Summary
这里介绍的方法总结了使用细胞外通量分析仪实时测量HSPCs的细胞外酸化速率（ECAR）和耗氧速率（OCR）评估非贴壁小鼠造血干细胞和原始祖细胞（HSPC）中细胞生物能量的优化方案。
Abstract
在稳态下，造血干细胞（HSC）在很大程度上保持静止，并且被认为主要依靠糖酵解来满足其能量需求。然而，在感染或失血等应激条件下，HSC增殖并迅速产生下游祖细胞，而下游祖细胞又进一步分化，最终产生成熟的血细胞。在这个转变和分化过程中，HSC从静止状态中退出，并迅速经历从糖酵解到氧化磷酸化（OxPHOS）的代谢转换。各种应激条件，如衰老，癌症，糖尿病和肥胖症，会对线粒体功能产生负面影响，从而改变造血过程中HSC和祖细胞的代谢重编程和分化。通过评估HSC和祖细胞在正常和胁迫条件下的糖酵解和线粒体功能，可以获得对其细胞外酸化率（ECAR）和耗氧率（OCR）的宝贵见解，这分别是细胞糖酵解和线粒体呼吸的指标。
在这里，提供了一个详细的方案，以使用细胞外通量分析仪测量小鼠骨髓来源的谱系阴性细胞群中的ECAR和OCR，其中包括造血干细胞和原始祖细胞（HSPC）。该协议描述了从小鼠骨髓中分离谱系阴性细胞的方法，解释了这些测定中使用的细胞接种密度和2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG，抑制糖酵解的葡萄糖类似物）和各种OxPHOS靶向药物（寡霉素，FCCP，鱼藤酮和抗霉素A）浓度的优化，并描述了药物治疗策略。糖酵解通量的关键参数，如糖酵解、糖酵解容量和糖酵解储备，以及OxPHOS参数，如基础呼吸、最大呼吸、质子泄漏、ATP产生、备用呼吸能力和偶联效率，可以在这些测定中测量。该协议允许在非贴壁性HSPCs上进行ECAR和OCR测量，并且可以推广以优化任何类型悬浮细胞的分析条件。
Introduction
造血是由HSCs1形成具有高度专业化功能的各种类型的成熟血细胞的过程。HSC能够自我更新和分化成各种多能和谱系特异性祖细胞群。这些祖细胞最终产生淋巴样、髓系、红细胞和巨核细胞谱系的细胞。为了保持其自我更新能力，HSC在很大程度上保持静止状态，并且与其他组织干细胞一样，被认为依靠糖酵解而不是线粒体OxPHOS来产生ATP2，3。进入细胞周期导致呼吸和OxPHOS增强，导致活性氧（ROS）水平升高，这对HSC的维持和功能有害3。因此，重复的细胞分裂可能导致HSC的自我更新能力降低，并最终导致其耗尽。
在成人造血中，HSC主要经历不对称细胞分裂，在此期间，其中一个子细胞保留HSC潜力并继续依赖糖酵解代谢。另一个子细胞成为原始的祖细胞，失去自我更新能力，但增殖并最终产生分化的功能性造血细胞4。当HSCs分化产生下游祖细胞时，从糖酵解到线粒体代谢的转变被认为是为了提供支持这种快速转变所需的能量和构建块5，正如HSC具有无活性线粒体质量6，7，8，9的观察结果所表明的那样。.相反，线粒体活性（由连锁ROS水平表示）在谱系承诺的祖细胞中远高于HSCs9，10，11。因此，在造血最早阶段发生的代谢变化表明线粒体在调节HSC命运中具有直接和至关重要的作用。
在各种应激条件下（如衰老、癌症、糖尿病和肥胖）下存在的功能失调线粒体12 会干扰 HSC 自我更新能力，通过产生过量的 ROS、损害 ATP 生成和/或改变其他代谢过程来诱导 HSC/祖细胞分化的失衡9，12，13.HSC/祖细胞分化中代谢稳态的扰动可显著影响造血，可能导致血液学异常的发展13.鉴于糖酵解和线粒体OxPHOS对HSC干性和分化的关键影响，研究正常和胁迫条件下的代谢参数是有意义的。通过评估其ECAR和OCR，可以获得对HSC和祖细胞的糖酵解和线粒体功能的宝贵见解，它们分别是细胞糖酵解和线粒体呼吸的指标。
Seahorse细胞外通量分析仪是一种功能强大的仪器，每孔配备两个探针，可同时测量活细胞中的ECAR和OCR，因此可用于实时评估细胞生物能量，以响应各种底物或抑制剂。与分析仪一起使用的检测盒包含进样口，可容纳多达四种药物，以便在测定过程中自动进样。典型的糖酵解压力试验方案如图 1A所示。该测定从测量细胞的ECAR开始，在含有谷氨酰胺但不含有葡萄糖或丙酮酸的糖酵解胁迫测试培养基中孵育。这表示由于细胞的非糖酵解活性而发生的酸化，并且被报道为非糖酵解酸化。接下来以饱和浓度注射葡萄糖。通过糖酵解，细胞中的葡萄糖转化为丙酮酸盐，丙酮酸盐在细胞质中进一步代谢以产生乳酸盐，或在线粒体中产生CO2 和水。
葡萄糖转化为乳酸盐导致净产生并随后将质子释放到细胞外培养基中，导致ECAR14，15，16的快速增加。ECAR中这种葡萄糖刺激的变化被报告为基础条件下的糖酵解。第二次注射由寡霉素（ATP合酶的抑制剂，又名复合物V17）组成，其抑制线粒体ATP的产生。在寡霉素介导的OxPHOS抑制期间，细胞最大限度地上调糖酵解以满足其能量需求。这导致ECAR进一步增加，揭示了细胞的最大糖酵解能力。最大糖酵解能力与基础糖酵解之间的差异称为糖酵解储备。最后，注射2-DG，这导致ECAR显着下降，通常接近非糖酵解酸化水平。2-DG是一种葡萄糖类似物，具有竞争力地与己糖激酶结合，导致糖酵解18的抑制。因此，2-DG诱导的ECAR降低进一步证实糖酵解确实是葡萄糖和寡霉素注射后观察到的ECAR的来源。
