Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Оценка клеточной биоэнергетики в гемопоэтических стволовых клетках мыши и примитивных клетках-предшественниках с помощью анализатора внеклеточного потока

Published: September 24, 2021 doi: 10.3791/63045
Automatic Translation
1, 2, 2,3,4, 1,4,5
1Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Cellular and Developmental Biology, University of Michigan, Ann Arbor, 4Rogel Cancer Center, University of Michigan, Ann Arbor, 5Institute of Gerontology, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Метод, представленный здесь, обобщает оптимизированные протоколы оценки клеточной биоэнергетики в неадгезивных гемопоэтических стволовых и примитивных клетках-предшественниках (HSPCs) с использованием внеклеточного анализатора потоков для измерения скорости внеклеточного подкисления (ECAR) и скорости потребления кислорода (OCR) HSPC в режиме реального времени.

Abstract

В установившемся состоянии гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) остаются в значительной степени покоящимися и, как полагают, преимущественно зависят от гликолиза для удовлетворения своих энергетических потребностей. Однако в стрессовых условиях, таких как инфекция или кровопотеря, ГСК становятся пролиферативными и быстро производят клетки-предшественники, которые, в свою очередь, дополнительно дифференцируются, в конечном итоге производя зрелые клетки крови. Во время этого процесса перехода и дифференцировки ГСК выходят из покоя и быстро подвергаются метаболическому переходу от гликолиза к окислительному фосфорилированию (OxPHOS). Различные стрессовые состояния, такие как старение, рак, диабет и ожирение, могут негативно влиять на функцию митохондрий и, таким образом, могут изменить метаболическое перепрограммирование и дифференцировку ГСК и предшественников во время кроветворения. Ценная информация о гликолитических и митохондриальных функциях ГСК и предшественников в нормальных и стрессовых условиях может быть получена путем оценки их скорости внеклеточного подкисления (ECAR) и скорости потребления кислорода (OCR), которые являются показателями клеточного гликолиза и митохондриального дыхания соответственно.

Здесь представлен подробный протокол для измерения ECAR и OCR в популяциях клеток, полученных из костного мозга мыши, которые включают как гемопоэтические стволовые, так и примитивные клетки-предшественники (HSPC), с использованием анализатора внеклеточного потока. Этот протокол описывает подходы к выделению линейно-отрицательных клеток из костного мозга мыши, объясняет оптимизацию плотности посева клеток и концентраций 2-дезокси-D-глюкозы (2-DG, аналог глюкозы, который ингибирует гликолиз) и различных OxPHOS-таргетных препаратов (олигомицин, FCCP, ротенон и антимицин А), используемых в этих анализах, и описывает стратегии лечения лекарственными средствами. Ключевые параметры гликолитического потока, такие как гликолиз, гликолитическая емкость и гликолитический резерв, а также параметры OxPHOS, такие как базальное дыхание, максимальное дыхание, утечка протонов, производство АТФ, резервная дыхательная способность и эффективность связи, могут быть измерены в этих анализах. Этот протокол позволяет проводить измерения ECAR и OCR на неадгезивных HSPC и может быть обобщен для оптимизации условий анализа для любого типа суспензионных клеток.

Introduction

Кроветворение – это процесс, посредством которого из ГСК 1 образуются различные типы зрелых клеток крови с узкоспециализированнымифункциями. ГСК способны к самообновлению и дифференциации в различные мультипотентные и родословные популяции-прародители. Эти предшественники в конечном итоге продуцируют клетки лимфоидных, миелоидных, эритроидных и мегакариоцитарных линий. Чтобы сохранить свою способность к самообновлению, ГСК остаются в значительной степени спокойными и, как и другие тканевые стволовые клетки, полагаются на гликолиз, а не на митохондриальный OxPHOS для производства АТФ 2,3. Вступление в клеточный цикл приводит к усилению дыхания и OxPHOS, что приводит к повышенным уровням активных форм кислорода (АФК), которые наносят ущерб поддержанию HSC и функции3. Повторное деление клеток, таким образом, может привести к снижению самообновляющейся способности ГСК и, в конечном счете, к их истощению.

При взрослом кроветворении ГСК в первую очередь подвергаются асимметричному делению клеток, в ходе которого одна из дочерних клеток сохраняет потенциал ГСК и продолжает полагаться на гликолитический метаболизм. Другая дочерняя клетка становится примитивной клеткой-предшественником, которая теряет способность к самообновлению, но размножается и в конечном итоге приводит к дифференцированным функциональным кроветворным клеткам4. Когда ГСК дифференцируются для производства последующих предшественников, считается, что происходит переход от гликолиза к митохондриальному метаболизму для снабжения энергией и строительными блоками, необходимыми для поддержки этого быстрого перехода5, как показывают наблюдения, что ГСК обладают неактивной митохондриальной массой 6,7,8,9 . Напротив, митохондриальная активность (обозначенная связанными уровнями АФК) намного выше у прародителей, зафиксированных линией, чем у ГСК 9,10,11. Метаболические изменения, которые происходят на самом раннем этапе кроветворения, таким образом, предполагают прямую и решающую роль митохондрий в регулировании судьбы ГСК.

Дисфункциональные митохондрии, присутствующие в различных стрессовых условиях, таких как старение, рак, диабет и ожирение12, могут мешать способности к самообновлению HSC, вызывая дисбаланс в дифференциации HSC / прародителя путем производства чрезмерного количества АФК, нарушения производства АТФ и / или путем изменения других метаболических процессов 9,12,13 . Возмущения метаболического гомеостаза при дифференцировке ГСК/предшественника могут существенно влиять на кроветворение, потенциально способствуя развитию гематологических аномалий13. Учитывая критическое влияние гликолиза и митохондриального OxPHOS на стволовость и дифференцировку HSC, представляет интерес исследование как метаболических параметров в нормальных, так и в стрессовых условиях. Ценную информацию о гликолитической и митохондриальной функции ГСК и клеток-предшественников можно получить, оценив их ECAR и OCR, которые являются показателями клеточного гликолиза и митохондриального дыхания соответственно.

