו לעיל בחצי העליון של הצלחת. השאר אחד ריק היטב ולהוסיף 30 μL של תרבות טפילים בינוני (ללא IEs עבור THP-1 לבד שליטה). (איורS2A). דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ומוגנת מפני אור.
    4. להוסיף 170 μL לכל באר של תרבות טפילים בינוני. סובבו את הצלחת ב-500 x g למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר והסרו את ה-supernatant על-ידי הטסת הצלחת מעל מיכל פסולת מתאים.
    5. לשטוף את IEs תווית EtBr פעמיים נוספות באמצעות 200 μL לכל באר של תרבות טפילים בינוני ספינינג הצלחת ב 500 x g עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר. ניתן להסיר את supernatant מהשטיפה הראשונה על ידי הטסת הצלחת. הסירו בזהירות את הסופרנטנט מהשטף השני באמצעות פיפטה רב ערוצית כדי לוודא שכל נפח הכביסה של מדיום מוסר. נא לא להפריע את הכדור.
    6. להשעות מחדש את IEs התווית EtBr ב 30 μL של נוגדן / פלזמה / תמיסת סרום מוכן בריכוזים הרצויים במדיום תרבות טפילים.
    7. כלול תמיד את הפקדיםהבאים (איור S2B):פקד ללא בקרת תאי IEs/THP-1 (מדיום תרבות טפילים); שליטה ללא נוגדן או פלזמה/סרום (בקרה לא-אופוניסטית); שליטה חיובית באמצעות נוגדן אריתרושייט אנטי-אנושי זמין מסחרית בשעה 1:100 דילול (ראה טבלת חומרים); שתי בקרות פלזמה/סרום שליליות ב-1:5 דילול (בריכה תמימה למלריה ובריכה מזכרים שנחשפו למלריה); ובקרת סרום חיובית ב-1:5 דילול (בריכה של נשים שנחשפו למלריה, שהיו בהריון בעבר (רצוי רב-גרביידי)).
      הערה: דילול של 1:100 עבור השליטה החיובית נראה לעבוד באופן עקבי על פני אצוות שונות של נוגדנים שנרכשו (הנתונים לא מוצגים). עם זאת, מומלץ לשלול וריאציות בין אצוות על ידי בדיקת מספר דילולים בכל פעם אצווה חדשה של נוגדנים משמש.
    8. דגירה במשך 45 דקות בחושך ב 37 °C.
  3. הכנת תאי THP-1 ופלגוציטוזיס
    1. בעוד IEs הם להיות opsonized (3.2.8), להתחיל להכין את תאי THP-1.
    2. הסר את תאי THP-1 מ בקבוקון התרבות, סובב אותם כלפי מטה (500 x g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר), תסיר את הסופרנטנט והשעה מחדש את הגלולה במדיום תרבות התא THP-1.
    3. ספין שוב (500 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר), decant supernatant ולהשעות מחדש את גלולת התא ב 1 מ"ל של THP-1 תא תרבות בינונית.
    4. לקבוע את ספירת התאים בפתרון שהוכן לעיל ולהוסיף מדיום יותר כדי להשיג ריכוז סופי של 5 x10 5 תאים/מ"ל.
    5. הסר את תמיסת החסימה מצלחת 96 הבאר הנותרים (צלחת phagocytosis) על-ידי ההפלת הצלחת והסרת עודף נוזל על פיסת נייר מגבת.
    6. להוסיף 100 μL לכל באר של מתלה תא THP-1 מוכן 3.3.4 ולשים בחזרה ב אינקובטור תרבותהתא (איור S2C).
    7. לאחר הנוגדן / פלזמה / סרום זמן הדגירה הסתיים, להוסיף 170 μL לכל באר של תרבות טפילים בינוני. סובבו את הצלחת ב-500 x g למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר והסרו את ה-supernatant על-ידי הטסת הצלחת מעל מיכל פסולת מתאים.
    8. לשטוף את IEs opsonized פעמיים נוספות באמצעות 200 μL לכל באר של תרבות טפילים בינוני, ספינינג הצלחת ב 500 x g עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר. ניתן להסיר את supernatant מהשטיפה הראשונה על ידי הטסת הצלחת. הסירו בזהירות את הסופרנטנט מהשטף השני, תוך שימוש בפיפטה רב-ערוצית כדי לוודא שכל נפח הכביסה של מדיום מוסר. נא לא להפריע את הכדור.
