Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Vurdering af cellulær bioenergetik i hæmatopoietisk stamme og primitive stamceller ved hjælp af den ekstracellulære fluxanalysator

Published: September 24, 2021 doi: 10.3791/63045
Automatic Translation
1, 2, 2,3,4, 1,4,5
1Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Cellular and Developmental Biology, University of Michigan, Ann Arbor, 4Rogel Cancer Center, University of Michigan, Ann Arbor, 5Institute of Gerontology, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Metoden, der præsenteres her, opsummerer optimerede protokoller til vurdering af cellulær bioenergetik i ikke-klæbende musehæmatopoietisk stamme og primitive stamceller (HSPC'er) ved hjælp af den ekstracellulære fluxanalysator til måling af den ekstracellulære forsuringshastighed (ECAR) og iltforbrugshastighed (OCR) for HSPC'er i realtid.

Abstract

Under steady state forbliver hæmatopoietiske stamceller (HSC'er) stort set stillestående og menes at være overvejende afhængige af glykolyse for at imødekomme deres energiske behov. Under stresstilstande som infektion eller blodtab bliver HSC'er imidlertid proliferative og producerer hurtigt nedstrøms stamceller, som igen differentierer yderligere og i sidste ende producerer modne blodlegemer. Under denne overgangs- og differentieringsproces forlader HSC'er fra quiescens og gennemgår hurtigt en metabolisk switch fra glykolyse til oxidativ phosphorylering (OxPHOS). Forskellige stresstilstande, såsom aldring, kræft, diabetes og fedme, kan påvirke mitokondriefunktionen negativt og dermed ændre den metaboliske omprogrammering og differentiering af HSC'er og forfædre under hæmatopoiesis. Værdifuld indsigt i glykolytiske og mitokondrielle funktioner hos HSC'er og forfædre under normale og stressforhold kan opnås gennem vurderingen af deres ekstracellulære forsuringshastighed (ECAR) og iltforbrugshastighed (OCR), som er indikatorer for henholdsvis cellulær glykolyse og mitokondriel respiration.

Her tilvejebringes en detaljeret protokol til måling af ECAR og OCR i museknoglemarvsafledte slægtsnegative cellepopulationer, som omfatter både hæmatopoietisk stamme og primitive stamceller (HSPC'er) ved hjælp af den ekstracellulære fluxanalysator. Denne protokol beskriver tilgange til at isolere afstamningsnegative celler fra museknoglemarv, forklarer optimering af cellesåningstæthed og koncentrationer af 2-deoxy-D-glucose (2-DG, en glukoseanalog, der hæmmer glykolyse) og forskellige OxPHOS-målrettede lægemidler (oligomycin, FCCP, rotenon og antimycin A), der anvendes i disse assays, og beskriver lægemiddelbehandlingsstrategier. Nøgleparametre for glykolytisk flux, såsom glykolyse, glykolytisk kapacitet og glykolytisk reserve og OxPHOS-parametre, såsom basal respiration, maksimal respiration, protonlækage, ATP-produktion, ledig åndedrætskapacitet og koblingseffektivitet, kan måles i disse assays. Denne protokol tillader ECAR- og OCR-målinger på ikke-klæbende HSPC'er og kan generaliseres for at optimere analysebetingelserne for enhver type suspensionsceller.

Introduction

Hæmatopoiesis er den proces, hvorved forskellige typer modne blodlegemer med højt specialiserede funktioner dannes ud fra HSC'er1. HSC'er er i stand til selvfornyelse og differentiering i forskellige multipotente og slægtsspecifikke stamfaderpopulationer. Disse forfædre producerer i sidste ende celler af lymfoide, myeloide, erythroid og megakaryocyt slægter. For at opretholde deres selvfornyelseskapacitet forbliver HSC'er stort set stillestående og menes ligesom andre vævsstamceller at stole på glykolyse snarere end mitokondriel OxPHOS til ATP-produktion 2,3. Indtræden i cellecyklussen fører til øget åndedræt og OxPHOS, hvilket resulterer i forhøjede niveauer af reaktive iltarter (ROS), som er skadelige for HSC-vedligeholdelse og funktion3. Gentagen celledeling kan således føre til nedsat selvfornyelseskapacitet hos HSC'er og i sidste ende til deres udmattelse.

I voksen hæmatopoiesis gennemgår HSC'er primært asymmetrisk celledeling, hvor en af dattercellerne bevarer HSC-potentialet og fortsætter med at stole på glykolytisk metabolisme. Den anden dattercelle bliver en primitiv stamcelle, der mister selvfornyelseskapacitet, men formerer sig og til sidst giver anledning til differentierede funktionelle hæmatopoietiske celler4. Når HSC'er differentierer for at producere nedstrøms forfædre, menes et skift fra glykolyse til mitokondriemetabolisme at forekomme for at levere den energi og byggesten, der er nødvendige for at understøtte denne hurtige overgang5, som foreslået af observationerne om, at HSC'er besidder inaktiv mitokondriemasse 6,7,8,9 . I modsætning hertil er mitokondrieaktivitet (angivet med sammenkædede ROS-niveauer) meget højere hos slægtsforpligtede forfædre end i HSC'er 9,10,11. Metaboliske ændringer, der opstår under det tidligste trin af hæmatopoiesis, antyder således en direkte og afgørende rolle mitokondrier i reguleringen af HSC-skæbnen.

Dysfunktionelle mitokondrier, der er til stede under forskellige stresstilstande, såsom aldring, kræft, diabetes og fedme12, kan forstyrre HSC's selvfornyelseskapacitet og fremkalde en ubalance i HSC / stamcelledifferentiering ved at producere for store mængder ROS, forringe ATP-produktionen og / eller ved at ændre andre metaboliske processer 9,12,13 . Forstyrrelser i metabolisk homeostase i HSC/stamfaderdifferentiering kan påvirke hæmatopoiesis betydeligt og potentielt bidrage til udviklingen af hæmatologiske abnormiteter13. I betragtning af de kritiske påvirkninger af glykolyse og mitokondriel OxPHOS på HSC-stamme og differentiering er det af interesse at undersøge både metaboliske parametre under normale og stressforhold. Værdifuld indsigt i HSC'ers og stamcellers glykolytiske og mitokondrielle funktion kan opnås ved at vurdere deres ECAR og OCR, som er indikatorer for henholdsvis cellulær glykolyse og mitokondriel respiration.

Seahorse ekstracellulære fluxanalysator er et kraftfuldt apparat udstyret med to sonder pr. brønd til samtidig måling af ECAR og OCR i levende celler og kan således bruges til at vurdere cellulær bioenergetik i realtid som reaktion på forskellige substrater eller hæmmere. Assaypatronen, der anvendes sammen med analysatoren, indeholder injektionsporte til at rumme op til fire lægemidler til automatiseret injektion under analysen. Et skema med en typisk glykolyse stresstest er vist i figur 1A. Assayet starter med måling af ECAR af celler, inkuberet i glykolyse stresstestmedium indeholdende glutamin, men ikke glucose eller pyruvat. Dette repræsenterer forsuring, der forekommer på grund af ikke-glykolytiske aktiviteter i cellerne og rapporteres som ikke-glykolytisk forsuring. Dette efterfølges af injektion af glucose i en mættende koncentration. Via glykolyse omdannes glukose i cellen til pyruvat, som yderligere metaboliseres i cytoplasmaet for at producere laktat eller i mitokondrier for at producere CO2 og vand.

Omdannelse af glukose til laktat forårsager nettoproduktion og efterfølgende frigivelse af protoner til det ekstracellulære medium, hvilket resulterer i en hurtig stigning i ECAR 14,15,16. Denne glukosestimulerede ændring i ECAR rapporteres som glykolyse under basale forhold. Den anden injektion består af oligomycin (en hæmmer af ATP-syntase, alias kompleks V17), som hæmmer mitokondriel ATP-produktion. Under oligomycinmedieret OxPHOS-hæmning opregulerer celler maksimalt glykolyse for at imødekomme deres energiske krav. Dette medfører en yderligere stigning i ECAR, hvilket afslører cellernes maksimale glykolytiske kapacitet. Forskellen mellem den maksimale glykolytiske kapacitet og basal glykolyse kaldes glykolytisk reserve. Endelig injiceres 2-GD, hvilket forårsager et signifikant fald i ECAR, normalt tæt på ikke-glykolytiske forsuringsniveauer. 2-DG er en glucoseanalog, der konkurrencedygtigt binder til hexokinase, hvilket resulterer i hæmning af glykolyse18. Således bekræfter det 2-DG-inducerede fald i ECAR yderligere, at glykolyse faktisk er kilden til ECAR observeret efter glucose- og oligomycininjektioner.

Figur 1B viser skemaet for en typisk mitokondriel stresstest. Assayet starter med baseline OCR-måling af cellerne, inkuberet i mitokondrielt stresstestmedium indeholdende glucose, glutamin og pyruvat. Efter basale OCR-målinger injiceres oligomycin i dette assay, som hæmmer kompleks V og derved reducerer elektronstrømmen gennem elektrontransportkæden (ETC)17. Følgelig reduceres OCR som reaktion på oligomycininjektion, og dette fald i OCR er forbundet med mitokondriel ATP-produktion. Den anden injektion består af carbonylcyanid-4 (trifluormethoxy) phenylhydrazon (FCCP), en protonofor og en afkobling af mitokondriel OxPHOS17. FCCP kollapser den mitokondrielle protongradient ved at tillade strømmen af protoner over den mitokondrielle indre membran. På grund af FCCP-injektionen er elektronstrømmen gennem ETC dereprimeret, og kompleks IV forbruger ilt på det maksimale niveau. Forskellen mellem maksimal OCR og basal OCR kaldes den ekstra åndedrætskapacitet, som er et mål for cellens evne til at reagere på øget energibehov under stressforhold. Endelig injiceres en blanding af to ETC-hæmmere (rotenon, en kompleks I-hæmmer og antimycin A, en kompleks III-hæmmer17), som fuldstændigt lukker elektronstrømmen, og OCR falder til et lavt niveau. OCR målt efter rotenon og antimycin En injektion svarer til ikke-mitokondriel OCR drevet af andre processer inde i cellerne. Ikke-mitokondriel OCR muliggør beregning af basal respiration, protonlækage og maksimal respiration.

Basal respiration repræsenterer forskellen mellem baseline OCR og ikke-mitokondriel OCR. Protonlækage refererer til forskellen mellem OCR efter oligomycininjektion og ikke-mitokondriel OCR. Maksimal respiration repræsenterer forskellen mellem OCR efter FCCP-injektion og ikke-mitokondriel OCR. Koblingseffektivitet beregnes som procentdelen af ATP-produktionshastighed til basal respirationshastighed. Dette metodepapir giver en detaljeret protokol til måling af ECAR og OCR i afstamningsnegative HSPC'er ved hjælp af Seahorse XFe96 ekstracellulær fluxanalysator. Denne protokol beskriver tilgange til at isolere museafstamningsnegative HSPC'er, forklarer optimeringen af cellesåningstæthed og koncentrationer af forskellige lægemidler, der anvendes i ekstracellulære fluxassays, og beskriver lægemiddelbehandlingsstrategier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøg med hvirveldyr blev godkendt af og udført i overensstemmelse med reglerne fra University of Michigan Committee on Use and Care of Animals.

1. Dag før analysen (Samlet tid: ~ 10 min)

  1. Hydrering af sensorpatronen (Trintid: ~10 min)
    1. Åbn det ekstracellulære fluxanalysesæt, og fjern sensorpatronen og hjælpepladeenheden. Gem lastevejledningslejligheder til brug den næste dag.
    2. Adskil sensorpatronen manuelt (den øverste grønne del med låg) fra værktøjspladen (nederste mikroplade med 96 brønde), og anbring den på hovedet ved siden af hjælpepladen.
    3. Brug en flerkanalspipette til at fylde hver brønd på hjælpepladen med 200 μL calibrant, inkluderet i fluxanalysesæt.
    4. Anbring sensorpatronen tilbage på værktøjspladen, og sørg for at nedsænke sensorerne helt i kalibreren.
    5. Anbring den samlede sensorpatron og brugsplade med calibrant i en inkubator uden CO2 37 °C natten over. For at forhindre fordampning af kalibreringsmidlet skal du sørge for, at inkubatoren er korrekt befugtet. Hvis du bruger en almindelig ovninkubator til inkubationer uden CO2 37 °C, anbringes et åbent bægerglas indeholdende vand inde i inkubatoren for at befugte det. Hvis det er tilgængeligt, skal du bruge en XF-forberedelsesstation til alle inkubationer uden for CO2 37 °C.
      BEMÆRK: Alternativt kan sensorpatronen hydreres natten over med 200 μL pr. brønd sterilt ultrarent vand i en ikke-CO2 37 °C inkubator. Udskift vand med 200 μL pr. brønd på 37 °C forvarmet kalibrant, mindst 45-60 minutter, før injektionsportene på analysedagen indlæses.

2. Assayets dag (Samlet tid: ~ 9 timer 30 minutter)

BEMÆRK: Den samlede tid, der er angivet ovenfor, omfatter kumulative varigheder af trin 2.1-2.4 ud over enten trin 2.5 eller trin 2.6.

  1. Fremstilling af celleklæbende belagte mikroplader (Trintid: ~ 1 t 30 min)
    BEMÆRK: Udfør alle trin i et biosikkerhedsskab.
    1. Der fremstilles 2,5 ml af celleklæbemiddelopløsningen (22,4 μg/ml, se materialetabellen) pr. mikroplade med cellekultur med 96 brønde ved at opløse 56 μg af celleklæbemidlet i et passende volumen filtersteriliseret 0,1 M natriumbicarbonat (pH 8,0) og straks tilsætte 1 N natriumhydroxid ved halvdelen af det anvendte volumen celleklæbemiddel. Hvirvel eller pipette op og ned for at blande.
    2. Åbn mikropladen med 96 brønd cellekultur (inkluderet i fluxanalysesættet), og dispenser 25 μL af den fremstillede celleklæbemiddelopløsning i bunden af hver brønd. Dæk mikropladen med låget og inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur inde i emhætten.
    3. Efter inkubation fjernes og kasseres overskydende celleklæbemiddelopløsning ved hjælp af en flerkanalspipette eller aspirator, og hver brønd vaskes to gange med 200 μL sterilt ultrarent vand. Lufttør pladen, med låget fjernet, inde i emhætten i 30-45 min.
      BEMÆRK: Celleklæbende belagte cellekulturmikroplader kan opbevares i op til en uge ved 4 °C. Forbelagte mikroplader, der opbevares ved 4 °C, skal kunne varmes op til stuetemperatur inde i emhætten, inden de sås celler.
  2. Forberedelse af analysemedier (Trintid: ~ 30 min)
    1. Fremstilling af glykolyse stresstestassay medium
      1. Suppler 100 ml basismedium (se materialetabellen) med 1 ml 200 mM L-glutamin.
        BEMÆRK: Den endelige L-glutaminkoncentration i analysemediet er 2 mM.
      2. Det L-glutamin-supplerede medium opvarmes til 37 °C i et vandbad.
      3. Juster pH-værdien i det varme medium til 7,4 med 1 N NaOH.
      4. Filtersterilisere mediet med et 0,2 μm filter og opbevar det ved 37 °C, indtil det er klar til brug.
    2. Fremstilling af mitokondrielt stresstestassaymedium
      1. Suppler 100 ml af basismediet med 0,45 g glucose, 1 ml 200 mM L-glutamin og 1 ml 100 mM natriumpyruvat.
        BEMÆRK: Det endelige analysemedium indeholder 25 mM glucose, 2 mM L-glutamin og 1 mM natriumpyruvat.
      2. Varm glucose, L-glutamin og natriumpyruvat-suppleret medium til 37 °C i et vandbad.
      3. Juster pH-værdien i det varme medium til 7,4 med 1 N NaOH.
      4. Filtersteriliseres mediet med et filter på 0,2 μm og opbevares ved 37 °C, indtil det er klar til brug.
  3. Høst muse afstamning-negative HSPC'er (Trintid: ~ 3 timer)
    1. Forbered assaybufferen ved at supplere Hanks afbalancerede saltopløsning med 4% føtalt kvægserum. Forbered 1x berigelsesbuffer ved at fortynde 5x bestanden med sterilt destilleret vand. Opbevar begge buffere på is indtil brug.
    2. Humant aflive mus ved hjælp af CO2 efterfulgt af cervikal dislokation og fjern bagbenene med en saks. Fjern forsigtigt alt væv fra knoglerne, og skær enderne fra begge sider af lårbenet og skinnebenet ved hjælp af en saks. Skyl knoglemarvsceller ud af lårbenet og skinnebenet ved hjælp af assaybufferen. De skyllede celler føres gennem et sterilt 70 μm filter, centrifugeres filtratet ved 200 × g i 5 minutter ved 4 °C og kasseres supernatanten.
    3. Lys de røde blodlegemer ved at genbruge cellepillen i 500 μL ACK-buffer (150 mMNH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 7,2). Efter lysis i 1 min på is vaskes prøverne ved tilsætning af 1 ml assaybuffer og centrifuge ved 200 × g i 5 minutter ved 4 °C. Kassér supernatanten.
    4. Efter vask inkuberes prøverne med en cocktail af biotinylerede antistoffer rettet mod CD2 (1:200 fortynding), CD3 (1:200 fortynding), CD5 (1:200 fortynding), CD8 (1:200 fortynding), Ter-119 (1:200 fortynding), B220 (1:200 fortynding) og Gr-1 (1:800 fortynding) i 45 minutter på is i et samlet volumen på 500 μL assaybuffer.
    5. Prøverne vaskes med 1 ml assaybuffer med centrifugering som ovenfor.
    6. Prøverne vaskes med 1 ml 1x berigelsesbuffer med centrifugering som ovenfor.
    7. Inkubere prøverne med 20 μL streptavidin nanoperler og 100 μL 1x berigelsesbuffer på is i 15 min.
    8. Prøverne vaskes med 1 ml 1x berigelsesbuffer med centrifugering som ovenfor.
    9. Resuspend prøverne i 2,5 ml 1x berigelsesbuffer. Placer dem på en separationsmagnet i 5 minutter. Saml supernatanterne separat i 15 ml koniske rør.
    10. Resuspend magnetseparerede prøver i yderligere 2,5 ml 1x berigelsesbuffer, og læg dem igen på separationsmagneten i 5 minutter. Saml og kombiner supernatanter til de tidligere samlinger i 15 ml koniske rør fra trin 2.3.9.
      BEMÆRK: Supernatanterne indeholder de afstamningsnegative cellefraktioner.
    11. Centrifugering af de 15 ml koniske rør, der indeholder de negativt udvalgte celler, i 5 minutter ved 200 × g ved 4 °C.
    12. Resuspend cellepillerne i 1 ml assaybuffer og tæl cellenummeret ved hjælp af trypan blue manuelt eller via en automatiseret celletæller som en grevinde 3.
      BEMÆRK: Efter den ovenfor beskrevne fremgangsmåde bør ~6 × 106 afstamningsnegative HSPC'er let renses fra bagbenene på en enkelt mus. Hvis reagenser, såsom assaybuffer, 1x berigelsesbuffer og afstamningsspecifik antistofcocktail, fremstilles dagen før forsøget, tager det ca. 2,5-3 timer at berige HSPC'er fra 4 mus. Det ville tage yderligere 10 minutter for hver mus ud over dette tal.
  4. Såning af celler i celleklæbende belagte mikroplader (Trintid: ~1 time)
    1. Centrifugeceller fra trin 2.3.12 ved 200 × g i 5 minutter ved stuetemperatur.
    2. Fjern supernatanten, og genophænd cellepillen i det relevante analysemedium (glykolyse-stresstestmedium eller mitokondrie-stresstestmedium). Centrifuge ved 200 × g i 5 minutter ved stuetemperatur.
    3. Gentag trin 2.4.2. Supernatanten fjernes, og cellerne i det relevante opvarmede analysemedium suspenderes til en koncentration på 2,5 × 105 celler pr. 50 μL eller 5 × 106 pr. ml.
    4. Pipette 50 μL af cellesuspensionen langs siden af hver brønd i den stuetemperaturcelleklæbende belagte mikroplade med cellekultur med 96 brønde. Pipette 50 μL af analysemediet i hjørnebaggrundsmålebrøndene. Brug en flerkanalspipette til cellebelægning for at sikre konsistens.
    5. Opret en centrifugebalanceplade ved at tilsætte 50 μL vand pr. Brønd af en ikke-belagt 96-brønds cellekulturmikroplade.
    6. Centrifugering af cellerne i pladen ved 200 × g i 1 min ved stuetemperatur. Lad være med at bremse. Overfør pladen til en ikke-CO2 37 °C inkubator i 25-30 minutter for at sikre, at cellerne er helt fastgjort. Bekræft visuelt under et mikroskop, at cellerne er stabilt klæbet til mikropladens overflade.
      BEMÆRK: Da ~6 × 106 afstamningsnegative HSPC'er kan høstes fra bagbenene på en enkelt mus, er HSPC'er isoleret fra 4 mus (~ 2,4 × 107 celler) nødvendige for at fylde en hel plade med 96 brønde, hvis målet er at screene flere indgreb ex vivo parallelt. Men hvis målet er at undersøge virkningen af en genetisk ændring eller en intervention på de metaboliske parametre for HSPC'er in vivo, kan HSPC'er isoleret fra flere kontrolpar og testmus analyseres i flere tekniske replikater parallelt ved hjælp af en enkelt plade.
  5. Udførelse af glykolyse stresstest ved hjælp af den ekstracellulære fluxanalysator (Trintid: ~ 3 timer 30 min)
    1. Ilægning af sensorpatron med indsprøjtningsforbindelser
      1. Forbered 100 mM glucose, 20 μM oligomycin og 500 mM 2-DG opløsninger i forvarmet glykolyse stresstestassay medium (pH 7,4).
        BEMÆRK: Alle injektionsblandingsopløsninger fremstilles ved 10x koncentration. De endelige brøndkoncentrationer er 10 mM for glucose, 2 μM for oligomycin og 50 mM for 2-GD (se tabel 1).
      2. Fjern den hydratiserede sensorpatron fra inkubatorenuden FOR CO 2 37 °C fra trin 1.1.5. Fjern luftbobler fra kalibreringsmidlet i brugspladen ved at løfte sensorpatronen ud af kalibreren og udskifte den på den samme brugsplade med kalibreren.
      3. Placer A/D-lasteguiden fladt (inkluderet i det ekstracellulære fluxanalysesæt) øverst på sensorpatronen, og orienter den, så bogstavet 'A' er placeret i øverste venstre hjørne for at sikre, at kun port A er tilgængelige til lastning. Brug en flerkanalspipette til at dispensere 20 μL 100 mM glucoseopløsning i port A.
      4. Udskift A/D-lasteføringen fladt med B/C-lasteguiden fladt, og orienter dig, så bogstavet »B« er placeret i øverste venstre hjørne for at sikre, at kun port B er tilgængelig til lastning. Brug en flerkanalspipette til at dispensere 22 μL 20 μM oligomycinopløsning i port B.
      5. Ret B/C-lasteguiden fladt for at finde bogstavet »C« i øverste venstre hjørne for lasteporte C. Brug en flerkanalspipette til at dispensere 25 μL 500 mM 2-DG-opløsning i port C.
      6. Fjern og kassér lasteføringsfladerne.
        BEMÆRK: Det er vigtigt, at hver portserie af alle 96 brønde, inklusive dem i baggrundsbrøndene, lastes fuldstændigt med det samme volumen af injektionsforbindelsen.
    2. Oprettelse, kalibrering og målinger af skabeloner
      1. Opret eller indlæs skabelonen til glykolyseststresstesten på controlleren. Indtast detaljer vedrørende injektionsstrategier, behandlingsbetingelser og celletyper, og tryk på generer grupper. Gå til pladekortet og tildel brønde til hver gruppe, der skal analyseres. Tildel de 4 hjørnebrønde til baggrundsmålinger.
      2. I protokollen skal du sørge for, at kalibrering og ligevægt kontrolleres i initialiseringstrinnet .
      3. For baselinemåling og målinger efter hver injektion (glucose, oligomycin og 2-DG) skal du indstille antallet af målecyklusser til 3 og Mix - Vent - Måletider til 3 min - 0 min - 3 min (se tabel 2).
      4. Fjern låget fra de forbindelser, der er lagt i og hydreret sensorpatron, nedsænket i kaliber i brugspladen. Placer den på arbejdsbakken på den ekstracellulære fluxanalysator, og start kørslen.
        BEMÆRK: Det første trin er kalibreringen, som normalt tager ~ 20 minutter.
      5. Mikropladen, der indeholder cellerne, tages ud af inkubatoren uden CO2 37 °C fra trin 2.4.6, når 25-30 minutters inkubation er overstået. Uden at forstyrre cellerne tilsættes langsomt 130 μL af det forvarmede glykolyse-stresstestassaymedium (pH 7,4) pr. brønd for at udgøre mediumvolumenet i hver brønd til 180 μL og returnere pladen til inkubatoren uden CO2 37 °C i yderligere 15-20 minutter.
        BEMÆRK: En samlet inkubationstid på 45-60 min efter centrifugering foretrækkes.
      6. Når kalibreringen er overstået, skal du udskifte hjælpepladen med assaymikropladen (uden låg), der indeholder cellerne. Tryk på Vejecellepladen for at starte målingerne, hvilket vil tage ~1,5 time, før analysen er afsluttet.
      7. Når målingerne er overstået, skal du indsamle assaymikropladen, der indeholder cellerne, og fjerne analysemediet uden at forstyrre cellerne. Vask en gang forsigtigt med 250 μL 1x fosfatbufret saltvand uden at fjerne cellerne.
      8. Tilsæt 10 μL RIPA-lysisbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% NP-40, 0,5 % Na-deoxycholat, 0,1% natriumdodecylsulfat, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF), suppleret med 1x proteasehæmmercocktail, til hver brønd og omrør pladen på en ryster i 10 minutter. Frys hele pladen ved -80 °C.
      9. Tø pladen op, og udfør et proteinmålingsassay til datanormalisering efter producentens anvisninger.
      10. Hent og analysér dataene. Åbn datafilen ved hjælp af Wave Desktop Software. Klik på Normaliser og indsæt normaliseringsværdierne for hver brønd. Klik på Anvend for at normalisere dataene. Klik på Eksporter og vælg glykolyse stresstestrapportgenerator for at eksportere de analyserede data til en rapportgenerator. Du kan også eksportere dataene til et eksternt program.
        BEMÆRK: Alternativt kan det samlede nukleare DNA-indhold i hver brønd bruges til at normalisere dataene. Et fluorescerende farvestof, såsom CyQuant, der binder til nukleinsyre, kan bruges til at vurdere det samlede nukleare DNA-indhold pr. Brønd.
  6. Udførelse af en mitokondriel stresstest ved hjælp af den ekstracellulære fluxanalysator (Trintid: ~ 3 timer 30 min)
    1. Ilægning af sensorpatron med indsprøjtningsforbindelser
      1. Forbered 20 μM oligomycin, 20 μM FCCP og 5 μM rotenon + 5 μM antimycin A-opløsninger i forvarmet mitokondrielt stresstestassaymedium (pH 7,4).
        BEMÆRK: Alle injektionsblandingsopløsninger fremstilles ved 10x koncentration. De endelige brøndkoncentrationer er 2 μM for oligomycin, 2 μM for FCCP og 0,5 μM hver for rotenon og antimycin A (se tabel 3).
      2. Fjern den hydratiserede sensorpatron fra 37 °C-inkubatoren fra trin 1.1.5, og fjern luftbobler som beskrevet tidligere i trin 2.5.1.2.
      3. Ved at følge trin 2.5.1.3 til 2.5.1.6 dispenseres 20 μL 20 μM oligomycin i port A, 22 μL af 20 μM FCCP i port B og 25 μL af en blanding af 5 μM rotenon og 5 μM antimycin A i port C.
        BEMÆRK: Det er vigtigt, at hver portserie af alle 96 brønde, inklusive baggrundsbrøndene, lastes fuldstændigt med det samme volumen injektionsforbindelse.
    2. Oprettelse, kalibrering og målinger af skabeloner
      1. Opret eller indlæs skabelonen til mitokondrie-stresstesten på controlleren. Indtast detaljer vedrørende injektionsstrategier, behandlingsbetingelser og celletyper, og tryk på generer grupper. Gå til pladekortet og tildel brønde til hver gruppe, der skal analyseres. Tildel de 4 hjørnebrønde til baggrundsmålinger.
      2. I protokollen skal du sørge for, at kalibrering og ligevægt kontrolleres i initialiseringstrinnet.
      3. For baselinemåling og målinger efter hver injektion (oligomycin, FCCP og rotenon + antimycin A) skal du indstille antallet af målecyklusser til 3 og Mix - Vent - Måletider til 3 minutter - 0 minutter - 3 minutter (se tabel 4).
      4. Start kørslen for at udføre kalibreringen som i trin 2.5.2.4.
      5. Der tilsættes 130 μL af det forvarmede mitokondrielle stresstestassaymedium (pH 7,4) pr. brønd som i trin 2.5.2.5.
      6. Start målingerne; hente og analysere dataene som i trin 2.5.2.6 til 2.5.2.10. Eksporter de analyserede data til mitokondrie-stresstestrapportgeneratoren eller en ekstern applikation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjælp af denne protokol blev celleantallet og koncentrationerne af forskellige OxPHOS-målrettede lægemidler (anvendt i de ekstracellulære fluxassays) optimeret til at måle ECAR og OCR af HSPC'er isoleret fra 24 uger gamle kvindelige C57BL / 6-mus. For det første blev glykolyseststresstesten udført for at optimere celleantal og oligomycinkoncentration. Et varierende antal HSPC'er pr. brønd fra 5 × 104 til 2,5 × 105 blev anvendt i dette assay. Som vist i figur 2A og figur 2C stiger den ikke-glykolytiske forsuringshastighed med øget celleantal fra 5 × 104 til 2,5 × 105 , men stiger kun minimalt mellem 2 × 105 til 2,5 × 105 celler. Som forventet stimulerer injektion af 10 mM glucose glykolyse ved alle celletal, med en maksimal stigning i ECAR observeret ved 2,5 × 105 celler pr. Brønd. Injektion af 2 μM oligomycin øger dog ikke ECAR yderligere, som ellers forventet. Anvendelsen af 1 μM oligomycin gav lignende resultater (ikke vist). Disse resultater kunne fortolkes til at indikere, at disse oligomycinkoncentrationer ikke var optimale i disse assays.

OCR-data opnået i det samme sæt glykolyseststresstest viser imidlertid, at begge testede oligomycinkoncentrationer (1 μM og 2 μM) faktisk var effektive, som antydet af det signifikante fald i OCR efter oligomycininjektion på grund af kompleks V-hæmning (se figur 2B for 2 μM oligomycin; ikke vist for 1 μM oligomycin). Ved begge testede oligomycinkoncentrationer blev der observeret maksimale fald i OCR ved 2,5 × 105 celler pr. Brønd. Endelig resulterede injektion af 50 mM 2-DG i en signifikant reduktion af ECAR, hvilket indebærer, at glykolyse er kilden til ECAR observeret i disse eksperimenter. Samlet set kan det konkluderes, at HSPC'er opnår maksimal glykolyse efter glukoseinjektion i disse assays, og de besidder ringe eller ingen glykolytisk reserve. Dette indikerer, at ligesom rensede HSC'er er afstamningsnegative HSPC'er, som omfatter HSC-fraktionen, der anvendes i dette assay, også overvejende afhængige af glykolyse til deres ATP-produktion. I celler med en høj glykolytisk hastighed er der muligvis ikke en signifikant stigning i ATP-efterspørgslen ved oligomycinmedieret hæmning af mitokondriel ATP-produktion. Celler kunne let styre tabet af mitokondriel ATP uden yderligere at regulere glykolyse19. Glykolyse stresstestparametre -ikke-glykolytisk forsuring, glykolyse, glykolytisk kapacitet og glykolytisk reserve som vist i figur 2C - blev beregnet som beskrevet tidligere i introduktions- og protokolafsnittene. Baseret på disse data blev 2,5 × 105 celler pr. brønd og 2 μM oligomycin udvalgt til yderligere undersøgelser.

Den mitokondrielle stresstest blev brugt til optimering af FCCP-koncentrationen. I dette assay blev der anvendt 2,5 × 105 HSPC'er pr. brønd, som optimeret tidligere via glykolyse-stresstesten. Som vist i figur 3A begynder analysen med måling af baseline OCR efterfulgt af 2 μM oligomycininjektion, hvilket forårsager en signifikant reduktion i OCR via hæmning af kompleks V. Efter OCR-målinger efter oligomycininjektion blev FCCP injiceret i varierende koncentrationer: 0,5 μM, 1 μM, 1,5 μM og 2 μM. Som tidligere nævnt vender FCCP den oligomycin-inducerede undertrykkelse af elektronstrømmen gennem ETC ved at afkoble protontransport fra OxPHOS og tvinger kompleks IV til at forbruge ilt maksimalt. Som vist i figur 3A stimulerer FCCP OCR i HSPC'er på en dosisafhængig måde med en maksimal stigning i OCR observeret ved 2 μM FCCP. Endelig blev der injiceret en blanding af 0,5 μM rotenon og 0,5 μM antimycin A, som fuldstændigt lukker elektronstrømmen gennem ETC, og OCR falder til sit minimale niveau. OCR målt efter rotenon og antimycin A-injektion svarer til ikke-mitokondrielt iltforbrug. Andre mitokondrielle stresstestparametre - basal respiration, maksimal respiration, protonlækage, ATP-produktion, ledig åndedrætskapacitet og koblingseffektivitet som vist i figur 3B - blev beregnet som beskrevet tidligere i introduktions- og protokolafsnittene. Endelig blev 2 μM FCCP udvalgt til yderligere undersøgelser.