Внеклеточный анализатор потока Seahorse представляет собой мощный аппарат, оснащенный двумя зондами на скважину для одновременного измерения ECAR и OCR в живых клетках и, таким образом, может использоваться для оценки клеточной биоэнергетики в режиме реального времени в ответ на различные субстраты или ингибиторы. Пробирный картридж, используемый с анализатором, содержит инъекционные порты для удержания до четырех препаратов для автоматической инъекции во время анализа. Схема типичного гликолизного стресс-теста показана на фиг.1А. Анализ начинается с измерения ECAR клеток, инкубированных в среде гликолизного стресс-теста, содержащей глютамин, но не глюкозу или пируват. Это представляет собой подкисление, происходящее из-за негликолитической активности клеток, и сообщается как негликолитическое подкисление. За этим следует инъекция глюкозы в насыщенной концентрации. Посредством гликолиза глюкоза в клетке превращается в пируват, который далее метаболизируется в цитоплазме с образованием лактата или в митохондриях для производства CO2 и воды.

Превращение глюкозы в лактат вызывает чистую выработку и последующее высвобождение протонов во внеклеточную среду, что приводит к быстрому увеличению ECAR 14,15,16. Это стимулируемое глюкозой изменение ECAR сообщается как гликолиз в базальных условиях. Вторая инъекция состоит из олигомицина (ингибитор АТФ-синтазы, также известного как комплекс V17), который ингибирует выработку митохондриальной АТФ. Во время олигомицин-опосредованного ингибирования OxPHOS клетки максимально усиливают гликолиз для удовлетворения своих энергетических потребностей. Это вызывает дальнейшее увеличение ECAR, выявляя максимальную гликолитическую емкость клеток. Разница между максимальной гликолитической емкостью и базальным гликолизом называется гликолитическим резервом. Наконец, вводится 2-DG, что вызывает значительное падение ECAR, обычно близкое к уровням негликолитического подкисления. 2-DG является аналогом глюкозы, который конкурентно связывается с гексокиназой, что приводит к ингибированию гликолиза18. Таким образом, 2-DG-индуцированное снижение ECAR еще раз подтверждает, что гликолиз действительно является источником ECAR, наблюдаемым после инъекций глюкозы и олигомицина.

На рисунке 1B показана схема типичного митохондриального стресс-теста. Анализ начинается с базового измерения OCR клеток, инкубированных в митохондриальной стресс-тестовой среде, содержащей глюкозу, глютамин и пируват. После базальных измерений OCR в этот анализ вводится олигомицин, который ингибирует комплекс V, тем самым уменьшая поток электронов через цепь переноса электронов (ETC)17. Следовательно, OCR снижается в ответ на инъекцию олигомицина, и это снижение OCR связано с митохондриальной продукцией АТФ. Вторая инъекция состоит из карбонильного цианида-4 (трифторметокси) фенилгидразона (FCCP), протонофора и разъединителя митохондриального OxPHOS17. FCCP разрушает митохондриальный протонный градиент, позволяя потоку протонов через внутреннюю мембрану митохондрий. Из-за впрыска FCCP поток электронов через внеземные цивилизации дерепрессируется, и комплекс IV потребляет кислород на максимальном уровне. Разница между максимальным OCR и базальным OCR называется запасной дыхательной способностью, которая является мерой способности клетки реагировать на повышенную потребность в энергии в условиях стресса. Наконец, вводится смесь двух ингибиторов ETC (ротенон, ингибитор комплекса I, и антимицин А, комплексный ингибитор III17), который полностью отключает поток электронов, и OCR снижается до низкого уровня. OCR, измеренный после инъекции ротенона и антимицина А, соответствует немитохондриальному OCR, вызванному другими процессами внутри клеток. Немитохондриальный OCR позволяет рассчитать базальное дыхание, утечку протонов и максимальное дыхание.

Базальное дыхание представляет собой разницу между базовым OCR и немитохондриальным OCR. Протонная утечка относится к разнице между OCR после инъекции олигомицина и немитохондриальной OCR. Максимальное дыхание представляет собой разницу между OCR после инъекции FCCP и немитохондриальным OCR. Эффективность соединения рассчитывается как процентное отношение скорости производства АТФ к скорости базального дыхания. В этом методе представлен подробный протокол измерения ECAR и OCR в отрицательных HSPC с использованием внеклеточного анализатора потока Seahorse XFe96. Этот протокол описывает подходы к выделению мышиных линионно-отрицательных HSPC, объясняет оптимизацию плотности посева клеток и концентраций различных препаратов, используемых во внеклеточных анализах потока, и описывает стратегии лечения лекарственными средствами.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты с позвоночными на животных были одобрены и выполнены в соответствии с правилами Комитета Мичиганского университета по использованию и уходу за животными.

1. За день до анализа (Общее время: ~10 мин)

  1. Гидратация картриджа датчика (время шага: ~10 мин)
    1. Откройте комплект для анализа внеклеточного флюса и извлеките картридж датчика и узел полезной пластины. Сохраните погрузочно-разгрузочные квартиры для использования на следующий день.
    2. Вручную отделите картридж датчика (верхняя зеленая часть с крышкой) от вспомогательной пластины (нижняя 96-луночная микроплита) и поместите его вверх ногами рядом с полезной пластиной.
    3. Используя многоканальную пипетку, заполните каждую скважину полезной пластины калибром 200 мкл, входящим в комплект для анализа потока.
    4. Поместите картридж датчика обратно на полезную пластину, убедившись, что датчики полностью погружены в калибрант.
    5. Поместите собранный картридж датчика и пластину с калибром в инкубатор без CO2 37 °C на ночь. Чтобы предотвратить испарение калибранта, убедитесь, что инкубатор должным образом увлажнен. Если вы используете обычный инкубатор для инкубации без CO2 37 °C, поместите открытый стакан, содержащий воду, внутри инкубатора, чтобы увлажнить его. Если доступно, используйте станцию подготовки XF для всех инкубаций без CO2 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, картридж датчика может быть гидратирован в течение ночи с 200 мкл на лунку стерильной сверхчистой воды в инкубаторе без CO2 37 °C. Замените воду на 200 мкл на скважину с предваренным калибрантом 37 °C, по крайней мере, за 45-60 минут до загрузки инжекционных отверстий в день анализа.

2. День анализа (Общее время: ~9 ч 30 мин)

ПРИМЕЧАНИЕ: Общее время, указанное выше, включает совокупную продолжительность этапов 2.1-2.4 в дополнение к этапу 2.5 или этапу 2.6.

  1. Приготовление микропластин с клеточным адгезионным покрытием (время шага: ~1 ч 30 мин)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все шаги в шкафу биобезопасности.
    1. Готовят 2,5 мл клеточного адгезивного раствора (22,4 мкг/мл, см. Таблицу материалов) на 96-луночную микропластинку клеточной культуры, растворяя 56 мкг клеточного клея в соответствующем объеме стерилизованного фильтром 0,1 М бикарбоната натрия (рН 8,0) и сразу добавляя 1 Н гидроксида натрия в половину объема используемого клеточного клеевого материала. Вихрь или пипетка вверх и вниз для смешивания.
    2. Откройте микропластину клеточной культуры из 96 лунок (входит в комплект для анализа потока) и дозируйте 25 мкл подготовленного клеточного адгезивного раствора на дне каждой лунки. Накройте микропластин крышкой и высиживайте в течение 30 мин при комнатной температуре внутри вытяжки.
    3. После инкубации удалите и выбросьте избыток клеточного клеевого раствора с помощью многоканальной пипетки или аспиратора и дважды промыть каждую лунку 200 мкл стерильной сверхчистой воды. Высушите пластину на воздухе, со снятой крышкой, внутри вытяжки в течение 30-45 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Микропластины клеточных культур с клеточным адгезионным покрытием могут храниться до одной недели при температуре 4 °C. Предварительно покрытым микропластинкам, хранящимся при температуре 4 °C, необходимо дать нагреться до комнатной температуры внутри вытяжки перед посевом клеток.
  2. Подготовка пробирной среды (Время шага: ~30 мин)
    1. Подготовка среды для анализа гликолизного стресс-теста
      1. Дополнить 100 мл базовой среды (см. Таблицу материалов) 1 мл 200 мМ L-глутамина.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация L-глутамина в пробирной среде составляет 2 мМ.
      2. Нагрейте L-глютаминовую среду до 37 °C на водяной бане.
      3. Отрегулируйте рН теплой среды до 7,4 с 1 Н NaOH.
      4. Фильтруйте и стерилизуйте среду фильтром 0,2 мкм и держите ее при температуре 37 °C до готовности к использованию.
    2. Подготовка среды для анализа митохондриального стресс-теста
      1. Дополнить 100 мл базовой среды 0,45 г глюкозы, 1 мл 200 мМ L-глутамина и 1 мл 100 мМ пирувата натрия.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная среда для анализа содержит 25 мМ глюкозы, 2 мМ L-глутамина и 1 мМ пирувата натрия.
      2. Теплая глюкоза, L-глютамин и среда, дополненная пируватом натрия, до 37 °C на водяной бане.
      3. Отрегулируйте рН теплой среды до 7,4 с 1 Н NaOH.
      4. Фильтрующую стерилизующую среду с фильтром 0,2 мкм и выдерживайте при температуре 37 °C до готовности к использованию.
  3. Сбор отрицательной линии мыши HSPCs (время шага: ~3 ч)
    1. Подготовьте буфер анализа, дополнив сбалансированный солевой раствор Хэнка 4% фетальной бычьей сывороткой. Приготовьте 1-кратный буфер обогащения, разбавив 5-кратный бульон стерильной дистиллированной водой. Держите оба буфера на льду до использования.
    2. Гуманно усыпляйте мышей с помощью CO2 с последующим вывихом шейки матки и удаляйте задние конечности ножницами. Аккуратно извлеките все ткани из костей, а концы с обеих сторон бедренной и большеберцовой костей обрежьте ножницами. Вымывайте клетки костного мозга из бедренной и большеберцовой костей с помощью буфера анализа. Пропустите промытые клетки через стерильный фильтр 70 мкм, центрифугируйте фильтрат при 200 × г в течение 5 мин при 4 °C и выбросьте супернатант.
    3. Лизируют эритроциты путем повторного использования клеточной гранулы в 500 мкл буфера ACK (150 мМ NH4Cl, 10 мМ KHCO3, 0,1 мМ ЭДТА, рН 7,2). После лизиса в течение 1 мин на льду промыть образцы, добавив 1 мл пробного буфера и центрифуги при 200 × г в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте супернатант.
    4. После промывки инкубируют образцы коктейлем из биотинилированных антител, направленных против CD2 (разведение 1:200), CD3 (разведение 1:200), CD5 (разведение 1:200), CD8 (разведение 1:200), Ter-119 (разведение 1:200), B220 (разведение 1:200) и Gr-1 (разведение 1:800) в течение 45 мин на льду в общем объеме 500 мкл пробного буфера.
    5. Промывайте образцы 1 мл пробного буфера центрифугированием, как указано выше.
    6. Промыть образцы 1 мл 1x буфера обогащения центрифугированием, как указано выше.
    7. Инкубируйте образцы с 20 мкл наношарик стрептавидина и 100 мкл 1x обогащения буфера на льду в течение 15 мин.
    8. Промыть образцы 1 мл 1x буфера обогащения центрифугированием, как указано выше.
    9. Повторное суспендирование образцов в 2,5 мл 1-кратного буфера обогащения. Поместите их на разделительный магнит на 5 мин. Соберите супернатанты отдельно в конические пробирки по 15 мл.
    10. Повторно суспендируйте образцы, разделенные магнитами, в дополнительные 2,5 мл 1-кратного буфера обогащения и поместите их снова на разделительный магнит в течение 5 минут. Собирайте и комбинируйте супернатанты с предыдущими коллекциями в конических трубках по 15 мл с этапа 2.3.9.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Супернатанты содержат линейно-отрицательные клеточные фракции.
    11. Центрифугируют конические трубки объемом 15 мл, содержащие отрицательно отобранные клетки, в течение 5 мин при 200 × г при 4 °С.
    12. Повторно суспендируйте гранулы клеток в 1 мл буфера анализа и подсчитайте номер ячейки с помощью трипан-синего вручную или с помощью автоматизированного счетчика клеток, такого как Countess 3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следуя вышеописанному подходу, ~6 × 106 отрицательных по линии HSPC должны быть легко очищены от задних конечностей одной мыши. Если реагенты, такие как буфер анализа, 1-кратный буфер обогащения и коктейль из специфических для линии антител, приготовлены за день до эксперимента, для обогащения HSPC у 4 мышей требуется примерно 2,5-3 ч. Это займет дополнительные 10 минут для каждой мыши сверх этого числа.
  4. Посев клеток в микропластинках с клеевым покрытием (время шага: ~1 ч)
    1. Центрифужные ячейки со стадии 2.3.12 при 200 × г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    2. Удалите супернатант и повторно суспендируйте клеточную гранулу в соответствующей пробирной среде (среде для гликолизного стресс-теста или митохондриальной стресс-тестовой среде). Центрифуга по 200 × г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    3. Повторите шаг 2.4.2. Удаляют надосадочную массу и повторно суспендируют клетки в соответствующей подогретой пробирной среде до концентрации 2,5 × 105 клеток на 50 мкл или 5 × 106 на мл.
    4. Пипетка 50 мкл клеточной суспензии вдоль боковой стороны каждой лунки микропластины клеточной культуры с клеевым покрытием комнатной температуры. Пипетка 50 мкл пробирной среды в угловые фоновые измерительные колодцы. Используйте многоканальную пипетку для покрытия ячеек для обеспечения согласованности.
    5. Создайте балансовую пластину центрифуги, добавив 50 мкл воды на лунку микропластины культуры клеток без покрытия из 96 лунок.
    6. Центрифугируют ячейки в пластине при 200 × г в течение 1 мин при комнатной температуре. Не применяйте тормоза. Переложите пластину в инкубатор без CO2 37 °C в течение 25-30 минут, чтобы убедиться, что клетки полностью прикреплены. Визуально подтвердить под микроскопом, что клетки стабильно прилипают к поверхности микропластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку ~6 × 106 отрицательных по линии HSPC могут быть собраны из задних конечностей одной мыши, HSPC, выделенные из 4 мышей (~ 2,4 × 107 клеток), необходимы для заполнения всей 96-луночной пластины, если цель состоит в том, чтобы экранировать несколько вмешательств ex vivo параллельно. Однако, если цель состоит в том, чтобы исследовать влияние генетического изменения или вмешательства на метаболические параметры HSPC in vivo, то HSPC, выделенные из нескольких пар контрольных и тестовых мышей, могут быть проанализированы в нескольких технических репликах параллельно с использованием одной пластины.
  5. Выполнение гликолизного стресс-теста с использованием внеклеточного анализатора потока (время шага: ~3 ч 30 мин)
    1. Картридж с датчиком загрузки с инжекторными составами
      1. Приготовьте 100 мМ глюкозы, 20 мкМ олигомицина и 500 мМ 2-DG растворов в предварительной гликолизной стресс-тестовой среде (рН 7,4).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Все инъекционные растворы соединений изготавливаются в 10-кратной концентрации. Конечные концентрации в скважине составляют 10 мМ для глюкозы, 2 мкМ для олигомицина и 50 мМ для 2-ДГ (см. Таблицу 1).
      2. Извлеките гидратированный картридж датчика из инкубатора без CO2 37 °C на этапе 1.1.5. Удалите пузырьки воздуха из калибранта в вспомогательной пластине, подняв картридж датчика из калибранта и заменив его на ту же полезную пластину с калибрантом.
      3. Поместите направляющую A/D заряжания плоской (входит в комплект для анализа внеклеточного потока) в верхней части картриджа датчика, ориентируя ее так, чтобы буква «A» располагалась в верхнем левом углу, чтобы обеспечить доступ только порты A для загрузки. Используя многоканальную пипетку, дозируют 20 мкл раствора глюкозы 100 мМ в портах А.
      4. Замените направляющую загрузки A/D плоской на плоскую направляющую загрузки B/C, ориентируясь таким образом, чтобы буква «B» располагалась в верхнем левом углу, чтобы обеспечить наличие для погрузки только портов B. Используя многоканальную пипетку, дозируйте 22 мкл раствора олигомицина 20 мкМ в портах B.
      5. Переориентируйте направляющую загрузки B/C, чтобы найти букву «C» в верхнем левом углу для портов загрузки C. Используя многоканальную пипетку, дозируйте 25 мкл 500 мМ раствора 2-DG в портах C.
      6. Снимите и выбросьте плоские направляющие погрузки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы каждая портовая серия всех 96 скважин, включая фоновые скважины, была полностью загружена одним и тем же объемом закачиваемого соединения.
    2. Создание, калибровка и измерения шаблонов
      1. Создайте или загрузите шаблон для нагрузочного теста гликолиза на контроллере. Введите подробную информацию о стратегиях инъекций, условиях лечения и типах клеток, а также нажмите создать группы. Перейдите к карте плит и назначьте скважины каждой группе для анализа. Назначьте 4 угловых колодца для фоновых измерений.
      2. В протоколе убедитесь, что калибровка и уравновешивание проверены на этапе инициализации .
      3. Для исходных измерений и измерений после каждой инъекции (глюкоза, олигомицин и 2-ДГ) установите число циклов измерения равным 3 и Mix - Wait - Measure times до 3 мин - 0 мин - 3 мин (см. Таблицу 2).
      4. Снимите крышку с нагруженного и гидратированного картриджа датчика, погруженного в калибр в полезную пластину. Поместите его на рабочий лоток внеклеточного анализатора потока и начните запуск.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Первым шагом является калибровка, которая обычно занимает ~ 20 минут.
      5. Извлеките микропластину, содержащую клетки, из инкубатора без CO2 37 °C со стадии 2.4.6 после окончания 25-30 мин инкубации. Не нарушая работу клеток, медленно добавляют 130 мкл предварительной гликолизной стресс-тестовой среды (рН 7,4) на лунку, чтобы восполнить объем среды в каждой лунке до 180 мкл и вернуть пластину в инкубатор без CO2 37 °C в течение дополнительных 15-20 мин.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительно общее время инкубации 45-60 мин после центрифугирования.
      6. После завершения калибровки замените полезную пластину на микропластинку анализа (без крышки), содержащую ячейки. Нажмите на пластину тензодатчика, чтобы начать измерения, которые займут ~1,5 ч для завершения анализа.
      7. После того, как измерения завершены, соберите микропластинку анализа, содержащую клетки, и удалите среду анализа, не нарушая клетки. Один раз осторожно промыть 250 мкл 1x фосфатно-буферного физиологического раствора без смещения клеток.
      8. Добавьте 10 мкл буфера лизиса RIPA (50 мМ Tris-HCl, pH 7,4, 1% NP-40, 0,5 % Na дезоксихолата, 0,1% додецилсульфата натрия, 150 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА, 50 мМ NaF), дополненного коктейлем ингибитора протеазы по 1x, и перемешайте пластину на шейкере в течение 10 мин. Заморозьте всю пластину при -80 °C.
      9. Разморозьте пластину и выполните анализ измерения белка для нормализации данных в соответствии с инструкциями производителя.
      10. Извлеките и проанализируйте данные. Откройте файл данных с помощью программного обеспечения Wave Desktop. Нажмите « Нормализовать» и вставьте значения нормализации для каждой скважины. Нажмите кнопку Применить , чтобы нормализовать данные. Нажмите « Экспорт» и выберите генератор отчетов о нагрузочных тестах на гликолиз , чтобы экспортировать проанализированные данные в генератор отчетов. Кроме того, можно экспортировать данные во внешнее приложение.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, общее содержание ядерной ДНК в каждой скважине может быть использовано для нормализации данных. Флуоресцентный краситель, такой как CyQuant, который связывается с нуклеиновой кислотой, может быть использован для оценки общего содержания ядерной ДНК в лунке.
  6. Выполнение митохондриального стресс-теста с использованием анализатора внеклеточного потока (время шага: ~3 ч 30 мин)
    1. Картридж с датчиком загрузки с инжекторными составами
      1. Приготовьте 20 мкМ олигомицина, 20 мкМ FCCP и 5 мкМ растворов ротенона + 5 мкМ антимицина А в предварительной митохондриальной среде для анализа стресса (рН 7,4).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Все инъекционные растворы соединений изготавливаются в 10-кратной концентрации. Конечные концентрации в скважине составляют 2 мкМ для олигомицина, 2 мкМ для FCCP и по 0,5 мкМ для ротенона и антимицина А (см. таблицу 3).
      2. Извлеките гидратированный картридж датчика из инкубатора с температурой 37 °C на этапе 1.1.5 и удалите пузырьки воздуха, как описано ранее на этапе 2.5.1.2.
      3. Выполнив этапы 2.5.1.3-2.5.1.6, дозируют 20 мкл 20 мкМ олигомицина в портах А, 22 мкл 20 мкМ FCCP в портах В и 25 мкл смеси ротенона 5 мкМ и антимицина А 5 мкМ в портах С.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы каждая портовая серия всех 96 скважин, включая скважины фоновых скважин, была полностью загружена одинаковым объемом нагнетательного соединения.
    2. Создание, калибровка и измерения шаблонов
      1. Создайте или загрузите шаблон для митохондриального стресс-теста на контроллере. Введите подробную информацию о стратегиях инъекций, условиях лечения и типах клеток, а также нажмите создать группы. Перейдите к карте плит и назначьте скважины каждой группе для анализа. Назначьте 4 угловых колодца для фоновых измерений.
      2. В протоколе убедитесь, что калибровка и уравновешивание проверены на этапе инициализации.
      3. Для исходных измерений и измерений после каждой инъекции (олигомицин, FCCP и ротенон + антимицин А) установите число циклов измерения равным 3 и Mix - Wait - Время измерения до 3 мин - 0 мин - 3 мин (см. Таблицу 4).
      4. Запустите запуск для выполнения калибровки, как показано в шаге 2.5.2.4.
      5. Добавьте 130 мкл предварительной митохондриальной среды для анализа стресса (рН 7,4) на шаг 2.5.2.5.
      6. Начните измерения; извлекать и анализировать данные, как указано в шагах 2.5.2.6-2.5.2.10. Экспортируйте проанализированные данные в генератор отчетов о митохондриальном стресс-тесте или во внешнее приложение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Используя этот протокол, количество клеток и концентрации различных препаратов, нацеленных на OxPHOS (используемых во внеклеточных анализах потока), были оптимизированы для измерения ECAR и OCR HSPC, выделенных у 24-недельных самок мышей C57BL/6. Во-первых, был проведен гликолизный стресс-тест для оптимизации количества клеток и концентрации олигомицина. В этом анализе использовалось различное количество HSPC на скважину в диапазоне от 5 × 104 до2,5 × 10 5. Как показано на Фиг.2А и Фиг.2С, скорость негликолиотического подкисления повышается с увеличением числа клеток с 5 × 104 до 2,5 × 105 , но увеличивается лишь минимально между 2 × 105 до 2,5 × 105 клеток. Как и ожидалось, инъекция глюкозы 10 мМ стимулирует гликолиз при всех количествах клеток, при этом максимальное увеличение ЭКАР наблюдается при 2,5 × 105 клеток на лунку. Однако инъекция 2 мкМ олигомицина не приводит к дальнейшему увеличению ECAR, как ожидалось в противном случае. Применение 1 мкМ олигомицина дало аналогичные результаты (не показано). Эти результаты могут быть интерпретированы, чтобы указать, что эти концентрации олигомицина не были оптимальными в этих анализах.