    9. לבסוף להשעות מחדש את IEs opsonized ב 100 μL של THP-1 חימום מראש תא תרבות בינונית. להעביר 50 μL של השעיית IE opsonized לכל באר בצלחת phagocytosis. מאז יש סך של 100 μL של IEs, כל דילול נוגדן / סרום ניתן להפעיל בכפילויות בצלחת phagocytosis (איור S2D)
      הערה: כמות ה-IEs ותאי THP-1 המשמשים בהסאא תואמת ליחס של 10:1.
    10. דגירה במשך 40 דקות בחושך ב 37 °C, 5% CO2.
      הערה: אל תאפשר לפלגוציטוזיס להמשיך במשך יותר מ- 40 דקות.
    11. עצרו את הפאגוציטוזיס על-ידי צנטריפוגציה ב-4°C (500 x g, 5 דקות) והשליכו את הסופרנטנט על-ידי הטסת הלוח. מוסיפים 150 μL של תמיסת אמוניום כלורי בטמפרטורת החדר ( טבלתחומרים) ומערבבים על ידי צנרת, דגירה בדיוק 3 דקות.
      הערה: שלב זה יהיה lyse אריתרושיטים שלא היו phagocytosed על ידי תאי THP-1.
    12. לעצור את הליזה על ידי הוספת 100 μL של קר כקרח 2% FBS ב PBS. סובבו את הצלחת ב-4°C (500 x g למשך 3 דקות) והסרו את ה-supernatant על-ידי הטסת הצלחת מעל מיכל פסולת מתאים.
    13. לשטוף שלוש פעמים באמצעות 200 μL לכל באר של קר כקרח 2% FBS ב PBS ספינינג הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס (500 x גרם עבור 3 דקות). לאחר השטיפה הסופית, להשעות מחדש ב 200 μL של קר כקרח 2% FBS ב PBS ומיד לנתח על ידי ציתימטריה זרימה.
      הערה: פרסומים קודמים השתמשו קיבעון תא ב 2% paraformaldehyde לפני ציתוםזרימה 31, אבל התוצאות שהוצגו כאן נרכשו מיד לאחר השלמת הודעה. דחיית רכישת נתוני ציתימטריה זרימה על ידי אחסון הלוח ב 4 מעלות צלזיוס אינה מומלצת, מאז אחוז תאי EtBr+ THP-1 נרקב במהירות(איור S3).
  4. רכישה וניתוח ציתומיה של זרימה
    הערה: כל ציטומטר זרימה התומך 96 פורמט צלחת גם ויש לייזרים מתאימים / מסננים כדי למדוד פלואורסצנט EtBr ניתן להשתמש.
    1. לרכישה, שער בתאי THP-1 באמצעות פיזור קדמי ליניארי (FSC) לעומת חלקת פיזור צד ליניארי (SSC) באמצעות הבארות לא נוספו(איור 2A)ורכשו 10,000 אירועים בשער זה.
    2. למדוד את עוצמת הפלואורסצנט עבור EtBr (FL3-Log) בשער THP-1 באמצעות עלילה היסטוגרמה.
    3. עבור gating, השער הראשון על תאי THP-1 ב- FSC לעומת SSC צפיפות העלילה, באמצעות הבאות לא היו IEs נוספו(איור 2A). לאחר מכן להגדיר שער חיובי בהיסטוגרמה FL3 (EtBr), באמצעות תאי THP-1 (ללא IEs נוסף) ואת השליטה un-opsonized(איור 2B).
    4. העתק שערים אלה בכל הדגימות האחרות שנבדקו באותה צלחת ולקבוע את אחוז תאי THP-1 חיוביים EtBr (תאי THP-1 בעלי פלגוציטר לפחות IE אחד). עבור כל אחת מהדגימות שנבדקו, phagocytosis ניתן לדווח כערכים המוחלטים (אחוז של תאי EtBr+ THP-1) או כמו phagocytosis יחסי מחושב כאחוז באמצעות הפקד החיובי כמקסימום.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאן אנו מציגים בפירוט פרוטוקול שתואר בעבר31 והשתמש 11 ,12,13,14,15,15,16,17,18 כדי למדוד את הקיבולת של נוגדנים מיקוד פני השטח של P. falciparum IEs כדי לגרום opsonization ו phagocytosis על ידי תאי THP-1.