图1B 显示了典型线粒体压力测试的示意图。该测定从细胞的基线OCR测量开始，在含有葡萄糖，谷氨酰胺和丙酮酸的线粒体压力测试培养基中孵育。在基础OCR测量之后，在该测定中注入寡霉素，其抑制复合物V，从而减少通过电子传递链（ETC）的电子流动17。因此，OCR在寡霉素注射后降低，OCR的这种降低与线粒体ATP产生有关。第二次注射剂由羰基氰化物-4（三氟甲氧基）苯腙（FCCP），质子团和线粒体OxPHOS17的解偶联剂组成。FCCP通过允许质子流过线粒体内膜来折叠线粒体质子梯度。由于FCCP注射，通过ETC的电子流被抑制，复合物IV以最大水平消耗氧气。最大OCR和基础OCR之间的差异被称为备用呼吸能力，这是细胞在压力条件下对增加的能量需求做出反应的能力的衡量标准。最后，注射两种ETC抑制剂（鱼藤酮，复合物I抑制剂和抗霉素A，复合物III抑制剂17）的混合物，其完全关闭电子流，OCR降低到低水平。鱼藤酮和抗霉素A注射后测量的OCR对应于由细胞内其他过程驱动的非线粒体OCR。非线粒体 OCR 能够计算基底呼吸、质子泄漏和最大呼吸。
基础呼吸代表基线 OCR 和非线粒体 OCR 之间的差异。质子泄漏是指寡霉素注射后的OCR与非线粒体OCR的区别。最大呼吸量表示 FCCP 注射后 OCR 与非线粒体 OCR 之间的差异。耦合效率计算为ATP生产率与基础呼吸速率的百分比。该方法论文提供了使用海马XFe96细胞外通量分析仪测量谱系阴性HSPC中ECAR和OCR的详细方案。该协议描述了分离小鼠谱系阴性HSPC的方法，解释了细胞接种密度和细胞外通量测定中使用的各种药物浓度的优化，并描述了药物治疗策略。
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Protocol
所有脊椎动物实验均由密歇根大学动物使用和护理委员会批准并按照其进行。
1.测定前一天（总时间：约10分钟）
- 传感器滤芯的水化（步骤时间：约 10 分钟）
- 打开细胞外通量测定试剂盒，取下传感器盒和实用板组件。保存装载指南单位，以便第二天使用。
- 手动将传感器盒（带盖的顶部绿色部分）与实用板（下部96孔微孔板）分开，并将其倒置放在实用板旁边。
- 使用多通道移液器，用200μL校准剂填充实用板的每个孔，包含在通量测定试剂盒中。
- 将传感器盒放回多功能板上，确保将传感器完全浸入校准器中。
- 将组装好的传感器盒和带有校准剂的实用板放入非CO2 37°C培养箱中过夜。为防止校准剂蒸发，请确保培养箱适当加湿。如果使用常规烘箱培养箱进行非CO2 37°C培养，请在培养箱内放置一个装有水的开放式烧杯以加湿。如果可用，请使用XF制备站进行所有非CO2 37°C孵育。
注：或者，传感器滤芯可在非 CO 2 37 °C 培养箱中用每孔200 μL 无菌超纯水水合过夜。用每孔200μL的37°C预热校准剂代替水，至少在测定当天加载注射口前45-60分钟。
2.测定当天（总时间：〜9小时30分钟）
注：除步骤2.5或步骤2.6外，上述总时间还包括步骤2.1-2.4的累计持续时间。
- 制备细胞粘合剂包被的微孔板（步骤时间：〜1小时30分钟）
注：在生物安全柜中执行所有步骤。- 通过将56μg细胞粘合剂溶解在适当体积的0.1M碳酸氢钠（pH 8.0）中，并立即以所用细胞粘合剂原液的一半体积加入1 N氢氧化钠，每96孔细胞培养微孔板制备2.5mL细胞粘合剂溶液（22.4μg/ mL，参见 材料表）。涡旋或移液器上下搅拌以混合。
- 打开96孔细胞培养微孔板（包含在助焊剂测定试剂盒中），并在每个孔的底部分配25μL制备的细胞粘合剂溶液。用盖子盖住微孔板，并在室温下在罩内孵育30分钟。
- 孵育后，使用多通道移液器或吸出器除去多余的细胞粘合剂溶液，并用200μL无菌超纯水洗涤每个孔两次。将板风干，取下盖子，在罩内30-45分钟。
注意：细胞粘合剂包被的细胞培养微孔板可以在4°C下储存长达一周。 在接种细胞之前，必须允许储存在4°C下的预涂微孔板在罩内加热至室温。
- 制备测定培养基（步骤时间：约30分钟）
- 糖酵解负荷试验测定培养基的制备
- 补充100毫升基础培养基（见 材料表）与1毫升200毫升L-谷氨酰胺。
注意：测定培养基中的最终L-谷氨酰胺浓度为2mM。 - 在水浴中将L-谷氨酰胺补充的培养基加热至37°C。
- 用1 N NaOH将温介质的pH值调节至7.4。
- 用0.2μm过滤器对培养基进行过滤灭菌，并将其保持在37°C直至准备使用。
- 补充100毫升基础培养基（见 材料表）与1毫升200毫升L-谷氨酰胺。
- 线粒体负荷试验测定培养基的制备
- 补充100毫升基础培养基，含0.45克葡萄糖，1毫升200毫升L-谷氨酰胺和1毫升100毫升丙酮酸钠。
注意：最终的测定培养基含有25 mM葡萄糖，2 mM L-谷氨酰胺和1 mM丙酮酸钠。 - 在水浴中将葡萄糖，L-谷氨酰胺和丙酮酸钠补充培养基加热至37°C。
- 用1 N NaOH将温介质的pH值调节至7.4。
- 用0.2μm过滤器过滤灭菌培养基，并保持在37°C直至准备使用。
- 补充100毫升基础培养基，含0.45克葡萄糖，1毫升200毫升L-谷氨酰胺和1毫升100毫升丙酮酸钠。
- 糖酵解负荷试验测定培养基的制备
- 收获小鼠谱系阴性 HSPC（步骤时间：约 3 小时）
- 通过将Hank的平衡盐溶液与4%胎牛血清补充来制备测定缓冲液。通过用无菌蒸馏水稀释5x储备液来制备1x富集缓冲液。将两种缓冲液放在冰上，直到使用。