Тем не менее, данные OCR, полученные в одном и том же наборе нагрузочных тестов гликолиза, показывают, что обе протестированные концентрации олигомицина (1 мкМ и 2 мкМ) действительно были эффективными, о чем свидетельствует значительное снижение OCR после инъекции олигомицина из-за комплексного ингибирования V (см. Рисунок 2B для 2 мкМ олигомицина; не показано для 1 мкМ олигомицина). При обеих испытуемых концентрациях олигомицина наблюдалось максимальное снижение OCR на 2,5 × 105 клеток на лунку. Наконец, инъекция 50 мМ 2-DG привела к значительному снижению ECAR, подразумевая, что гликолиз является источником ECAR, наблюдаемым в этих экспериментах. Взятые вместе, можно сделать вывод, что HSPC достигают максимального гликолиза после инъекции глюкозы в эти анализы, и они обладают незначительным или нулевым гликолитическим резервом. Это указывает на то, что, как и очищенные ГСК, линейно-отрицательные HSPC, которые включают фракцию HSC, используемую в этом анализе, также полагаются преимущественно на гликолиз для их производства АТФ. В клетках с высокой гликолитической скоростью может не наблюдаться значительного увеличения спроса на АТФ при олигомицин-опосредованном ингибировании митохондриальной продукции АТФ. Клетки могут легко управлять потерей митохондриальной АТФ без дальнейшего повышения регуляции гликолиза19. Параметры нагрузочного теста гликолиза - негликолитное подкисление, гликолиз, гликолитическая емкость и гликолитический резерв, как показано на рисунке 2C, - были рассчитаны так, как описано ранее в разделах введения и протокола. На основании этих данных для дальнейших исследований было отобрано2,5 × 10 5 клеток на лунку и 2 мкМ олигомицина.

Митохондриальный стресс-тест был использован для оптимизации концентрации FCCP. В этом анализе на скважину было использовано 2,5 × 105 HSPC, оптимизированных ранее с помощью гликолизного стресс-теста. Как показано на рисунке 3A, анализ начинается с измерения исходного OCR с последующей инъекцией олигомицина 2 мкМ, что вызывает значительное снижение OCR за счет ингибирования комплекса V. После измерений OCR после инъекций олигомицина FCCP вводили в различных концентрациях: 0,5 мкМ, 1 мкМ, 1,5 мкМ и 2 мкМ. Как указывалось ранее, FCCP обращает вспять индуцированную олигомицином подавление потока электронов через внеземные цивилизации, отделяя транспорт протонов от OxPHOS и заставляя комплекс IV максимально потреблять кислород. Как показано на рисунке 3A, FCCP стимулирует OCR в HSPC дозозависимым образом с максимальным увеличением OCR, наблюдаемым при 2 мкМ FCCP. Наконец, была введена смесь ротенона 0,5 мкМ и антимицина А 0,5 мкМ, которая полностью отключает поток электронов через ВНЕЗЕМНУЮ систему, и OCR снижается до минимального уровня. OCR, измеренный после инъекции ротенона и антимицина А, соответствует немитохондриальному потреблению кислорода. Другие параметры митохондриального стресс-теста - базальное дыхание, максимальное дыхание, утечка протонов, выработка АТФ, запасная дыхательная способность и эффективность связи, как показано на рисунке 3B, - были рассчитаны так, как описано ранее во введении и разделах протокола. Наконец, 2 мкМ FCCP были отобраны для дальнейших исследований.

Figure 1
Рисунок 1: Схематическое представление оценки гликолитической функции и митохондриального дыхания с помощью анализатора внеклеточного потока. Показаны последовательности и сроки инъекций различных эффекторных соединений, используемых в гликолитическом стресс-тесте (А) и митохондриальном стресс-тесте (В). (A) Изложены гликолитические параметры, гликолиз, гликолитическая емкость, гликолитический резерв и негликолитное подкисление, а также (B) параметры митохондриальной функции, базальное дыхание, АТФ-связанное дыхание, максимальное дыхание, немитохондриальное потребление кислорода, утечка протонов и резервная дыхательная способность. Сокращения: ECAR = скорость внеклеточного подкисления; 2-DG = 2-дезокси-D-глюкоза; OCR = норма потребления кислорода; FCCP = карбонилцианид-4 (трифторметокси) фенилгидразон; Гнить. = ротенон; Анти. A = антимицин A. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Оценка гликолитической функции у мышиных HSPCs. Стресс-тест на гликолиз проводился для измерения (A) скорости внеклеточного подкисления (ECAR, mpH / min) и (B) скорости потребления кислорода (OCR, pmol / min) HSPC, выделенных у 24-недельных самок мышей C57BL / 6. В указанные моменты вводили глюкозу (10 мМ), олигомицин (2 мкМ) и 2-ДГ (50 мМ). (C) ECAR рассчитывается как негликолитное подкисление, гликолиз, гликолитическая емкость и гликолитический резерв на 5 × 104, 1 × 105, 1,5 × 105, 2 × 105 и 2,5 × 105 HSPC/скважину. Данные представлены в виде среднего ± SEM, n = 4. Сокращения: HSPC = гемопоэтические стволовые и примитивные клетки-предшественники; ECAR = скорость внеклеточного подкисления; 2-DG = 2-дезокси-D-глюкоза; OCR = норма потребления кислорода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Оценка митохондриального дыхания у мышиных HSPC. Был проведен митохондриальный стресс-тест для измерения (А) скорости потребления кислорода (пмоль/мин) HSPC, выделенных у 24-недельных самок мышей C57BL/6. В указанное время вводили олигомицин (2 мкМ), FCCP (0,5 мкМ, 1 мкМ, 1,5 мкМ, 2 мкМ), а также ротенон и антимицин А (Рот./АА, 0,5 мкМ каждый). (B) OCR рассчитывается как немитохондриальное потребление кислорода, базальное дыхание, утечка протонов, максимальное дыхание (на 0,5 мкМ, 1 мкМ, 1,5 мкМ и 2 мкМ FCCP), выработка АТФ, запасная дыхательная способность (на 0,5 мкМ, 1 мкМ, 1,5 мкМ и 2 мкМ FCCP) и эффективность связи на 2,5 × 105 ГСПЦ/лунка. Данные представлены в виде среднего ± SEM, n = 4. Сокращения: HSPC = гемопоэтические стволовые и примитивные клетки-предшественники; OCR = норма потребления кислорода; FCCP = карбонилцианид-4 (трифторметокси) фенилгидразон; Гнить. = ротенон; AA = антимицин A. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Инжекционный порт Объем порта Инъекционное соединение (10x концентрированное) Конечная концентрация соединения в скважине
A 20 мкл Глюкоза (100 мМ) 10 мМ
B 22 мкл Олигомицин (20 мкМ) 2 мкМ
C 25 мкл 2-ДГ (500 мМ) 50 мМ

Таблица 1: Инъекционная стратегия для гликолизного стресс-теста. Аббревиатура: 2-DG = 2-дезокси-D-глюкоза.

1 Калибровка
2 Равновесие
3 Инъекции и измерения
Циклов Смешивать Ждать Измерять
Исходный уровень (негликолитное подкисление) 3 раза 3 мин 0 мин 3 мин
Инъекционный порт A: Глюкоза 3 раза 3 мин 0 мин 3 мин
Инъекционный порт B: Олигомицин 3 раза 3 мин 0 мин 3 мин
Инжекторный порт C: 2-DG 3 раза 3 мин 0 мин 3 мин

Таблица 2: Программа внеклеточного анализатора флюса для гликолизного стресс-теста. Аббревиатура: 2-DG = 2-дезокси-D-глюкоза.

Инжекционный порт Объем порта Инъекционное соединение (10x концентрированное) Конечная концентрация соединения в скважине
A 20 мкл Олигомицин (20 мкМ) 2 мкМ
B 22 мкл FCCP (20 мкМ) 2 мкМ
C 25 мкл Ротенон (5 мкМ) + антимицин А (5 мкМ) 0,5 мкМ каждый

Таблица 3: Инъекционная стратегия для митохондриального стресс-теста. Аббревиатура: FCCP = карбонильный цианид-4 (трифторметокси) фенилгидразон.

1 Калибровка
2 Равновесие
3 Инъекции и измерения
Циклов Смешивать Ждать Измерять
Базовые измерения 3 раза 3 мин 0 мин 3 мин
Инъекционный порт A: Олигомицин 3 раза 3 мин 0 мин 3 мин
Инжекторный порт B: FCCP 3 раза 3 мин 0 мин 3 мин
Инъекционный порт C: ротенон и антимицин A 3 раза 3 мин 0 мин 3 мин

Таблица 4: Программа внеклеточного анализатора потока для митохондриального стресс-теста. Аббревиатура: FCCP = карбонильный цианид-4 (трифторметокси) фенилгидразон.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В данной методической работе описан оптимизированный протокол оценки клеточной биоэнергетики (гликолиз и OxPHOS) в мышиных HSPCs с использованием анализатора внеклеточного потока Seahorse. Это устройство является мощным инструментом, который одновременно измеряет ECAR и OCR живых клеток, которые являются метриками гликолиза и митохондриального дыхания соответственно. Таким образом, его можно использовать для оценки клеточной биоэнергетики в режиме реального времени. Кроме того, платформа на основе 96-луночных микропластин предлагает высокопроизводительную количественную оценку с высокой чувствительностью, что позволяет одновременно анализировать несколько образцов с использованием одной пластины по сравнению с другим респирометром высокого разрешения, Oroboros O2k, который может анализировать только 2 образца одновременно, или классическим электродом Кларка20.

Анализатор внеклеточного потока в основном использовался для анализа адгезивных типов клеток, поскольку он требует, чтобы клетки присутствовали в монослое, что затрудняет анализ клеток, выращенных в суспензии. Кроме того, после инъекции препарата из порта во время цикла смешивания лекарственных средств в скважинах перед измерениями возникает турбулентность, которая может вытеснить клетки. Поэтому клетки нужно прочно прикрепить к дну лунки. Протоколы, описанные здесь, использовали клеточно-адгезивную формулу неиммуногенных полифенольных белков, извлеченных из морской мидии, Mytilus edulis, для получения адгезивного монослоя мышиных HSPC.

Другим ограничением этой технологии является стоимость анализа, которая очень высока по сравнению с электродом типа Кларка и Oroboros O2k. Картриджи относительно дорогие и не могут быть использованы повторно. Подсчитано, что стоимость самого внеклеточного анализатора потока ~4 раза выше, чем у Oroboros O2k20. Однако, учитывая полуавтоматизацию и высокую пропускную способность внеклеточного анализатора потоков, за один запуск может быть собран гораздо больший объем данных, чем с O2k.

Полученные здесь результаты показывают, что для получения достоверных данных с использованием внеклеточного анализатора потока на 96 скважин требуется2,5 × 10 5 HSPC на скважину. Это добавляет еще одну проблему при выполнении анализов потока с использованием HSPC, которые трудно получить в больших количествах от мыши и требуют проточной цитометрической сортировки для получения чистой популяции. Кроме того, проточная сортировка добавляет значительное время к эксперименту и может изменить метаболический фенотип клеток-предшественников. Чтобы преодолеть ограничения, связанные с очисткой на основе проточной цитометрии, обсуждаемая здесь стратегия использовала специфические для линии антитела, связанные с магнитными шариками, для истощения предшественников, приверженных линии, тем самым обогащая отрицательные линии HSPC. Для дальнейшего обогащения для более примитивных HSPC можно добавить дополнительный этап обогащения cKit; однако это связано с затратами на дополнительное время ex vivo (~ 1,5 ч) и уменьшением количества ячеек. Использование такого протокола потребует оптимизации за пределами сферы применения этого протокола.

Чтобы сохранить свою плюрипотентность, ГСК должны оставаться спокойными и предпочтительно находиться в гипоксической среде внутри костного мозга 9,21. Считается, что покоящиеся ГСК полагаются преимущественно на гликолиз для удовлетворения своих скромных энергетических потребностей, поскольку высокие уровни АФК, побочного продукта митохондриального дыхания, вредны для их ствола 2,3. ГСК обладают относительно высокой, но в значительной степени неактивной митохондриальной массой, поддерживая клеточный АФК на низких уровнях, чтобы обеспечить поддержание плюрипотентности ГСК9. Однако во время приверженности и дифференциации митохондрии становятся основным источником продукции АТФ в ГСК 5,9. Таким образом, митохондрии играют ключевую функцию в переходе ГСК из покоя в метаболически активное состояние, необходимое для их приверженности и дифференциации линии. В дополнение к производству АТФ через OxPHOS, митохондрии играют много других важных ролей в гомеостазе кроветворных клеток, включая регуляцию АФК, апоптоз, передачу сигналов кальция и синтез гема и многих других критических метаболитных промежуточных продуктов9. Изменения в митохондриальных функциях могут значительно влиять на пути дифференцировки HSC / предшественников и могут способствовать различным гематологическим нарушениям, таким как злокачественные кроветворения, врожденный диссеритропоэз и сидеробластическая анемия, а также миелодиспластические синдромы13. В злокачественных кроветворных клетках дисфункциональные митохондрии играют решающую роль в придании устойчивости к апоптозу, индуцированному различными цитотоксическими препаратами13.

Благодаря центральной роли митохондрий в поддержании ГСК/гомеостаза-предшественника, ценная информация о физиологическом состоянии этих клеток может быть получена путем оценки их митохондриального ОксФОСа в нормальных и стрессовых условиях. Идентификация новых модуляторов митохондриальной активности может идентифицировать новые терапевтические мишени для лечения гематологических аномалий. Протокол, описанный в этой статье, может быть использован для скрининга воздействия химических соединений или метаболических библиотек CRISPR на OCR и ECAR ГСК в нормальных и патологических условиях, например, ГСК, собранные из генетически модифицированных мышиных моделей гематологических нарушений. Такой скрининг также может быть полезен для выяснения метаболических путей, которые поддерживают потенцию ГСК в их гипоксической нише, что было бы полезно при разработке стратегий расширения ГСК in vitro при сохранении их плюрипотентности в терапевтических целях. Учитывая высокую пропускную способность этого анализа, протокол, описанный здесь, может быть легко адаптирован для скрининга большого количества биоэнергетических модуляторов в ГСК, кроветворных предшественниках и злокачественных кроветворных клетках.

Таким образом, методы, представленные здесь, описывают оптимизированные протоколы для измерения ECAR и OCR в первичных мышиных HSPC с использованием внеклеточного анализатора потока. Результаты, полученные в результате гликолизного стресс-теста, показали, что 2,5 × 105 клеток на лунку и 2 мкМ олигомицина являются оптимальными для дальнейшего анализа. Используя 2,5 × 105 клеток на лунку и 2 мкМ олигомицина, митохондриальный стресс-тест был выполнен для оптимизации концентрации FCCP, и было обнаружено, что 2 мкМ FCCP индуцируют максимальный OCR. Хотя текущее исследование в основном сосредоточено на мышиных HSPC, протокол и этот подход могут быть легко адаптированы для оптимизации условий анализа для любого типа суспензионных клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что конфликта интересов нет.

Acknowledgments

Работа в ломбардской лаборатории поддерживается NIH (NIGMS R01GM101171, NIEHS R21ES032305), DoD (CA190267, CA170628, NF170044 и ME200030) и Фондом медицинских исследований Гленна. Работа в лаборатории Li поддерживается NIH (NHLBI 5R01HL150707).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 μm filter Corning 430626 Used to filter-sterilize the assay media
100 mM sodium pyruvate Life Technologies 11360-070 Component of mitochondrial stress test assay medium
15 mL conical Falcon tubes Corning 352096 Used during HSPCs harvest and to prepare assay drug solutions
200 mM L-glutamine Life Technologies 25030-081 Component of glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media
2-Deoxy-D-glucose (2-DG) Sigma-Aldrich D8375 3rd drug injection during glycolysis stress test
5x Enrichment buffer (MojoSort) Biolegend 480017 Used for washings during HSPCs harvest
Ammonium chloride (NH4Cl) Fisher Scientific A661-3 Component of ACK lysis buffer
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674 3rd drug injection during mitochondrial stress test
Bio-Rad DC protein assay kit Bio-Rad 500-0112 Used as per manufacturer's instructions
Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) Sigma-Aldrich C2920 2nd drug injection during mitochondrial stress test
Cell-Tak Corning 354240 Cell adhesive. Used for coating cell microplates
Countes 3 Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific For cell counting
EDTA Fisher Scientific O2793-500 Component of ACK lysis buffer and RIPA lysis buffer
Falcon 70 μm filter Fisher Scientific 08-771-2 Used as cells strainer during HSPCs harvest
Gibco Fetal bovine serum (FBS) Fisher Scientific 26400044 Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest
Gibco HBSS Fisher Scientific 14175095 Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest
Glucose Sigma-Aldrich G7528 Component of mitochondrial stress test assay medium and first injection of glycolysis stress test
Oligomycin Sigma-Aldrich O4876 2nd drug injection during glycolysis stress test and 1st drug injection during mitochondrial stress test
PBS Life Technologies 10010-049 Used to wash cells after assay for protein quantification
Potassium bicarbonate (KHCO3) Fisher Scientific P235-500 Component of ACK lysis buffer
Protease Inhibitor Cocktail (PIC) Roche 11836170001 Supplied as tablets. One tablet was dissolved in 10 mL of RIPA buffer to make 1x PIC.
Rat biotin antimouse-B220, Clone ID: RA3-6B2 Biolegend 103203 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD2, Clone ID: RM2-5 Biolegend 100103 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD3, Clone ID: 17A2 Biolegend 100243 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3 Biolegend 100603 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7 Biolegend 100703 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5 Biolegend 108403 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119 Biolegend 116203 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rotenone Sigma-Aldrich R8875 3rd drug injection during mitochondrial stress test
Seahorse XFe96 extracellular flux analyzer Seahorse Biosciences now Agilent For ECAR and OCR measurments in real time.
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 Used to make Cell-adhesive solution for microplate coating
Sodium chloride (NaCl) Fisher BP358 Component of RIPA lysis buffer
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750 Component of RIPA lysis buffer
Sodium Fluoride (NaF) Sigma-Aldrich S7920 Component of RIPA lysis buffer
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S8045 Prepared 1 N solution. Used for pH normalization
Streptavidin Nanobeads (MojoSort) Biolegend 480015 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Tris-HCl Fisher BP153 Component of RIPA lysis buffer
XF base medium Agilent 102353-100 base medium used to prepare glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media
XF prep station Seahorse Biosciences Used for non-CO2 37 °C incubations
XFe96 extracellular FluxPak Agilent 102416-100 or 102601-100 Includes assay cartridges with utility plates, loading guide flats for loading
drugs onto the assay cartridge, XF calibrant solution, and XF cell culture microplate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rieger, M. A., Schroeder, T. Hematopoiesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008250 (2012).
  2. Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial role in stemness and differentiation of hematopoietic stem cells. Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).
  3. Snoeck, H. W. Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).
  4. Bujko, K., Kucia, M., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 49-77 (2019).
  5. Ito, K., Suda, T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).
  6. Norddahl, G. L., et al. Accumulating mitochondrial DNA mutations drive premature hematopoietic aging phenotypes distinct from physiological stem cell aging. Cell Stem Cell. 8 (5), 499-510 (2011).
  7. de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-independent methods reveal elevated mitochondrial mass in hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
  8. Kim, M., Cooper, D. D., Hayes, S. F., Spangrude, G. J. Rhodamine-123 staining in hematopoietic stem cells of young mice indicates mitochondrial activation rather than dye efflux. Blood. 91 (11), 4106-4117 (1998).
  9. Filippi, M. D., Ghaffari, S. Mitochondria in the maintenance of hematopoietic stem cells: new perspectives and opportunities. Blood. 133 (18), 1943-1952 (2019).
  10. Inoue, S., et al. Mitochondrial respiration defects modulate differentiation but not proliferation of hematopoietic stem and progenitor cells. FEBS Letters. 584 (15), 3402-3409 (2010).
  11. Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
  12. Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders - A step towards mitochondria based therapeutic strategies. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1863 (5), 1066-1077 (2017).
  13. Fontenay, M., Cathelin, S., Amiot, M., Gyan, E., Solary, E. Mitochondria in hematopoiesis and hematological diseases. Oncogene. 25 (34), 4757-4767 (2006).
  14. Nadanaciva, S., et al. Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).
  15. Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511 (2010).
  16. Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).
  17. Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics, Fourth Edition. Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. , Academic Press. Ch. 9 255-302 (2013).
  18. Aft, R. L., Zhang, F. W., Gius, D. Evaluation of 2-deoxy-D-glucose as a chemotherapeutic agent: mechanism of cell death. British Journal of Cancer. 87 (7), 805-812 (2002).
  19. Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54918 (2016).
  20. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  21. Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).

Tags

Биология выпуск 175 гемопоэтические стволовые клетки кроветворные клетки-предшественники гликолиз митохондриальное дыхание окислительное фосфорилирование скорость внеклеточного подкисления скорость потребления кислорода внеклеточный поток неадгезивные клетки
Оценка клеточной биоэнергетики в гемопоэтических стволовых клетках мыши и примитивных клетках-предшественниках с помощью анализатора внеклеточного потока
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kumar, S., Jones, M., Li, Q.,… More

Kumar, S., Jones, M., Li, Q., Lombard, D. B. Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer. J. Vis. Exp. (175), e63045, doi:10.3791/63045 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter