Summary
L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire istruzioni su come misurare la capacità degli anticorpi presenti nella sera o nel plasma degli individui, naturalmente esposti all'infezione da Plasmodium falciparum, di opsonizzare e indurre la fagonitosi degli etriciti infettati da parassiti (IE).
Abstract
Il protocollo descrive come impostare ed eseguire un'analisi della faciocitosi basata sulla citometria di flusso di erythrociti (IE) infettati da Plasmodium falciparum(IEs) opsonizzati da anticorpi IgG acquisiti naturalmente specifici per VAR2CSA. VAR2CSA è l'antigene parassita che media il sequestro selettivo di IE nella placenta che può causare una grave forma di malaria nelle donne in gravidanza, chiamata malaria placentale (PM). La protezione da PM è mediata da anticorpi specifici di VAR2CSA che si ritiene funzionino inibendo il sequestro placente e/o opsonizzando IEs per la fagocitosi. Il saggio impiega IE sincronizzati in fase avanzata che sono stati selezionati in vitro per esprimere VAR2CSA, plasma/siero-anticorpi da donne con immunità specifica PM acquisita naturalmente, e la linea cellulare fagocitica THP-1. Tuttavia, il protocollo può essere facilmente modificato per valutare la funzionalità degli anticorpi contro qualsiasi antigene parassita presente sulla superficie IE, sia indotto dall'esposizione naturale o dalla vaccinazione. Il saggio offre una valutazione semplice e ad alto rendimento, con buona riproducibilità, di un importante aspetto funzionale dell'immunità mediata dagli anticorpi nella malaria. È quindi utile quando si valuta l'immunità clinica alla malaria di P. falciparum, una delle principali cause di morbilità e mortalità nei tropici, in particolare nell'Africa sub-sahariana.
Introduction
La malaria è una malattia trasmessa da vettori causata nell'uomo dopo l'infezione con cinque diverse specie del genere Plasmodium. La specie più diffusa è P. falciparum, che è anche responsabile della maggior morbilità e mortalità1. La presentazione clinica della malaria varia da infezioni asintomatiche o benigne a malattie complicate/gravi, quest'ultima che si verifica principalmente nei bambini di età inferiore ai cinque anni. L'esposizione a P. falciparum non induce l'immunità sterile, ma gli individui che vivono in aree endemiche sviluppano lentamente l'immunità contro la malattia clinica. La protezione dipende dall'età/esposizione e l'immunità viene normalmente acquisita durante i primi 5-10 anni di vita2. Le donne adulte sono un'eccezione importante, in quanto la malaria grave può verificarsi durante la gravidanza in una presentazione clinica nota come malaria placenteale (PM). Pm è una causa importante di aborto, parto morto, parto prematuro, basso peso alla nascita, morte fetale e anemia materna. La resistenza al PM si sviluppa su gravidanze successive3. La protezione da PM è associata all'acquisizione di anticorpi contro il tipo VAR2CSA PfEMP14,5, un antigene superficiale di etritocite infetto (IE) che si lega al solfato di condroitina A (CSA) consentendo il sequestro IE nella placenta. Gli anticorpi mediano la protezione svolgendo varie attività funzionali (riviste in6,7) tra cui l'opsonizzazione di IE per indurre la fagocitosi. I primi studi in vitro hanno dimostrato che gli anticorpi possono limitare la crescita di P. falciparum in presenza di monociti tramite fagocitosi8,9. Studi più recenti hanno dimostrato che livelli più elevati di anticorpi che inducono la fagocitosi sono associati a migliori esiti di gravidanza (nel contesto della co-infezione da HIV)10,11, indicando la rilevanza di questa funzione ersione nella risposta immunitaria naturalmente acquisita.
Qui presentiamo un protocollo per misurare questa funzione di anticorpi presenti nel plasma/siero umano, utilizzando IE in vitro colture che esprimono VAR2CSA insieme alla linea monocita THP-1. Il saggio è stato precedentemente utilizzato11,12,13,1414,15,16,17,18 edè considerato un approccio migliorato e più facile rispetto ai protocolli precedenti basati sumicroscopio 8, poiché consente la sperimentazione di un maggior numero di campioni di anticorpi in una singola corsa utilizzando piccoli volumi di anticorpi ed evitando il conteggio della microscopia noiosa e di parte. Anche se il saggio è stato utilizzato da più laboratori e la sua esecuzione è abbastanza semplice, richiede un'attenta pianificazione e preparazione, quindi, un protocollo dettagliato consentirebbe la sua applicazione da laboratori e ricercatori privi di esperienza precedente. Usiamo, ad esempio, IE sincronizzati in fase avanzata che esprimono VAR2CSA opsonizzati con anticorpi presenti nel siero raccolti da donne con immunità specifica PM acquisita naturalmente. Tuttavia, il protocollo può essere facilmente modificato per valutare la funzionalità degli anticorpi contro qualsiasi antigene parassita presente sulla superficie IE, sia indotto dall'esposizione naturale o dalla vaccinazione.
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Protocol
I campioni di siero umano utilizzati per i risultati qui presentati sono stati raccolti in uno studio separato19. La raccolta è stata approvata dall'Institutional Review Board del Noguchi Memorial Institute for Medical Research dell'Università del Ghana (studio 038/10-11) e dai Comitati Etici di Ricerca Regionali, Regione Capitale della Danimarca (protocollo H-4-2013-083).
1. Cultura parassita
NOTA: Seguire le normative locali per la manipolazione dei patogeni umani.
- Mantenere i parassiti P. falciparum secondo il protocollo standard come descritto prima20 nel mezzo di coltura dei parassiti (vedi Tabella dei materiali).
- Mantenere i parassiti strettamente sincronizzati utilizzando il trattamento del sorbitolo come descritto in precedenza21.
- Per garantire l'espressione VAR2CSA sulla superficie dell'IE, eseguire ripetuti cicli di selezione immuno-magnetica utilizzando un anticorpo anti-VAR2CSA (ad esempio, anticorpo PAM1.4, un IgG222specifico monoclonale umano cross-reattivo accoppiato alla proteina G-magneticheperline 23.
- In breve, incubare la trophozoite-IE in fase avanzata con perline magnetiche accoppiate ad un anticorpo anti-VAR2CSA e selezionate positivamente utilizzando un magnete.
- Espandere i parassiti selezionati in coltura per alcuni cicli fino a quando la parassitimia è almeno del 5%.
- In alternativa, selezionare i parassiti che si legano alla CSA in plastica (il recettore per VAR2CSA) come descritto inprecedenza 24.
- Per verificare l'espressione VAR2CSA sui parassiti selezionati eseguire la citometria di flusso come descritto inprecedenza 25.
- In breve, etichettare la trophozoite-IE in fase avanzata con lo stesso anticorpo utilizzato per la selezione magnetica (punto 1.3) seguito da un anticorpo secondario etichettato in modo fluorescente.
- Misurare la reattività della superficie di IE in base alla citometria del flusso. La selezione degli anticorpi di successo normalmente si traduce in una popolazione di parassiti che esprime VAR2CSA nella maggior parte dei parassiti (≈80%).
- Per il saggio della fagocitosi, utilizzare la trophozoite-IE purificata a metà-stadio tardivo. Eseguire la purificazione utilizzando la separazione magnetica come descritto inprecedenza 26.
NOTA: Per determinare con precisione lo stadio dei parassiti, eseguire la colorazione Giemsa su strisci di sangue seguiti da osservazione leggera della microscopia. Seguire le procedure standard e le linee guida morfologiche descritte primadel 27. La purificazione in fase avanzata può essere eseguita anche utilizzando il mezzo di pendenza della densità. La resa di IE, tuttavia, nella nostra esperienza è inferiore e, quindi, la purificazione magnetica è preferibile.- Per la separazione magnetica, far girare la coltura del parassita (5-10% di parassitia) a 500 x g per 10 min a temperatura ambiente. Rimuovere il supernante e sospendere nuovamente il pellet cellulare in 10 mL di mezzo di coltura parassita.
- Aggiungere la sospensione del parassita in una colonna CS accoppiata a un magnete (vedere Tabella dei materiali) e lasciarla passare lentamente attraverso la colonna. I Trophozoite-IE sono paramagnetici (a causa della presenza di emozoina) e rimarranno nella rete di colonne.
- Lavare la colonna con 50 mL di media coltura parassita e elute le IE dalla colonna magnetica utilizzando 50 mL di mezzo di coltura parassita.
- Ruotare l'eluiato da 1,5,3 a 500 x g per 10 min a temperatura ambiente. Scartare con cura il supernatant e ri-sospendere in 1 mL di mezzo di coltura parassita.
- Utilizzando un emocitometro, contare il numero di IE (facilmente identificabili dalla microscopia leggera come eritrociti con pigmento emozoina scuro) e il numero totale di cellule per calcolare la parassita finale (percentuale di IEs).
NOTA: Utilizzare solo parassiti con almeno l'80% di purezza (80% IEs). - Sulla base del numero di campioni di siero/anticorpi previsti per il test, stimare la quantità totale di IE necessaria e aumentare di conseguenza le colture di parassiti. Un flacone di 75 cm2 con 25 mL di coltura al 5% di ematocrito e 5-10% parassita dovrebbe produrre abbastanza IE per eseguire un piatto completo di 96 pozzetti. Per una piastra completa (42 campioni più 6 controlli in duplicato), sono necessarie una sospensione minima di 1,5 mL di parassiti a 3,3 x10 7 IE/mL.
2. Cellule THP-1
NOTA: La linea di celle THP-1 viene utilizzata in questo saggio. Questa linea cellulare monocita è derivata da un paziente con leucemia monocitica28 e può essere acquistata da ATCC. Mantenere la linea della cella in base alle istruzioni del provider nel supporto di coltura THP-1 (vedere Tabella dei materiali).
- Per una manutenzione regolare, iniziare la coltura cellulare THP-1 a 2-4 x 105 celle/mL e sottocultura quando la concentrazione cellulare raggiunge 8 x 105 celle/mL.
NOTA: Non consentire alla concentrazione cellulare di superare 1 x 106 celle/mL e tenere traccia del numero di passaggio. Evitare l'uso di cellule che sono oltre il passaggio 25. Il tempo medio di raddoppio della linea cellulare THP-1 varia tra 19-50 h. Determinare il tempo di raddoppio del lotto cellulare prima di iniziare gli esperimenti di fagonecitosi. Ciò contribuirà a stimare approssimativamente la quantità necessaria di coltura necessaria per un determinato numero di campioni di siero da testare (ad esempio, per una piastra completa di 96 pormi, sono necessari 10 mL di coltura a 5 x10 5 cellule/mL). - Controllare periodicamente le cellule THP-1 per l'espressione superficiale dei Fcγ-recettori I (CD64), II (CD32) e III (CD16) comedescritto in precedenza 15.
- In breve, macchiare le cellule THP-1 (separatamente) con anticorpi anti-CD64, anti-CD32 e anti-CD16 con etichetta fluorescente(Tabella dei Materiali) per 30 min a temperatura ambiente (1:100 diluizione preparata nel 2% FBS in PBS).
- Lavare tre volte con il 2% di FBS in PBS e misurare la colorazione superficiale mediante citometria di flusso.
NOTA: le celle THP-1 sono negative per CD16 e positive per CD32 e CD64 come riportato inprecedenza 29,30 ( Figura1).
- Per il saggio sulla fagocitosi, impostare un flacone di coltura cellulare THP-1 con 2,5 x10 5 cellule/mL il giorno prima dell'esperimento per produrre circa 5 x10 5 cellule/mL il giorno del saggio.
NOTA: Assicurarsi che 4-6 x10 5 celle/mL siano presenti il giorno del saggio.
3. Analisi della fagocitosi (Figura S1)
- Prima di iniziare il saggio, bloccare (>1 h) due piastre di pozzo 96 dal fondo rotondo (una per l'opsonizzazione e un'altra per la fagocitosi) utilizzando 150 lL per pozzo di sterile 2% FBS in PBS.