- 使用CO2 人道地安乐死小鼠，然后使用宫颈脱位并用剪刀去除后肢。小心地从骨骼中取出所有组织，并用剪刀从股骨和胫骨两侧切开末端。使用测定缓冲液从股骨和胫骨中冲洗出骨髓细胞。将冲洗的细胞通过无菌的70μm过滤器，在4°C下以200× g 离心滤液5分钟，并丢弃上清液。
- 通过将细胞沉淀重悬于500μLACK缓冲液（150mM NH4Cl，10mM KHCO3，0.1mM EDTA，pH 7.2）中来裂解红细胞。在冰上裂解1分钟后，通过加入1mL测定缓冲液洗涤样品，并在4°C下以200× g 离心5分钟。 弃去上清液。
- 洗涤后，将样品与针对CD2（1：200稀释），CD3（1：200稀释），CD5（1：200稀释），CD8（1：200稀释），Ter-119（1：200稀释），B220（1：200稀释）和Gr-1（1：800稀释）的混合物一起孵育样品，在总体积为500μL测定缓冲液的冰上孵育45分钟。
- 如上所述，用1mL测定缓冲液离心样品。
- 如上所述，用1 mL 1x富集缓冲液洗涤样品并进行离心。
- 将样品与20μL链霉亲和素纳米珠和100μL1x富集缓冲液在冰上孵育15分钟。
- 如上所述，用1 mL 1x富集缓冲液洗涤样品并进行离心。
- 将样品重悬于2.5 mL 1x富集缓冲液中。将它们放在分离磁铁上5分钟。将上清液分别收集在15 mL锥形管中。
- 将磁铁分离的样品重悬于另外的2.5mL 1x富集缓冲液中，并再次将其放在分离磁铁上5分钟。从步骤2.3.9开始，在15mL锥形管中收集并组合上清液到先前的收集物中。
注意：上清液含有谱系阴性细胞组分。 - 在4°C下以200× g 离心含有负选择细胞的15mL锥形管5分钟。
- 将细胞沉淀重悬于1 mL测定缓冲液中，并使用台盼蓝手动或通过自动细胞计数器（如Countess 3）计数细胞数。
注意：按照上述方法，应从单个小鼠的后肢中轻松纯化约6×10 6 谱系阴性HSPC。如果在实验前一天制备试剂，例如测定缓冲液，1x富集缓冲液和谱系特异性抗体混合物，则大约需要2.5-3小时才能从4只小鼠中富集HSPCs。超过此数字的每只小鼠需要额外的10分钟。
- 在细胞粘合剂包被的微孔板中接种细胞（步骤时间：〜1小时）
- 从步骤2.3.12中在室温下以200× g 离心细胞5分钟。
- 除去上清液并将细胞沉淀重悬于适当的测定培养基（糖酵解压力测试培养基或线粒体压力测试培养基）中。在室温下以200× g 离心5分钟。
- 重复步骤 2.4.2。除去上清液并将细胞重悬于适当的加热测定培养基中至每50μL2.5×105 个细胞或每mL5×106 个浓度。
- 移液管50μL细胞悬浮液沿着室温细胞粘合剂包被的96孔细胞培养微孔板的一侧。将50μL测定培养基移入角落背景测量孔中。使用多通道移液器进行细胞接种，以确保一致性。
- 通过每孔非包被的96孔细胞培养微孔板加入50μL水来创建离心平衡板。
- 在室温下以200× g 离心平板中的细胞1分钟。不要踩刹车。将板转移到非CO2 37°C培养箱中25-30分钟，以确保细胞完全附着。在显微镜下目视确认细胞稳定地粘附在微孔板表面。
注意：由于可以从单个小鼠的后肢收获约6×10个6谱系阴性HSPC，因此如果目的是并行筛选多个体外干预，则需要从4只小鼠（约2.4×10个7个细胞）中分离出的HSPC来填充整个96孔板。然而，如果目的是研究遗传改变或干预对体内HSPC代谢参数的影响，那么从多对对照和测试小鼠中分离的HSPC可以使用单个板在多个技术重复中并行分析。
- 使用细胞外通量分析仪进行糖酵解压力测试（步骤时间：〜3小时30分钟）
- 带注射化合物的装载传感器盒
- 在预热糖酵解胁迫测试测定培养基（pH 7.4）中制备100mM葡萄糖，20μM寡霉素和500mM 2-DG溶液。
注意：所有注射化合物溶液均在10倍浓度下制成。最终孔浓度为葡萄糖10 mM，寡霉素为2μM，2-DG为50 mM（见 表1）。 - 从步骤1.1.5中的非CO2 37°C培养箱中取出水合传感器盒。通过将传感器盒从校准器中取出并将其与校准器更换到同一功能板上，从实用板上清除校准器上的气泡。
- 将A / D加载指南平放（包含在细胞外通量测定试剂盒中）放在传感器盒的顶部，使其定向，使字母“A”位于左上角，以确保只有端口A可用于加载。使用多通道移液器，在端口A中分配20μL100mM葡萄糖溶液。
- 将 A/D 装载导轨平放，将 B/C 装载导轨平放，使字母“B”位于左上角，以确保只有端口 B 可用于装载。使用多通道移液器，在端口B中分配22μL20μM寡霉素溶液。
- 将 B/C 上样导轨重新定向平整，以将字母“C”定位在左上角的上角，用于装样口 C.使用多通道移液器，在端口 C 中分配 25 μL 的 500 mM 2-DG 溶液。
- 卸下并丢弃装载导轨平板。
注意：重要的是，所有96个孔的每个端口系列，包括背景孔的端口系列，都要完全加载相同体积的注入化合物。
- 在预热糖酵解胁迫测试测定培养基（pH 7.4）中制备100mM葡萄糖，20μM寡霉素和500mM 2-DG溶液。
- 模板创建、校准和测量
- 在控制器上创建或加载糖酵解压力测试的模板。输入有关注射策略，治疗条件和细胞类型的详细信息，然后按 生成组。转到 板块图 并将孔分配给要分析的每个组。分配 4 个角孔进行背景测量。
- 在协议中，确保在初始化步骤中检查校准和平衡。
