Single-Cell Optisk Action Potentiel måling i human induceret pluripotente stamcelle-afledte kardiomyocytter
Summary
Her beskriver vi optisk erhvervelse og karakterisering af handlingspotentialer fra inducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter ved hjælp af et højhastigheds modulært fotometrisystem.
Abstract
Konventionelle intracellulære mikroelektrode teknikker til at kvantificere kardiomyocyt elektrofysiologi er yderst komplekse, arbejdskrævende, og typisk udføres i lav gennemløb. Hurtig og løbende udvidelse af induceret pluripotente stamcelleteknologi (iPSC) præsenterer en ny standard inden for hjerte-kar-forskning, og alternative metoder er nu nødvendige for at øge gennemløbet af elektrofysiologiske data på et enkelt celleniveau. VF2.1Cl er en nyligt afledt spænding følsomme farvestof, som giver en hurtig enkelt kanal, høj størrelsesorden reaktion på udsving i membran potentiale. Den har kinetika, der er bedre end andre eksisterende spændingsindikatorer, og stiller funktionelle data svarende til de traditionelle mikroelektrodeteknikker til rådighed. Her demonstrerer vi forenklede, ikke-invasive handlingspotentiale karakterisering i eksternt tempo menneskelige iPSC afledte kardiomyocytter ved hjælp af en modulær og meget overkommelig fotometri system.
Introduction
Elektrofysiologisk modellering af kardiomyocytter og opbygning af effektive platforme til screening af hjertemedicin er afgørende for udviklingen af terapeutiske strategier for en række arytmisk lidelser. Hurtig udvidelse af induceret pluripotente stamcelle (iPSC) teknologi har produceret lovende indhug i menneskers sygdom modellering og farmakologisk undersøgelse ved hjælp af isolerede patient afledte kardiomyocytter (iPSC-CM). “Gold standard” teknikker til elektrofysiologisk karakterisering af disse celler gennem patch-clamp (nuværende-klemme) kan kvantificere handling potentiale (AP) morfologi og varighed, men denne metode er utrolig kompleks og langsom, og ikke velegnet til høj gennemløb dataindsamling1. iPSC-CMs er regelmæssigt rapporteret at have en øget diastolisk membran potentiale og øget lækagestrøm i forhold til voksne indfødte kardiomyocytter2. Det foreslås, at mindre cellestørrelse og reduceret membran kapacitans observeret i iPSC-CMs kan producere nogle systematiske fejl, når du bruger den nuværende klemme teknik, måske forklare disse afvigelser3. For at maksimere nytten af en iPSC-CM-platform er en ekstra metode værdifuld for at øge gennemløbet og sikre datanøjagtighed, når du karakteriserer transmembranspændingsændringer på et enkelt celleniveau i iPSC-CMs.
Spændingsfølsomme farvestoffer (VSD) har længe været en foreslået metode til at give hurtigere, ikke-invasiv og tilsvarende analyse af hjerte AP kinetik svarende til de traditionelle teknikker4. En nylig undersøgelse har vist egnetheden af forholdetmetrisk spænding følsomme sonde fotometri til præcist kvantificere hjerte AP5. Desuden, evnen til let at opskalere optiske fotometri tilgange giver denne teknik til stor skala cardiotoksicitet skærme kritisk i terapeutisk lægemiddeludvikling (f.eks CiPA). Udvikling af standardiserede cardiotoxicity protokoller i en blændet multi-site undersøgelse ved hjælp af mikroelektrode array og spænding-sensing optiske teknikker har vist den vigtigste værdi af denne tilgang6.
Mange potentiometriske farvestoffer er kommercielt tilgængelige, og løbende syntetisk udvikling af nye sonder viser spændende potentiale for at strømline deres effektivitet på tværs af en række hjerte-og neurale konstruktioner. Den ideelle VSD vil have augmented kinetik og følsomhed, mens der vises nedsat kapacitiv belastning, fotobleaching og cytotoksicitet. Den nyligt syntetiserede VF2.1Cl (FluoVolt) udtrykker mange af disse gavnlige egenskaber i høj grad på grund af sin nye wire-baserede molekylære struktur, deles af andre medlemmer af den nye VoltageFluor (VF) familie7. I modsætning til almindelige elektrokrome VSD’er, hvor simple sonder molekylært og elektrisk konjugerer til plasmamembranen, består dette farvestof af en passivt indsat, membran-spænder syntetisk ledning, der parrer en elektron-rig donor med en modificeret fluorescein fluorophor (FITC). Mekanistiske detaljer findes i figur 1. Dette farvestof viser fremragende følsomhed over for membranspændingsudsving, der viser en 27% ændring i emissionsintensiteten pr. 100 mV i modsætning til ~ 10% set i andre almindelige sonder ved sammenlignelige hastigheder7. Derudover interagerer trådbaserede PeT-systemer ikke direkte med det cellulære elektriske felt, der producerer minimal elektrisk interferens og ubetydelige ændringer i cellulær kapacitiv belastning.
Figur 1: Kemiske, spektrale og mekanistiske parametre for VF2.1Cl farvestof. (A) Den kemiske struktur af VF2.1Cl. Molekylære egenskaber, der skal bemærkes, omfatter flere alkylgrupper i phenylen vinylen molekylærtråden, som letter indsættelsen i plasmamembranen. En negativt ladet sulfonsyregruppe, der er bøjet til FITC-sonden, sikrer fluorophorestabilisering på den ekstracellulære overflade og hjælper nær vinkelret indsættelse i forhold til lipid-bilayerens elektriske felt. (B) Et forenklet skema over vinkelret VF2.1Cl, der integreres i plasmamembranen i en målcelle. (C) Absorption og emission spektre af VF2.1Cl farvestof. Spektre er identisk med standard FITC- og GFP-sonder. (D) Skildring af VF2.1Cl’s mekanistiske virkningsmåde. Under hvileforhold (hyperpolariseret) driver negative intracellulære spændinger frie elektroner mod rostralfluoriphe. Elektron overflod sikrer foto-induceret elektron overførsel (PeT) er begunstiget som en vej ud af ophidset tilstand efter den optiske excitation, effektivt slukke fluorescens. I modsætning hertil påvirker et depolariseret membranpotentiale nedadgående elektronbevægelse, der favoriserer fluorescens ved optisk excitation. Den resulterende fluorescerende respons er lineært relateret til membranspænding og kan udnyttes præcist til at indsamle detaljerede tidsmæssige oplysninger om cellulær elektrofysiologisk kinetik. (E) Repræsentativt lysfelt (øvre) og fluorescens ved 470 nm (lavere) billeder af leporine kardiomyocytter fyldt med VF2.1Cl. (F) Z stak af en enkelt lastet kardiomyocyt. Pile angiver områder med klar lokalisering af VF2.1Cl til cellemembranen. Billeder blev erhvervet med en roterende disk confocal system bestående af en X-lightv3 spinning disk konfokal hoved med en 50 μm pinhole mønster; LDI-7 illuminator; Prime95B kamera og en PlanApo Lambda 100x mål. Skalalinje: 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
FITC-sonden, der er bøjet til VF2.1Cl, sikrer, at den kan bruges effektivt under standard- og GFP-filterkonfigurationer, og det kræver kun et enkelt kanalopsamlingssystem, som begge er fælles træk ved fluorescerende billedplatforme. Analyse af tætte humane iPSC-CM-monolag med dette farvestof er for nylig blevet rapporteret8,9,10,11. Vores protokol adskiller sig fra disse undersøgelser på grund af vores undersøgelse af enkelt, isolerede iPSC-CMs, unperturbed af de elektriske og parakrine påvirkninger af tætte syncytial monolayers, og vores brug af en overkommelig og tilpasses fotometri system i modsætning til komplekse confocal eller wide-field imaging arrangementer.
Her beskriver vi vores protokol for hurtig erhvervelse og analyse af robuste optiske AP’er fra isolerede menneskelige iPSC-afledte kardiomyocytter og indfødte kardiomyocytter (se supplerende fil). Vi bruger VF2.1Cl kombineret med en tilpasselig state of the art platform til enkelt celle fotometri målinger. Disse eksperimentelle protokoller er godkendt af den etiske komité på University Medical Center Göttingen (nr. 10/9/15).
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en grundlæggende protokol til nemt at erhverve detaljerede AP profiler fra isolerede iPSC-CMs egnet til elektrofysiologisk modellering og hjertemedicin screening. Vi registrerer regelmæssige, robuste APs fra vores sparsomt seedede iPSC-CMs, som antyder både indikatorfunktionalitet og metodologisk troskab.
På grund af det brede spektrum af kommercielle metoder til iPSC omprogrammering og manglende standardisering for hjertedifferentiering protokoller, iPSC baserede modeller…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne anerkende Cairn Research Ltd. for deres art finansielle bidrag, der dækkede produktionsomkostningerne ved denne publikation. Derudover takker vi Ines Mueller og Fru Stefanie Kestel for deres fremragende tekniske support.
Forfatternes forskning støttes af Det Tyske Center for Hjerte-Kar-Forskning (DZHK), Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation, VO 1568/3-1, IRTG1816 RP12, SFB1002 TPA13 og under Tysklands Excellence Strategy – EXC 2067/1- 390729940) og Else-Kröner-Fresenius Stiftung (EKFS 2016_A20).
Materials
| Reagents | |||
| 0.25 Trypsin EDTA | Gibco | 25200056 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| CaCl2 | Carl Roth | HN04.2 | |
| D(+)-Glucose anhydrous BioChemica | ITW Reagents | A1422 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| FluoVolt Membrane Potential Kit | Invitrogen | F10488 | |
| HEPES | Carl Roth | HN77.4 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 6781.1 | |
| Lamanin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | |
| Matrigel | BD | 354230 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 9265.2 | |
| Nifedipine | Sigma-Aldrich | 21829-25-4 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| ROCK Inhibitor Y27632 | Stemolecule | 04-0012-10 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 61870010 | |
| Versene EDTA | Gibco | 15040033 | |
| Equipment | |||
| 495LP Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | ||
| Circle Coverslips, Thickness 0 | Thermo Scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Digidata 1550B | Molecular Devices | ||
| Dual OptoLED Power Supply | Cairn Research | ||
| ET470/40x Excitation Filter | Chroma Technology | ||
| ET535/50m | Chroma Technology | ||
| Etched Neubauer Hemacytometer | Hausser Scientific | ||
| Filter Cubes | Cairn Research | ||
| IX73 Inverted Microscope | Olympus | ||
| MonoLED | Cairn Research | ||
| Multiport Adaptors | Cairn Research | ||
| Myopacer Cell Stimulator | IonOptix | ||
| Optomask Shutter | Cairn Research | ||
| Optoscan System Controller | Cairn Research | ||
| PH-1 Temperature Controlled Platform | Warner Instruments | ||
| Photomultiplier Detector | Cairn Research | ||
| PMT Amplifier Insert | Cairn Research | ||
| PMT Supply Insert | Cairn Research | ||
| RC-26G Open Bath Chamber | Warner Instruments | ||
| SA-OLY/2AL Stage Adaptor | Olympus | ||
| T565lpxr Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| T660lpxr Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| TC-20 Dual Channel Temperature Controller | npi Electronic | ||
| UPLFLN 40X Objective | Olympus | ||
| USB 3.0 Colour Camera | Imaging Source | ||
| Software | |||
| Clampex 11.1 | Molecular Devices | ||
| Clampfit 11.1 | Molecular Devices | ||
| IC Capture 2.4 | Imaging Source | ||
| Prism 8 | Graphpad |
Referências
- Miller, E. W. Small molecule fluorescent voltage indicators for studying membrane potential. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 74-80 (2016).
- Liang, P., et al. Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
- Horváth, A., et al. Low resting membrane potential and low inward rectifier potassium currents are not inherent features of hiPSC-derived cardiomyocytes. Stem Cell Reports. 10 (3), 822-833 (2018).
- Salama, G., Morad, M. Merocyanine 540 as an optical probe of transmembrane electrical activity in the heart. Science. 191 (4226), 485-487 (1976).
- Hortigon-Vinagre, M., et al. The use of ratiometric fluorescence measurements of the voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS to examine action potential characteristics and drug effects on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Toxicological Sciences. 154 (2), 320-331 (2016).
- Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
- Miller, E. W., et al. Optically monitoring voltage in neurons by photo-induced electron transfer through molecular wires. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (6), 2114-2119 (2012).
- Bedut, S., et al. High-throughput drug profiling with voltage- and calcium-sensitive fluorescent probes in human iPSC-derived cardiomyocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (1), 44-53 (2016).
- McKeithan, W. L., et al. An automated platform for assessment of congenital and drug-induced arrhythmia with hiPSC-derived cardiomyocytes. Frontiers in Physiology. 8, 766 (2017).
- Duncan, G., et al. Drug-mediated shortening of action potentials in LQTS2 human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells and Development. 26 (23), 1695-1705 (2017).
- Asakura, K., Hayashi, S., Ojima, A., Taniguchi, T., Miyamoto, N. Improvement of acquisition and analysis methods in multi-electrode array experiments with iPS cell-derived cardiomyocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 75, 17-26 (2015).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Kleinsorge, M., Cyganek, L. Subtype-directed differentiation of human iPSCs into atrial and ventricular cardiomyocytes. STAR Protocols. , 100026 (2020).
- Knollmann, B. C., Katchman, A. N., Franz, M. R. Monophasic action potential recordings from intact mouse heart: validation, regional heterogeneity, and relation to refractoriness. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 12 (11), 1286-1294 (2001).
- Leopold, J. A., Loscalzo, J. Emerging role of precision medicine in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (9), 1302-1315 (2018).
- Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents. Journal of Visualized Experiments. (77), e50235 (2013).
- Voigt, N., et al. Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ Leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 125 (17), 2059-2070 (2012).
- Voigt, N., et al. Cellular and molecular mechanisms of atrial arrhythmogenesis in patients with paroxysmal atrial fibrillation. Circulation. 129 (2), 145-156 (2014).
- Fakuade, F. E., et al. Altered atrial cytosolic calcium handling contributes to the development of postoperative atrial fibrillation. Cardiovascular Research. , 162 (2020).
- Gross, E., Bedlack, R. S., Loew, L. M. Dual-wavelength ratiometric fluorescence measurement of the membrane dipole potential. Biophysical Journal. 67 (1), 208-216 (1994).
- Matiukas, A., et al. Near-infrared voltage-sensitive fluorescent dyes optimized for optical mapping in blood-perfused myocardium. Heart Rhythm. 4 (11), 1441-1451 (2007).
- Mutoh, H., et al. Spectrally-resolved response properties of the three most advanced fret based fluorescent protein voltage probes. PLoS One. 4 (2), 4555 (2009).
- Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
- Huang, Y. L., Walker, A. S., Miller, E. W. A photostable silicon rhodamine platform for optical voltage sensing. Journal of the American Chemical Society. 137 (33), 10767-10776 (2015).
- Deal, P. E., Kulkarni, R. U., Al-Abdullatif, S. H., Miller, E. W. Isomerically pure tetramethylrhodamine voltage reporters. Journal of the American Chemical Society. 138 (29), 9085-9088 (2016).
- Fluhler, E., Burnham, V. G., Loew, L. M. Spectra, membrane binding, and potentiometric responses of new charge shift probes. Bioquímica. 24 (21), 5749-5755 (1985).
- Fromherz, P., Muller, C. O. Voltage-sensitive fluorescence of amphiphilic hemicyanine dyes in neuron membrane. Biochimica et Biophysica Acta. 1150 (2), 111-122 (1993).
- Salama, G., et al. Properties of new, long-wavelength, voltage-sensitive dyes in the heart. Journal of Membrane Biology. 208 (2), 125-140 (2005).
- Jin, L., et al. Single action potentials and subthreshold electrical events imaged in neurons with a fluorescent protein voltage probe. Neuron. 75 (5), 779-785 (2012).
- Kralj, J. M., Douglass, A. D., Hochbaum, D. R., MacLaurin, D., Cohen, A. E. Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin. Nature Methods. 9 (1), 90-95 (2012).
- Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins. Nature Methods. 5 (8), 683-685 (2008).
- Lundby, A., Mutoh, H., Dimitrov, D., Akemann, W., Knöpfel, T. Engineering of a genetically encodable fluorescent voltage sensor exploiting fast Ci-VSP voltage-sensing movements. PLoS One. 3 (6), 2514 (2008).
- Bradley, J., Luo, R., Otis, T. S., DiGregorio, D. A. Submillisecond optical reporting of membrane potential in situ using a neuronal tracer dye. The Journal of neuroscience. 29 (29), 9197-9209 (2009).
- Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).
- Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11, 464 (2020).
- Kettlewell, S., Walker, N. L., Cobbe, S. M., Burton, F. L., Smith, G. L. The electrophysiological and mechanical effects of 2,3-butane-dione monoxime and cytochalasin-D in the Langendorff perfused rabbit heart. Experimental Physiology. 89 (2), 163-172 (2004).
- Képiró, M., et al. para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable Myosin inhibitor. Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).