NOTA: etichettare la piastra 1 come piastra di opsonizzazione e utilizzarla sia per la colorazione ethidium bromuro (EtBr) che per l'opsonizzazione. Etichettare la piastra 2 come piastra di fagocitosi e utilizzare sia per la placcatura cellulare THP-1 e per la fase di fagocitosi. - Colorazione e opsonizzazione dei parassiti
- Prendere la sospensione IE preparata in 1,6 e regolare il numero di cellule a 3,3 x 107 IE/mL aggiungendo il mezzo di coltura del parassita e l'EtBr per ottenere una concentrazione finale di 2,5 g/mL (1:40 diluizione, da uno stock di 0,1 mg/mL).
NOTA: EtBr macchia il DNA del parassita, consentendo il rilevamento per citometria del flusso.
CAUTION: EtBr è un mutageno e pelle, occhio, e irritante respiratorio. Utilizzare un'adeguata protezione e smaltire i rifiuti secondo le normative locali. - Rimuovere la soluzione di blocco da una delle 96 piastre di pozzo (piastra di opsonizzazione), facendo scorrere la piastra e rimuovendo l'eccesso di liquido su un pezzo di carta assorbente.
- Aggiungere 30 L per pozzo della sospensione IE preparata sopra nella metà superiore della piastra. Lasciare un pozzo vuoto e aggiungere 30 L di mezzo di coltura parassita (senza IE per il controllo da solo THP-1). (Figura S2A). Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente e protetto dalla luce.
- Aggiungere 170 L per pozzo di mezzo di coltura parassita. Ruotare la piastra a 500 x g per 3 minuti a temperatura ambiente e rimuovere il supernante facendo scorrere la piastra su un contenitore di rifiuti appropriato.
- Lavare gli IE etichettati con EtBr altre due volte utilizzando 200 L per pozzo di coltura parassita media filatura della piastra a 500 x g per 3 min a temperatura ambiente. Il supernatanto del primo lavaggio può essere rimosso facendo scorrere la piastra. Rimuovere con attenzione il supernatant dal secondo lavaggio utilizzando una pipetta multicanale per assicurarsi che l'intero volume del mezzo di lavaggio venga rimosso. Non disturbare il pellet.
- Sospendere nuovamente gli IE etichettati con EtBr in 30 L di anticorpo/plasma/siero soluzione preparata alle concentrazioni desiderate nel mezzo di coltura dei parassiti.
- Includere sempre i seguenti controlli ( Figura 2B ): un controllo senza controllo delle celle IEs/THP-1 (media di coltura del parassita); un controllo senza anticorpi o plasma/siero (controllo non opsonizzato); un controllo positivo utilizzando l'anticorpo antiritocidato anti-umano coniglio disponibile in mercato a 1:100 diluizione (c'è la tabella dei materiali); due controlli negativi del plasma/siero a 1:5 diluizione (una piscina malaria-ingenua e una piscina da maschi esposti alla malaria); e un controllo positivo del siero a 1:5 diluizione (una piscina da donne esposte alla malaria, che in precedenza sono state incinte (preferibilmente multigravidae)).
NOTA: Una diluizione 1:100 per il controllo positivo sembra funzionare in modo coerente su diversi lotti di anticorpi acquistati (dati non mostrati). Tuttavia, si raccomanda di escludere le variazioni tra i lotti testando diverse diluizioni ogni volta che viene utilizzato un nuovo lotto di anticorpi. - Incubare per 45 minuti al buio a 37 gradi centigradi.
- Prendere la sospensione IE preparata in 1,6 e regolare il numero di cellule a 3,3 x 107 IE/mL aggiungendo il mezzo di coltura del parassita e l'EtBr per ottenere una concentrazione finale di 2,5 g/mL (1:40 diluizione, da uno stock di 0,1 mg/mL).
- Preparazione delle cellule THP-1 e fagonesi
- Mentre le IE sono in fase di opsonized (3.2.8), iniziare a preparare le cellule THP-1.
- Rimuovere le cellule THP-1 dal pallone di coltura, girarle verso il basso (500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente), decantare il supernante e ri-sospendere il pellet nel mezzo di coltura cellulare THP-1.
- Girare di nuovo (500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente), decantare il supernante e sospendere nuovamente il pellet cellulare in 1 mL di THP-1 base di coltura cellulare.
- Determinare il numero di celle nella soluzione preparata sopra e aggiungere più mezzo per ottenere una concentrazione finale di 5 x10 5 cellule / mL.
- Rimuovere la soluzione di blocco dalla piastra di 96 pozzetto rimanente (piastra di fagocitosi) facendo scorrere la piastra e rimuovendo l'eccesso di liquido su un pezzo di carta assorbente.
- Aggiungere 100 L per pozzo della sospensione cellulare THP-1 preparata in 3.3.4 e rimetterli nell'incubatore di coltura cellulare (Figura S2C).
- Una volta che il tempo di incubazione anticorpo/plasma/siero è terminato, aggiungere 170 L per pozzo di mezzo di coltura parassitaria. Ruotare la piastra a 500 x g per 3 minuti a temperatura ambiente e rimuovere il supernante facendo scorrere la piastra su un contenitore di rifiuti appropriato.
- Lavare l'IEs opsonizzato altre due volte utilizzando 200 L per pozzo di mezzo di coltura parassita, ruotando la piastra a 500 x g per 3 min a temperatura ambiente. Il supernatanto del primo lavaggio può essere rimosso facendo scorrere la piastra. Rimuovere con cura il supernatant dal secondo lavaggio, utilizzando una pipetta multicanale per assicurarsi che l'intero volume del mezzo di lavaggio venga rimosso. Non disturbare il pellet.
- Infine, riassate le IE opsonizzate in 100 L di mezzo di coltura cellulare THP-1 pre-riscaldata. Trasferire 50 L di sospensione IE opsonizzata ad ogni pozzo nella piastra di fagocitosi. Poiché vi è un totale di 100 L di IE, ogni anticorpo/diluizione del siero può essere eseguito in duplicati nella piastra di fagocitosi (Figura S2D)
NOTA: la quantità di celle IE e THP-1 utilizzate nel saggio corrisponde a un rapporto 10:1. - Incubare per 40 min al buio a 37 gradi centigradi, 5% CO2.
NOTA: Non permettere alla fagocitosi di procedere per più di 40 min. - Fermare la fagocitosi con la centrifugazione a 4 gradi centigradi (500 x g, 5 min) e scartare il supernante facendo scorrere la piastra. Aggiungere 150 L della soluzione di la percorsi del cloruro di ammonio a temperatura ambiente (Tabella dei materiali) e mescolare mediante pipetta, incubare per esattamente 3 min.
NOTA: Questo passaggio lyserà gli erythrociti che non sono stati phagocytosed dalle cellule THP-1. - Fermare la lisi aggiungendo 100 L di ghiaccio-freddo 2% FBS in PBS. Ruotare la piastra a 4 gradi centigradi (500 x g per 3 min) e rimuovere il supernante facendo scorrere la piastra su un contenitore di rifiuti appropriato.
- Lavare tre volte con 200 L per pozzo di ghiaccio freddo 2% FBS in PBS filatura della piastra a 4oC (500 x g per 3 min). Dopo il lavaggio finale, riasssferire in 200 L di GHIACCIO-freddo 2% FBS in PBS e analizzare immediatamente per citometria di flusso.
NOTA: Le pubblicazioni precedenti hanno utilizzato la fissazione cellulare in paraformaldeide del 2% prima della citometria di flusso31, ma i risultati qui presentati sono stati acquisiti subito dopo il completamento del saggio. Non è consigliabile posticipare l'acquisizione dei dati is not di citometria del flusso memorizzando la piastra a 4 gradi centigradi, poiché la percentuale di celluleEtBr e THP-1 decade rapidamente (Figura S3).
- Acquisizione e analisi della citometria di flusso
NOTA: è possibile utilizzare qualsiasi citometro di flusso che supporta il formato della piastra di 96 ben e che abbia i laser/filtri appropriati per misurare la fluorescenza EtBr.- Per l'acquisizione, gate su celle THP-1 utilizzando un grafico lineare forward-scatter (FSC) vs side-scatter lineare (SSC) utilizzando i pozzi non sono stati aggiunti IE (Figura 2A) e acquisire 10.000 eventi su questo cancello.
- Misurare l'intensità della fluorescenza per EtBr (FL3-Log) sul cancello THP-1 utilizzando un grafico istogramma.