Figure 1
Figur 1: Skematisk repræsentation af vurdering af glykolytisk funktion og mitokondriel respiration ved hjælp af den ekstracellulære fluxanalysator. Sekvenser og injektionstider for forskellige effektorforbindelser, der anvendes i den glykolytiske stresstest (A) og mitokondriestresstesten (B), er vist. (A) Glykolytiske parametre, glykolyse, glykolytisk kapacitet, glykolytisk reserve og ikke-glykolytisk forsuring og (B) mitokondrielle funktionsparametre, basal respiration, ATP-bundet åndedræt, maksimal respiration, ikke-mitokondrielt iltforbrug, protonlækage og ledig åndedrætskapacitet er skitseret. Forkortelser: ECAR = ekstracellulær forsuringshastighed; 2-DG = 2-deoxy-D-glucose; OCR = iltforbrugshastighed; FCCP = carbonylcyanid-4 (trifluormethoxy) phenylhydrazon; Rådne. = rotenon; Anti. A = antimycin A. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Vurdering af den glykolytiske funktion i musens HSPC'er. Glykolyseststresstesten blev udført for at måle (A) de ekstracellulære forsuringshastigheder (ECAR, mpH / min) og (B) iltforbrugshastighederne (OCR, pmol / min) af HSPC'er isoleret fra 24 uger gamle kvindelige C57BL / 6 mus. Til tider indikeret blev glucose (10 mM), oligomycin (2 μM) og 2-DG (50 mM) injiceret. (C) ECAR beregnes som ikke-glykolytisk forsuring, glykolyse, glykolytisk kapacitet og glykolytisk reserve pr. 5 × 104, 1 × 105, 1,5 × 105, 2 × 105 og 2,5 × 105 HSPC'er/brønd. Data præsenteres som gennemsnitlige ± SEM, n = 4. Forkortelser: HSPC'er = hæmatopoietisk stamme og primitive stamceller; ECAR = ekstracellulær forsuringshastighed; 2-DG = 2-deoxy-D-glucose; OCR = iltforbrugshastighed. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Vurdering af mitokondriel respiration i mus HSPC'er. En mitokondriel stresstest blev udført for at måle (A) iltforbruget (pmol/min) af HSPC'er isoleret fra 24 uger gamle kvindelige C57BL/6-mus. Til tider indikeret blev oligomycin (2 μM), FCCP (0,5 μM, 1 μM, 1,5 μM, 2 μM) og rotenon og antimycin A (Rot./AA, 0,5 μM hver) injiceret. (B) OCR beregnes som ikke-mitokondrielt iltforbrug, basal respiration, protonlækage, maksimal respiration (pr. 0,5 μM, 1 μM, 1,5 μM og 2 μM FCCP), ATP-produktion, ekstra åndedrætskapacitet (pr. 0,5 μM, 1 μM, 1,5 μM og 2 μM FCCP) og koblingseffektivitet pr. 2,5 × 105 HSPC'er/brønd. Data præsenteres som gennemsnitlige ± SEM, n = 4. Forkortelser: HSPC'er = hæmatopoietisk stamme og primitive stamceller; OCR = iltforbrugshastighed; FCCP = carbonylcyanid-4 (trifluormethoxy) phenylhydrazon; Rådne. = rotenon; AA = antimycin A. Klik her for at se en større version af denne figur.

Injektionsport Portens lydstyrke Injektionsforbindelse (10x koncentreret) Endelig sammensat koncentration i brønden
En 20 μL Glukose (100 mM) 10 mM
B 22 μL Oligomycin (20 μM) 2 μM
C 25 μL 2-GD (500 mM) 50 mM

Tabel 1: Injektionsstrategi for glykolyse-stresstesten. Forkortelse: 2-DG = 2-deoxy-D-glucose.

1 Kalibrering
2 Ligevægt
3 Injektioner og målinger
Cykler Blande Vent Måle
Baseline (ikke-glykolytisk forsuring) 3 gange 3 minutter 0 minutter 3 minutter
Injicer Port A: Glukose 3 gange 3 minutter 0 minutter 3 minutter
Injicer port B: Oligomycin 3 gange 3 minutter 0 minutter 3 minutter
Indsprøjt port C: 2-GD 3 gange 3 minutter 0 minutter 3 minutter

Tabel 2: Ekstracellulært fluxanalysatorprogram til glykolyse stresstesten. Forkortelse: 2-DG = 2-deoxy-D-glucose.

Injektionsport Portens lydstyrke Injektionsforbindelse (10x koncentreret) Endelig sammensat koncentration i brønden
En 20 μL Oligomycin (20 μM) 2 μM
B 22 μL FCCP (20 μM) 2 μM
C 25 μL Rotenon (5 μM) + antimycin A (5 μM) 0,5 μM hver

Tabel 3: Injektionsstrategi for mitokondrie-stresstesten. Forkortelse: FCCP = carbonylcyanid-4 (trifluormethoxy) phenylhydrazon.

1 Kalibrering
2 Ligevægt
3 Injektioner og målinger
Cykler Blande Vent Måle
Baseline målinger 3 gange 3 minutter 0 minutter 3 minutter
Injicer Port A: Oligomycin 3 gange 3 minutter 0 minutter 3 minutter
Indsprøjt port B: FCCP 3 gange 3 minutter 0 minutter 3 minutter
Injicer port C: Rotenon & Antimycin A 3 gange 3 minutter 0 minutter 3 minutter

Tabel 4: Ekstracellulært fluxanalysatorprogram til mitokondrie-stresstesten. Forkortelse: FCCP = carbonylcyanid-4 (trifluormethoxy) phenylhydrazon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette metodepapir beskriver en optimeret protokol til vurdering af cellulær bioenergetik (glykolyse og OxPHOS) i mus HSPC'er ved hjælp af Seahorse ekstracellulære fluxanalysator. Denne enhed er et kraftfuldt værktøj, der samtidig måler ECAR og OCR af levende celler, som er målinger af henholdsvis glykolyse og mitokondriel respiration. Således kan den bruges til at vurdere den cellulære bioenergetik i realtid. Endvidere tilbyder den 96-brønds mikropladebaserede platform kvantificering med høj gennemstrømning med høj følsomhed, hvilket muliggør samtidig analyse af flere prøver ved hjælp af en enkelt plade sammenlignet med et andet respirometer med høj opløsning, Oroboros O2k, som kun kan analysere 2 prøver samtidigt eller den klassiske Clark-elektrode20.

Den ekstracellulære fluxanalysator er primært blevet brugt til analyse af klæbende celletyper, da det kræver, at celler er til stede i et monolag, hvilket gør det mere udfordrende at analysere celler dyrket i suspension. Desuden opstår der efter lægemiddelinjektion fra porten turbulens under blandingscyklussen mellem lægemiddel og medier i brøndene forud for målingerne, hvilket kan løsne cellerne. Derfor skal cellerne fastgøres fast til bunden af brønden. De protokoller, der er beskrevet her, har anvendt en celleklæbende formulering af ikke-immunogene polyphenoliske proteiner ekstraheret fra havmuslingen, Mytilus edulis, til fremstilling af et klæbende monolag af murine HSPC'er.

En anden begrænsning af denne teknologi er per-assay-omkostningerne, som er meget høje sammenlignet med Clark-type elektroden og Oroboros O2k. Patronerne er relativt dyre og kan ikke genbruges. Det anslås, at omkostningerne ved selve den ekstracellulære fluxanalysator er ~ 4 gange højere end Oroboros O2k20. I betragtning af den ekstracellulære fluxanalysators semi-automatisering og kapacitet med høj gennemstrømning kan der imidlertid indsamles en meget større mængde data pr. Kørsel end med O2k.

Resultaterne opnået her viser, at der kræves 2,5 × 105 HSPC'er pr. Brønd for at opnå pålidelige data ved hjælp af en 96-brøndbaseret ekstracellulær fluxanalysator. Dette tilføjer en anden udfordring ved at udføre fluxassays ved hjælp af HSPC'er, som er vanskelige at opnå i store mængder fra en mus og kræver flowcytometrisk sortering for at opnå en ren population. Desuden tilføjer flowsortering betydelig tid til eksperimentet og kan ændre den metaboliske fænotype af stamcellerne. For at overvinde de begrænsninger, der er forbundet med flowcytometribaseret oprensning, anvendte den strategi, der blev diskuteret her, slægtsspecifikke antistoffer bundet til magnetiske perler for at nedbryde slægtsforpligtede forfædre og dermed berige de afstamningsnegative HSPC'er. For yderligere at berige mere primitive HSPC'er kan der tilføjes et ekstra cKit-berigelsestrin; Dette kommer dog med omkostningerne ved yderligere ex vivo-tid (~ 1,5 timer) og en reduktion i celleantal. Anvendelsen af en sådan protokol ville kræve optimering uden for denne protokols anvendelsesområde.

For at opretholde deres pluripotens skal HSC'er forblive stillestående og fortrinsvis opholde sig i det hypoxiske miljø inde i knoglemarven 9,21. Quiescent HSC'er menes overvejende at stole på glykolyse for at opfylde deres beskedne energibehov, da høje niveauer af ROS, et biprodukt af mitokondriel respiration, er skadelige for deres stamme 2,3. HSC'er besidder relativt høj, men stort set inaktiv mitokondriemasse, der opretholder cellulær ROS på lave niveauer for at muliggøre vedligeholdelse af HSCs pluripotens9. Under engagement og differentiering bliver mitokondrier imidlertid den primære kilde til ATP-produktion i HSC'er 5,9. Mitokondrier spiller således en nøglefunktion i overgangen af HSC'er fra quiescens til den metabolisk aktive tilstand, der kræves for deres afstamningsforpligtelse og differentiering. Ud over at producere ATP via OxPHOS spiller mitokondrier mange andre vigtige roller i hæmatopoietisk cellehomeostase, herunder ROS-regulering, apoptose, calciumsignalering og syntese af hæm og mange andre kritiske metabolitmellemprodukter9. Ændringer i mitokondrielle funktioner kan påvirke HSC / stamfader differentieringsveje betydeligt og kan bidrage til forskellige hæmatologiske lidelser, såsom hæmatopoietiske maligniteter, medfødt dyserythropoiesis og sideroblastiske anæmier og myelodysplastiske syndromer13. I maligne hæmatopoietiske celler spiller dysfunktionelle mitokondrier en kritisk rolle i at give resistens over for apoptose induceret af forskellige cytotoksiske lægemidler13.

På grund af mitokondriernes centrale rolle i opretholdelsen af HSC / stamfader homeostase kan værdifuld indsigt i disse cellers fysiologiske status opnås ved at vurdere deres mitokondrielle OxPHOS under normale og stressforhold. Identifikationen af nye modulatorer af mitokondrielle aktiviteter kunne identificere nye terapeutiske mål til behandling af hæmatologiske abnormiteter. Protokollen beskrevet i dette papir kan bruges til at screene virkningerne af kemiske forbindelser eller metaboliske CRISPR-biblioteker på OCR og ECAR af HSC'er under normale og patologiske forhold, f.eks. HSC'er høstet fra genetisk manipulerede musemodeller af hæmatologiske lidelser. En sådan screening kan også være nyttig til at belyse metaboliske veje, der opretholder HSC-styrke i deres hypoxiske niche, hvilket ville være nyttigt til at udtænke strategier for in vitro-udvidelse af HSC'er, samtidig med at deres pluripotens opretholdes til terapeutiske formål. I betragtning af denne analyses høje gennemstrømningskarakter kunne den protokol, der er beskrevet her, let tilpasses til at screene et stort antal bioenergetiske modulatorer i HSC'er, hæmatopoietiske forfædre og maligne hæmatopoietiske celler.

Sammenfattende beskriver de metoder, der præsenteres her, optimerede protokoller til måling af ECAR og OCR i primære mus HSPC'er ved hjælp af den ekstracellulære fluxanalysator. Resultater opnået fra glykolyse stresstesten har vist, at 2,5 × 105 celler pr. Brønd og 2 μM oligomycin er optimale til yderligere analyse. Ved hjælp af 2,5 × 105 celler pr. Brønd og 2 μM oligomycin blev mitokondriestresstesten udført for at optimere FCCP-koncentrationen, og 2 μM FCCP viste sig at inducere maksimal OCR. Selvom den nuværende undersøgelse hovedsageligt er fokuseret på HSPC'er med mus, kan protokollen og denne tilgang let tilpasses til at optimere analysebetingelserne for enhver form for suspensionsceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikt.

Acknowledgments

Arbejdet i Lombard-laboratoriet støttes af NIH (NIGMS R01GM101171, NIEHS R21ES032305), DoD (CA190267, CA170628, NF170044 og ME200030) og Glenn Foundation for Medical Research. Arbejdet i Li-laboratoriet understøttes af NIH (NHLBI 5R01HL150707).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 μm filter Corning 430626 Used to filter-sterilize the assay media
100 mM sodium pyruvate Life Technologies 11360-070 Component of mitochondrial stress test assay medium
15 mL conical Falcon tubes Corning 352096 Used during HSPCs harvest and to prepare assay drug solutions
200 mM L-glutamine Life Technologies 25030-081 Component of glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media
2-Deoxy-D-glucose (2-DG) Sigma-Aldrich D8375 3rd drug injection during glycolysis stress test
5x Enrichment buffer (MojoSort) Biolegend 480017 Used for washings during HSPCs harvest
Ammonium chloride (NH4Cl) Fisher Scientific A661-3 Component of ACK lysis buffer
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674 3rd drug injection during mitochondrial stress test
Bio-Rad DC protein assay kit Bio-Rad 500-0112 Used as per manufacturer's instructions
Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) Sigma-Aldrich C2920 2nd drug injection during mitochondrial stress test
Cell-Tak Corning 354240 Cell adhesive. Used for coating cell microplates
Countes 3 Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific For cell counting
EDTA Fisher Scientific O2793-500 Component of ACK lysis buffer and RIPA lysis buffer
Falcon 70 μm filter Fisher Scientific 08-771-2 Used as cells strainer during HSPCs harvest
Gibco Fetal bovine serum (FBS) Fisher Scientific 26400044 Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest
Gibco HBSS Fisher Scientific 14175095 Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest
Glucose Sigma-Aldrich G7528 Component of mitochondrial stress test assay medium and first injection of glycolysis stress test
Oligomycin Sigma-Aldrich O4876 2nd drug injection during glycolysis stress test and 1st drug injection during mitochondrial stress test
PBS Life Technologies 10010-049 Used to wash cells after assay for protein quantification
Potassium bicarbonate (KHCO3) Fisher Scientific P235-500 Component of ACK lysis buffer
Protease Inhibitor Cocktail (PIC) Roche 11836170001 Supplied as tablets. One tablet was dissolved in 10 mL of RIPA buffer to make 1x PIC.
Rat biotin antimouse-B220, Clone ID: RA3-6B2 Biolegend 103203 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD2, Clone ID: RM2-5 Biolegend 100103 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD3, Clone ID: 17A2 Biolegend 100243 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3 Biolegend 100603 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7 Biolegend 100703 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5 Biolegend 108403 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119 Biolegend 116203 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rotenone Sigma-Aldrich R8875 3rd drug injection during mitochondrial stress test
Seahorse XFe96 extracellular flux analyzer Seahorse Biosciences now Agilent For ECAR and OCR measurments in real time.
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 Used to make Cell-adhesive solution for microplate coating
Sodium chloride (NaCl) Fisher BP358 Component of RIPA lysis buffer
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750 Component of RIPA lysis buffer
Sodium Fluoride (NaF) Sigma-Aldrich S7920 Component of RIPA lysis buffer
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S8045 Prepared 1 N solution. Used for pH normalization
Streptavidin Nanobeads (MojoSort) Biolegend 480015 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Tris-HCl Fisher BP153 Component of RIPA lysis buffer
XF base medium Agilent 102353-100 base medium used to prepare glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media
XF prep station Seahorse Biosciences Used for non-CO2 37 °C incubations
XFe96 extracellular FluxPak Agilent 102416-100 or 102601-100 Includes assay cartridges with utility plates, loading guide flats for loading
drugs onto the assay cartridge, XF calibrant solution, and XF cell culture microplate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rieger, M. A., Schroeder, T. Hematopoiesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008250 (2012).
  2. Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial role in stemness and differentiation of hematopoietic stem cells. Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).
  3. Snoeck, H. W. Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).
  4. Bujko, K., Kucia, M., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 49-77 (2019).
  5. Ito, K., Suda, T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).
  6. Norddahl, G. L., et al. Accumulating mitochondrial DNA mutations drive premature hematopoietic aging phenotypes distinct from physiological stem cell aging. Cell Stem Cell. 8 (5), 499-510 (2011).
  7. de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-independent methods reveal elevated mitochondrial mass in hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
  8. Kim, M., Cooper, D. D., Hayes, S. F., Spangrude, G. J. Rhodamine-123 staining in hematopoietic stem cells of young mice indicates mitochondrial activation rather than dye efflux. Blood. 91 (11), 4106-4117 (1998).
  9. Filippi, M. D., Ghaffari, S. Mitochondria in the maintenance of hematopoietic stem cells: new perspectives and opportunities. Blood. 133 (18), 1943-1952 (2019).
  10. Inoue, S., et al. Mitochondrial respiration defects modulate differentiation but not proliferation of hematopoietic stem and progenitor cells. FEBS Letters. 584 (15), 3402-3409 (2010).
  11. Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
  12. Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders - A step towards mitochondria based therapeutic strategies. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1863 (5), 1066-1077 (2017).
  13. Fontenay, M., Cathelin, S., Amiot, M., Gyan, E., Solary, E. Mitochondria in hematopoiesis and hematological diseases. Oncogene. 25 (34), 4757-4767 (2006).
  14. Nadanaciva, S., et al. Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).
  15. Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511 (2010).
  16. Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).
  17. Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics, Fourth Edition. Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. , Academic Press. Ch. 9 255-302 (2013).
  18. Aft, R. L., Zhang, F. W., Gius, D. Evaluation of 2-deoxy-D-glucose as a chemotherapeutic agent: mechanism of cell death. British Journal of Cancer. 87 (7), 805-812 (2002).
  19. Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54918 (2016).
  20. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  21. Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).

Tags

Biologi udgave 175 hæmatopoietiske stamceller hæmatopoietiske stamceller glykolyse mitokondriel respiration oxidativ phosphorylering ekstracellulær forsuringshastighed iltforbrugshastighed ekstracellulær flux ikke-klæbende celler
Vurdering af cellulær bioenergetik i hæmatopoietisk stamme og primitive stamceller ved hjælp af den ekstracellulære fluxanalysator
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kumar, S., Jones, M., Li, Q.,… More

Kumar, S., Jones, M., Li, Q., Lombard, D. B. Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer. J. Vis. Exp. (175), e63045, doi:10.3791/63045 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter