Avaliação de Bioenergésicos Celulares em Tronco Hematopoiético de Camundongos e Células Progenitoras Primitivas usando o Analisador de Fluxo Extracelular

Surinder Kumar; Morgan Jones; Qing Li; David B. Lombard

doi:10.3791/63045

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Artigo de método

Avaliação de Bioenergésicos Celulares em Tronco Hematopoiético de Camundongos e Células Progenitoras Primitivas usando o Analisador de Fluxo Extracelular

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DOI:

10.3791/63045

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24 de setembro de 2021

Surinder Kumar¹ , Morgan Jones² , Qing Li²^,³^,⁴ , David B. Lombard¹^,⁴^,⁵

¹Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor, ²Department of Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor, ³Department of Cellular and Developmental Biology, University of Michigan, Ann Arbor, ⁴Rogel Cancer Center, University of Michigan, Ann Arbor, ⁵Institute of Gerontology, University of Michigan, Ann Arbor

Neste artigo

Resumo

O método aqui apresentado resume protocolos otimizados para avaliação de bioenergésicos celulares em haste hematopoiéticas não aderentes e células progenitoras primitivas (HSPCs) utilizando o analisador de fluxo extracelular para medir a taxa de acidificação extracelular (ECAR) e a taxa de consumo de oxigênio (OCR) dos HSPCs em tempo real.

Resumo

Sob estado estável, as células-tronco hematopoiéticas (HSCs) permanecem em grande parte quiescentes e acredita-se que são predominantemente dependentes da glicólise para atender às suas necessidades energéticas. No entanto, sob condições de estresse, como infecção ou perda de sangue, os HSCs tornam-se proliferativos e produzem rapidamente células progenitoras a jusante, que por sua vez diferenciam ainda mais, produzindo células sanguíneas maduras. Durante este processo de transição e diferenciação, os HSCs saem da quiescência e passam rapidamente por uma mudança metabólica da glicólise para a fosforilação oxidativa (OxPHOS). Várias condições de estresse, como envelhecimento, câncer, diabetes e obesidade, podem impactar negativamente a função mitocondrial e, assim, podem alterar a reprogramação metabólica e diferenciação de HSCs e progenitores durante a hematopoiese. Insights valiosos sobre funções glicolíticas e mitocondriais de HSCs e progenitores em condições normais e de estresse podem ser obtidos através da avaliação de sua taxa de acidificação extracelular (ECAR) e taxa de consumo de oxigênio (OCR), que são indicadores de glicolise celular e respiração mitocondrial, respectivamente.

Aqui, um protocolo detalhado é fornecido para medir o ECAR e o OCR em populações de células de linhagem derivada da medula óssea do rato, que incluem tronco hematopoiético e células progenitoras primitivas (HSPCs), usando o analisador de fluxo extracelular. Este protocolo descreve abordagens para isolar as células de linhagem negativas da medula óssea do rato, explica a otimização da densidade de semeadura celular e concentrações de 2-desoxi-D-glicose (2-DG, um análogo de glicose que inibe a glicólise) e várias drogas direcionadas ao OxPHOS (oligomicina, FCCP, rotenona e antimicina A) usadas nesses ensaios, e descreve estratégias de tratamento de drogas. Os principais parâmetros do fluxo glicóglitico, como glicólise, capacidade glicóltica e reserva glicóltica, e parâmetros oxphos, como respiração basal, respiração máxima, vazamento de prótons, produção de ATP, capacidade respiratória sobressalente e eficiência de acoplamento, podem ser medidos nestes ensaios. Este protocolo permite medições de ECAR e OCR em HSPCs não aderentes e pode ser generalizado para otimizar condições de análise para qualquer tipo de células de suspensão.

Introdução

Hematopoiese é o processo pelo qual vários tipos de células sanguíneas maduras com funções altamente especializadas são formadas a partir de HSCs¹. Os HSCs são capazes de auto-renovação e diferenciação em várias populações progenitoras multipotentes e específicas da linhagem. Esses progenitores acabam produzindo células de linhagem linfoide, mieloide, eritróida e megacaito. Para manter sua capacidade de auto-renovação, acredita-se que os HSCs permaneçam em grande parte quiescentes e, como outras células-tronco tecerá-los, dependem da glicólise em vez de OxPHOS mitocondrial para a produção de ATP ^2,3