- Per il gating, è stato aggiunto il primo gate sulle celle THP-1 in un grafico di densità FSC e SSC, utilizzando i pozzi non sono stati aggiunti IE (Figura 2A). Impostare quindi un gate positivo in un istogramma FL3 (EtBr), utilizzando le celle THP-1 (nessun IEs aggiunto) e il controllo non opsonizzato (Figura 2B).
- Copiare questi cancelli in tutti gli altri campioni testati nella stessa piastra e determinare la percentuale di cellule THP-1 etbr-positive (cellule THP-1 che hanno phagocitizzato almeno un IE). Per ciascuno dei campioni testati, la fagocitosi può essere segnalata come valori assoluti (percentuale di celluleEtBr e THP-1) o come relativa fagocitosi calcolata come percentuale utilizzando il controllo positivo come massimo.
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Representative Results
Qui presentiamo in dettaglio un protocollo che è stato precedentementedescritto 31 eutilizzato 11,12,13,14,15,16,17,18 per misurare la capacità degli anticorpi mirati alla superficie di P. falciparum IEs per indurre l'osonizzazione e la fagontosi da cellule THP-1.
Il saggio misura specificamente la fagonitosi mediata dagli anticorpi e, pertanto, è necessaria l'interazione con i recettori Fc appropriati sulla superficie delle cellule THP-1. Per questo motivo, e come indicato nel protocollo, si consiglia di controllare periodicamente l'espressione di Fcγ-recettori sulla superficie delle cellule THP-1 per citometria di flusso. Le celle devono essere negative per CD16 (Figura 1A) e positive per CD32 e CD64 (Figura 1B,C).
Per il saggio, gli IE purificati in fase avanzata sono stati etichettati con EtBr e poi opsonizzati con anticorpi presenti nel plasma/siero di individui esposti alla malaria o alla malaria. La fagocitosi è stata misurata dalla citometria di flusso, quantificando la percentuale di celluleEtBr - THP-1 dopo 40 min di co-incubazione con IEs etichettate etBr e anticorpali. Inizialmente, le celle THP-1 venivano bloccate utilizzando un grafico di densità FSC e SSC (Figura 2A). Quindi, è statocreato un marcatore EtBr , utilizzando un istogramma FL3 sulle celle THP-1 e IE non opsonized ( Figura2B). Questi cancelli sono stati poi utilizzati per analizzare tutti gli altri controlli e campioni di prova.
I controlli negativi (comprese le sole cellule THP-1, il controllo IE non opsonizzato e i controlli con maschi esposti alla malaria e alla malaria) dovrebbero tutti generare un singolo picco negativo nel canale FL3 (Figura 3A) con solo pochi eventi nel marcatoreEtBr . Di conseguenza, i valori medio della fagocitosi sia come celleassolute EtBr e THP-1 che come percentuali relative di fagocitosi dovrebbero essere molto basse (Figura 3B, C, normalmente inferiore al 2% per tutti i casi). Al contrario, i controlli positivi (compreso l'anticorpo etritocite del coniglio e il pool femminile esposto alla malaria) dovrebbero generare tracce con due picchi(Figura 3A):uno negativo (in gran parte sovrapposto a quello generato da tutti i controlli negativi) e uno chiaramente positivo e ben separato situato all'interno del marcatoreEtBr. Un campione positivo, come l'esempio presentato (campione da una donna multigravid esposta alla malaria/NF20) dovrebbe generare un profilo simile a quello dei controlli positivi. I valori medio della fagocitosi, misurati come celluleassolute etBr -THP-1 e come relativa fagocitosi, erano normalmente più alti per il controllo positivo (58%/100%), seguiti dal pool femminile esposto alla malaria (29%/53%), e poi dalla singola donna esposta alla malaria (23%/40%). Come osservato nella Figura 3B,C, in cui sono presentati tre esperimenti indipendenti, c'è stata una notevole variabilità tra gli esperimenti e pertanto raccomandiamo l'esecuzione di campioni destinati al confronto nello stesso esperimento. Nelle nostre mani, almeno quattro piastre complete di 96 po 'possono essere maneggiate da un singolo ricercatore esperto. La variabilità tra i saggi è stata osservata chiaramente anche quando due esperimenti identici che testavano diversi campioni di siero da donne esposte alla malaria sono stati eseguiti contemporaneamente. Sono state utilizzate la stessa preparazione del parassita (dopo la purificazione magnetica degli IE in fase avanzata) e le diluizioni del siero. Le cellule THP-1 sono state conservate in due fiasche separate, ma sono state seme dalla stessa fiaschetta iniziale e gli esperimenti sono stati eseguiti da due diversi ricercatori. Anche se l'analisi sembra generare risultati coerenti se eseguita separatamente, con correlazioni lineari strette (r>0.9 sia per i valori assoluti che relativi della fagocitosi) tra i valori di fagocitosi misurati nei due esperimenti, il coefficiente di pendenza delle linee regolate si discosta da uno, indicando che i valori generati in diversi esperimenti non erano identici. Questa deviazione è stata più evidente per i valori assoluti (intervallo di confidenza del coefficiente di pendenza 0,55-0,72) rispetto ai valori relativi (intervallo di confidenza del coefficiente di pendenza 0,68-1)(Figura 4). Pertanto, raccomandiamo di utilizzare valori relativi, soprattutto se per qualche motivo (ad esempio, non abbastanza IE purificati, più di 4 piastre complete, ecc.) non è possibile eseguire tutti i campioni in un singolo esperimento. Consigliamo inoltre di eseguire esperimenti destinati all'analisi comparativa nel più breve periodo di tempo, per evitare di introdurre variazioni aggiuntive dovute alla deriva nell'espressione PfEMP1 (così come in altri antigeni) e a causa di sottili differenze sulle cellule THP-1 in base al tempo prolungato in termini di coltura.
Figura 1: recettori Fc espressi sulla superficie della cellula THP-1.
(A) Fcγ-recettore III/CD16 (rosso). (B) Fcγ-recettore II/CD32 (verde). C. Fcγ-recettore I/CD64 (arancione). Le celle non etichettate vengono visualizzate in blu. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Strategia di gating della citometria di flusso.
(A) Cellule THP-1 recintate su FSC/SSC. (B) Ethidium bromuro positivo (EtBr ) THP-1 cellule in un istogramma FL3.+ Vengono visualizzate le celle THP-1 da sole/senza IE aggiunte (blu), cellule THP-1 incubate con IE non opsonizzate (verde) e cellule THP-1 incubate con IEs opsonized con un controllo positivo (rosso). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Phagocitosi di IT4VAR04-IEs da cellule THP-1.
(A) Istogrammi di citometria di flusso rappresentativi di uno degli esperimenti presentati in B (identificati da simboli più grandi). (B) Percentuale di cellule EtBr- THP-1 (mezzi e deviazioni standard di tre esperimenti indipendenti). (C) Stessi dati come in B, dopo la normalizzazione rispetto al controllo positivo corrispondente. La codifica a colori è la stessa in tutti i pannelli: THP-alone (nero), non opsonizzato / nessun controllo anticorpo (blu), controllo anti-malaria -naif (ciano), piscina maschile esposta alla malaria (verde), piscina femminile esposta alla malaria (arancione), un donatore femminile esposto alla malaria (rosa), e controllo positivo / eritrociti anti-umani (rosso). Vengono visualizzate le deviazioni media e standard. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Phagocitosi di IT4VAR04 IEs da cellule THP-1 su opsonizzazione con siero da 10 donne esposte alla malaria.
Le trame presentano analisi di regressione lineare per due esperimenti identici eseguiti nello stesso giorno, ma da diversi ricercatori. (A) Dati presentati come valori assoluti e come (B) relativi alla fagonesi. Analisi eseguita utilizzando un software di analisi statistica. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura S1: Diagramma di flusso di analisi della fagocitosi. Diagramma di flusso che illustra i passaggi principali del saggio. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.
Figura S2: layout dell'esperimento a 96 pos. (A) Layout per l'etichettatura IEs EtBr. (B) Layout per l'opsonizzazione; 6 pozzi sono sempre riservati ai controlli. (C) Layout per la placcatura delle celle THP. (D) Layout per la fagonitosi. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.
Figura S3: codifica a colori come illustrato nella Figura 3. (A) Sovrapposizione istogramma di citometria di flusso di un esperimento acquisito immediatamente e (B) dopo lo stoccaggio a 4 gradi centigradi per 12 h. (C) Percentuale di celluleEtBr - THP-1 misurate prima e dopo lo stoccaggio. L'NF rappresenta diverse donatrici esposte alla malaria. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.
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Discussion
Il protocollo qui presentato è stato precedentemente descritto e utilizzato12,15,17,31 per misurare la capacità di anticorpi mirati alla superficie di P. falciparum IEs per indurre l'opsonizzazione e la faagocitosi da cellule THP-1. I risultati qui presentati si concentrano sugli anticorpi specifici var2CSA acquisiti naturalmente nel plasma/siero delle donne che vivono in una regione endemica di P. falciparum. VAR2CSA è un tipo di PfEMP1 coinvolto nel sequestro placental di IE, e un fattore determinante nella patogenesi del PM.
Il saggio può essere utilizzato per anticorpi indotti dall'immunizzazione e/o mirati ad altre varianti di PfEMP1 o a qualsiasi altro antigene parassita presente sulla superficie IE, a condizione che l'anticorpo testato interagisca con i Fcγ-recettori umani espressi dalle cellule THP-1 (CD32 e CD64). Il test è semplice, ad alta velocità effettiva (consentendo l'analisi di grandi set di campioni) e può essere eseguito in un giorno. La fagocitosi è misurata dalla citometria del flusso, quantificando la percentuale di celluleEtBr - THP-1 dopo 40 min di co-incubazione con IEs etichettate etBr e anticorpali.
Anche se il saggio dà risultati coerenti rispetto alle repliche sperimentali, c'è variabilità tra i valori assoluti misurati e, pertanto, si consiglia di calcolare i valori relativi utilizzando un controllo positivo che deve essere sempre incluso. Si consiglia inoltre di eseguire tutti i campioni da testare in un singolo esperimento, per evitare variazioni inter-assay come descritto in precedenza. Quando si testano campioni di siero raccolti da individui esposti all'infezione da P. falciparum, si consiglia di includere sempre una serie di campioni provenienti da individui ingenui da utilizzare come gruppo di controllo. Questo gruppo di controllo può essere utilizzato per impostare una soglia per determinare quali campioni di test devono essere considerati positivi.
Abbiamo già usato questo approccio per confrontare la capacità di indurre la faagocitosi di sera raccolti da bambini con diverse presentazioni cliniche sulla malaria (grave contro lieve)17.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Maiken Visti è ringraziato per l'eccellente assistenza tecnica. Questo lavoro è stato in parte finanziato da una sovvenzione (MAVARECA II; 17-02-KU) del Ministero degli Affari Esteri della Danimarca e amministrata dal Danida Fellowship Centre. Il finanziatore non ha avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well cell culture plates, round bottom with lid | Corning | 3799 | Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use |
| AlbuMAX-II | Gibco | 11021-037 | |
| AlbuMAX-II (5%) | - | - | 5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Anti-Red Blood Cells antibody | Abcam | ab34858 | Prepare 2μl aliquots and freeze a -20°C. Use one aliquot per experiment. |
| DPBS | Sigma | P8622 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10003D | |
| Ethidium bromide solution | Sigma | E1510 | Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light |
| FC500 flow cytometer | Beckman Coulter | Any flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used. | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099-141 | Heat inactivate before use. |
| FITC mouse anti-human CD16 | BD Biosciences | 555406 or 556618 | |
| FITC mouse anti-human CD32 | BD Biosciences | 552883 | |
| FITC mouse anti-human CD64 | BD Biosciences | 555527 | |
| FlowLogic software | Inivai technologies | Any flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist | |
| Gentamicin (10mg/mL) | Sigma | G1272 | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9377 | |
| L-glutamine (200mM) | Sigma | G7513 | |
| Lysing solution | - | - | 15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA |
| MACS CS-column and accesories | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | |
| Parasite culture medium | - | - | 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50µg/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL) | Sigma | P0781 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R5886 | |
| THP-1 culture medium | - | - | 10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Vario MACS magnet | Miltenyi Biotec |
References
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