ההספד מודד באופן ספציפי phagocytosis מתווכים נוגדנים, ולכן, אינטראקציה עם קולטני Fc המתאימים על פני השטח של תאי THP-1 נדרש. מסיבה זו, וכמובן המוזכר בפרוטוקול, אנו ממליצים לבדוק מעת לעת את הביטוי של Fcơ-קולטני על פני השטח של תאי THP-1 על-ידי ציתום זרימה. התאים צריכים להיות שליליים עבור CD16(איור 1A) וחיוביעבור CD32 ו- CD64(איור 1B,C).

עבור ההתארגנות, IEs בשלב מאוחר מטוהרים סומנו עם EtBr ולאחר מכן opsoned עם נוגדנים נוכחים פלזמה / סרום של אנשים נאיביים מלריה או מלריה חשופים. Phagocytosis נמדד על ידי ציטומטריית זרימה, לכמת את אחוז תאי EtBr+ THP-1 לאחר 40 דקות דגירה שיתופית עם EtBr תווית ונוגדן opsonized IEs. בתחילה, תאי THP-1 היו מגודרים באמצעות FSC לעומת SSC צפיפות העלילה (איור 2A). לאחר מכן,סמן EtBr + נוצר, באמצעות היסטוגרמה FL3 על תאי THP-1 ו- IEs un-opsonized(איור 2B). שערים אלה שימשו לאחר מכן לניתוח כל הפקדים האחרים ודגימות בדיקה.

הפקדים השליליים (כולל תאי THP-1 בלבד, בקרת IE un-opsonized, ואת הפקדים עם זכרים נאיביים מלריה וחשופים למלריה) כל צריך ליצור שיא שלילי יחיד בערוץ FL3 (איור 3A) עם רק כמה אירועים EtBr+ סמן. בהתאם לכך, ערכי phagocytosis ממוצע הן כתאי EtBrמוחלט + THP-1 כמו אחוזי phagocytosis יחסי צריך להיות נמוך מאוד(איור 3B, C, בדרך כלל פחות מ 2% עבור כל המקרים). לעומת זאת, הפקדים החיוביים (כולל נוגדן אריתרושייט אנטי-אנושי של הארנב והבריכה הנשית החשופה למלריה) אמורים ליצור עקבות עם שתיפסגות (איור 3A): אחדשלילי (חופף במידה רבה לזו שנוצרת על ידי כל הפקדים השליליים) ואחד חיובי ומופרד היטב הממוקם בתוך ה-EtBr+ סמן. מדגם חיובי, כמו הדוגמה המוצגת (מדגם מאישה multigravid חשוף מלריה / NF20) צריך ליצור פרופיל דומה כמו הפקדים החיוביים. ערכי phagocytosis הממוצע, נמדד כמו מוחלט EtBr+ תאי THP-1 כמו phagocytosis יחסית, היו בדרך כלל הגבוהים ביותר עבור השליטה החיובית (58%/100%), ואחריו מאגר נשי חשוף מלריה (29%/53%), ולאחר מכן האישה היחידה שנחשפה למלריה (23%/40%). כפי שנצפה בדמות 3B,C, שבה מוצגים שלושה ניסויים עצמאיים, הייתה שונות ניכרת בין הניסויים ולכן אנו ממליצים להריץ דגימות המיועדות להשוואה באותו ניסוי. בידיים שלנו, לפחות ארבע מלא 96 צלחות גם יכול להיות מטופל על ידי חוקר מנוסה אחד. השונות בין הבדיקות נצפתה גם כאשר שני ניסויים זהים שבדקו מספר דגימות סרום מנשים שנחשפו למלריה בוצעו בו זמנית. באותה הכנת טפיל (לאחר טיהור מגנטי של IEs בשלב מאוחר) ודילול סרום שימשו. תאי THP-1 הוחזקו בשתי מבחנות נפרדות אך נצרעו מאותו בקבוקון ראשוני והניסויים בוצעו על ידי שני חוקרים שונים. למרות שנראה שהאסא מפיק תוצאות עקביות כאשר מתבצעות בנפרד, עם מתאם ליניארי הדוק (r>0.9 עבור ערכי פלגוציטוזיס אבסולוטיים ויחסיים כאחד) בין ערכי phagocytosis הנמדדים בשני הניסויים, מקדם המדרון של הקווים המותאמים סוטה מאחד, המציין את הערכים שנוצרו בניסויים שונים לא היו זהים. סטייה זו הייתה ניכרת יותר עבור הערכים המוחלטים (מרווח ביטחון מקדם מדרון 0.55-0.72) בהשוואה לערכים היחסיים (מרווח ביטחון מקדם מדרון 0.68.1)(איור 4). אנו, לכן, ממליצים להשתמש בערכים יחסיים, במיוחד אם מסיבה כלשהי (למשל, אין מספיק IEs מטוהרים, יותר מ 4 צלחות מלאות, וכו ') זה לא אפשרי להפעיל את כל הדגימות בניסוי אחד. כמו כן, אנו ממליצים להריץ ניסויים המיועדים לניתוח השוואתי בתוך פרק הזמן הקצר ביותר, כדי להימנע מהחדרת וריאציה נוספת בשל נסחף בביטוי PfEMP1 (כמו גם אנטיגנים אחרים) ו בשל הבדלים עדינים בתאי THP-1 עם זמן ממושך בתרבות.

