Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Evaluación de la bioenergética celular en células madre hematopoyéticas de ratón y células progenitoras primitivas utilizando el analizador de flujo extracelular

Published: September 24, 2021 doi: 10.3791/63045
Automatic Translation
1, 2, 2,3,4, 1,4,5
1Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Cellular and Developmental Biology, University of Michigan, Ann Arbor, 4Rogel Cancer Center, University of Michigan, Ann Arbor, 5Institute of Gerontology, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

El método presentado aquí resume los protocolos optimizados para evaluar la bioenergética celular en células madre hematopoyéticas de ratón no adherentes y células progenitoras primitivas (HSPC) utilizando el analizador de flujo extracelular para medir la tasa de acidificación extracelular (ECAR) y la tasa de consumo de oxígeno (OCR) de los HSPC en tiempo real.

Abstract

Bajo estado estacionario, las células madre hematopoyéticas (HSC) permanecen en gran medida inactivas y se cree que dependen predominantemente de la glucólisis para satisfacer sus necesidades energéticas. Sin embargo, en condiciones de estrés como la infección o la pérdida de sangre, las HSC se vuelven proliferativas y producen rápidamente células progenitoras aguas abajo, que a su vez se diferencian aún más, produciendo en última instancia células sanguíneas maduras. Durante este proceso de transición y diferenciación, las HSC salen de la inactividad y se someten rápidamente a un cambio metabólico de la glucólisis a la fosforilación oxidativa (OxPHOS). Varias condiciones de estrés, como el envejecimiento, el cáncer, la diabetes y la obesidad, pueden afectar negativamente la función mitocondrial y, por lo tanto, pueden alterar la reprogramación metabólica y la diferenciación de las HSC y los progenitores durante la hematopoyesis. Se pueden obtener información valiosa sobre las funciones glucolíticas y mitocondriales de las HSC y los progenitores en condiciones normales y de estrés a través de la evaluación de su tasa de acidificación extracelular (ECAR) y la tasa de consumo de oxígeno (OCR), que son indicadores de la glucólisis celular y la respiración mitocondrial, respectivamente.

Aquí, se proporciona un protocolo detallado para medir ECAR y OCR en poblaciones de células negativas de linaje derivadas de la médula ósea de ratón, que incluyen células madre hematopoyéticas y células progenitoras primitivas (HSPC), utilizando el analizador de flujo extracelular. Este protocolo describe enfoques para aislar células de linaje negativo de la médula ósea de ratón, explica la optimización de la densidad de siembra celular y las concentraciones de 2-desoxi-D-glucosa (2-DG, un análogo de glucosa que inhibe la glucólisis) y varios medicamentos dirigidos a OxPHOS (oligomicina, FCCP, rotenona y antimicina A) utilizados en estos ensayos, y describe las estrategias de tratamiento farmacológico. Los parámetros clave del flujo glicolítico, como la glucólisis, la capacidad glucolítica y la reserva glucolítica, y los parámetros de OxPHOS, como la respiración basal, la respiración máxima, la fuga de protones, la producción de ATP, la capacidad respiratoria excedente y la eficiencia de acoplamiento, se pueden medir en estos ensayos. Este protocolo permite mediciones de ECAR y OCR en HSPC no adherentes y se puede generalizar para optimizar las condiciones de análisis para cualquier tipo de células de suspensión.

Introduction

La hematopoyesis es el proceso por el cual se forman varios tipos de células sanguíneas maduras con funciones altamente especializadas a partir de HSCs1. Las HSC son capaces de autorrenovarse y diferenciarse en varias poblaciones progenitoras multipotentes y específicas del linaje. Estos progenitores finalmente producen células de linajes linfoides, mieloides, eritroides y megacariocitarios. Para mantener su capacidad de autorrenovación, las HSC permanecen en gran medida inactivas y, al igual que otras células madre tisulares, se cree que dependen de la glucólisis en lugar de OxPHOS mitocondrial para la producción de ATP 2,3. La entrada en el ciclo celular conduce a una mejor respiración y OxPHOS, lo que resulta en niveles elevados de especies reactivas de oxígeno (ROS), que son perjudiciales para el mantenimiento y la función de HSC3. Por lo tanto, la división celular repetida puede conducir a una reducción de la capacidad de autorrenovación de las HSC y, en última instancia, a su agotamiento.

En la hematopoyesis adulta, las HSC se someten principalmente a una división celular asimétrica, durante la cual una de las células hijas conserva el potencial de HSC y continúa dependiendo del metabolismo glicolítico. La otra célula hija se convierte en una célula progenitora primitiva que pierde capacidad de autorrenovación pero prolifera y eventualmente da lugar a células hematopoyéticas funcionales diferenciadas4. Cuando las HSC se diferencian para producir progenitores aguas abajo, se cree que se produce un cambio de la glucólisis al metabolismo mitocondrial para suministrar la energía y los bloques de construcción necesarios para apoyar esta rápida transición5, como sugieren las observaciones de que las HSC poseen una masa mitocondrial inactiva 6,7,8,9 . Por el contrario, la actividad mitocondrial (indicada por los niveles de ROS vinculados) es mucho mayor en los progenitores comprometidos por el linaje que en las HSC 9,10,11. Por lo tanto, los cambios metabólicos que ocurren durante el primer paso de la hematopoyesis sugieren un papel directo y crucial de las mitocondrias en la regulación del destino de HSC.

Las mitocondrias disfuncionales presentes bajo diversas condiciones de estrés, como el envejecimiento, el cáncer, la diabetes y la obesidad12, pueden interferir con la capacidad de autorrenovación de HSC, induciendo un desequilibrio en la diferenciación HSC/progenitor al producir cantidades excesivas de ROS, afectar la producción de ATP y/o alterar otros procesos metabólicos 9,12,13 . Las perturbaciones en la homeostasis metabólica en la diferenciación HSC/progenitor podrían afectar significativamente a la hematopoyesis, contribuyendo potencialmente al desarrollo de anomalías hematológicas13. Dadas las influencias críticas de la glucólisis y el OxPHOS mitocondrial en el tallo y la diferenciación de HSC, es de interés investigar tanto los parámetros metabólicos en condiciones normales como de estrés. Se pueden obtener información valiosa sobre la función glucolítica y mitocondrial de las HSC y las células progenitoras mediante la evaluación de su ECAR y OCR, que son indicadores de la glucólisis celular y la respiración mitocondrial, respectivamente.

El analizador de flujo extracelular Seahorse es un potente aparato equipado con dos sondas por pozo para medir simultáneamente ECAR y OCR en células vivas y, por lo tanto, se puede utilizar para evaluar la bioenergética celular en tiempo real, en respuesta a diversos sustratos o inhibidores. El cartucho de ensayo utilizado con el analizador contiene puertos de inyección para contener hasta cuatro medicamentos para la inyección automatizada durante el ensayo. En la Figura 1A se muestra un esquema de una prueba de esfuerzo de glucólisis típica. El ensayo comienza con la medición de ECAR de células, incubadas en medio de prueba de esfuerzo de glucólisis que contiene glutamina pero no glucosa o piruvato. Esto representa la acidificación que ocurre debido a las actividades no glucolíticas de las células y se informa como acidificación no glicolítica. Esto es seguido por la inyección de glucosa a una concentración saturante. A través de la glucólisis, la glucosa en la célula se convierte en piruvato, que se metaboliza aún más en el citoplasma para producir lactato, o en las mitocondrias para producir CO2 y agua.

La conversión de glucosa en lactato provoca la producción neta y la posterior liberación de protones en el medio extracelular, lo que resulta en un rápido aumento de la ECAR 14,15,16. Este cambio estimulado por la glucosa en ECAR se informa como glucólisis en condiciones basales. La segunda inyección consiste en oligomicina (un inhibidor de la ATP sintasa, también conocido como complejo V17), que inhibe la producción mitocondrial de ATP. Durante la inhibición de OxPHOS mediada por oligomicina, las células regulan al máximo la glucólisis para satisfacer sus demandas energéticas. Esto provoca un aumento adicional en ECAR, revelando la capacidad glucolítica máxima de las células. La diferencia entre la capacidad glucolítica máxima y la glucólisis basal se conoce como reserva glucolítica. Finalmente, se inyecta 2-DG, lo que provoca una caída significativa en ECAR, generalmente cerca de los niveles de acidificación no glicolítica. 2-DG es un análogo de la glucosa que se une competitivamente a la hexoquinasa, lo que resulta en la inhibición de la glucólisis18. Por lo tanto, la disminución inducida por 2-DG en ECAR confirma aún más que la glucólisis es de hecho la fuente de ECAR observada después de las inyecciones de glucosa y oligomicina.

La Figura 1B muestra el esquema de una prueba de esfuerzo mitocondrial típica. El ensayo comienza con la medición de OCR basal de las células, incubadas en un medio de prueba de esfuerzo mitocondrial que contiene glucosa, glutamina y piruvato. Después de las mediciones basales de OCR, se inyecta oligomicina en este ensayo, que inhibe el complejo V, reduciendo así el flujo de electrones a través de la cadena de transporte de electrones (ETC)17. En consecuencia, el OCR se reduce en respuesta a la inyección de oligomicina, y esta disminución en el OCR está relacionada con la producción de ATP mitocondrial. La segunda inyección consiste en cianuro de carbonilo-4 (trifluorometoxia) fenilhidrazona (FCCP), un protonóforo y un desacoplador de OxPHOSmitocondrial 17. FCCP colapsa el gradiente de protones mitocondriales al permitir el flujo de protones a través de la membrana interna mitocondrial. Debido a la inyección de FCCP, el flujo de electrones a través del ETC se reprime, y el complejo IV consume oxígeno al nivel máximo. La diferencia entre el OCR máximo y el OCR basal se conoce como la capacidad respiratoria sobrante, que es una medida de la capacidad de la célula para responder al aumento de la demanda de energía en condiciones de estrés. Finalmente, se inyecta una mezcla de dos inhibidores de ETC (rotenona, un inhibidor del complejo I, y antimicina A, un inhibidor del complejo III17), que apaga completamente el flujo de electrones y el OCR disminuye a un nivel bajo. El OCR medido después de la inyección de rotenona y antimicina A corresponde al OCR no mitocondrial impulsado por otros procesos dentro de las células. El OCR no mitocondrial permite el cálculo de la respiración basal, la fuga de protones y la respiración máxima.

La respiración basal representa la diferencia entre la OCR basal y la OCR no mitocondrial. La fuga de protones se refiere a la diferencia entre el OCR después de la inyección de oligomicina y el OCR no mitocondrial. La respiración máxima representa la diferencia entre el OCR después de la inyección de FCCP y el OCR no mitocondrial. La eficiencia de acoplamiento se calcula como el porcentaje de la tasa de producción de ATP a la tasa de respiración basal. Este documento de método proporciona un protocolo detallado para medir ECAR y OCR en HSPC de linaje negativo utilizando el analizador de flujo extracelular Seahorse XFe96. Este protocolo describe los enfoques para aislar los HSPC negativos para el linaje de ratones, explica la optimización de la densidad de siembra celular y las concentraciones de varios fármacos utilizados en los ensayos de flujo extracelular y describe las estrategias de tratamiento farmacológico.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Todos los experimentos con animales vertebrados fueron aprobados y realizados de acuerdo con las regulaciones del Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Michigan.

1. Día antes del ensayo (Tiempo total: ~10 min)

  1. Hidratación del cartucho del sensor (tiempo de paso: ~ 10 min)
    1. Abra el kit de ensayo de flujo extracelular y retire el cartucho del sensor y el conjunto de la placa de utilidad. Guarde los pisos de guía de carga para usarlos al día siguiente.
    2. Separe manualmente el cartucho del sensor (la parte verde superior con tapa) de la placa de utilidad (microplaca inferior de 96 pocillos) y colóquelo boca abajo junto a la placa de utilidad.
    3. Usando una pipeta multicanal, llene cada pozo de la placa de utilidad con 200 μL de calibrante, incluido con el kit de ensayo de flujo.
    4. Vuelva a colocar el cartucho del sensor en la placa de utilidad, asegurándose de sumergir completamente los sensores en el calibrante.
    5. Coloque el cartucho del sensor ensamblado y la placa de utilidad con el calibrante en una incubadora sin CO2 a 37 °C durante la noche. Para evitar la evaporación del calibrante, asegúrese de que la incubadora esté humidificada adecuadamente. Si utiliza una incubadora de horno normal para incubaciones sin CO2 a 37 °C, coloque un vaso de precipitados abierto que contenga agua dentro de la incubadora para humidificarla. Si está disponible, utilice una estación de preparación XF para todas las incubaciones sin CO2 a 37 °C.
      NOTA: Alternativamente, el cartucho del sensor se puede hidratar durante la noche con 200 μL por pozo de agua ultrapura estéril en una incubadora sin CO2 a 37 °C. Reemplace el agua con 200 μL por pozo de calibrante precalentado de 37 °C, al menos 45-60 min antes de cargar los puertos de inyección el día del ensayo.

2. Día del ensayo (Tiempo total: ~9 h 30 min)

NOTA: El tiempo total indicado anteriormente incluye las duraciones acumuladas de los pasos 2.1-2.4, además del paso 2.5 o el paso 2.6.

  1. Preparación de microplacas recubiertas de adhesivo celular (tiempo de paso: ~1 h 30 min)
    NOTA: Realice todos los pasos en un gabinete de bioseguridad.
    1. Preparar 2,5 ml de la solución adhesiva celular (22,4 μg/ml, consulte la Tabla de materiales) por microplaca de cultivo celular de 96 pocillos disolviendo 56 μg del adhesivo celular en un volumen apropiado de bicarbonato de sodio esterilizado por filtro de 0,1 M (pH 8,0) y añadiendo inmediatamente hidróxido de sodio 1 N a la mitad del volumen de material adhesivo celular utilizado. Vórtice o pipeta hacia arriba y hacia abajo para mezclar.
    2. Abra la microplaca de cultivo celular de 96 pocillos (incluida con el kit de ensayo de flujo) y dispense 25 μL de la solución adhesiva celular preparada en el fondo de cada pozo. Cubra la microplaca con la tapa e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente dentro de la campana.
    3. Después de la incubación, retire y deseche el exceso de solución adhesiva celular con una pipeta o aspirador multicanal, y lave cada pozo dos veces con 200 μL de agua ultrapura estéril. Seque al aire la placa, con la tapa retirada, dentro de la campana durante 30-45 min.
      NOTA: Las microplacas de cultivo celular recubiertas con adhesivo celular pueden almacenarse hasta una semana a 4 °C. Las microplacas precubiertas almacenadas a 4 °C deberán dejarse calentar a temperatura ambiente dentro de la campana antes de sembrar las células.
  2. Preparación de medios de ensayo (tiempo de paso: ~ 30 min)
    1. Preparación del medio de ensayo de prueba de esfuerzo de glucólisis
      1. Suplementar 100 mL de medio base (ver la Tabla de Materiales) con 1 mL de 200 mM L-glutamina.
        NOTA: La concentración final de L-glutamina en el medio de ensayo es de 2 mM.
      2. Caliente el medio suplementado con L-glutamina a 37 ° C en un baño de agua.
      3. Ajuste el pH del medio cálido a 7.4 con 1 N NaOH.
      4. Esterilizar con filtro el medio con un filtro de 0,2 μm y mantenerlo a 37 °C hasta que esté listo para usar.
    2. Preparación del medio de ensayo de prueba de esfuerzo mitocondrial
      1. Suplementar 100 mL del medio base con 0,45 g de glucosa, 1 mL de 200 mM de L-glutamina y 1 mL de piruvato de sodio de 100 mM.
        NOTA: El medio de ensayo final contiene 25 mM de glucosa, 2 mM de L-glutamina y 1 mM de piruvato de sodio.
      2. Glucosa tibia, L-glutamina y el medio suplementado con piruvato de sodio a 37 ° C en un baño de agua.
      3. Ajuste el pH del medio cálido a 7.4 con 1 N NaOH.
      4. Filtro-esterilizar el medio con un filtro de 0,2 μm y mantener a 37 °C hasta que esté listo para usar.
  3. Cosechar HSPC negativos para el linaje del ratón (tiempo de paso: ~ 3 h)
    1. Prepare el tampón del ensayo complementando la solución de sal equilibrada de Hank con suero bovino fetal al 4%. Prepare 1x tampón de enriquecimiento diluyendo el caldo 5x con agua destilada estéril. Mantenga ambos tampones en hielo hasta su uso.
    2. Sacrificar humanamente a los ratones usando CO2 seguido de dislocación cervical y eliminar las extremidades posteriores con tijeras. Retire cuidadosamente todos los tejidos de los huesos y corte los extremos de ambos lados del fémur y la tibia con tijeras. Elimine las células de la médula ósea del fémur y la tibia con el tampón del ensayo. Pase las células enjuagadas a través de un filtro estéril de 70 μm, centrifugue el filtrado a 200 × g durante 5 min a 4 °C y deseche el sobrenadante.
    3. Lisar los glóbulos rojos resuspiendo el gránulo celular en 500 μL de tampón ACK (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA, pH 7.2). Después de la lisis durante 1 min en hielo, lave las muestras agregando 1 ml de tampón de ensayo y centrífuga a 200 × g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
    4. Después del lavado, incube las muestras con un cóctel de anticuerpos biotinilados dirigidos contra CD2 (dilución 1:200), CD3 (dilución 1:200), CD5 (dilución 1:200), CD8 (dilución 1:200), Ter-119 (dilución 1:200), B220 (dilución 1:200) y Gr-1 (dilución 1:800) durante 45 min en hielo en un volumen total de 500 μL de tampón de ensayo.
    5. Lave las muestras con 1 ml de tampón de ensayo con centrifugación como la anterior.
    6. Lave las muestras con 1 ml de tampón de enriquecimiento 1x con centrifugación como se indica arriba.
    7. Incubar las muestras con 20 μL de nanoperlas de estreptavidina y 100 μL de tampón de enriquecimiento 1x sobre hielo durante 15 min.
    8. Lave las muestras con 1 ml de tampón de enriquecimiento 1x con centrifugación como se indica arriba.
    9. Resuspend las muestras en 2,5 mL de tampón de enriquecimiento 1x. Colóquelos en un imán de separación durante 5 min. Recoger los sobrenadantes por separado en tubos cónicos de 15 ml.
    10. Resuspender muestras separadas por imán en un tampón de enriquecimiento adicional de 2,5 ml y colocarlas nuevamente en el imán de separación durante 5 minutos. Recoger y combinar sobrenadantes a las colecciones anteriores en tubos cónicos de 15 ml del paso 2.3.9.
      NOTA: Los sobrenadantes contienen las fracciones celulares negativas para el linaje.
    11. Centrifugar los tubos cónicos de 15 ml que contienen las células seleccionadas negativamente durante 5 min a 200 × g a 4 °C.
    12. Resuspenda los gránulos celulares en 1 ml de tampón de ensayo y cuente el número de celda usando azul tripano manualmente o a través de un contador de celdas automatizado como una Condesa 3.
      NOTA: Siguiendo el enfoque descrito anteriormente, ~ 6 × 106 HSPC de linaje negativo deben purificarse fácilmente de las extremidades posteriores de un solo ratón. Si los reactivos, como el tampón de ensayo, el tampón de enriquecimiento 1x y el cóctel de anticuerpos específicos del linaje, se preparan el día anterior al experimento, se tarda aproximadamente 2,5-3 h en enriquecer los HSPC de 4 ratones. Tomaría 10 minutos adicionales para cada mouse más allá de este número.
  4. Células de siembra en microplacas recubiertas con adhesivo celular (tiempo de paso: ~ 1 h)
    1. Células centrífugas del paso 2.3.12 a 200 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
    2. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular en el medio de ensayo apropiado (medio de prueba de esfuerzo de glucólisis o medio de prueba de esfuerzo mitocondrial). Centrifugar a 200 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
    3. Repita el paso 2.4.2. Retire el sobrenadante y resuspenda las células en el medio de ensayo calentado apropiado a la concentración de 2,5 × 105 células por 50 μL o 5 × 106 por ml.
    4. Pipetear 50 μL de la suspensión celular a lo largo del lado de cada pocillo de la microplaca de cultivo celular de 96 pocillos recubierta con adhesivo celular a temperatura ambiente. Pipetear 50 μL del medio de ensayo en los pozos de medición de fondo de esquina. Utilice una pipeta multicanal para el revestimiento de celdas para garantizar la consistencia.
    5. Cree una placa de equilibrio de centrífuga agregando 50 μL de agua por pozo de una microplaca de cultivo celular de 96 pocillos sin recubrimiento.
    6. Centrifugar las células en la placa a 200 × g durante 1 min a temperatura ambiente. No aplique freno. Transfiera la placa a una incubadora sin CO2 a 37 °C durante 25-30 minutos para asegurarse de que las células se hayan unido por completo. Confirme visualmente bajo un microscopio que las células están adheridas de manera estable a la superficie de la microplaca.
      NOTA: Como se pueden recolectar ~ 6 × 106 HSPC de linaje negativo de las extremidades posteriores de un solo ratón, se necesitan HSPC aislados de 4 ratones (~ 2.4 × 107 células) para llenar una placa completa de 96 pocillos si el objetivo es detectar múltiples intervenciones ex vivo en paralelo. Sin embargo, si el objetivo es investigar el impacto de una alteración genética o una intervención en los parámetros metabólicos de los HSPC in vivo, entonces los HSPC aislados de múltiples pares de ratones de control y prueba se pueden analizar en múltiples réplicas técnicas en paralelo utilizando una sola placa.
  5. Realización de la prueba de esfuerzo de glucólisis utilizando el analizador de flujo extracelular (tiempo de paso: ~ 3 h 30 min)
    1. Cartucho de sensor de carga con compuestos de inyección
      1. Preparar soluciones de glucosa de 100 mM, oligomicina de 20 μM y 2-DG de 500 mM en medio de ensayo de prueba de esfuerzo de glucólisis precalentada (pH 7.4).
        NOTA: Todas las soluciones compuestas inyectables se fabrican a una concentración de 10x. Las concentraciones finales del pozo son de 10 mM para la glucosa, 2 μM para la oligomicina y 50 mM para la 2-DG (ver Tabla 1).
      2. Retire el cartucho del sensor hidratado de la incubadora sin CO2 a 37 °C del paso 1.1.5. Elimine las burbujas de aire del calibrante en la placa de utilidad levantando el cartucho del sensor del calibrante y reemplazándolo en la misma placa de utilidad con el calibrante.
      3. Coloque la guía de carga A/D plana (incluida en el kit de ensayo de flujo extracelular) en la parte superior del cartucho del sensor, orientándola de modo que la letra 'A' se encuentre en la esquina superior izquierda para asegurarse de que solo los puertos A estén disponibles para la carga. Utilizando una pipeta multicanal, dispensar 20 μL de solución de glucosa de 100 mM en los puertos A.
      4. Reemplace la guía de carga A/D plana por la guía de carga B/C plana, orientándose de modo que la letra 'B' se encuentre en la esquina superior izquierda para garantizar que solo los puertos B estén disponibles para la carga. Utilizando una pipeta multicanal, dispensar 22 μL de solución de oligomicina de 20 μM en los puertos B.
      5. Reoriente la guía de carga B/C plana para ubicar la letra 'C' en la esquina superior izquierda para cargar los puertos C. Utilizando una pipeta multicanal, dispense 25 μL de la solución 500 mM 2-DG en los puertos C.
      6. Retire y deseche los planos de la guía de carga.
        NOTA: Es importante que cada serie de puertos de los 96 pozos, incluidos los de los pozos de fondo, se cargue completamente con el mismo volumen del compuesto inyector.
    2. Creación, calibración y mediciones de plantillas
      1. Cree o cargue la plantilla para la prueba de esfuerzo de glucólisis en el controlador. Ingrese detalles sobre estrategias de inyección, condiciones de tratamiento y tipos de células, y presione generar grupos. Vaya al mapa de placas y asigne pozos a cada grupo a analizar. Asigne los 4 pozos de esquina para las mediciones de fondo.
      2. En el protocolo, asegúrese de que la calibración y el equilibrio se comprueban en el paso de inicialización .
      3. Para la medición inicial y las mediciones después de cada inyección (glucosa, oligomicina y 2-DG), establezca el número de ciclos de medición en 3 y Mezclar - Esperar - Medir los tiempos a 3 min - 0 min - 3 min (ver Tabla 2).
      4. Retire la tapa del cartucho sensor de compuestos cargado e hidratado, sumergido en calibrante en la placa de utilidad. Colóquelo en la bandeja de trabajo del analizador de flujo extracelular y comience la ejecución.
        NOTA: El primer paso es la calibración, que generalmente toma ~ 20 minutos.
      5. Saque la microplaca que contiene las células de la incubadora sin CO2 a 37 °C del paso 2.4.6 después de que finalicen los 25-30 minutos de incubación. Sin perturbar las células, agregue lentamente 130 μL del medio de ensayo de prueba de esfuerzo de glucólisis precalentado (pH 7.4) por pozo para compensar el volumen medio en cada pozo a 180 μL y devuelva la placa a la incubadora sin CO2 37 ° C durante 15-20 min adicionales.
        NOTA: Se prefiere un tiempo total de incubación de 45-60 minutos después de la centrifugación.
      6. Una vez finalizada la calibración, reemplace la placa de utilidad con la microplaca de ensayo (sin tapa) que contiene las celdas. Presione la placa de la célula de carga para iniciar las mediciones, que tomarán ~ 1.5 h para completar el ensayo.
      7. Una vez finalizadas las mediciones, recoja la microplaca de ensayo que contiene las células y retire el medio de ensayo sin perturbar las células. Lavar una vez suavemente con 250 μL de solución salina tamponada con fosfato 1x sin desalojar las células.
      8. Añadir 10 μL de tampón de lisis RIPA (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% NP-40, 0,5 % Na desoxicolato, 0,1% dodecilsulfato de sodio, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF), complementado con 1x cóctel inhibidor de la proteasa, a cada pozo y agitar la placa en un agitador durante 10 min. Congelar toda la placa a -80 °C.
      9. Descongele la placa y realice un ensayo de medición de proteínas para la normalización de datos siguiendo las instrucciones del fabricante.
      10. Recupere y analice los datos. Abra el archivo de datos con Wave Desktop Software. Haga clic en Normalizar y pegue los valores de normalización para cada pozo. Haga clic en aplicar para normalizar los datos. Haga clic en Exportar y seleccione el generador de informes de prueba de esfuerzo de glucólisis para exportar los datos analizados a un generador de informes. Como alternativa, exporte los datos a una aplicación externa.
        NOTA: Alternativamente, el contenido total de ADN nuclear en cada pozo se puede utilizar para normalizar los datos. Un colorante fluorescente, como CyQuant que se une al ácido nucleico, se puede utilizar para evaluar el contenido total de ADN nuclear por pozo.
  6. Realización de una prueba de esfuerzo mitocondrial utilizando el analizador de flujo extracelular (Tiempo de paso: ~3 h 30 min)
    1. Cartucho de sensor de carga con compuestos de inyección
      1. Preparar soluciones de oligomicina de 20 μM, FCCP de 20 μM y 5 μM de rotenona + 5 μM de antimicina A en un medio de ensayo de prueba de esfuerzo mitocondrial precalentado (pH 7.4).
        NOTA: Todas las soluciones compuestas inyectables se fabrican a una concentración de 10x. Las concentraciones finales del pozo son de 2 μM para la oligomicina, 2 μM para la FCCP y 0,5 μM para la rotenona y la antimicina A (ver Tabla 3).
      2. Retire el cartucho del sensor hidratado de la incubadora de 37 °C del paso 1.1.5 y retire las burbujas de aire como se describe anteriormente en el paso 2.5.1.2.
      3. Siguiendo los pasos 2.5.1.3 a 2.5.1.6, dispensar 20 μL de oligomicina de 20 μM en los puertos A, 22 μL de 20 μM fccP en los puertos B y 25 μL de una mezcla de 5 μM de rotenona y 5 μM de antimicina A en los puertos C.
        NOTA: Es importante que cada serie de puertos de los 96 pozos, incluidos los de los pozos de fondo, se cargue completamente con el mismo volumen de compuesto de inyección.
    2. Creación, calibración y mediciones de plantillas
      1. Cree o cargue la plantilla para la prueba de esfuerzo mitocondrial en el controlador. Ingrese detalles sobre estrategias de inyección, condiciones de tratamiento y tipos de células, y presione generar grupos. Vaya al mapa de placas y asigne pozos a cada grupo a analizar. Asigne los 4 pozos de esquina para las mediciones de fondo.
      2. En el protocolo, asegúrese de que la calibración y el equilibrio se comprueban en el paso de inicialización.
      3. Para la medición basal y las mediciones después de cada inyección (oligomicina, FCCP y rotenona + antimicina A), establezca el número de ciclos de medición en 3 y Mezclar - Esperar - Medir los tiempos a 3 min - 0 min - 3 min (ver Tabla 4).
      4. Inicie la ejecución para realizar la calibración como en el paso 2.5.2.4.
      5. Añadir 130 μL del medio de ensayo de ensayo de esfuerzo mitocondrial precalentado (pH 7,4) por pozo y en el paso 2.5.2.5.
      6. Iniciar las mediciones; recuperar y analizar los datos como en los pasos 2.5.2.6 a 2.5.2.10. Exporte los datos analizados al generador de informes de pruebas de esfuerzo mitocondrial o a una aplicación externa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Usando este protocolo, el número de células y las concentraciones de varios fármacos dirigidos a OxPHOS (utilizados en los ensayos de flujo extracelular) se optimizaron para medir ECAR y OCR de HSPC aislados de ratones C57BL / 6 hembra de 24 semanas de edad. En primer lugar, se realizó la prueba de esfuerzo de glucólisis para optimizar el número de células y la concentración de oligomicina. En este ensayo se utilizó un número variable de HSPC por pozo que oscilaba entre 5 × 104 y2,5 × 10 5. Como se muestra en la Figura 2A y la Figura 2C, la tasa de acidificación no glicolítica aumenta con el aumento del número de células de 5 × 104 a 2.5 × 105 , pero aumenta solo mínimamente entre 2 × 105 a 2.5 × 105 células. Como era de esperar, la inyección de glucosa de 10 mM estimula la glucólisis en todos los números celulares, con un aumento máximo de ECAR observado a 2,5 × 105 células por pozo. Sin embargo, la inyección de 2 μM de oligomicina no aumenta aún más el ECAR, como se esperaba. El uso de 1 μM de oligomicina arrojó resultados similares (no mostrados). Estos resultados podrían interpretarse para indicar que estas concentraciones de oligomicina no fueron óptimas en estos ensayos.

Sin embargo, los datos de OCR obtenidos en el mismo conjunto de pruebas de esfuerzo de glucólisis muestran que ambas concentraciones de oligomicina probadas (1 μM y 2 μM) fueron realmente efectivas, como lo sugiere la caída significativa de la OCR después de la inyección de oligomicina debido a la inhibición del complejo V (ver Figura 2B para 2 μM de oligomicina; no se muestra para 1 μM de oligomicina). En ambas concentraciones de oligomicina probadas, se observaron disminuciones máximas en OCR a 2,5 × 105 células por pozo. Finalmente, la inyección de 50 mM 2-DG resultó en una reducción significativa de ECAR, lo que implica que la glucólisis es la fuente de ECAR observada en estos experimentos. En conjunto, se puede concluir que los HSPC logran la glucólisis máxima después de la inyección de glucosa en estos ensayos, y poseen poca o ninguna reserva glucolítica. Esto indica que, al igual que las HSC purificadas, las HSPC de linaje negativo, que incluyen la fracción de HSC utilizada en este ensayo, también dependen predominantemente de la glucólisis para su producción de ATP. En las células con una alta tasa glucolítica, puede no haber un aumento significativo en la demanda de ATP tras la inhibición mediada por oligomicina de la producción de ATP mitocondrial. Las células podrían manejar fácilmente la pérdida de ATP mitocondrial sin regular aún más la glucólisis19. Los parámetros de la prueba de esfuerzo de glucólisis -acidificación no glucolítica, glucólisis, capacidad glucolítica y reserva glucolítica como se muestra en la Figura 2C- se calcularon como se describió anteriormente en las secciones de introducción y protocolo. Sobre la base de estos datos, se seleccionaron 2,5 × 105 células por pocillo y 2 μM de oligomicina para estudios adicionales.

La prueba de esfuerzo mitocondrial se utilizó para la optimización de la concentración de FCCP. En este ensayo, se utilizaron 2,5 × 105 HSPC por pozo, optimizados previamente a través de la prueba de esfuerzo de glucólisis. Como se muestra en la Figura 3A, el ensayo comienza con la medición de la OCR basal seguida de la inyección de oligomicina de 2 μM, causando una reducción significativa en la OCR a través de la inhibición del complejo V. Después de las mediciones de OCR posteriores a la inyección de oligomicina, fccP se inyectó a concentraciones variables: 0,5 μM, 1 μM, 1,5 μM y 2 μM. Como se indicó anteriormente, FCCP revierte la represión inducida por oligomicina del flujo de electrones a través de ETC al desacoplar el transporte de protones de OxPHOS y obliga al complejo IV a consumir oxígeno al máximo. Como se muestra en la Figura 3A, FCCP estimula el OCR en HSPC de una manera dependiente de la dosis con un aumento máximo en el OCR observado a 2 μM de FCCP. Finalmente, se inyectó una mezcla de 0,5 μM de rotenona y 0,5 μM de antimicina A, que apaga completamente el flujo de electrones a través del ETC, y el OCR disminuye a su nivel mínimo. La OCR medida después de la inyección de rotenona y antimicina A corresponde al consumo de oxígeno no mitocondrial. Otros parámetros de la prueba de esfuerzo mitocondrial (respiración basal, respiración máxima, fuga de protones, producción de ATP, capacidad respiratoria excedentaria y eficiencia de acoplamiento como se muestra en la Figura 3B) se calcularon como se describió anteriormente en las secciones de introducción y protocolo. Finalmente, se seleccionaron 2 μM de FCCP para estudios adicionales.

Figure 1
Figura 1: Representación esquemática de la evaluación de la función glucolítica y la respiración mitocondrial utilizando el analizador de flujo extracelular. Se muestran secuencias y tiempos de inyección de varios compuestos efectores utilizados en la prueba de esfuerzo glucolítico (A) y la prueba de esfuerzo mitocondrial (B). (A) Se describen los parámetros glicolíticos, la glucólisis, la capacidad glucolítica, la reserva glucolítica y la acidificación no glicolítica, y (B) los parámetros de la función mitocondrial, la respiración basal, la respiración ligada a ATP, la respiración máxima, el consumo de oxígeno no mitocondrial, la fuga de protones y la capacidad respiratoria sobrante. Abreviaturas: ECAR = tasa de acidificación extracelular; 2-DG = 2-desoxi-D-glucosa; OCR = tasa de consumo de oxígeno; FCCP = cianuro de carbonilo-4 (trifluorometoxi) fenilhidrazona; Pudrirse. = rotenona; Anti. A = antimicina A. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Evaluación de la función glucolítica en HSPC de ratón. La prueba de esfuerzo de glucólisis se realizó para medir (A) las tasas de acidificación extracelular (ECAR, mpH / min) y (B) las tasas de consumo de oxígeno (OCR, pmol / min) de HSPC aislados de ratones C57BL / 6 hembra de 24 semanas de edad. En los momentos indicados, se inyectaron glucosa (10 mM), oligomicina (2 μM) y 2-DG (50 mM). (C) ECAR se calcula como acidificación no glicolítica, glucólisis, capacidad glucolítica y reserva glucolítica por 5 × 104, 1 × 105, 1.5 × 105, 2 × 105 y 2.5 × 105 HSPC/pozo. Los datos se presentan como media ± SEM, n = 4. Abreviaturas: HSPCs = células madre hematopoyéticas y progenitoras primitivas; ECAR = tasa de acidificación extracelular; 2-DG = 2-desoxi-D-glucosa; OCR = tasa de consumo de oxígeno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Evaluación de la respiración mitocondrial en HSPC de ratón. Se realizó una prueba de esfuerzo mitocondrial para medir (A) las tasas de consumo de oxígeno (pmol / min) de HSPC aislados de ratones C57BL / 6 hembra de 24 semanas de edad. En los momentos indicados, se inyectaron oligomicina (2 μM), FCCP (0,5 μM, 1 μM, 1,5 μM, 2 μM), rotenona y antimicina A (Rot./AA, 0,5 μM cada uno). (B) El OCR se calcula como el consumo de oxígeno no mitocondrial, la respiración basal, la fuga de protones, la respiración máxima (por 0,5 μM, 1 μM, 1,5 μM y 2 μM FCCP), la producción de ATP, la capacidad respiratoria excedentaria (por 0,5 μM, 1 μM, 1,5 μM y 2 μM FCCP) y la eficiencia de acoplamiento por 2,5 × 105 HSPC/pozo. Los datos se presentan como media ± SEM, n = 4. Abreviaturas: HSPCs = células madre hematopoyéticas y progenitoras primitivas; OCR = tasa de consumo de oxígeno; FCCP = cianuro de carbonilo-4 (trifluorometoxi) fenilhidrazona; Pudrirse. = rotenona; AA = antimicina A. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Puerto de inyección Volumen de puerto Compuesto inyector (10x concentrado) Concentración final de compuestos en el pozo
Un 20 μL Glucosa (100 mM) 10 mM
B 22 μL Oligomicina (20 μM) 2 μM
C 25 μL 2-DG (500 mM) 50 metros

Tabla 1: Estrategia de inyección para la prueba de esfuerzo de glucólisis. Abreviatura: 2-DG = 2-desoxi-D-glucosa.

1 Calibración
2 Equilibrado
3 Inyecciones y mediciones
Ciclos Mezclar Esperar Medir
Línea de base (acidificación no glicolítica) 3 veces 3 min 0 min 3 min
Inyectar puerto A: Glucosa 3 veces 3 min 0 min 3 min
Puerto B de inyección: Oligomicina 3 veces 3 min 0 min 3 min
Puerto de inyección C: 2-DG 3 veces 3 min 0 min 3 min

Tabla 2: Programa analizador de flujo extracelular para la prueba de esfuerzo de glucólisis. Abreviatura: 2-DG = 2-desoxi-D-glucosa.

Puerto de inyección Volumen de puerto Compuesto inyector (10x concentrado) Concentración final de compuestos en el pozo
Un 20 μL Oligomicina (20 μM) 2 μM
B 22 μL FCCP (20 μM) 2 μM
C 25 μL Rotenona (5 μM) + antimicina A (5 μM) 0,5 μM cada uno

Tabla 3: Estrategia de inyección para la prueba de esfuerzo mitocondrial. Abreviatura: FCCP = cianuro de carbonilo-4 (trifluorometoxi) fenilhidrazona.

1 Calibración
2 Equilibrado
3 Inyecciones y mediciones
Ciclos Mezclar Esperar Medir
Mediciones de referencia 3 veces 3 min 0 min 3 min
Inyecte el puerto A: Oligomicina 3 veces 3 min 0 min 3 min
Puerto de inyección B: FCCP 3 veces 3 min 0 min 3 min
Inyecte el puerto C: rotenona y antimicina A 3 veces 3 min 0 min 3 min

Tabla 4: Programa analizador de flujo extracelular para la prueba de esfuerzo mitocondrial. Abreviatura: FCCP = cianuro de carbonilo-4 (trifluorometoxi) fenilhidrazona.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Este documento de método describe un protocolo optimizado para la evaluación de la bioenergética celular (glucólisis y OxPHOS) en HSPC de ratón utilizando el analizador de flujo extracelular Seahorse. Este dispositivo es una poderosa herramienta que mide simultáneamente el ECAR y el OCR de las células vivas, que son métricas de glucólisis y respiración mitocondrial, respectivamente. Por lo tanto, se puede utilizar para evaluar la bioenergética celular en tiempo real. Además, la plataforma basada en microplacas de 96 pocillos ofrece cuantificación de alto rendimiento con alta sensibilidad, lo que permite el análisis simultáneo de múltiples muestras utilizando una sola placa, en comparación con otro respirómetro de alta resolución, el Oroboros O2k, que solo puede analizar 2 muestras simultáneamente, o el clásico electrodo Clark20.

El analizador de flujo extracelular se ha utilizado principalmente para el análisis de tipos de células adherentes, ya que requiere que las células estén presentes en una monocapa, lo que hace que sea más difícil analizar las células cultivadas en suspensión. Además, después de la inyección de drogas desde el puerto, se producen turbulencias durante el ciclo de mezcla de fármacos y medios en los pozos antes de las mediciones, lo que puede desalojar las células. Por lo tanto, las células deben estar firmemente unidas al fondo del pozo. Los protocolos aquí descritos han utilizado una formulación adhesivo celular de proteínas polifenólicas no inmunogénicas extraídas del mejillón marino, Mytilus edulis, para preparar una monocapa adherente de HSPC murinas.

Otra limitación de esta tecnología es el costo por ensayo, que es muy alto en comparación con el electrodo tipo Clark y el Oroboros O2k. Los cartuchos son relativamente caros y no se pueden reutilizar. Se estima que el costo del analizador de flujo extracelular en sí es ~ 4 veces mayor que el Oroboros O2k20. Sin embargo, dada la semiautomatización y la capacidad de alto rendimiento del analizador de flujo extracelular, se puede recopilar una cantidad mucho mayor de datos por ejecución que con el O2k.

Los resultados obtenidos aquí muestran que se requieren 2,5 × 105 HSPC por pozo para obtener datos confiables utilizando un analizador de flujo extracelular basado en 96 pocillos. Esto agrega otro desafío en la realización de ensayos de flujo utilizando HSPC, que son difíciles de obtener en grandes cantidades de un ratón y requieren una clasificación citométrica de flujo para obtener una población pura. Además, la clasificación del flujo agrega un tiempo sustancial al experimento y podría alterar el fenotipo metabólico de las células progenitoras. Para superar las limitaciones asociadas con la purificación basada en la citometría de flujo, la estrategia discutida aquí utilizó anticuerpos específicos del linaje unidos a perlas magnéticas para agotar a los progenitores comprometidos con el linaje, enriqueciendo así los HSPC negativos para el linaje. Para enriquecer aún más los HSPC más primitivos, se puede agregar un paso de enriquecimiento de cKit adicional; sin embargo, esto viene con el costo de tiempo ex vivo adicional (~ 1.5 h) y una reducción en el número de células. La utilización de dicho protocolo requeriría una optimización fuera del alcance de este protocolo.

Para mantener su pluripotencia, las HSC deben permanecer inactivas y residir preferentemente en el ambiente hipóxico dentro de la médula ósea 9,21. Se cree que las HSC inactivas dependen predominantemente de la glucólisis para satisfacer sus modestos requisitos de energía, ya que los altos niveles de ROS, un subproducto de la respiración mitocondrial, son perjudiciales para su tallo 2,3. Las HSC poseen una masa mitocondrial relativamente alta, pero en gran parte inactiva, manteniendo las ROS celulares en niveles bajos para permitir el mantenimiento de la pluripotencia de las HSC9. Sin embargo, durante el compromiso y la diferenciación, las mitocondrias se convierten en la principal fuente de producción de ATP en las HSC 5,9. Por lo tanto, las mitocondrias desempeñan una función clave en la transición de las HSC de la inactividad al estado metabólicamente activo requerido para su compromiso y diferenciación de linaje. Además de producir ATP a través de OxPHOS, las mitocondrias desempeñan muchas otras funciones importantes en la homeostasis de las células hematopoyéticas, incluida la regulación de ros, la apoptosis, la señalización de calcio y la síntesis de hemo y muchos otros intermedios de metabolitos críticos9. Las alteraciones en las funciones mitocondriales podrían afectar significativamente las vías de diferenciación HSC/progenitor y pueden contribuir a diversos trastornos hematológicos, como neoplasias malignas hematopoyéticas, diseritropoyesis congénita y anemias sideroblásticas, y síndromes mielodisplásicos13. En las células hematopoyéticas malignas, las mitocondrias disfuncionales desempeñan un papel crítico en la concesión de resistencia a la apoptosis inducida por diversos fármacos citotóxicos13.

Debido al papel central de las mitocondrias en el mantenimiento de la homeostasis HSC /progenitora, se pueden obtener información valiosa sobre el estado fisiológico de estas células mediante la evaluación de su OxPHOS mitocondrial en condiciones normales y de estrés. La identificación de nuevos moduladores de las actividades mitocondriales podría identificar nuevas dianas terapéuticas para el tratamiento de anomalías hematológicas. El protocolo descrito en este artículo se puede utilizar para evaluar los efectos de los compuestos químicos o las bibliotecas CRISPR metabólicas en el OCR y el ECAR de las HSC en condiciones normales y patológicas, por ejemplo, HSC cosechadas de modelos de ratón genéticamente modificados de trastornos hematológicos. Tal detección también podría ser útil para dilucidar las vías metabólicas que sostienen la potencia de HSC en su nicho hipóxico, lo que sería útil para diseñar estrategias para la expansión in vitro de HSC mientras se mantiene su pluripotencia con fines terapéuticos. Dada la naturaleza de alto rendimiento de este análisis, el protocolo descrito aquí podría adaptarse fácilmente para detectar un gran número de moduladores bioenergéticos en HSC, progenitores hematopoyéticos y células hematopoyéticas malignas.

En resumen, los métodos presentados aquí describen protocolos optimizados para medir ECAR y OCR en HSPC primarios de ratón utilizando el analizador de flujo extracelular. Los resultados obtenidos de la prueba de esfuerzo de glucólisis han demostrado que 2,5 × 105 células por pozo y 2 μM de oligomicina son óptimos para un análisis posterior. Utilizando 2,5 × 105 células por pocillo y 2 μM de oligomicina, se realizó la prueba de esfuerzo mitocondrial para optimizar la concentración de FCCP, y se encontró que 2 μM de FCCP inducen OCR máximo. Aunque el estudio actual se centra principalmente en las HSPC de ratón, el protocolo y este enfoque podrían adaptarse fácilmente para optimizar las condiciones de análisis para cualquier tipo de células de suspensión.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores declaran que no hay conflicto de intereses.

Acknowledgments

El trabajo en el laboratorio Lombard cuenta con el apoyo de los NIH (NIGMS R01GM101171, NIEHS R21ES032305), el DoD (CA190267, CA170628, NF170044 y ME200030) y la Fundación Glenn para la Investigación Médica. El trabajo en el laboratorio Li cuenta con el apoyo de los NIH (NHLBI 5R01HL150707).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 μm filter Corning 430626 Used to filter-sterilize the assay media
100 mM sodium pyruvate Life Technologies 11360-070 Component of mitochondrial stress test assay medium
15 mL conical Falcon tubes Corning 352096 Used during HSPCs harvest and to prepare assay drug solutions
200 mM L-glutamine Life Technologies 25030-081 Component of glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media
2-Deoxy-D-glucose (2-DG) Sigma-Aldrich D8375 3rd drug injection during glycolysis stress test
5x Enrichment buffer (MojoSort) Biolegend 480017 Used for washings during HSPCs harvest
Ammonium chloride (NH4Cl) Fisher Scientific A661-3 Component of ACK lysis buffer
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674 3rd drug injection during mitochondrial stress test
Bio-Rad DC protein assay kit Bio-Rad 500-0112 Used as per manufacturer's instructions
Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) Sigma-Aldrich C2920 2nd drug injection during mitochondrial stress test
Cell-Tak Corning 354240 Cell adhesive. Used for coating cell microplates
Countes 3 Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific For cell counting
EDTA Fisher Scientific O2793-500 Component of ACK lysis buffer and RIPA lysis buffer
Falcon 70 μm filter Fisher Scientific 08-771-2 Used as cells strainer during HSPCs harvest
Gibco Fetal bovine serum (FBS) Fisher Scientific 26400044 Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest
Gibco HBSS Fisher Scientific 14175095 Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest
Glucose Sigma-Aldrich G7528 Component of mitochondrial stress test assay medium and first injection of glycolysis stress test
Oligomycin Sigma-Aldrich O4876 2nd drug injection during glycolysis stress test and 1st drug injection during mitochondrial stress test
PBS Life Technologies 10010-049 Used to wash cells after assay for protein quantification
Potassium bicarbonate (KHCO3) Fisher Scientific P235-500 Component of ACK lysis buffer
Protease Inhibitor Cocktail (PIC) Roche 11836170001 Supplied as tablets. One tablet was dissolved in 10 mL of RIPA buffer to make 1x PIC.
Rat biotin antimouse-B220, Clone ID: RA3-6B2 Biolegend 103203 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD2, Clone ID: RM2-5 Biolegend 100103 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD3, Clone ID: 17A2 Biolegend 100243 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3 Biolegend 100603 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7 Biolegend 100703 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5 Biolegend 108403 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119 Biolegend 116203 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rotenone Sigma-Aldrich R8875 3rd drug injection during mitochondrial stress test
Seahorse XFe96 extracellular flux analyzer Seahorse Biosciences now Agilent For ECAR and OCR measurments in real time.
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 Used to make Cell-adhesive solution for microplate coating
Sodium chloride (NaCl) Fisher BP358 Component of RIPA lysis buffer
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750 Component of RIPA lysis buffer
Sodium Fluoride (NaF) Sigma-Aldrich S7920 Component of RIPA lysis buffer
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S8045 Prepared 1 N solution. Used for pH normalization
Streptavidin Nanobeads (MojoSort) Biolegend 480015 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Tris-HCl Fisher BP153 Component of RIPA lysis buffer
XF base medium Agilent 102353-100 base medium used to prepare glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media
XF prep station Seahorse Biosciences Used for non-CO2 37 °C incubations
XFe96 extracellular FluxPak Agilent 102416-100 or 102601-100 Includes assay cartridges with utility plates, loading guide flats for loading
drugs onto the assay cartridge, XF calibrant solution, and XF cell culture microplate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rieger, M. A., Schroeder, T. Hematopoiesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008250 (2012).
  2. Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial role in stemness and differentiation of hematopoietic stem cells. Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).
  3. Snoeck, H. W. Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).
  4. Bujko, K., Kucia, M., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 49-77 (2019).
  5. Ito, K., Suda, T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).
  6. Norddahl, G. L., et al. Accumulating mitochondrial DNA mutations drive premature hematopoietic aging phenotypes distinct from physiological stem cell aging. Cell Stem Cell. 8 (5), 499-510 (2011).
  7. de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-independent methods reveal elevated mitochondrial mass in hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
  8. Kim, M., Cooper, D. D., Hayes, S. F., Spangrude, G. J. Rhodamine-123 staining in hematopoietic stem cells of young mice indicates mitochondrial activation rather than dye efflux. Blood. 91 (11), 4106-4117 (1998).
  9. Filippi, M. D., Ghaffari, S. Mitochondria in the maintenance of hematopoietic stem cells: new perspectives and opportunities. Blood. 133 (18), 1943-1952 (2019).
  10. Inoue, S., et al. Mitochondrial respiration defects modulate differentiation but not proliferation of hematopoietic stem and progenitor cells. FEBS Letters. 584 (15), 3402-3409 (2010).
  11. Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
  12. Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders - A step towards mitochondria based therapeutic strategies. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1863 (5), 1066-1077 (2017).
  13. Fontenay, M., Cathelin, S., Amiot, M., Gyan, E., Solary, E. Mitochondria in hematopoiesis and hematological diseases. Oncogene. 25 (34), 4757-4767 (2006).
  14. Nadanaciva, S., et al. Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).
  15. Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511 (2010).
  16. Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).
  17. Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics, Fourth Edition. Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. , Academic Press. Ch. 9 255-302 (2013).
  18. Aft, R. L., Zhang, F. W., Gius, D. Evaluation of 2-deoxy-D-glucose as a chemotherapeutic agent: mechanism of cell death. British Journal of Cancer. 87 (7), 805-812 (2002).
  19. Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54918 (2016).
  20. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  21. Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).

Tags

Biología Número 175 células madre hematopoyéticas células progenitoras hematopoyéticas glucólisis respiración mitocondrial fosforilación oxidativa tasa de acidificación extracelular tasa de consumo de oxígeno flujo extracelular células no adherentes
Evaluación de la bioenergética celular en células madre hematopoyéticas de ratón y células progenitoras primitivas utilizando el analizador de flujo extracelular
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kumar, S., Jones, M., Li, Q.,… More

Kumar, S., Jones, M., Li, Q., Lombard, D. B. Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer. J. Vis. Exp. (175), e63045, doi:10.3791/63045 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter