Summary
ここで提示された方法は、HSPCの細胞外酸性化速度(ECAR)および酸素消費速度(OCR)をリアルタイムで測定するために、細胞外フラックス分析装置を使用して、非付着性マウス造血幹および原始前駆細胞(HSPC)における細胞生体エネルギーを評価するための最適化されたプロトコルを要約する。
Abstract
定常状態では、造血幹細胞(HSC)は大部分が静止したままであり、そのエネルギー的ニーズを満たすために主に解糖系に依存していると考えられている。しかし、感染や失血などのストレス条件下では、HSCは増殖性になり、下流の前駆細胞を急速に産生し、それがさらに分化し、最終的に成熟した血液細胞を産生する。この移行および分化プロセスの間、HSCは静止から終了し、解糖系から酸化的リン酸化(OxPHOS)への代謝スイッチを急速に受ける。加齢、癌、糖尿病、肥満などの様々なストレス状態は、ミトコンドリア機能に悪影響を及ぼす可能性があり、したがって、造血中のHSCおよび前駆細胞の代謝リプログラミングおよび分化を変化させる可能性がある。HSCおよび前駆細胞の正常およびストレス条件下での解糖系およびミトコンドリア機能に関する貴重な洞察は、それぞれ細胞解糖系およびミトコンドリア呼吸の指標である細胞外酸性化速度(ECAR)および酸素消費速度(OCR)の評価を通じて得ることができる。
ここでは、細胞外フラックス分析装置を使用して、造血幹細胞および原始前駆細胞(HSPC)の両方を含むマウス骨髄由来系統陰性細胞集団におけるECARおよびOCRを測定するための詳細なプロトコールが提供される。このプロトコールは、マウス骨髄から系統陰性細胞を単離するためのアプローチを説明し、細胞播種密度および2-デオキシ-D-グルコース(2-DG、解糖系を阻害するグルコース類似体)およびこれらのアッセイで使用される様々なOxPHOS標的薬物(オリゴマイシン、FCCP、ロテノン、およびアンチマイシンA)の濃度を説明し、薬物治療戦略を説明する。解糖系、解糖系容量、解糖系予備量などの解糖系フラックスの主要なパラメータと、基礎呼吸、最大呼吸、プロトン漏れ、ATP産生、予備呼吸能力、カップリング効率などのOxPHOSパラメータは、これらのアッセイで測定できます。このプロトコルは、非付着性HSPCのECARおよびOCR測定を可能にし、あらゆるタイプの浮遊細胞の分析条件を最適化するために一般化することができます。
Introduction
造血は、高度に専門化された機能を有する様々なタイプの成熟血液細胞がHSCs1から形成されるプロセスである。HSCは、自己複製および様々な多能性および系統特異的な前駆集団への分化が可能である。これらの前駆細胞は、最終的にリンパ系、骨髄系、赤血球系、および巨核球系譜の細胞を産生する。自己複製能力を維持するために、HSCは大部分が静止したままであり、他の組織幹細胞と同様に、ATP産生のためにミトコンドリアOxPHOSではなく解糖系に依存すると考えられている2,3。細胞周期に入ると、呼吸とOxPHOSが増強され、HSCの維持と機能に有害な活性酸素種(ROS)のレベルが上昇します3。したがって、細胞分裂を繰り返すと、HSCの自己複製能力が低下し、最終的には枯渇する可能性があります。
成体造血では、HSCは主に非対称細胞分裂を受け、その間、娘細胞の1つがHSC電位を保持し、解糖系代謝に依存し続ける。もう一方の娘細胞は、自己複製能を失うが増殖し、最終的に分化した機能造血細胞4を生じさせる原始前駆細胞となる。HSCが分化して下流の祖先を産生すると、HSCが不活性なミトコンドリア塊を有するという観察によって示唆されるように、解糖系からミトコンドリア代謝への切り替えが起こると考えられている5、HSCが不活性なミトコンドリア塊6、7、8、9.対照的に、ミトコンドリア活性(リンクされたROSレベルによって示される)は、HSCs9、10、11よりも系統コミットされた前駆細胞においてはるかに高い。したがって、造血の初期段階で起こる代謝変化は、HSCの運命を調節する上でのミトコンドリアの直接的かつ重要な役割を示唆している。
老化、癌、糖尿病、肥満などの様々なストレス条件下で存在する機能不全のミトコンドリア12は、HSCの自己複製能力を妨害し、過剰な量のROSを産生し、ATP産生を損ない、および/または他の代謝プロセスを変化させることによってHSC/前駆分化の不均衡を誘発する可能性がある9,12,13.HSC/前駆分化における代謝恒常性における摂動は、造血に重大な影響を及ぼし、血液学的異常の発症に寄与する可能性がある13。解糖系およびミトコンドリアOxPHOSがHSCのステムネスおよび分化に及ぼす重大な影響を考えると、正常およびストレス条件下で両方の代謝パラメータを調査することが興味深い。HSCおよび前駆細胞の解糖系およびミトコンドリア機能に関する貴重な洞察は、細胞の解糖系およびミトコンドリア呼吸の指標であるECARおよびOCRをそれぞれ評価することによって得ることができる。
タツノオトシゴ細胞外フラックス分析計は、生細胞中のECARおよびOCRを同時に測定するためにウェルあたり2つのプローブを備えた強力な装置であり、したがって、様々な基質または阻害剤に応答して、細胞の生体エネルギーをリアルタイムで評価するために使用することができる。分析装置で使用されるアッセイカートリッジには、アッセイ中に自動注入用の最大 4 つの薬物を保持する注入ポートが含まれています。典型的な解糖系ストレス試験のスキームを 図1Aに示す。アッセイは、グルコースまたはピルビン酸を含まないグルタミンを含む解糖系ストレス試験培地中でインキュベートした細胞のECARの測定から始まる。これは、細胞の非解糖系活性のために起こる酸性化を表し、非解糖系酸性化として報告されている。これに続いて、飽和濃度でのグルコースの注射が続く。解糖系を介して、細胞内のグルコースはピルビン酸に変換され、これはさらに細胞質内で代謝されて乳酸塩を生成し、またはミトコンドリア内でCO2 および水を生成する。
グルコースから乳酸への変換は、細胞外培地へのプロトンの正味産生およびその後の放出を引き起こし、その結果、ECAR14、15、16の急速な増加をもたらす。ECARにおけるこのグルコース刺激変化は、基礎条件下で解糖系として報告される。2回目の注射は、ミトコンドリアATP産生を阻害するオリゴマイシン(ATP合成酵素、別名複合体V17の阻害剤)からなる。オリゴマイシン媒介性OxPHOS阻害の間、細胞は解糖系を最大限アップレギュレートして、その精力的要求を満たす。これはECARのさらなる増加を引き起こし、細胞の最大解糖系能力を明らかにする。最大解糖系容量と基礎解糖系との差を解糖系予備量と呼ぶ。最後に、2-DGが注入され、これはECARの有意な低下を引き起こし、通常は非解糖系酸性化レベルに近い。2-DGは、ヘキソキナーゼに競合的に結合し、解糖系18の阻害をもたらすグルコース類似体である。したがって、ECARの2-DG誘導性減少は、解糖系が実際にグルコースおよびオリゴマイシン注射後に観察されるECARの供給源であることをさらに確認する。
図1B は、典型的なミトコンドリアストレス試験の概略を示す。アッセイは、細胞のベースラインOCR測定から始まり、グルコース、グルタミン、およびピルビン酸を含むミトコンドリアストレス試験培地中でインキュベートする。基礎OCR測定に続いて、このアッセイにおいてオリゴマイシンが注入され、これは錯体Vを阻害し、それによって電子輸送鎖(ETC)を通る電子流を減少させる17。その結果、オリゴマイシン注射に応答してOCRが減少し、このOCRの減少がミトコンドリアATP産生と関連している。2回目の注射は、カルボニルシアン化物-4(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン(FCCP)、プロトノフォアおよびミトコンドリアOxPHOS17のアンカプラーからなる。FCCPは、ミトコンドリア内膜を横切るプロトンの流れを可能にすることによってミトコンドリアプロトン勾配を崩壊させる。FCCP注入のために、ETCを通る電子流は抑制されず、錯体IVは最大レベルで酸素を消費する。最大OCRと基礎OCRの差は予備呼吸能力と呼ばれ、ストレス条件下でのエネルギー需要の増加に応答する細胞の能力の尺度である。最後に、2つのETC阻害剤(ロテノン、複合体I阻害剤、およびアンチマイシンA、複合体III阻害剤17)の混合物が注入され、電子の流れが完全に遮断され、OCRは低レベルに低下する。ロテノンおよびアンチマイシンA注射後に測定されたOCRは、細胞内の他のプロセスによって駆動される非ミトコンドリアOCRに対応する。非ミトコンドリアOCRは、基礎呼吸、陽子漏れ、および最大呼吸の計算を可能にします。
基礎呼吸は、ベースラインOCRと非ミトコンドリアOCRとの差を表す。プロトンリークは、オリゴマイシン注射後のOCRと非ミトコンドリアOCRとの差を指す。最大呼吸は、FCCP注射後のOCRと非ミトコンドリアOCRとの差を表す。結合効率は、基礎呼吸数に対するATP生産率の割合として計算される。この方法論文は、タツノオトシゴXFe96細胞外フラックス分析装置を使用して系統陰性HSPC中のECARおよびOCRを測定するための詳細なプロトコルを提供する。このプロトコールは、マウス系統陰性HSPCを単離するためのアプローチを説明し、細胞播種密度および細胞外フラックスアッセイで使用される様々な薬物の濃度の最適化を説明し、薬物治療戦略を説明する。
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Protocol
すべての脊椎動物実験は、ミシガン大学動物の使用および世話に関する委員会の規則に従って承認され、実施された。
アッセイ前日(合計時間:〜10分)
- センサーカートリッジの水分補給(ステップ時間:〜10分)
- 細胞外フラックスアッセイキットを開き、センサーカートリッジとユーティリティプレートアセンブリを取り外します。翌日に使用するためにローディングガイドフラットを保存します。
- センサーカートリッジ(蓋付きの上部の緑色の部分)をユーティリティプレート(下部の96ウェルマイクロプレート)から手動で分離し、ユーティリティプレートの横に逆さまに置きます。
- マルチチャンネルピペットを使用して、ユーティリティプレートの各ウェルに、フラックスアッセイキットに付属の200 μLのキャリバートを充填します。
- センサーカートリッジをユーティリティプレートに戻し、センサーをキャリバーントに完全に浸してください。
- キャリブラントで組み立てられたセンサーカートリッジとユーティリティプレートを非CO2 37°Cインキュベーターに一晩置きます。キャリバートの蒸発を防ぐために、インキュベーターが適切に加湿されていることを確認してください。非CO2 37°Cインキュベーションに通常のオーブンインキュベーターを使用する場合は、インキュベーター内部に水を入れたオープンビーカーを置き、それを加湿する。利用可能な場合は、すべての非CO2 37°CインキュベーションにXFプレップステーションを使用してください。
注:あるいは、センサーカートリッジは、非CO2 37°Cインキュベーター内の滅菌超純水1ウェルあたり200μLで一晩水和することができます。アッセイ当日に注入口を装填する前に、少なくとも45〜60分前に、37°Cに予温したキャリバートのウェルあたり200μLで水を交換してください。
アッセイの日(合計時間:〜9時間30分)
メモ: 上記の合計時間には、ステップ 2.5 またはステップ 2.6 に加えて、ステップ 2.1 ~ 2.4 の累積継続時間が含まれます。
- 細胞接着コーティングマイクロプレートの調製(ステップ時間:〜1時間30分)
メモ:バイオセーフティキャビネットのすべての手順を実行します。- 56 μgの細胞接着液を適当な量のフィルター滅菌した0.1 M炭酸水素ナトリウム(pH 8.0)に溶解し、直ちに1 N水酸化ナトリウムを、使用した細胞接着ストックの半分の容量で加えることにより、96穴細胞培養マイクロプレートあたり2.5 mLの細胞接着溶液(22.4 μg/mL、 材料表参照)を調製する。渦またはピペットを上下にして混合します。
- 96ウェル細胞培養マイクロプレート(フラックスアッセイキットに付属)を開き、調製した細胞接着溶液25 μLを各ウェルの底に分注する。マイクロプレートを蓋で覆い、フード内の室温で30分間インキュベートします。
- インキュベーション後、マルチチャンネルピペットまたはアスピレーターを用いて余分な細胞接着溶液を除去して廃棄し、各ウェルを200μLの滅菌超純水で2回洗浄する。蓋を外した状態で、フード内でプレートを30〜45分間空気乾燥させます。
注:細胞接着コーティングされた細胞培養マイクロプレートは、4°Cで最大1週間保存することができる。 4°Cで保存されたプレコートマイクロプレートは、細胞を播種する前にフード内の室温まで温める必要があります。
- アッセイ培地の調製(ステップ時間:〜30分)
- 解糖系ストレス試験用アッセイ培地の調製
- 100mLのベース培地( 材料表を参照)を1mLの200mM L-グルタミンで補足する。
注:アッセイ培地中の最終L-グルタミン濃度は2mMである。 - L-グルタミン添加培地をウォーターバス中で37°Cに温める。
- 温培地のpHを1N NaOHで7.4に調整する。
- 培地を0.2μmフィルターでろ過滅菌し、使用できる状態になるまで37°Cに保ちます。
- 100mLのベース培地( 材料表を参照)を1mLの200mM L-グルタミンで補足する。
- ミトコンドリアストレス試験用アッセイ培地の調製
- 100 mLのベース培地に0.45 gのグルコース、1 mLの200 mM L-グルタミン、および1 mLの100 mM ピルビン酸ナトリウムを補充する。
注:最終アッセイ培地は、25 mM グルコース、2 mM L-グルタミン、および 1 mM ピルビン酸ナトリウムを含有する。 - グルコース、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム添加培地をウォーターバス中で37°Cに温めた。
- 温培地のpHを1N NaOHで7.4に調整する。
- 培地を0.2μmフィルターでろ過滅菌し、使用準備が整うまで37°Cに保ちます。
- 100 mLのベース培地に0.45 gのグルコース、1 mLの200 mM L-グルタミン、および1 mLの100 mM ピルビン酸ナトリウムを補充する。
- 解糖系ストレス試験用アッセイ培地の調製
- マウス系統陰性HSPC(ステップタイム:〜3時間)を収穫する
- ハンクのバランス塩溶液に4%ウシ胎児血清を補充してアッセイバッファーを調製します。5xストックを滅菌蒸留水で希釈することによって1x濃縮緩衝液を調製する。使用時まで両方のバッファーを氷の上に保管してください。
- CO2を用いてマウスを人道的に安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼を行い、ハサミで後肢を除去する。骨からすべての組織を慎重に取り除き、はさみを使って大腿骨と脛骨の両側から端を切り取ります。アッセイバッファーを使用して大腿骨および脛骨から骨髄細胞を洗い流す。洗い流した細胞を滅菌70μmフィルターに通し、ろ液を200×gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てる。
- 細胞ペレットを500 μLのACK緩衝液(150 mM NH4Cl、10 mM KHCO3、0.1 mM EDTA、pH 7.2)に再懸濁して赤血球を溶解する。氷上で1分間溶解した後、1mLのアッセイバッファーおよび遠心分離機で200× g を加えて4°Cで5分間サンプルを洗浄する。 上清を捨てる。
- 洗浄後、CD2(1:200希釈)、CD3(1:200希釈)、CD5(1:200希釈)、CD8(1:200希釈)、Ter-119(1:200希釈)、B220(1:200希釈)、およびGr-1(1:800希釈)に対するビオチン化抗体のカクテルと共に、アッセイバッファーの全容量500μL中で氷上で45分間、サンプルをインキュベートする。
- 上記のように遠心分離で1mLのアッセイバッファーでサンプルを洗浄する。
- 上記のように遠心分離で1mLの1x濃縮緩衝液でサンプルを洗浄する。
- サンプルを20 μLのストレプトアビジンナノビーズおよび100 μLの1x濃縮バッファーとともに氷上で15分間インキュベートします。
- 上記のように遠心分離で1mLの1x濃縮緩衝液でサンプルを洗浄する。
- サンプルを2.5 mLの1x濃縮バッファーに再懸濁します。それらを分離磁石の上に5分間置きます。上清を15mL円錐管に別々に集める。
- マグネット分離したサンプルを追加の2.5 mLの1倍濃縮バッファーに再懸濁し、再び分離マグネット上に5分間置きます。ステップ2.3.9から15mLの円錐管で以前のコレクションに上清を集めて組み合わせます。
注:上清には、系統陰性細胞画分が含まれています。 - 負に選択された細胞を含む15mL円錐管を4°Cで200× g で5分間遠心分離する。
- 細胞ペレットを1mLのアッセイバッファーに再懸濁し、トリパンブルーを手動で使用するか、Countess 3などの自動細胞カウンターを介して細胞数をカウントします。
注:上記のアプローチに従って、〜6〜106 ×系統陰性HSPCは、単一のマウスの後肢から容易に精製されるべきである。アッセイバッファー、1x濃縮バッファー、系統特異的抗体カクテルなどの試薬を実験の前日に調製した場合、4匹のマウスからHSPCを濃縮するのに約2.5~3時間かかります。この数を超えると、マウスごとにさらに10分かかります。
- 細胞接着コーティングされたマイクロプレートに細胞を播種する(ステップ時間:〜1時間)
- ステップ2.3.12から細胞を200× g で室温で5分間遠心分離する。
- 上清を除去し、細胞ペレットを適切なアッセイ培地(解糖系ストレス試験培地またはミトコンドリアストレス試験培地)に再懸濁する。200 × g で室温で5分間遠心分離する。
- 手順 2.4.2 を繰り返します。上清を除去し、細胞を適切な加温アッセイ培地に再懸濁して、50 μLあたり2.5 ×105細胞 または1mLあたり5×106の 濃度にする。
- 50 μLの細胞懸濁液を室温細胞接着コーティングされた96ウェル細胞培養マイクロプレートの各ウェルの側面に沿ってピペットする。アッセイ培地50 μLをコーナーバックグラウンド測定ウェルにピペットする。細胞プレーティングにはマルチチャンネルピペットを使用して、一貫性を確保します。
- コーティングされていない96ウェル細胞培養マイクロプレートのウェルあたり50μLの水を加えて遠心分離機バランスプレートを作成します。
- プレート中の細胞を200 × g で室温で1分間遠心分離する。ブレーキをかけないでください。プレートを非CO2 37°Cインキュベーターに25〜30分間移し、細胞が完全に付着したことを確認する。マイクロプレート表面に細胞が安定に接着していることを顕微鏡で目視で確認する。
注:1匹のマウスの後肢から〜6×106 系統陰性HSPCを採取することができるので、4匹のマウス(〜2.4×107 細胞)から単離されたHSPCは、 複数の介入をエキソビボ で並行してスクリーニングすることである場合、96ウェルプレート全体を満たすために必要である。しかし、遺伝子改変または介入が 生体内のHSPCの代謝パラメータに及ぼす影響を調査することが目的である場合、複数の対照マウスおよび試験マウスから単離されたHSPCは、単一のプレートを使用して複数の技術的複製で並行して分析することができる。
- 細胞外フラックス分析装置を用いて解糖系ストレス試験を行う(工程時間:〜3時間30分)
- コンパウンドを注入するローディングセンサーカートリッジ
- 100 mM グルコース、20 μM オリゴマイシン、および 500 mM 2-DG 溶液を、加温した解糖系ストレス試験アッセイ培地 (pH 7.4) に調製します。
注:すべての注入化合物溶液は10倍の濃度で作られています。最終ウェル濃度は、グルコースで10 mM、オリゴマイシンで2 μM、2-DGで50 mMです( 表1参照)。 - ステップ 1.1.5 から非CO2 37 °C インキュベーターから水和センサーカートリッジを取り外します。センサーカートリッジをキャリブラントから持ち上げ、キャリブラントと同じユーティリティプレートに交換して、ユーティリティプレートのキャリブラントから気泡を取り除きます。
- A/Dローディングガイド(細胞外フラックスアッセイキットに付属)をセンサーカートリッジの上部に平らに置き、文字「A」が左上隅に位置するように向きを変えて、ポートAのみがロードに使用できるようにします。マルチチャンネルピペットを使用して、ポートAに20 μLの100 mMグルコース溶液を分注します。
- A/D ローディングガイドをフラットな B/C ローディングガイドに交換し、文字「B」が左上隅に位置するように方向を変えて、ポート B のみがロードに使用できるようにします。マルチチャンネルピペットを使用して、ポートBに22 μLの20 μMオリゴマイシン溶液を分注します。
- B/Cローディングガイドの向きを平らにして、ポートCをロードするための左上隅の文字「C」を見つけます。マルチチャンネルピペットを使用して、ポートCに25 μLの500 mM 2-DG溶液を分配します。
- ローディングガイドのフラットを取り外して廃棄します。
注:バックグラウンドウェルのポートを含むすべての96ウェルの各ポートシリーズに、同じ容量の注入化合物を完全に装填することが重要です。
- 100 mM グルコース、20 μM オリゴマイシン、および 500 mM 2-DG 溶液を、加温した解糖系ストレス試験アッセイ培地 (pH 7.4) に調製します。
- テンプレートの作成、キャリブレーション、測定
- 解糖系ストレス テストのテンプレートを作成またはコントローラーに読み込みます。注射戦略、治療条件、および細胞タイプに関する詳細を入力し、 生成グループを押します。 プレートマップ に移動し、分析する各グループにウェルを割り当てます。バックグラウンド測定用に4つのコーナーウェルを割り当てます。
- プロトコルでは、初期化ステップでキャリブレーションと平衡化がチェックされていることを確認します。
- ベースライン測定および各注射後の測定(グルコース、オリゴマイシン、および2-DG)については、測定サイクル数を3に設定し、混合-待機-測定時間を3分~0分~3分に設定します(表2参照)。
- コンパウンド装填および水和センサーカートリッジから蓋を取り外し、ユーティリティプレートのキャリブラントに沈めます。細胞外フラックス分析装置の作業トレイに置き、実行を開始します。
注:最初のステップはキャリブレーションで、通常は約20分かかります。 - 細胞を入れたマイクロプレートを非CO2から 取り出し、37°Cのインキュベーターからステップ2.4.6から25~30分のインキュベーションが終わった後。細胞を乱すことなく、ウェルあたり130 μLの予温解糖系ストレス試験アッセイ培地(pH 7.4)をゆっくりと加えて、各ウェルの培地容量を180 μLにし、プレートを非CO2 37°Cインキュベーターに戻してさらに15〜20分間。
注:遠心分離後の合計インキュベーション時間は45〜60分が好ましい。 - 較正が終了したら、ユーティリティプレートを細胞を含むアッセイマイクロプレート(蓋なし)と交換する。 ロードセルプレートを押して測定を開始すると、アッセイの完了に約1.5時間かかります。
- 測定が終わったら、細胞を含むアッセイマイクロプレートを収集し、細胞を乱すことなくアッセイ培地を除去する。細胞を脱落させることなく、250 μLの1xリン酸緩衝生理食塩水で1回穏やかに洗浄する。
- 10 μLのRIPA溶解バッファー(50 mM Tris-HCl、pH 7.4、1% NP-40、0.5 % Naデオキシコール酸、0.1% ドデシル硫酸ナトリウム、150 mM NaCl、2 mM EDTA、50 mM NaF)を加え、1xプロテアーゼ阻害剤カクテルを添加し、各ウェルに、シェーカー上でプレートを10分間攪拌する。プレート全体を-80°Cで凍結する。
- プレートを解凍し、製造元の指示に従ってデータ正規化のためのタンパク質測定アッセイを行う。
- データを取得して分析します。Waveデスクトップソフトウェアを使用してデータファイルを開きます。[正規化]をクリックし、各ウェルの正規化値を貼り付けます。[適用]をクリックしてデータを正規化します。[エクスポート]をクリックし、[解糖系ストレステストレポートジェネレータ]を選択して、分析データをレポートジェネレータにエクスポートします。または、データを外部アプリケーションにエクスポートします。
注:あるいは、各ウェル中の核DNAの総含有量を使用して、データを正規化することもできます。核酸に結合するCyQuantなどの蛍光色素を使用して、ウェルあたりの総核DNA含有量を評価することができます。
- コンパウンドを注入するローディングセンサーカートリッジ
- 細胞外フラックス分析装置を用いてミトコンドリアストレス試験を行う(ステップ時間:〜3時間30分)
- コンパウンドを注入するローディングセンサーカートリッジ
- 20 μM オリゴマイシン、20 μM FCCP、および 5 μM ロテノン + 5 μM アンチマイシン A 溶液を、予温したミトコンドリアストレス試験アッセイ培地 (pH 7.4) に調製します。
注:すべての注入化合物溶液は10倍の濃度で作られています。最終ウェル濃度は、オリゴマイシンで2 μM、FCCPで2 μM、ロテノンとアンチマイシンAでそれぞれ0.5 μMです( 表3参照)。 - ステップ 1.1.5 から 37 °C インキュベーターから水和センサーカートリッジを取り外し、ステップ 2.5.1.2 で前述したように気泡を除去します。
- 手順 2.5.1.3 ~ 2.5.1.6 に従って、ポート A に 20 μL の 20 μM オリゴマイシン、ポート B に 22 μL の 20 μM FCCP、ポート C に 5 μM ロテノンと 5 μM アンチマイシン A の混合物 25 μL を分注します。
注:バックグラウンドウェルのポートを含むすべての96ウェルの各ポートシリーズに、同じ量の注入化合物を完全にロードすることが重要です。
- 20 μM オリゴマイシン、20 μM FCCP、および 5 μM ロテノン + 5 μM アンチマイシン A 溶液を、予温したミトコンドリアストレス試験アッセイ培地 (pH 7.4) に調製します。
- テンプレートの作成、キャリブレーション、測定
- ミトコンドリアストレステスト用のテンプレートを作成またはコントローラにロードします。注射戦略、治療条件、および細胞タイプに関する詳細を入力し、 生成グループを押します。 プレートマップ に移動し、分析する各グループにウェルを割り当てます。バックグラウンド測定用に4つのコーナーウェルを割り当てます。
- プロトコルでは、初期化ステップでキャリブレーションと平衡化がチェックされていることを確認します。
- ベースライン測定および各注射後の測定(オリゴマイシン、FCCP、およびロテノン+アンチマイシンA)について、測定サイクル数を3に設定し、混合-待機-測定時間を3分~0分~3分に設定します(表4参照)。
- 実行を開始して、ステップ 2.5.2.4 のようにキャリブレーションを実行します。
- ステップ2.5.2.5において、予め加温したミトコンドリアストレス試験アッセイ培地(pH7.4)をウェルあたり130μL加える。
- 測定を開始します。手順 2.5.2.6 から 2.5.2.10 のようにデータを取得して分析します。分析したデータを ミトコンドリアストレステストレポートジェネレーター または外部アプリケーションにエクスポートします。
- コンパウンドを注入するローディングセンサーカートリッジ
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Representative Results
このプロトコールを使用して、細胞数および様々なOxPHOS標的薬(細胞外フラックスアッセイに使用)の濃度を最適化し、24週齢の雌C57BL/6マウスから単離されたHSPCのECARおよびOCRを測定した。まず、細胞数およびオリゴマイシン濃度を最適化するために解糖系ストレス試験を行った。このアッセイでは、5 ~104 ~ 2.5 × 105 の範囲のウェルあたりのさまざまな数のHSPC×使用しました。図2Aおよび図2Cに示すように、非解糖系酸性化率は、細胞数が5×104から2.5×105に増加するにつれて上昇するが、2×105〜2.5×105細胞の間では最小限にしか増加しない。予想通り、10mMグルコースの注射は、すべての細胞数で解糖系を刺激し、CARの最大増加は1ウェル当たり2.5×105細胞で観察される。しかし、2μMのオリゴマイシンの注射は、そうでなければ予想されるように、ECARをさらに増加させない。1μMオリゴマイシンの使用により、同様の結果が得られた(図示せず)。これらの結果は、これらのオリゴマイシン濃度がこれらのアッセイにおいて最適ではなかったことを示すと解釈することができた。
しかしながら、同じ解糖系ストレス試験のセットで得られたOCRデータは、複雑なV阻害によるオリゴマイシン注射後のOCRの有意な低下によって示唆されるように、試験されたオリゴマイシン濃度(1μMおよび2μM)の両方が実際に有効であったことを示している(2μMオリゴマイシンについては 図2B を参照;1μMオリゴマイシンについては示されていない)。試験した両方のオリゴマイシン濃度において、OCRの最大減少は、1ウェル当たり2.5×105 細胞で観察された。最後に、50mM 2-DGの注射はECARの有意な減少をもたらし、解糖系がこれらの実験で観察されたCARの供給源であることを示唆する。まとめると、HSPCはこれらのアッセイにおいてグルコース注入後に最大の解糖系を達成し、解糖系予備をほとんどまたはまったく有していないと結論付けることができる。これは、精製されたHSCと同様に、このアッセイで使用されるHSC画分を含む系統陰性HSPCも、ATP産生のために主に解糖系に依存していることを示している。解糖系率の高い細胞では、オリゴマイシン媒介性ミトコンドリアATP産生の阻害によるATP需要の有意な増加はない可能性がある。細胞は、解糖系をさらにアップレギュレートすることなく、ミトコンドリアATPの損失を容易に管理することができた19。解糖系ストレス試験パラメータ−非解糖系酸性化、解糖系、解糖系能力、および 図2Cに示すような解糖系予備能−は、導入およびプロトコールのセクションで以前に説明したように計算された。これらのデータに基づいて、1ウェルあたり2.5×105 個の細胞および2μMのオリゴマイシンがさらなる研究のために選択された。
ミトコンドリアストレス試験をFCCP濃度の最適化に使用した。このアッセイでは、解糖系ストレス試験によって以前に最適化されたように、ウェルあたり2.5×105 個のHSPCが使用されました。 図3Aに示すように、アッセイはベースラインOCRの測定から始まり、続いて2μMオリゴマイシン注射を行い、複合体Vの阻害を介してOCRの有意な減少を引き起こす。オリゴマイシン注射後のOCR測定に続いて、FCCPを様々な濃度で注射した:0.5μM、1μM、1.5μM、および2μM。先に示したように、FCCPは、OxPHOSからのプロトン輸送を解離することによって、ETCを通る電子流のオリゴマイシン誘発抑制を逆転させ、複合体IVに酸素を最大限消費させる。 図3Aに示すように、FCCPは用量依存的にHSPC中のOCRを刺激し、2μMのFCCPで観察されたOCRの最大の増加を伴う。最後に、0.5μMロテノンと0.5μMアンチマイシンAの混合物を注入し、ETCを通る電子流を完全に遮断し、OCRは最小レベルまで低下する。ロテノンおよびアンチマイシンA注射後に測定されたOCRは、非ミトコンドリア酸素消費量に対応する。 他のミトコンドリアストレス試験パラメータ−基礎呼吸、最大呼吸、プロトン漏れ、ATP産生、予備呼吸能力、および結合効率−導入およびプロトコールのセクションで以前に説明したように計算された。最後に、さらなる研究のために2μMのFCCPが選択された。
図1:細胞外フラックス分析装置を用いた解糖機能およびミトコンドリア呼吸の評価の概略図。 解糖系ストレス試験(A)およびミトコンドリアストレス試験(B)に用いた各種エフェクター化合物の配列および注入時期を示す。(A)解糖系パラメータ、解糖系、解糖系容量、解糖系予備量、および非解糖系酸性化、ならびに(B)ミトコンドリア機能パラメータ、基礎呼吸、ATP結合呼吸、最大呼吸、非ミトコンドリア酸素消費、プロトン漏れ、および予備呼吸能力が概説されている。略語: ECAR = 細胞外酸性化率;2-DG = 2-デオキシ-D-グルコース;OCR = 酸素消費率;FCCP = カルボニルシアニド-4(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン;腐る。= ロテノン;反。A = antimycin A. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:マウスHSPCにおける解糖機能の評価。解糖系ストレス試験は、24週齢の雌性C57BL/6マウスから単離されたHSPCの(A)細胞外酸性化速度(ECAR、mpH/分)および(B)酸素消費速度(OCR、pmol/分)を測定するために実施した。示された時点で、グルコース(10mM)、オリゴマイシン(2μM)、および2−DG(50mM)を注射した。(C)CARは、5×104、1×105、1.5×105、2×105、および2.5×105HSPCs/ウェルあたりの非解糖系酸性化、解糖系、解糖系容量、および解糖系埋蔵量として計算される。データはSEM±平均として提示され、n=4である。略語:HSPC =造血幹および原始前駆細胞;ECAR = 細胞外酸性化率;2-DG = 2-デオキシ-D-グルコース;OCR = 酸素消費率。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:マウスHSPCにおけるミトコンドリア呼吸の評価。 (A)24週齢の雌性C57BL/6マウスから単離されたHSPCの酸素消費速度(pmol/min)を測定するためにミトコンドリアストレス試験を実施した。示された時点で、オリゴマイシン(2 μM)、FCCP(0.5 μM、1 μM、1.5 μM、2 μM)、およびロテノンおよびアンチマイシンA(Rot./AA、それぞれ0.5 μM)を注射した。(B) OCRは、非ミトコンドリア酸素消費量、基礎呼吸、プロトン漏れ、最大呼吸(0.5 μM、1 μM、1.5 μM、および2 μM FCCPあたり)、ATP産生、予備呼吸能力(0.5 μM、1 μM、1.5 μM、および2 μM FCCPあたり)、および2.5 ×105 HSPC/ウェルあたりの結合効率として計算されます。データはSEM±平均として提示され、n=4である。略語:HSPC =造血幹および原始前駆細胞;OCR = 酸素消費率;FCCP = カルボニルシアニド-4(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン;腐る。= ロテノン;AA = アンチマイシン A. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 注入口 | ポートボリューム | 注入化合物(10倍濃縮) | ウェル内の最終化合物濃度 |
| ある | 20 μL | グルコース (100 mM) | 10ミリオンメートル |
| B | 22 μL | オリゴマイシン (20 μM) | 2 μM |
| C | 25 μL | 2 DG (500 mM) | 50ミリオンメートル |
表1:解糖系ストレス試験のための注射戦略。 略語:2-DG=2-デオキシ-D-グルコース。
| 1 | キャリブレーション | ||||
| 2 | 平衡 | ||||
| 3 | 注射と測定 | ||||
| サイクル | 混ぜる | 待つ | 測る | ||
| ベースライン(非解糖系酸性化) | 3回 | 3分 | 0分 | 3分 | |
| 注入ポートA:グルコース | 3回 | 3分 | 0分 | 3分 | |
| 注入ポートB:オリゴマイシン | 3回 | 3分 | 0分 | 3分 | |
| インジェクションポートC:2-DG | 3回 | 3分 | 0分 | 3分 | |
表2:解糖系ストレス試験のための細胞外フラックス分析プログラム。 略語:2-DG=2-デオキシ-D-グルコース。
| 注入口 | ポートボリューム | 注入化合物(10倍濃縮) | ウェル内の最終化合物濃度 |
| ある | 20 μL | オリゴマイシン (20 μM) | 2 μM |
| B | 22 μL | FCCP (20 μM) | 2 μM |
| C | 25 μL | ロテノン (5 μM) + アンチマイシン A (5 μM) | 各 0.5 μM |
表3:ミトコンドリアストレステストのための注射戦略。 略語:FCCP=カルボニルシアニド-4(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン。
| 1 | キャリブレーション | ||||
| 2 | 平衡 | ||||
| 3 | 注射と測定 | ||||
| サイクル | 混ぜる | 待つ | 測る | ||
| ベースライン測定 | 3回 | 3分 | 0分 | 3分 | |
| 注入ポートA:オリゴマイシン | 3回 | 3分 | 0分 | 3分 | |
| インジェクション ポート B: FCCP | 3回 | 3分 | 0分 | 3分 | |
| 注入ポートC:ロテノン&アンチマイシンA | 3回 | 3分 | 0分 | 3分 | |
表4:ミトコンドリアストレス試験のための細胞外フラックス分析プログラム。 略語:FCCP=カルボニルシアニド-4(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン。
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Discussion
この方法論文は、タツノオトシゴ細胞外フラックス分析装置を用いてマウスHSPCにおける細胞生体エネルギー学(解糖系およびOxPHOS)の評価のための最適化されたプロトコールを記載している。この装置は、解糖系およびミトコンドリア呼吸の指標である生細胞のECARおよびOCRを同時に測定する強力なツールである。したがって、細胞生体エネルギー学をリアルタイムで評価するために使用することができる。さらに、96ウェルマイクロプレートベースのプラットフォームは、高感度でハイスループット定量を提供し、別の高分解能呼吸計、2つのサンプルを同時に分析できるOroboros O2k、または古典的なクラーク電極20と比較して、単一のプレートを使用して複数のサンプルを同時に分析することができます。
細胞外フラックス分析計は、細胞が単層に存在する必要があり、懸濁状態で増殖した細胞を分析することがより困難になるため、主に付着細胞型の分析に使用されてきました。また、ポートからの薬物注入後、測定前のウェルにおける薬物・培地混合サイクル中に乱流が生じ、細胞が脱落することがある。したがって、細胞はウェルの底にしっかりと付着する必要があります。ここに記載したプロトコールは、ウミイガイ、 ミチルス・エデュリスから抽出された非免疫原性ポリフェノールタンパク質の細胞接着製剤を使用して、マウスHSPCの接着性単分子層を調製した。
この技術のもう1つの制限はアッセイごとのコストであり、これはクラーク型電極およびオロボロスO2kと比較して非常に高い。カートリッジは比較的高価で、再利用できません。細胞外フラックス分析装置自体のコストは、オロボロスO2k20よりも約4倍高いと推定される。しかし、細胞外フラックス分析装置の半自動化と高スループット能力を考えると、O2kよりもはるかに多くのデータを1回の実行に収集できます。
ここで得られた結果は×、96ウェルベースの細胞外フラックス分析装置を使用して信頼性の高いデータを得るためには、ウェルあたり2.5〜105 個のHSPCが必要であることを示しています。これは、マウスから大量に得ることが困難であり、純粋な集団を得るためにフローサイトメトリーソートを必要とするHSPCを使用してフラックスアッセイを行う際の別の課題を追加します。さらに、フローソーティングは実験にかなりの時間を追加し、前駆細胞の代謝表現型を変化させる可能性がある。フローサイトメトリーベースの精製に関連する限界を克服するために、ここで議論される戦略は、磁気ビーズに結合した系統特異的抗体を利用して、系統コミット前駆細胞を枯渇させ、系統陰性HSPCを濃縮した。より原始的なHSPCをさらに濃縮するために、追加のcKit濃縮ステップを追加することができる。しかし、これには追加の エクスビボ 時間(〜1.5時間)と細胞数の減少のコストが伴います。このようなプロトコルを利用するには、このプロトコルの範囲外の最適化が必要になります。
多能性を維持するために、HSCは静止状態を維持し、骨髄内の低酸素環境に優先的に存在しなければならない9,21。静止HSCは、ミトコンドリア呼吸の副産物である高レベルのROSが茎に有害であるため、控えめなエネルギー要件を満たすために主に解糖系に依存していると考えられています2,3。HSCは比較的高いが、大部分が不活性なミトコンドリア塊を有し、細胞ROSを低レベルに維持してHSCs多能性の維持を可能にする9。しかし、コミットメントと分化の間、ミトコンドリアはHSCs5,9におけるATP産生の主要な供給源となる。したがって、ミトコンドリアは、HSCを静止状態から系統の関与および分化に必要な代謝活性状態に移行する上で重要な機能を果たす。ミトコンドリアは、OxPHOSを介してATPを産生することに加えて、ROS調節、アポトーシス、カルシウムシグナル伝達、ヘムおよび他の多くの重要な代謝産物中間体の合成など、造血細胞の恒常性維持において他の多くの重要な役割を果たしている9。ミトコンドリア機能の変化は、HSC/前駆分化経路に重大な影響を及ぼす可能性があり、造血性悪性腫瘍、先天性赤血球形成不全および側胚芽球性貧血、骨髄異形成症候群などの様々な血液学的障害に寄与する可能性がある13。悪性造血細胞において、機能不全のミトコンドリアは、様々な細胞傷害性薬物によって誘導されるアポトーシスに対する耐性を付与する上で重要な役割を果たしている13。
HSC/前駆恒常性の維持におけるミトコンドリアの中心的な役割のために、これらの細胞の生理学的状態に関する貴重な洞察は、正常およびストレス条件下でのミトコンドリアOxPHOSを評価することによって得ることができる。ミトコンドリア活性の新規モジュレーターの同定は、血液学的異常を治療するための新規治療標的を同定することができる。この論文に記載されているプロトコルは、正常および病理学的条件下でのHSCのOCRおよびCARに対する化合物または代謝CRISPRライブラリーの影響、 例えば 、血液学的障害の遺伝子操作マウスモデルから採取されたHSCをスクリーニングするために使用することができる。このようなスクリーニングは、低酸素ニッチにおけるHSCの効力を維持する代謝経路の解明にも有用であり、HSCの多能性を維持しつつ、治療目的でのHSCの in vitro 拡大戦略の立案にも役立つと考えられる。この分析のハイスループットな性質を考えると、ここで説明するプロトコルは、HSC、造血前駆細胞、および悪性造血細胞における多数の生体エネルギーモジュレーターをスクリーニングするために容易に適合させることができる。
要約すると、ここに提示された方法は、細胞外フラックス分析装置を用いて初代マウスHSPCにおけるECARおよびOCRを測定するための最適化されたプロトコルを記述する。解糖系ストレス試験から得られた結果は、1ウェルあたり2.5×105 細胞および2μMオリゴマイシンがさらなる分析に最適であることを示している。1ウェルあたり2.5×105 細胞および2μMオリゴマイシンを用いて、FCCP濃度を最適化するためにミトコンドリアストレス試験を実施し、2μMのFCCPが最大OCRを誘導することを見出した。現在の研究は主にマウスHSPCに焦点を当てていますが、プロトコルとこのアプローチは、あらゆるタイプの浮遊細胞の分析条件を最適化するために容易に適応させることができます。
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Disclosures
著者らは、利益相反はないと宣言している。
Acknowledgments
ロンバード研究所での研究は、NIH(NIGMS R01GM101171、NIEHS R21ES032305)、国防総省(CA190267、CA170628、NF170044、ME200030)、およびGlenn Foundation for Medical Researchによってサポートされています。李研究室での作業はNIH(NHLBI 5R01HL150707)によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm filter | Corning | 430626 | Used to filter-sterilize the assay media |
| 100 mM sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | Component of mitochondrial stress test assay medium |
| 15 mL conical Falcon tubes | Corning | 352096 | Used during HSPCs harvest and to prepare assay drug solutions |
| 200 mM L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Component of glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media |
| 2-Deoxy-D-glucose (2-DG) | Sigma-Aldrich | D8375 | 3rd drug injection during glycolysis stress test |
| 5x Enrichment buffer (MojoSort) | Biolegend | 480017 | Used for washings during HSPCs harvest |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-3 | Component of ACK lysis buffer |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | 3rd drug injection during mitochondrial stress test |
| Bio-Rad DC protein assay kit | Bio-Rad | 500-0112 | Used as per manufacturer's instructions |
| Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | 2nd drug injection during mitochondrial stress test |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell adhesive. Used for coating cell microplates |
| Countes 3 Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | For cell counting | |
| EDTA | Fisher Scientific | O2793-500 | Component of ACK lysis buffer and RIPA lysis buffer |
| Falcon 70 μm filter | Fisher Scientific | 08-771-2 | Used as cells strainer during HSPCs harvest |
| Gibco Fetal bovine serum (FBS) | Fisher Scientific | 26400044 | Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest |
| Gibco HBSS | Fisher Scientific | 14175095 | Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Component of mitochondrial stress test assay medium and first injection of glycolysis stress test |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | 2nd drug injection during glycolysis stress test and 1st drug injection during mitochondrial stress test |
| PBS | Life Technologies | 10010-049 | Used to wash cells after assay for protein quantification |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | Fisher Scientific | P235-500 | Component of ACK lysis buffer |
| Protease Inhibitor Cocktail (PIC) | Roche | 11836170001 | Supplied as tablets. One tablet was dissolved in 10 mL of RIPA buffer to make 1x PIC. |
| Rat biotin antimouse-B220, Clone ID: RA3-6B2 | Biolegend | 103203 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-CD2, Clone ID: RM2-5 | Biolegend | 100103 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-CD3, Clone ID: 17A2 | Biolegend | 100243 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3 | Biolegend | 100603 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7 | Biolegend | 100703 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5 | Biolegend | 108403 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119 | Biolegend | 116203 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | 3rd drug injection during mitochondrial stress test |
| Seahorse XFe96 extracellular flux analyzer | Seahorse Biosciences now Agilent | For ECAR and OCR measurments in real time. | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Used to make Cell-adhesive solution for microplate coating |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher | BP358 | Component of RIPA lysis buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Component of RIPA lysis buffer |
| Sodium Fluoride (NaF) | Sigma-Aldrich | S7920 | Component of RIPA lysis buffer |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | Prepared 1 N solution. Used for pH normalization |
| Streptavidin Nanobeads (MojoSort) | Biolegend | 480015 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Tris-HCl | Fisher | BP153 | Component of RIPA lysis buffer |
| XF base medium | Agilent | 102353-100 | base medium used to prepare glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media |
| XF prep station | Seahorse Biosciences | Used for non-CO2 37 °C incubations | |
| XFe96 extracellular FluxPak | Agilent | 102416-100 or 102601-100 | Includes assay cartridges with utility plates, loading guide flats for loading drugs onto the assay cartridge, XF calibrant solution, and XF cell culture microplate |
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