- 对于基线测量和每次注射后的测量（葡萄糖，寡霉素和2-DG），将 测量周期 数设置为 3 ， 混合 - 等待 - 测量时间 至 3分钟 - 0分钟 - 3 分钟（见 表2）。
- 从装填的化合物和水合传感器盒中取下盖子，浸没在实用板中的校准剂中。将其放在细胞外通量分析仪的工作托盘上并开始运行。
注意：第一步是校准，通常需要约20分钟。 - 从步骤2.4.6的非CO2 37°C培养箱中取出含有细胞的微孔板，孵育25-30分钟结束后。在不干扰细胞的情况下，每孔缓慢加入130μL预热糖酵解胁迫试验培养基（pH 7.4），以将每个孔中的培养基体积补足至180μL，并将板返回到非CO2 37°C培养箱中，再增加15-20分钟。
注意：离心后的总孵育时间为45-60分钟是优选的。 - 校准结束后，用含有细胞的测定微孔板（无盖）替换实用板。按 称重传感器板开始测量，完成测定需要约1.5小时。
- 测量结束后，收集含有细胞的测定微孔板并除去测定培养基而不干扰细胞。用250μL1x磷酸盐缓冲盐水轻轻洗涤一次，而不会使细胞脱落。
- 加入10μLRIPA裂解缓冲液（50mM Tris-HCl，pH 7.4，1%NP-40，0.5%脱氧胆酸钠，0.1%十二烷基硫酸钠，150mM NaCl，2mM EDTA，50mM NaF），补充1x蛋白酶抑制剂鸡尾酒，并在振荡器上搅拌板10分钟。将整个板在-80°C下冷冻。
- 解冻板，并按照制造商的说明进行蛋白质测量测定以进行数据归一化。
- 检索和分析数据。使用Wave桌面软件打开数据文件。单击“ 归一化” 并粘贴每个孔的归一化值。单击“ 应用 ”以规范化数据。单击“ 导出 ”并选择“ 糖酵解压力测试报告生成器 ”，将分析的数据导出到报告生成器。或者，将数据导出到外部应用程序。
注意：或者，每个孔中的总核DNA含量可用于使数据归一化。与核酸结合的荧光染料，如CyQuant，可用于评估每孔的总核DNA含量。
- 带注射化合物的装载传感器盒
- 使用细胞外通量分析仪进行线粒体压力测试（步骤时间：〜3小时30分钟）
- 带注射化合物的装载传感器盒
- 在预热线粒体压力测试测定培养基（pH 7.4）中制备20μM寡霉素，20μM FCCP和5μM鱼藤酮+ 5μM抗霉素A溶液。
注意：所有注射化合物溶液均在10倍浓度下制成。寡霉素的最终孔浓度为2μM，FCCP为2μM，鱼藤酮和抗霉素A的终孔浓度为0.5μM（见 表3）。 - 从步骤1.1.5的37°C培养箱中取出水合物传感器盒，并按照前面的步骤2.5.1.2所述除去气泡。
- 通过执行步骤2.5.1.3至2.5.1.6，在端口A中分配20μL的20μM寡霉素，在端口B中分配22μL的20μM FCCP，在端口C中分配25μL的5μM鱼藤酮和5μM抗霉素A的混合物。
注意：重要的是，所有96个孔的每个端口系列，包括背景孔的端口系列，都要完全加载相同体积的注入化合物。
- 在预热线粒体压力测试测定培养基（pH 7.4）中制备20μM寡霉素，20μM FCCP和5μM鱼藤酮+ 5μM抗霉素A溶液。
- 模板创建、校准和测量
- 在控制器上创建或加载线粒体压力测试的模板。输入有关注射策略，治疗条件和细胞类型的详细信息，然后按 生成组。转到 板块图 并将孔分配给要分析的每个组。分配 4 个角孔进行背景测量。
- 在协议中，确保在初始化步骤中检查校准和平衡。
- 对于基线测量和每次注射后的测量（寡霉素，FCCP和鱼藤酮+抗霉素A），将 测量周期 数设置为 3 和 混合 - 等待 - 测量时间 至 3分钟 - 0分钟 - 3分钟 （见 表4）。
- 启动运行以执行校准，如步骤 2.5.2.4 所示。
- 在步骤2.5.2.5中每孔加入130μL预热线粒体压力试验培养基（pH 7.4）。
- 开始测量;检索和分析数据，如步骤 2.5.2.6 到 2.5.2.10 所示。将分析的数据导出到 线粒体压力测试报告生成器 或外部应用程序。
- 带注射化合物的装载传感器盒
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Representative Results
使用该协议，优化各种OxPHOS靶向药物（用于细胞外通量测定）的细胞数量和浓度，以测量从24周龄雌性C57BL / 6小鼠中分离的HSPC的ECAR和OCR。首先，进行糖酵解胁迫试验，以优化细胞数量和寡霉素浓度。在该测定中使用每孔不同数量的HSPC，范围从5×10 4 到2.5×10 5 。如图 2A 和 图2C所示，非糖酵解酸化速率随着细胞数量的增加而升高，从5×104 增加到2.5×105 ，但在2×10 5到2.5 ×105 个细胞之间仅略有增加。正如预期的那样，注射10mM葡萄糖刺激所有细胞数量的糖酵解，在每孔2.5×105 个细胞时观察到ECAR的最大增加。然而，注射2μM寡霉素不会像其他预期的那样进一步增加ECAR。使用1μM寡霉素产生类似的结果（未显示）。这些结果可以被解释为表明这些寡霉素浓度在这些测定中不是最佳的。
然而，在同一组糖酵解胁迫试验中获得的OCR数据显示，两种测试的寡霉素浓度（1μM和2μM）确实有效，正如由于复合物V抑制而注射寡霉素后OCR显着下降所表明的那样（参见 图2B为2μM 寡霉素;对于1μM寡霉素未显示）。在两种测试的寡霉素浓度下，观察到OCR的最大降低为每孔2.5×105 个细胞。最后，注射50mM 2-DG导致ECAR显着降低，这意味着糖酵解是这些实验中观察到的ECAR的来源。综上所述，可以得出结论，在这些测定中，HSPC在葡萄糖注射后达到最大的糖酵解，并且它们具有很少甚至没有糖酵解储备。这表明，与纯化的HSCs一样，谱系阴性HSPC（包括该测定中使用的HSC部分）也主要依靠糖酵解来产生ATP。在糖酵解速率高的细胞中，寡霉素介导的线粒体ATP产生抑制ATP需求可能没有显着增加。细胞可以很容易地控制线粒体ATP的损失，而无需进一步上调糖酵解19。糖酵解胁迫试验参数 - 非糖酵解酸化，糖酵解，糖酵解容量和糖酵解储备如图 2C所示 - 按照前面在介绍和方案部分所述计算。根据这些数据，每孔选择2.5×105 个细胞和2μM寡霉素进行进一步研究。
线粒体负荷试验用于FCCP浓度的优化。在该测定中，每孔使用2.5×105 HSPC，如前所述通过糖酵解胁迫试验进行了优化。如图 3A所示，测定从基线OCR的测量开始，然后注射2μM寡霉素，通过抑制复合物V引起OCR的显着降低。在寡霉素注射后OCR测量之后，以不同的浓度注射FCCP：0.5μM，1μM，1.5μM和2μM。如前所述，FCCP通过解耦来自OxPHOS的质子转运来逆转寡霉素诱导的通过ETC的电子流的抑制，并迫使复合物IV最大限度地消耗氧气。如图 3A所示，FCCP以剂量依赖性方式刺激HSP中的OCR，在FCCP的2μM下观察到OCR的最大增加。最后，注入0.5μM鱼藤酮和0.5μM抗霉素A的混合物，其完全关闭通过ETC的电子流，并且OCR降低到其最低水平。鱼藤酮和抗霉素A注射后测量的OCR对应于非线粒体耗氧量。其他线粒体应激试验参数 - 基底呼吸，最大呼吸，质子泄漏，ATP产生，备用呼吸能力和偶联效率，如图 3B所示 - 按照前面在介绍和协议部分所述计算。最后，选择2 μM的FCCP进行进一步研究。
图1：使用细胞外通量分析仪评估糖酵解功能和线粒体呼吸的示意图。 显示了糖酵解压力试验（A）和线粒体负荷试验（B）中使用的各种效应化合物的序列和注射时间。（A）概述糖酵解参数、糖酵解、糖酵解容量、糖酵解储备和非糖酵解酸化，以及（B）线粒体功能参数、基础呼吸、ATP相关呼吸、最大呼吸、非线粒体耗氧量、质子泄漏和备用呼吸能力。缩写：ECAR =细胞外酸化速率;2-DG = 2-脱氧-D-葡萄糖;OCR = 耗氧率;FCCP = 羰基氰化物-4（三氟甲氧基）苯腙;腐烂。= 鱼藤酮;反。A = 抗霉素 A . 请点击这里查看此图的大图。
图2：评估小鼠HSPC中的糖酵解功能。进行糖酵解负荷试验以测量（A）从24周龄雌性C57BL / 6小鼠中分离的HSPCs的细胞外酸化速率（ECAR，mpH / min）和（B）耗氧速率（OCR，pmol / min）。有时，注射葡萄糖（10mM），寡霉素（2μM）和2-DG（50mM）。（C）ECAR计算为每5个×10 4、1个×10个5、1个×10个5、1.5个×10个5、2个×10个5、2个×10个5个HSPCs/孔的非糖酵解酸化、糖酵解容量和糖酵解储备。数据表示为SEM±平均值，n = 4。缩写：HSPCs =造血干细胞和原始祖细胞;ECAR = 细胞外酸化速率;2-DG = 2-脱氧-D-葡萄糖;OCR = 耗氧率。请点击此处查看此图的大图。
图3：评估小鼠HSPC中的线粒体呼吸。 进行线粒体压力测试以测量（A）从24周龄雌性C57BL / 6小鼠中分离的HSPC的耗氧率（pmol / min）。有时，注射寡霉素（2μM），FCCP（0.5μM，1μM，1.5μM，2μM）以及鱼藤酮和抗霉素A（腐烂/ AA，各0.5μM）。（B）OCR计算为非线粒体耗氧量，基础呼吸，质子泄漏，最大呼吸（每0.5μM，1μM，1.5μM和2μM FCCP），ATP产生，备用呼吸能力（每0.5μM，1μM，1.5μM和2μMFCCP）以及每2.5×105 HSPC /孔的耦合效率。数据表示为SEM±平均值，n = 4。缩写：HSPCs =造血干细胞和原始祖细胞;OCR = 耗氧率;FCCP = 羰基氰化物-4（三氟甲氧基）苯腙;腐烂。= 鱼藤酮;AA = 抗霉素 A . 请点击这里查看此图的大图。
| 注射口 | 端口容积 | 注射化合物（10倍浓缩） | 孔中的最终化合物浓度 |
| 一个 | 20 微升 | 葡萄糖 （100 mM） | 10 毫米 |
| B | 22 微升 | 寡霉素（20微米） | 2 微米 |
| C | 25 微升 | 2-双孔 （500 mM） | 50 毫米 |
表1：糖酵解负荷试验的注射策略。 缩写：2-DG = 2-脱氧-D-葡萄糖。
| 1 | 校准 | ||||
| 2 | 平衡 | ||||
| 3 | 注射和测量 | ||||
| 周期 | 混合 | 等 | 量 | ||
| 基线（非糖酵解酸化） | 3次 | 3 分钟 | 0 分钟 | 3 分钟 | |
| 注射端口A：葡萄糖 | 3次 | 3 分钟 | 0 分钟 | 3 分钟 | |
| 注射端口B：寡霉素 | 3次 | 3 分钟 | 0 分钟 | 3 分钟 | |
| 注入端口 C：2-DG | 3次 | 3 分钟 | 0 分钟 | 3 分钟 | |
表2：用于糖酵解胁迫试验的细胞外通量分析仪程序。 缩写：2-DG = 2-脱氧-D-葡萄糖。
| 注射口 | 端口容积 | 注射化合物（10倍浓缩） | 孔中的最终化合物浓度 |
| 一个 | 20 微升 | 寡霉素（20微米） | 2 微米 |
| B | 22 微升 | FCCP （20 μM） | 2 微米 |
| C | 25 微升 | 鱼藤酮（5 μM）+抗霉素A（5 μM） | 每个 0.5 μM |
表3：线粒体负荷试验的注射策略。 简称：FCCP=羰基氰化物-4（三氟甲氧基）苯腙。
| 1 | 校准 | ||||
| 2 | 平衡 | ||||
| 3 | 注射和测量 | ||||
| 周期 | 混合 | 等 | 量 | ||
| 基线测量 | 3次 | 3 分钟 | 0 分钟 | 3 分钟 | |
| 注射端口A：寡霉素 | 3次 | 3 分钟 | 0 分钟 | 3 分钟 | |
| 注入端口 B：FCCP | 3次 | 3 分钟 | 0 分钟 | 3 分钟 | |
| 注射端口C：鱼藤酮和抗霉素A | 3次 | 3 分钟 | 0 分钟 | 3 分钟 | |
表4：用于线粒体负荷试验的细胞外通量分析仪程序。 简称：FCCP=羰基氰化物-4（三氟甲氧基）苯腙。
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Discussion
该方法论文描述了一种优化的方案，用于使用Seahorse细胞外通量分析仪评估小鼠HSPC中的细胞生物能量（糖酵解和OxPHOS）。该装置是一种强大的工具，可同时测量活细胞的ECAR和OCR，分别是糖酵解和线粒体呼吸的指标。因此，它可用于实时评估细胞生物能量学。此外，基于96孔微孔板的平台提供高灵敏度的高通量定量，允许使用单个板同时分析多个样品，而另一种高分辨率呼吸计Oroboros O2k只能同时分析2个样品，或经典的Clark电极20。
细胞外通量分析仪主要用于分析贴壁细胞类型，因为它要求细胞存在于单层中，这使得分析悬浮液中生长的细胞更具挑战性。此外，从端口注射药物后，在测量之前的孔中的药物 - 介质混合周期中发生湍流，这可能会使细胞脱落。因此，细胞需要牢固地附着在孔的底部。这里描述的方案使用了从海洋贻贝 Mytilus edulis中提取的非免疫原性多酚蛋白的细胞粘合剂制剂来制备鼠HSPCs的贴壁单层。
该技术的另一个局限性是每次测定的成本，与Clark型电极和Oroboros O2k相比，这是非常高的。墨盒相对昂贵，无法重复使用。据估计，细胞外通量分析仪本身的成本比Oroboros O2k20高出约4倍。然而，鉴于细胞外通量分析仪的半自动化和高通量能力，每次运行可以收集比O2k更多的数据。
这里获得的结果表明，使用基于96孔的细胞外通量分析仪，每孔需要2.5 ×10 5个HSPCs才能获得可靠的数据。这增加了使用HSPC进行通量测定的另一个挑战，HSPC很难从小鼠中获得大量通量，并且需要流式细胞术分选才能获得纯群体。此外，流动分选为实验增加了大量时间，并可能改变祖细胞的代谢表型。为了克服与基于流式细胞术的纯化相关的局限性，这里讨论的策略利用与磁珠结合的谱系特异性抗体来消耗谱系承诺的祖细胞，从而丰富谱系阴性HSPC。为了进一步富集更原始的HSPCs，可以添加一个额外的cKit富集步骤;然而，这带来了额外的 离体 时间（约1.5小时）和细胞数量的减少的成本。使用这样的协议将需要在此协议范围之外进行优化。
为了保持其多能性，HSC必须保持静止并优先居住在骨髓9，21内的缺氧环境中。静态HSC被认为主要依靠糖酵解来满足其适度的能量需求，因为高水平的ROS（线粒体呼吸的副产物）对其干性有害2，3。HSC具有相对较高但基本上无活性的线粒体质量，将细胞ROS维持在较低水平以维持HSCs多能性9。然而，在承诺和分化期间，线粒体成为HSCs5，9中ATP产生的主要来源。因此，线粒体在将HSCs从静止过渡到其谱系承诺和分化所需的代谢活性状态方面起着关键作用。除了通过OxPHOS产生ATP外，线粒体在造血细胞稳态中还起着许多其他重要作用，包括ROS调节，细胞凋亡，钙信号传导，以及血红素和许多其他关键代谢产物中间体的合成9。线粒体功能的改变可显著影响 HSC/祖细胞分化途径，并可能导致各种血液系统疾病，例如造血性恶性肿瘤、先天性红细胞生成障碍和铁粒幼细胞性贫血以及骨髓增生异常综合征13。在恶性造血细胞中，功能失调的线粒体在赋予对各种细胞毒性药物诱导的细胞凋亡的抵抗力方面起着关键作用13。
由于线粒体在维持HSC /祖细胞稳态方面的核心作用，因此可以通过在正常和应激条件下评估其线粒体OxPHOS来获得对这些细胞生理状态的宝贵见解。线粒体活性新型调节剂的鉴定可以确定治疗血液学异常的新型治疗靶点。本文中描述的方案可用于筛选化合物或代谢CRISPR文库在正常和病理条件下对HSCs的OCR和ECAR的影响 ，例如， 从血液病的基因工程小鼠模型中收获的HSC。这种筛选也可用于阐明在其缺氧生态位中维持HSC效力的代谢途径，这将有助于设计HSC 体外 扩增的策略，同时保持其多能性用于治疗目的。鉴于该分析的高通量性质，此处描述的方案可以很容易地适应于筛选HSC，造血祖细胞和恶性造血细胞中的大量生物能量调节剂。
总之，这里介绍的方法描述了使用细胞外通量分析仪测量初级小鼠HSPC中ECAR和OCR的优化方案。从糖酵解胁迫试验中获得的结果表明，每孔2.5×105 个细胞和2μM寡霉素是进一步分析的最佳选择。使用2.5×每孔105 个细胞和2μM寡霉素，进行线粒体压力测试以优化FCCP浓度，并发现2μM的FCCP诱导最大OCR。虽然目前的研究主要集中在小鼠HSPC上，但该方案和这种方法可以很容易地适应任何类型的悬浮细胞的分析条件。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
伦巴第实验室的工作得到了NIH（NIGMS R01GM101171，NIEHS R21ES032305），DoD（CA190267，CA170628，NF170044和ME200030）和Glenn医学研究基金会的支持。Li实验室的工作由NIH（NHLBI 5R01HL150707）支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm filter | Corning | 430626 | Used to filter-sterilize the assay media |
| 100 mM sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | Component of mitochondrial stress test assay medium |
| 15 mL conical Falcon tubes | Corning | 352096 | Used during HSPCs harvest and to prepare assay drug solutions |
| 200 mM L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Component of glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media |
| 2-Deoxy-D-glucose (2-DG) | Sigma-Aldrich | D8375 | 3rd drug injection during glycolysis stress test |
| 5x Enrichment buffer (MojoSort) | Biolegend | 480017 | Used for washings during HSPCs harvest |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-3 | Component of ACK lysis buffer |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | 3rd drug injection during mitochondrial stress test |
| Bio-Rad DC protein assay kit | Bio-Rad | 500-0112 | Used as per manufacturer's instructions |
| Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | 2nd drug injection during mitochondrial stress test |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell adhesive. Used for coating cell microplates |
| Countes 3 Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | For cell counting | |
| EDTA | Fisher Scientific | O2793-500 | Component of ACK lysis buffer and RIPA lysis buffer |
| Falcon 70 μm filter | Fisher Scientific | 08-771-2 | Used as cells strainer during HSPCs harvest |
| Gibco Fetal bovine serum (FBS) | Fisher Scientific | 26400044 | Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest |
| Gibco HBSS | Fisher Scientific | 14175095 | Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Component of mitochondrial stress test assay medium and first injection of glycolysis stress test |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | 2nd drug injection during glycolysis stress test and 1st drug injection during mitochondrial stress test |
| PBS | Life Technologies | 10010-049 | Used to wash cells after assay for protein quantification |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | Fisher Scientific | P235-500 | Component of ACK lysis buffer |
| Protease Inhibitor Cocktail (PIC) | Roche | 11836170001 | Supplied as tablets. One tablet was dissolved in 10 mL of RIPA buffer to make 1x PIC. |
| Rat biotin antimouse-B220, Clone ID: RA3-6B2 | Biolegend | 103203 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-CD2, Clone ID: RM2-5 | Biolegend | 100103 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-CD3, Clone ID: 17A2 | Biolegend | 100243 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3 | Biolegend | 100603 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7 | Biolegend | 100703 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5 | Biolegend | 108403 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119 | Biolegend | 116203 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | 3rd drug injection during mitochondrial stress test |
| Seahorse XFe96 extracellular flux analyzer | Seahorse Biosciences now Agilent | For ECAR and OCR measurments in real time. | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Used to make Cell-adhesive solution for microplate coating |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher | BP358 | Component of RIPA lysis buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Component of RIPA lysis buffer |
| Sodium Fluoride (NaF) | Sigma-Aldrich | S7920 | Component of RIPA lysis buffer |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | Prepared 1 N solution. Used for pH normalization |
| Streptavidin Nanobeads (MojoSort) | Biolegend | 480015 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Tris-HCl | Fisher | BP153 | Component of RIPA lysis buffer |
| XF base medium | Agilent | 102353-100 | base medium used to prepare glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media |
| XF prep station | Seahorse Biosciences | Used for non-CO2 37 °C incubations | |
| XFe96 extracellular FluxPak | Agilent | 102416-100 or 102601-100 | Includes assay cartridges with utility plates, loading guide flats for loading drugs onto the assay cartridge, XF calibrant solution, and XF cell culture microplate |
References
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