Figure 1
איור 1: קולטני FC המתבטאים על פני השטח של התא THP-1.
(A) Fc大-קולטן III/CD16 (אדום). (ב)Fc大-קולטן II/CD32 (ירוק). ג., אתה בסדר? Fc大-קולטן I/CD64 (כתום). תאים לא מסומנים מוצגים בכחול. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: אסטרטגיית גתמות ציתומיה זרימה.
(A) תאי THP-1 מגודרים על FSC / SSC. (ב) אתידיום ברומיד חיובי (EtBr+) תאי THP-1 היסטוגרמה FL3. תאי THP-1 לבד/ללא IEs שנוספו (כחול), תאי THP-1 הדגירה עם IEs un-opsonized (ירוק), ותאי THP-1 דגירה עם IEs opsonized עם שליטה חיובית (אדום) מוצגים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: Phagocytosis של IT4VAR04-IEs לפי תאי THP-1.
(א)היסטוגרמה של אחד הניסויים שהוצגו ב-B (שזוהו על ידי סמלים גדולים יותר). (ב)אחוז תאי EtBr+ THP-1 (אמצעים ו סטיות תקן של שלושה ניסויים עצמאיים). (ג)אותם נתונים כמו ב- B, לאחר נורמליזציה מול הפקד החיובי המתאים. קידוד צבע זהה בכל הפאנלים: THP בלבד (שחור), לא opsonized / ללא בקרת נוגדנים (כחול), שליטה נאיבית מלריה (ציאן), בריכה זכר חשוף מלריה (ירוק), בריכה נשית חשופה למלריה (כתום), תורם נקבה חשופה למלריה (ורוד), ושליטה חיובית / ארנב אנטי אנושי אריתרושיטים (אדום). ממוצעים ו סטיות תקן מוצגות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: Phagocytosis של IT4VAR04 IEs על ידי תאי THP-1 על opsonization עם סרום מ 10 נשים חשופות מלריה.
העלילות מציגות ניתוח רגרסיה ליניארית לשני ניסויים זהים שבוצעו באותו יום, אך על ידי חוקרים שונים. (א)נתונים המוצגים כערכים אבסולוטיים וכערכי פלגוציטוזיס יחסיים (B). ניתוח שבוצע באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

איור S1: תרשים זרימה של תסיסה של Phagocytosis. תרשים זרימה המתאר את השלבים העיקריים של ההסכם. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.

איור S2: 96 גם צלחת צלחת פריסה ניסוי. (א)פריסה עבור תיוג ETBr של IEs. (ב)פריסה עבור opsonization; 6 בארות שמורות תמיד לפקדים. (ג)פריסה עבור ציפוי תאי THP. (ד) מה אתה עושה? פריסה עבור פלגוציטוזיס. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.

איור S3: קידוד צבעים כמו באות 3. (א)שכבת-על היסטוגרמה ציטומטרית זרימה של ניסוי אחד שנרכש באופן מיידי ו - (ב)לאחר אחסון ב 4 ° C עבור 12 שעות (C) אחוז של תאי EtBr+ THP-1 נמדד לפני ואחרי אחסון. NF## מייצגות תורמות שונות שנחשפו למלריה. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול שהוצג כאן תואר בעבר ונעשה בושימוש 12,15,17,31 כדילמדוד את הקיבולת של נוגדנים מיקוד פני השטח של P. falciparum IEs כדי לגרום opsonization ו phagocytosis על ידי תאי THP-1.15 התוצאות המוצגות כאן מתמקדות בתרופות נוגדנים ספציפיות ל-VAR2CSA שנרכשו באופן טבעי בפלזמה/סרום של נשים המתגוררות באזור אנדמי P. falciparum. VAR2CSA הוא סוג של PfEMP1 המעורב בהפליה של IEs, וקובע מפתח בפתוגנזה של PM.

ניתן להשתמש בהסכם עבור נוגדנים המושרים על ידי חיסון ו/או מיקוד בגרסאות PfEMP1 אחרות או כל אנטיגן טפיל אחר הקיים על פני השטח של IE, בתנאי שנוגדן שנבדק מקיים אינטראקציה עם קולטני Fcơ האנושיים המבוטאים על-ידי תאי THP-1 (CD32 ו- CD64). ההסכם הוא פשוט, תפוקה גבוהה (המאפשר ניתוח של ערכות מדגם גדולות) ולהיות מבוצע ביום אחד. Phagocytosis נמדד על ידי ציטומטריה זרימה, לכמת את אחוז EtBr+ THP-1 תאים לאחר 40 דקות דגירה שיתופית עם EtBr תווית ונוגדנים opsonized IEs.

למרות שההסכם נותן תוצאות עקביות על פני משכפלים ניסיוניים, קיימת שונות בין הערכים המוחלטים שנמדדו, ולכן, אנו ממליצים לחשב ערכים יחסיים באמצעות פקד חיובי שיש לכלול תמיד. כמו כן, אנו ממליצים להריץ את כל הדגימות כדי להיבדק בניסוי יחיד, כדי למנוע וריאציה בין-אסאי כפי שנדון לעיל. בעת בדיקת דגימות סרום שנאספו מאנשים שנחשפו לזיהום P. falciparum, אנו ממליצים תמיד לכלול קבוצה של דגימות מאנשים תמימים לשמש כקבוצה בקרה. ניתן להשתמש בקבוצת בקרה זו כדי להגדיר סף כדי לקבוע אילו מדגימות הבדיקה שלך ייחשבו חיוביות.

השתמשנו בעבר בגישה זו כדי להשוות את הקיבולת phagocytosis-inducing של סרה שנאספו מילדים עם מצגות קליניות מלריה שונות (חמור לעומת מתון)17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לסופרים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

Maiken Visti הוא הודה על סיוע טכני מעולה. עבודה זו מומנה בחלקה על ידי מענק (MAVARECA II; 17-02-KU) ממשרד החוץ של דנמרק ומנוהלת על ידי מרכז המעבדות דנידה. ל-funder לא היה כל תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף וניתוח נתונים, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well cell culture plates, round bottom with lid Corning 3799 Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use
AlbuMAX-II Gibco 11021-037
AlbuMAX-II (5%) - - 5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886)
Anti-Red Blood Cells antibody Abcam ab34858 Prepare 2μl aliquots and freeze a -20°C. Use one aliquot per experiment.
DPBS Sigma P8622
Dynabeads Protein G Invitrogen 10003D
Ethidium bromide solution Sigma E1510 Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light
FC500 flow cytometer Beckman Coulter Any flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used.
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10099-141 Heat inactivate before use.
FITC mouse anti-human CD16 BD Biosciences 555406 or 556618
FITC mouse anti-human CD32 BD Biosciences 552883
FITC mouse anti-human CD64 BD Biosciences 555527
FlowLogic software Inivai technologies Any flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist
Gentamicin (10mg/mL) Sigma G1272
Hypoxanthine Sigma H9377
L-glutamine (200mM) Sigma G7513
Lysing solution - - 15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA
MACS CS-column and accesories Miltenyi Biotec 130-041-305
Parasite culture medium - - 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50µg/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886)
Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL) Sigma P0781
RPMI-1640 medium Sigma R5886
THP-1 culture medium - - 10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886)
Vario MACS magnet Miltenyi Biotec

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. World Malaria Report - 2018. World Health Organization. , (2018).
  2. Pierce, S. K., Miller, L. H. World Malaria Day 2009: What malaria knows about the immune system that immunologists still do not. Journal of Immunology. 182 (9), 5171-5177 (2009).
  3. Gamain, B., Smith, J. D., Viebig, N. K., Gysin, J., Scherf, A. Pregnancy-associated malaria: Parasite binding, natural immunity and vaccine development. International Journal for Parasitology. 37 (3-4), 273-283 (2007).
  4. Staalsoe, T., et al. Variant surface antigen-specific IgG and protection against clinical consequences of pregnancy-associated Plasmodium falciparum malaria. Lancet. 363 (9405), 283-289 (2004).
  5. Feng, G., et al. Antibodies to variant surface antigens of plasmodium falciparum -Infected erythrocytes are associated with protection from treatment failure and the development of anemia in pregnancy. The Journal of Infectious Diseases. 200 (2), 299-306 (2009).
  6. Teo, A., Feng, G., Brown, G. V., Beeson, J. G., Rogerson, S. J. Functional Antibodies and Protection against Blood-stage Malaria. Trends in Parasitology. 32 (11), 1-12 (2016).
  7. Aitken, E. H., Mahanty, S., Rogerson, S. J. Antibody effector functions in malaria and other parasitic diseases: a few needles and many haystacks. Immunology & Cell Biology. 98 (4), 264-275 (2020).
  8. Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. Opsonic activity of human immune serum on in vitro phagocytosis of Plasmodium falciparum infected red blood cells by monocytes. Clinical and Experimental Immunology. 47 (3), 635-644 (1982).
  9. Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. Phagocytosis of Plasmodium falciparum-Parasitized Erythrocytes by Human Polymorphonuclear Leukocytes. The Journal of Parasitology. 69 (1), 49-53 (1983).
  10. Jaworowski, A., et al. Relationship between human immunodeficiency virus type 1 coinfection, anemia, and levels and function of antibodies to variant surface antigens in pregnancy-associated malaria. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (3), 312-319 (2009).
  11. Ataíde, R., Mwapasa, V., Molyneux, M. E., Meshnick, S. R., Rogerson, S. J. Antibodies that induce phagocytosis of malaria infected erythrocytes: Effect of HIV infection and correlation with clinical outcomes. PLoS One. 6 (7), 22491 (2011).
  12. Ghumra, A., et al. Immunisation with recombinant PfEMP1 domains elicits functional rosette-inhibiting and phagocytosis-inducing antibodies to Plasmodium falciparum. PloS One. 6 (1), 0016414 (2011).
  13. Ghumra, A., et al. Induction of strain-transcending antibodies against Group A PfEMP1 surface antigens from virulent malaria parasites. PLoS Pathogens. 8 (4), 1002665 (2012).
  14. Chan, J. A., et al. Targets of antibodies against erythrocytes in malaria immunity. J Clin Invest. 122 (9), 3227-3238 (2012).
  15. Quintana, M. P., Angeletti, D., Moll, K., Chen, Q., Wahlgren, M. Phagocytosis inducing antibodies to Plasmodium falciparum upon immunization with a recombinant PfEMP1 NTS DBL1α domain. Malaria Journal. 1, 1-9 (2016).
  16. Chan, J. A., et al. A single point in protein trafficking by Plasmodium falciparum determines the expression of major antigens on the surface of infected erythrocytes targeted by human antibodies. Cellular and Molecular Life Sciences. 73, 4141-4158 (2016).
  17. Quintana, M. P., et al. Antibodies in children with malaria to PfEMP1, RIFIN and SURFIN expressed at the Plasmodium falciparum parasitized red blood cell surface. Scientific Reports. 8 (1), 3262 (2018).
  18. Hommel, M., et al. Evaluating antibody functional activity and strain-specificity of vaccine candidates for malaria in pregnancy using in vitro phagocytosis assays. Parasites & Vectors. 11 (69), 1-7 (2018).
  19. Ampomah, P., Stevenson, L., Ofori, M. F., Barfod, L., Hviid, L. B-cell responses to pregnancy-restricted and -unrestricted Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 antigens in Ghanaian women naturally exposed to malaria parasites. Infection and Immunity. 82 (5), 1860-1871 (2014).
  20. Cranmer, S. L., Magowan, C., Liang, J., Coppel, R. L., Cooke, B. M. An alternative to serum for cultivation of Plasmodium falciparum in vitro. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (3), 363-365 (1997).
  21. Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. Journal of Parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).
  22. Barfod, L., et al. Human pregnancy-associated malaria-specific B cells target polymorphic, conformational epitopes in VAR2CSA. Molecular Microbiology. 63 (2), 335-347 (2007).
  23. Staalsoe, T., et al. In vitro selection of Plasmodium falciparum 3D7 for expression of variant surface antigens associated with severe malaria in African children. Parasite Immunology. 25 (8-9), 421-427 (2003).
  24. Chan, S., et al. Regulation of PfEMP1-VAR2CSA translation by a Plasmodium translation-enhancing factor. Nature Microbiology. 2, 17068 (2017).
  25. Barfod, L., et al. Evasion of immunity to Plasmodium falciparum malaria by IgM masking of protective IgG epitopes in infected erythrocyte surface-exposed PfEMP1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12485-12490 (2011).
  26. Moll, K., Kaneko, A., Scherf, A., Wahlgren, M. Methods in Malaria Research. , MR4/ATCC. Manassas, Virginia. (2013).
  27. WHO. Basic malaria microscopy. Part I. Learner's Guide. World Health Organization. , (1991).
  28. Tsuchiya, S. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). International Journal of Cancer. Journal International Du Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
  29. Fleit, H. B., Kobasiuk, C. D. The human monocyte-like cell line THP-1 expresses FcyRl and Fc'yRIl. Journal of Leukocyte Biology. 49, 556-565 (1991).
  30. Auwerx, J., Staels, B., Van Vaeck, F., Ceuppens, J. L. Changes in IgG Fc receptor expression induced by phorbol 12-myristate 13-acetate treatment of THP-1 monocytic leukemia cells. Leukemia research. 16 (3), 317-327 (1992).
  31. Ataíde, R., et al. Using an improved phagocytosis assay to evaluate the effect of HIV on specific antibodies to pregnancy-associated malaria. PloS One. 5 (5), 10807 (2010).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 162 phagocytosis opsonization נוגדנים מלריה שליה אריתוציטים נגועים טפילים IEs VAR2CSA
מדידת נוגדנים הרום Phagocytosis-באופן טבעי <em>כדי Plasmodium falciparum</em> טפילי על ידי אסאי מבוסס ציטומטריה זרימה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Quintana, M. d. P., Anabire, N. G.,… More

Quintana, M. d. P., Anabire, N. G., Hviid, L. Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay. J. Vis. Exp. (162), e61538, doi:10.3791/61538 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter