Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Vurdering av cellulær bioenergi i mus hematopoietisk stamme og primitive stamceller ved hjelp av extracellulær flux analysator

Published: September 24, 2021 doi: 10.3791/63045
Automatic Translation
1, 2, 2,3,4, 1,4,5
1Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Cellular and Developmental Biology, University of Michigan, Ann Arbor, 4Rogel Cancer Center, University of Michigan, Ann Arbor, 5Institute of Gerontology, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Metoden som presenteres her oppsummerer optimaliserte protokoller for å vurdere cellulær bioenergetikk i ikke-tilhengermus hematopoietisk stamme og primitive stamceller (HSPCer) ved hjelp av den ekstracellulære fluksanalysatoren for å måle den ekstracellulære forsuringshastigheten (ECAR) og oksygenforbruket (OCR) av HSPCer i sanntid.

Abstract

Under steady state forblir hematopoietiske stamceller (HSC) i stor grad passiviserende og antas å være overveiende avhengige av glykolyse for å møte deres energiske behov. Men under stressforhold som infeksjon eller blodtap blir HSC-er proliferative og produserer raskt nedstrøms stamceller, som igjen ytterligere skiller seg ut, og til slutt produserer modne blodlegemer. Under denne overgangs- og differensieringsprosessen går HSC-er ut av passivitet og gjennomgår raskt en metabolsk bryter fra glykolyse til oksidativ fosforylering (OxPHOS). Ulike stresstilstander, som aldring, kreft, diabetes og fedme, kan påvirke mitokondriefunksjonen negativt og kan dermed endre metabolsk omprogrammering og differensiering av HSC og forfedre under hematopoiesis. Verdifull innsikt i glykolytiske og mitokondriefunksjoner i HSC-er og forfedre under normale og stressforhold kan oppnås gjennom vurdering av deres ekstracellulære forsuringshastighet (ECAR) og oksygenforbrukshastighet (OCR), som er indikatorer på henholdsvis cellulær glykolyse og mitokondrie respirasjon.

Her er det gitt en detaljert protokoll for å måle ECAR og OCR i musebenmarg-avledede avstamning-negative cellepopulasjoner, som inkluderer både hematopoietisk stamme og primitive stamceller (HSPCer), ved hjelp av den ekstracellulære fluksanalysatoren. Denne protokollen beskriver tilnærminger for å isolere avstamningsnegative celler fra musebenmarg, forklarer optimalisering av cellesåingstetthet og konsentrasjoner av 2-deoksy-D-glukose (2-DG, en glukoseanalog som hemmer glykolyse) og ulike OxPHOS-målrettede legemidler (oligomycin, FCCP, rotenone og antimycin A) som brukes i disse analysene, og beskriver narkotikabehandlingsstrategier. Nøkkelparametere for glykolytisk flux, som glykolyse, glykolytisk kapasitet og glykolytisk reserve, og OxPHOS-parametere, som basal respirasjon, maksimal åndedrettsvern, protonlekkasje, ATP-produksjon, ledig åndedrettskapasitet og koblingseffektivitet, kan måles i disse analysene. Denne protokollen tillater ECAR- og OCR-målinger på ikke-tilhenger HSPCer og kan generaliseres for å optimalisere analyseforholdene for alle typer suspensjonsceller.

Introduction

Hematopoiesis er prosessen der ulike typer modne blodlegemer med svært spesialiserte funksjoner dannes fra HSC1. HSC-er er i stand til selvfornyelse og differensiering i ulike multipotente og avstamningsspesifikke stamcellepopulasjoner. Disse forfedrene produserer til slutt celler av lymfoid, myeloid, erythroid og megakaryocytt avstamninger. For å opprettholde sin selvfornyelseskapasitet forblir HSC-er i stor grad passivisert, og i likhet med andre vevsstammeceller antas det å stole på glykolyse i stedet for mitokondrie OxPHOS for ATP-produksjon 2,3. Inntreden i cellesyklusen fører til økt åndedrett og OxPHOS, noe som resulterer i forhøyede nivåer av reaktive oksygenarter (ROS), som er skadelige for HSC-vedlikehold og funksjon3. Gjentatt celledeling kan dermed føre til redusert selvfornyelseskapasitet for HSC-er og til slutt til utmattelse.

I voksen hematopoiesis gjennomgår HSC primært asymmetrisk celledeling, hvor en av dattercellene beholder HSC-potensialet og fortsetter å stole på glykolytisk metabolisme. Den andre dattercellen blir en primitiv stamcelle som mister selvfornyelseskapasitet, men sprer seg og til slutt gir opphav til differensierte funksjonelle hematopoietiske celler4. Når HSC-er skiller seg ut for å produsere nedstrøms forfedre, antas det at en overgang fra glykolyse til mitokondriemetabolisme oppstår for å forsyne energien og byggesteinene som trengs for å støtte denne raske overgangen5, som antydet av observasjonene at HSC-er har inaktiv mitokondriemasse 6,7,8,9 . I motsetning til dette er mitokondrieaktiviteten (indikert ved tilknyttede ROS-nivåer) mye høyere i avstamningstilknyttede forfedre enn i HSC-er 9,10,11. Metabolske endringer som oppstår i løpet av det tidligste trinnet av hematopoiesis dermed antyder en direkte og avgjørende rolle av mitokondrier i å regulere HSC skjebne.

Dysfunksjonelle mitokondrier tilstede under ulike stresstilstander, som aldring, kreft, diabetes og fedme12, kan forstyrre HSC selvfornyelseskapasitet, noe som fremkaller en ubalanse i HSC / forfedredifferensiering ved å produsere for store mengder ROS, svekke ATP-produksjon og / eller ved å endre andre metabolske prosesser 9,12,13 . Perturbasjoner i metabolsk homeostase i HSC / forfedre differensiering kan betydelig påvirke hematopoiesis, potensielt bidra til utviklingen av hematologiske abnormiteter13. Gitt de kritiske påvirkningene av glykolyse og mitokondrie OxPHOS på HSC-stilkhet og differensiering, er det av interesse å undersøke både metabolske parametere under normale og stressforhold. Verdifull innsikt i glykolytisk og mitokondriefunksjon av HSC-er og stamceller kan oppnås ved å vurdere deres ECAR og OCR, som er indikatorer på henholdsvis cellulær glykolyse og mitokondrie respirasjon.

Seahorse ekstracellulær flux analysator er et kraftig apparat utstyrt med to sonder per brønn for samtidig å måle ECAR og OCR i levende celler og dermed kan brukes til å vurdere cellulær bioenergi i sanntid, som svar på ulike substrater eller inhibitorer. Analysepatronen som brukes sammen med analysatoren inneholder injeksjonsporter for å holde opptil fire legemidler for automatisert injeksjon under analysen. En ordning med en typisk glykolysestresstest er vist i figur 1A. Analysen starter med måling av ECAR av celler, inkubert i glykolyse stress test medium som inneholder glutamin, men ikke glukose eller pyruvat. Dette representerer forsuring som oppstår på grunn av ikke-glykolytiske aktiviteter i cellene og rapporteres som ikke-glykolytisk forsuring. Dette etterfølges av injeksjon av glukose ved en mettende konsentrasjon. Via glykolyse omdannes glukose i cellen til pyruvat, som videre metaboliseres i cytoplasma for å produsere laktat, eller i mitokondrier for å produsere CO2 og vann.

Konvertering av glukose til laktat forårsaker netto produksjon og påfølgende frigjøring av protoner til det ekstracellulære mediet, noe som resulterer i en rask økning i ECAR 14,15,16. Denne glukose-stimulerte endringen i ECAR rapporteres som glykolyse under basale forhold. Den andre injeksjonen består av oligomycin (en hemmer av ATP-syntase, også kjent som kompleks V17), som hemmer mitokondrie ATP-produksjon. Under oligomycinmediert OxPHOS-hemming oppregulerer celler maksimalt glykolyse for å møte deres energiske krav. Dette fører til en ytterligere økning i ECAR, og avslører den maksimale glykolytiske kapasiteten til cellene. Forskjellen mellom maksimal glykolytisk kapasitet og basal glykolyse kalles glykolytisk reserve. Til slutt injiseres 2-DG, noe som forårsaker et betydelig fall i ECAR, vanligvis nær ikke-glykolytiske forsuringsnivåer. 2-DG er en glukoseanalog som konkurransedyktig binder seg til hexokinase, noe som resulterer i hemming av glykolyse18. Dermed bekrefter den 2-DG-induserte nedgangen i ECAR ytterligere at glykolyse faktisk er kilden til ECAR observert etter glukose- og oligomycininjeksjoner.

Figur 1B viser skjemaet for en typisk mitokondriestresstest. Analysen starter med baseline OCR-måling av cellene, inkubert i mitokondriestresstestmedium som inneholder glukose, glutamin og pyruvat. Etter basale OCR-målinger injiseres oligomycin i denne analysen, som hemmer kompleks V, og reduserer dermed elektronstrømmen gjennom elektrontransportkjeden (ETC)17. Følgelig er OCR redusert som respons på oligomycininjeksjon, og denne nedgangen i OCR er knyttet til mitokondrie ATP-produksjon. Den andre injeksjonen består av karbonylcyanid-4 (trifluorometoksy) fenylhydrazon (FCCP), en protonofor og en uncoupler av mitokondrie OxPHOS17. FCCP kollapser mitokondrieprotongradienten ved å tillate strømmen av protoner over mitokondrie indre membran. På grunn av FCCP-injeksjonen blir elektronstrømmen gjennom ETC depressert, og kompleks IV bruker oksygen på maksimalt nivå. Forskjellen mellom maksimal OCR og basal OCR kalles reserve åndedrettskapasitet, som er et mål på cellens evne til å reagere på økt energibehov under stressforhold. Til slutt injiseres en blanding av to ETC-hemmere (rotenon, en kompleks I-hemmer og antimycin A, en kompleks III-hemmer17), som helt slår av elektronstrømmen, og OCR reduseres til et lavt nivå. OCR målt etter rotenon og antimycin A injeksjon tilsvarer ikke-mitokondrie OCR drevet av andre prosesser inne i cellene. Ikke-mitokondrie OCR muliggjør beregning av basal respirasjon, protonlekkasje og maksimal respirasjon.

Basal respirasjon representerer forskjellen mellom baseline OCR og ikke-mitokondrie OCR. Protonlekkasje refererer til forskjellen mellom OCR etter oligomycininjeksjon og ikke-mitokondrie OCR. Maksimal respirasjon representerer forskjellen mellom OCR etter FCCP-injeksjon og ikke-mitokondrie OCR. Koblingseffektivitet beregnes som prosentandelen av ATP-produksjonshastigheten til basal respirasjonsrate. Dette metodepapiret gir en detaljert protokoll for å måle ECAR og OCR i avstamning-negative HSPCer ved hjelp av Seahorse XFe96 ekstracellulær fluksanalysator. Denne protokollen beskriver tilnærminger for å isolere muselinje-negative HSPCer, forklarer optimalisering av cellesåingstetthet og konsentrasjoner av ulike legemidler som brukes i ekstracellulære fluksanalyser, og beskriver narkotikabehandlingsstrategier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle virveldyrforsøk ble godkjent av og utført i samsvar med regelverket i University of Michigan Committee on Use and Care of Animals.

1. Dag før analysen (Total tid: ~10 min)

  1. Hydrering av sensorpatronen (Trinntid: ~10 min)
    1. Åpne det ekstracellulære fluksanalysesettet og fjern sensorpatronen og verktøyplateenheten. Lagre lasteguiden flate for bruk neste dag.
    2. Skill sensorpatronen manuelt (den øverste grønne delen med lokk) fra strømplaten (nedre mikroplate på 96 brønner) og plasser den opp-ned ved siden av nettplaten.
    3. Bruk en flerkanals pipette og fyll hver brønn på verktøyplaten med 200 μL kalibrant, inkludert med fluksanalysesett.
    4. Plasser sensorkassetten tilbake på strømplaten, og pass på at du senker sensorene helt ned i kalibratoren.
    5. Plasser den monterte sensorpatronen og verktøyplaten med kalibrant i en inkubator som ikke er CO2 37 °C over natten. For å forhindre fordampning av kalibratoren, må du sørge for at inkubatoren er riktig fuktet. Hvis du bruker en vanlig ovnsinkubator for ikke-CO2 37 °C inkubasjoner, plasserer du et åpent beger som inneholder vann inne i inkubatoren for å fukte det. Hvis tilgjengelig, bruk en XF prep-stasjon for alle ikke-CO2 37 °C inkubasjoner.
      MERK: Alternativt kan sensorpatronen hydreres over natten med 200 μL per brønn sterilt ultrarent vann i en ikke-CO2 37 °C inkubator. Bytt ut vann med 200 μL per brønn på 37 °C forhåndsvarslet kalibrant, minst 45-60 min før injeksjonsportene lastes på analysedagen.

2. Analysedag (Total tid: ~9 t 30 min)

MERK: Den totale tiden som er angitt ovenfor, inkluderer akkumulert varighet for trinn 2.1-2.4 i tillegg til enten trinn 2.5 eller trinn 2.6.

  1. Tilberedning av celleklebende mikroplater (Trinntid: ~1 t 30 min)
    MERK: Utfør alle trinnene i et biosikkerhetsskap.
    1. Forbered 2,5 ml av cellelimoppløsningen (22,4 μg/ml, se materialtabellen) per 96-brønns cellekulturmikroplate ved å oppløse 56 μg cellelim i et passende volum filtersterilisert 0,1 M natriumbikarbonat (pH 8.0) og tilsett umiddelbart 1 N natriumhydroksid ved halvparten av volumet av limcellen. Virvel eller pipette opp og ned for å blande.
    2. Åpne mikroplaten for 96-brønnscellekultur (følger med fluksanalysesettet) og dispenser 25 μL av den tilberedte cellelimløsningen nederst i hver brønn. Dekk mikroplaten med lokket og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur inne i hetten.
    3. Etter inkubasjon, fjern og kast overflødig cellelimløsning ved hjelp av en flerkanals pipette eller aspirator, og vask hver brønn to ganger med 200 μL sterilt ultrarent vann. Lufttørk platen, med lokket fjernet, inne i hetten i 30-45 min.
      MERK: Mikroplater med cellelimbelagt cellekultur kan oppbevares i opptil en uke ved 4 °C. Forhåndsbelagte mikroplater lagret ved 4 °C må varmes opp til romtemperatur inne i hetten før såddceller.
  2. Forberedelse av analysemedier (Trinntid: ~30 min)
    1. Fremstilling av glykolyse stress testanalyse medium
      1. Tilsupper 100 ml basismedium (se materialtabellen) med 1 ml 200 mM L-glutamin.
        MERK: Den endelige L-glutaminkonsentrasjonen i analysemediet er 2 mM.
      2. Varm L-glutamin-supplert medium til 37 °C i et vannbad.
      3. Juster pH på det varme mediet til 7,4 med 1 N NaOH.
      4. Filtrer-steriliser mediet med et filter på 0,2 μm og hold det ved 37 °C til det er klart til bruk.
    2. Fremstilling av mitokondrie stress test analyse medium
      1. Tilsupp 100 ml basemedium med 0,45 g glukose, 1 ml 200 ml L-glutamin og 1 ml 100 mM natriumpyruvat.
        MERK: Det endelige analysemediet inneholder 25 mM glukose, 2 mM L-glutamin og 1 mM natriumpyromin.
      2. Varm glukose, L-glutamin og natriumpyuvatt-supplert medium til 37 °C i et vannbad.
      3. Juster pH på det varme mediet til 7,4 med 1 N NaOH.
      4. Filtersteriliser medium med et filter på 0,2 μm og hold det ved 37 °C til det er klart til bruk.
  3. Høst muselinje-negative HSPCer (Trinntid: ~3 h)
    1. Forbered analysebufferen ved å supplere Hanks balanserte saltløsning med 4% foster bovint serum. Forbered 1x berikelsesbuffer ved å fortynne 5x-lageret med sterilt destillert vann. Hold begge bufferne på is til bruk.
    2. Humant euthanize mus ved hjelp av CO2 etterfulgt av cervical dislokasjon og fjerne bakbenene med saks. Fjern forsiktig alle vev fra beinene, og kutt endene fra begge sider av lårbenet og tibia ved hjelp av saks. Skyll ut benmargsceller fra lårbenet og tibia ved hjelp av analysebufferen. Før de skyllede cellene gjennom et sterilt 70 μm filter, sentrifuger filtratet ved 200 × g i 5 min ved 4 °C, og kast supernatanten.
    3. Lyse de røde blodcellene ved å resuspendere cellepellet i 500 μL ACK buffer (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 7,2). Etter lysis i 1 min på is, vask prøvene ved å tilsette 1 ml analysebuffer og sentrifuge ved 200 × g i 5 min ved 4 °C. Kast supernatanten.
    4. Etter vask, inkuber prøvene med en cocktail av biotinylerte antistoffer rettet mot CD2 (1:200 fortynning), CD3 (1:200 fortynning), CD5 (1:200 fortynning), CD8 (1:200 fortynning), CD5 (1:200 fortynning), CD8 (1:200 fortynning), CD8 (1:200 fortynning), CD5 (1:200 fortynning), CD8 (1:200 fortynning), CD8 (1:200 fortynning), CD5 (1:200 fortynning), CD8 (1:200 fortynning), CD8 (1:200 fortynning), CD5 (1:200 fortynning), CD8 Ter-119 (1:200 fortynning), B220 (1:200 fortynning) og Gr-1 (1:800 fortynning) i 45 min på is i et totalt volum på 500 μL analysebuffer.
    5. Vask prøvene med 1 ml analysebuffer med sentrifugering som ovenfor.
    6. Vask prøvene med 1 ml 1x berikelsesbuffer med sentrifugering som ovenfor.
    7. Inkuber prøvene med 20 μL streptavidin nanoberader og 100 μL 1x berikelsesbuffer på is i 15 minutter.
    8. Vask prøvene med 1 ml 1x berikelsesbuffer med sentrifugering som ovenfor.
    9. Bruk prøvene på nytt i 2,5 ml 1x berikelsesbuffer. Plasser dem på en separasjonsmagnet i 5 min. Samle supernatantene separat i 15 ml koniske rør.
    10. Resuspend magnet-separerte prøver i en ekstra 2,5 ml 1x berikelsesbuffer, og plasser dem igjen på separasjonsmagneten i 5 minutter. Samle og kombiner supernatanter til tidligere kolleksjoner i 15 ml koniske rør fra trinn 2.3.9.
      MERK: Supernatantene inneholder de avledningsnegative cellefraksjonene.
    11. Sentrifuger de 15 ml koniske rørene som inneholder de negativt utvalgte cellene i 5 min ved 200 × g ved 4 °C.
    12. Resuspend cellepellets i 1 ml analysebuffer og telle cellenummeret ved hjelp av trypan blå manuelt eller via en automatisert celle teller som en grevinne 3.
      MERK: Etter den ovenfor beskrevne tilnærmingen skal ~ 6 × 106 avstamning-negative HSPCer lett renses fra bakbenene til en enkelt mus. Hvis reagenser, som analysebuffer, 1x berikelsesbuffer og avledningsspesifikk antistoffcocktail, fremstilles dagen før eksperimentet, tar det omtrent 2,5-3 timer å berike HSPCer fra 4 mus. Det vil ta ytterligere 10 minutter for hver mus utover dette tallet.
  4. Såing celler i celle-lim-belagte mikroplater (Trinntid: ~1 h)
    1. Sentrifuger celler fra trinn 2.3.12 ved 200 × g i 5 min ved romtemperatur.
    2. Fjern supernatanten og resuspend cellepellet i riktig analysemedium (glykolyse stress test medium eller mitokondrie stress test medium). Sentrifuge ved 200 × g i 5 min ved romtemperatur.
    3. Gjenta trinn 2.4.2. Fjern supernatanten og resuspend cellene i riktig oppvarmet analysemedium til konsentrasjonen på 2,5 × 105 celler per 50 μL eller 5 × 106 per ml.
    4. Pipette 50 μL av celleopphenget langs siden av hver brønn i romtemperaturcelleklebelagt 96-brønns cellekulturmikroplate. Pipette 50 μL av analysemediet inn i hjørnebakgrunnsmålingsbrønnene. Bruk en pipette med flere kanals for cellebelegg for å sikre konsistens.
    5. Lag en sentrifugebalanseplate ved å tilsette 50 μL vann per brønn av en ikke-belagt 96-brønns cellekulturmikroplate.
    6. Sentrifuger cellene i platen ved 200 × g i 1 min ved romtemperatur. Ikke bruk brems. Overfør platen til en ikke-CO2 37 °C inkubator i 25-30 min for å sikre at cellene er helt festet. Bekreft visuelt under et mikroskop at cellene er stabilt festet til mikroplateoverflaten.
      MERK: Ettersom ~6 × 106 avledningsnegative HSPCer kan høstes fra bakbenene til en enkelt mus, er HSPCer isolert fra 4 mus (~ 2,4 × 107 celler) nødvendig for å fylle en hel 96-brønns plate hvis målet er å screene flere intervensjoner ex vivo parallelt. Men hvis målet er å undersøke virkningen av en genetisk endring eller en intervensjon på metabolske parametere av HSPCs in vivo, kan HSPCer isolert fra flere par kontroll- og testmus analyseres i flere tekniske repliker parallelt ved hjelp av en enkelt plate.
  5. Utføre glykolyse stress test ved hjelp av ekstracellulær flux analysator (Trinntid: ~ 3 h 30 min)
    1. Lastesensorpatron med injiseringsforbindelser
      1. Forbered 100 mM glukose, 20 μM oligomycin og 500 mM 2-DG-løsninger i forhåndsvarmt glykolyse stresstestanalysemedium (pH 7.4).
        MERK: Alle injiseringsforbindelser er laget ved 10x konsentrasjon. De endelige brønnkonsentrasjonene er 10 mM for glukose, 2 μM for oligomycin og 50 mM for 2-DG (se tabell 1).
      2. Fjern den hydrerte sensorpatronen fra inkubatoren uten CO2 37 °C fra trinn 1.1.5. Fjern luftbobler fra kalibreringen i bruksplaten ved å løfte sensorpatronen ut av kalibreringen og sette den på den samme nettplaten med kalibreringen.
      3. Plasser A/D-lasteføringen flat (inkludert i det ekstracellulære fluksanalysesettet) på toppen av sensorpatronen, og plasser den slik at bokstaven A er plassert øverst til venstre for å sikre at bare port A er tilgjengelige for lasting. Bruk en flerkanals pipette og dispenser 20 μL 100 mM glukoseoppløsning i port A.
      4. Bytt ut A/D-lasteføringen flatt med B/C-lasteføringen flat, orientering slik at bokstaven 'B' er plassert øverst til venstre for å sikre at bare port B er tilgjengelige for lasting. Bruk en flerkanals pipette og dispenser 22 μL 20 μM oligomycinoppløsning i port B.
      5. Orienter B/C-lasteføringen flatt for å finne bokstaven 'C' øverst til venstre for lasteportene C. Bruk en flerkanals pipette, dispenser 25 μL 500 mM 2-DG-løsning i port C.
      6. Fjern og kast lasteguidens flater.
        MERK: Det er viktig at hver havneserie med alle de 96 brønnene, inkludert bakgrunnsbrønnene, lastes helt med samme volum av injeksjonsforbindelsen.
    2. Oppretting, kalibrering og målinger av maler
      1. Opprett eller last inn malen for glykolysestresstesten på kontrolleren. Angi detaljer om injeksjonsstrategier, behandlingsbetingelser og celletyper, og trykk på generer grupper. Gå til platekartet og tilordne brønner til hver gruppe som skal analyseres. Tilordne de 4 hjørnebrønnene for bakgrunnsmålinger.
      2. I protokollen må du sørge for at kalibrering og likevekt kontrolleres i initialiseringstrinnet .
      3. For baseline måling og målinger etter hver injeksjon (glukose, oligomycin og 2 DG), sett antall målesykluser til 3 og Bland - Vent - Mål ganger til 3 min - 0 min - 3 min (se tabell 2).
      4. Fjern lokket fra de innlastede forbindelsene og den hydrerte sensorpatronen, nedsenket i kalibrant i strømplaten. Plasser den på arbeidsbrettet til den ekstracellulære fluksanalysatoren og begynn å løpe.
        MERK: Det første trinnet er kalibreringen, som vanligvis tar ~ 20 min.
      5. Ta ut mikroplaten som inneholder cellene fra inkubatoren ikke-CO2 37 °C fra trinn 2.4.6 etter at 25-30 min inkubasjon er over. Uten å forstyrre cellene, tilsett sakte 130 μL av det forhåndsvarmede glykolysestressanalysemediet (pH 7,4) per brønn for å utgjøre middels volum i hver brønn til 180 μL og returner platen til ikke-CO2 37 ° C inkubator i ytterligere 15-20 minutter.
        MERK: En total inkubasjonstid på 45-60 min etter sentrifugering foretrekkes.
      6. Etter at kalibreringen er over, bytt ut strømplaten med analysemikroplaten (uten lokk) som inneholder cellene. Trykk på Last inn celleplate for å starte målingene, som tar ~ 1,5 timer for ferdigstillelse av analysen.
      7. Når målingene er over, samler du opp analysemikroplaten som inneholder cellene, og fjerner analysemediet uten å forstyrre cellene. Vask en gang forsiktig med 250 μL 1x fosfatbufret saltvann uten å løsne cellene.
      8. Tilsett 10 μL RIPA lysis buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% NP-40, 0,5 % Na deoksycholat, 0,1 % natriumdodecylsulfat, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF), supplert med 1x proteasehemmercocktail, til hver brønn og agitate platen på en shaker i 10 min. Frys hele platen ved -80 °C.
      9. Tine platen, og utfør en proteinmålingsanalyse for datanormalisering i henhold til produsentens instruksjoner.
      10. Hent og analyser dataene. Åpne datafilen ved hjelp av Wave Desktop Software. Klikk på Normaliser og lim inn normaliseringsverdiene for hver brønn. Klikk på bruk for å normalisere dataene. Klikk på Eksporter og velg glykolyse stresstestrapportgenerator for å eksportere de analyserte dataene til en rapportgenerator. Du kan også eksportere dataene til et eksternt program.
        MERK: Alternativt kan det totale kjernefysiske DNA-innholdet i hver brønn brukes til å normalisere dataene. Et fluorescerende fargestoff, som CyQuant som binder seg til nukleinsyre, kan brukes til å vurdere det totale kjernefysiske DNA-innholdet per brønn.
  6. Utføre en mitokondriestresstest ved hjelp av den ekstracellulære fluksanalysatoren (Trinntid: ~ 3 t 30 min)
    1. Lastesensorpatron med injiseringsforbindelser
      1. Forbered 20 μM oligomycin, 20 μM FCCP og 5 μM rotenon + 5 μM antimycin A-løsninger i forhåndsvarmt mitokondriespenningstestanalysemedium (pH 7,4).
        MERK: Alle injiseringsforbindelser er laget ved 10x konsentrasjon. De endelige brønnkonsentrasjonene er 2 μM for oligomycin, 2 μM for FCCP og 0,5 μM hver for rotenon og antimycin A (se tabell 3).
      2. Fjern den hydrerte sensorpatronen fra inkubatoren på 37 °C fra trinn 1.1.5 og fjern luftbobler som beskrevet tidligere i trinn 2.5.1.2.
      3. Ved å følge trinn 2.5.1.3 til 2.5.1.6, dispensere 20 μL av 20 μM oligomycin i port A, 22 μL 20 μM FCCP i port B og 25 μL av en blanding av 5 μM rotenon og 5 μM antimycin A i portene C.
        MERK: Det er viktig at hver havneserie med alle de 96 brønnene, inkludert bakgrunnsbrønnene, lastes helt med samme volum injiseringsmasse.
    2. Oppretting, kalibrering og målinger av maler
      1. Opprett eller last inn malen for mitokondriestresstesten på kontrolleren. Angi detaljer om injeksjonsstrategier, behandlingsbetingelser og celletyper, og trykk på generer grupper. Gå til platekartet og tilordne brønner til hver gruppe som skal analyseres. Tilordne de 4 hjørnebrønnene for bakgrunnsmålinger.
      2. I protokollen må du sørge for at kalibrering og likevekt kontrolleres i initialiseringstrinnet.
      3. For baseline måling og målinger etter hver injeksjon (oligomycin, FCCP og rotenon + antimycin A), sett antall målesykluser til 3 og Mix - Vent - Mål ganger til 3 min - 0 min - 3 min (se tabell 4).
      4. Start løpet for å utføre kalibreringen som i trinn 2.5.2.4.
      5. Tilsett 130 μL av det forhåndsvarmede mitokondriestresstestanalysemediet (pH 7,4) per brønn og i trinn 2.5.2.5.
      6. Start målingene. hente og analysere dataene som i trinn 2.5.2.6 til 2.5.2.10. Eksporter de analyserte dataene til mitokondrie stress test rapport generator eller en ekstern applikasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjelp av denne protokollen ble cellenummeret og konsentrasjonene av ulike OxPHOS-målrettede legemidler (brukt i de ekstracellulære fluksanalysene) optimalisert for å måle ECAR og OCR av HSPCer isolert fra 24 uker gamle kvinnelige C57BL / 6 mus. For det første ble glykolysestresstesten utført for å optimalisere cellenummer og oligomycinkonsentrasjon. Et varierende antall HSPCer per brønn fra 5 × 104 til 2,5 × 105 ble brukt i denne analysen. Som vist i figur 2A og figur 2C, stiger den ikke-glykolytiske forsuringsraten med økt celletall fra 5 × 104 til 2,5 × 105 , men øker bare minimalt mellom 2 × 105 til 2,5 × 105 celler. Som forventet stimulerer injeksjon av 10 mM glukose glykolyse ved alle cellenumre, med en maksimal økning i ECAR observert ved 2,5 × 105 celler per brønn. Injeksjon av 2 μM oligomycin øker imidlertid ikke ECAR ytterligere, som ellers forventet. Bruken av 1 μM oligomycin ga lignende resultater (ikke vist). Disse resultatene kunne tolkes for å indikere at disse oligomycinkonsentrasjonene ikke var optimale i disse analysene.

Imidlertid viser OCR-data oppnådd i samme sett med glykolysestresstester at begge testet oligomycinkonsentrasjoner (1 μM og 2 μM) faktisk var effektive, som antydet av det betydelige fallet i OCR etter oligomycininjeksjon på grunn av kompleks V-hemming (se figur 2B for 2 μM oligomycin; ikke vist for 1 μM oligomycin). Ved begge testede oligomycinkonsentrasjoner ble det observert maksimal reduksjon i OCR ved 2,5 × 105 celler per brønn. Til slutt resulterte injeksjon på 50 mM 2-DG i en betydelig reduksjon av ECAR, noe som antyder at glykolyse er kilden til ECAR observert i disse forsøkene. Samlet sett kan det konkluderes med at HSPCer oppnår maksimal glykolyse etter glukoseinjeksjon i disse analysene, og de har lite eller ingen glykolytisk reserve. Dette indikerer at, som rensede HSC-er, avstamning-negative HSPCer, som inkluderer HSC-fraksjonen som brukes i denne analysen, også hovedsakelig er avhengig av glykolyse for ATP-produksjonen. I celler med høy glykolytisk hastighet kan det ikke være en signifikant økning i ATP-etterspørselen etter oligomycinmediert hemming av mitokondrie ATP-produksjon. Celler kan lett håndtere tap av mitokondrie ATP uten ytterligere oppregulerende glykolyse19. Glykolyse stresstestparametere-ikke-glykolytisk forsuring, glykolyse, glykolytisk kapasitet og glykolytisk reserve som vist i figur 2C- ble beregnet som beskrevet tidligere i introduksjons- og protokolldelene. Basert på disse dataene ble 2,5 × 105 celler per brønn og 2 μM oligomycin valgt ut til videre studier.

Mitokondriestresstesten ble brukt til optimalisering av FCCP-konsentrasjon. I denne analysen ble 2,5 × 105 HSPCer brukt per brønn, som optimalisert tidligere via glykolysestresstesten. Som vist i figur 3A begynner analysen med måling av baseline OCR etterfulgt av 2 μM oligomycininjeksjon, noe som forårsaker en betydelig reduksjon i OCR via hemming av kompleks V. Etter OCR-målinger etter oligomycininjeksjon ble FCCP injisert i varierende konsentrasjoner: 0,5 μM, 1 μM, 1,5 μM og 2 μM. Som tidligere antydet reverserer FCCP den oligomycininduserte undertrykkelsen av elektronstrøm gjennom ETC ved å trekke ut protontransport fra OxPHOS og tvinger kompleks IV til å konsumere oksygen maksimalt. Som vist i figur 3A stimulerer FCCP OCR i HSPCer på en doseavhengig måte med en maksimal økning i OCR observert ved 2 μM FCCP. Til slutt ble en blanding av 0,5 μM rotenon og 0,5 μM antimycin A injisert, noe som helt slår av elektronstrømmen gjennom ETC, og OCR reduseres til minimalt nivå. OCR målt etter rotenon og antimycin A injeksjon tilsvarer ikke-mitokondrie oksygenforbruk. Andre mitokondriestresstestparametere-basal respirasjon, maksimal respirasjon, protonlekkasje, ATP-produksjon, ledig åndedrettskapasitet og koblingseffektivitet som vist i figur 3B- ble beregnet som beskrevet tidligere i introduksjons- og protokolldelene. Til slutt ble 2 μM FCCP valgt ut til videre studier.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av vurdering av glykolytisk funksjon og mitokondrie-respirasjon ved hjelp av den ekstracellulære fluksanalysatoren. Sekvenser og injeksjonstider for ulike effektorforbindelser som brukes i glykolytisk stresstest (A) og mitokondriestresstesten (B) vises. (A) Glykolytiske parametere, glykolyse, glykolytisk kapasitet, glykolytisk reserve og ikke-glykolytisk forsuring, og (B) mitokondriefunksjonsparametere, basal respirasjon, ATP-tilknyttet respirasjon, maksimal respirasjon, ikke-mitokondrie oksygenforbruk, protonlekkasje og ekstra åndedrettskapasitet er skissert. Forkortelser: ECAR = ekstracellulær forsuringshastighet; 2-DG = 2-deoksy-D-glukose; OCR = oksygenforbruk; FCCP = karbonylcyanid-4 (trifluorometoksy) fenylhydrazon; Råte. = rotenon; Anti. A = antimycin A. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Vurdering av glykolytisk funksjon i HSPCer for mus. Glykolysestresstesten ble utført for å måle (A) de ekstracellulære forsuringsratene (ECAR, mpH/min) og (B) oksygenforbruket (OCR, pmol/min) av HSPCer isolert fra 24 uker gamle kvinnelige C57BL/6 mus. Til tider indikert ble glukose (10 mM), oligomycin (2 μM) og 2-DG (50 mM) injisert. (C) ECAR beregnes som ikke-glykolytisk forsuring, glykolyse, glykolytisk kapasitet og glykolytisk reserve per 5 × 104, 1 × 105, 1,5 × 105, 2 × 105 og 2,5 × 105 HSPCer/brønn. Data presenteres som gjennomsnittlig ± SEM, n = 4. Forkortelser: HSPCs = hematopoietisk stamme og primitive stamceller; ECAR = ekstracellulær forsuringshastighet; 2-DG = 2-deoksy-D-glukose; OCR = oksygenforbruk. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Vurdering av mitokondrie-respirasjonen i HSPC-er for mus. En mitokondriestresstest ble utført for å måle (A) oksygenforbruket (pmol/min) av HSPCer isolert fra 24 uker gamle kvinnelige C57BL/6 mus. Til tider indikert ble oligomycin (2 μM), FCCP (0,5 μM, 1 μM, 1,5 μM, 2 μM) og rotenon og antimycin A (Rot./AA, 0,5 μM hver) injisert. (B) OCR beregnes som ikke-mitokondrie oksygenforbruk, basal respirasjon, protonlekkasje, maksimal respirasjon (per 0,5 μM, 1 μM, 1,5 μM og 2 μM FCCP), ATP-produksjon, ledig åndedrettskapasitet (per 0,5 μM, 1 μM, 1,5 μM og 2 μM FCCP) og koblingseffektivitet per 2,5 × 105 HSPC/brønn. Data presenteres som gjennomsnittlig ± SEM, n = 4. Forkortelser: HSPCs = hematopoietisk stamme og primitive stamceller; OCR = oksygenforbruk; FCCP = karbonylcyanid-4 (trifluorometoksy) fenylhydrazon; Råte. = rotenon; AA = antimycin A. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Injeksjonsport Portvolum Injiseringsforbindelse (10x konsentrert) Endelig sammensatt konsentrasjon i brønnen
En 20 μL Glukose (100 mM) 10 mM
B 22 μL Oligomycin (20 μM) 2 μM
C 25 μL 2DG (500 mM) 50 mM

Tabell 1: Injeksjonsstrategi for glykolysestresstesten. Forkortelse: 2-DG = 2-deoksy-D-glukose.

1 Kalibrering
2 Likevekt
3 Injeksjoner og målinger
Sykluser Blande Vent Måle
Baseline (Ikke-glykolytisk forsuring) 3 ganger 3 min 0 min. 3 min
Injiser port A: Glukose 3 ganger 3 min 0 min. 3 min
Injiser port B: Oligomycin 3 ganger 3 min 0 min. 3 min
Injiser port C: 2-DG 3 ganger 3 min 0 min. 3 min

Tabell 2: Ekstracellulært fluksanalysatorprogram for glykolysestresstesten. Forkortelse: 2-DG = 2-deoksy-D-glukose.

Injeksjonsport Portvolum Injiseringsforbindelse (10x konsentrert) Endelig sammensatt konsentrasjon i brønnen
En 20 μL Oligomycin (20 μM) 2 μM
B 22 μL FCCP (20 μM) 2 μM
C 25 μL Rotenon (5 μM) + antimycin A (5 μM) 0,5 μM hver

Tabell 3: Injeksjonsstrategi for mitokondriestresstesten. Forkortelse: FCCP = carbonylcyanid-4 (trifluorometoksy) fenylhydrazon.

1 Kalibrering
2 Likevekt
3 Injeksjoner og målinger
Sykluser Blande Vent Måle
Planlagte mål 3 ganger 3 min 0 min. 3 min
Injiser port A: Oligomycin 3 ganger 3 min 0 min. 3 min
Injiser port B: FCCP 3 ganger 3 min 0 min. 3 min
Injiser port C: Rotenone & Antimycin A 3 ganger 3 min 0 min. 3 min

Tabell 4: Ekstracellulært fluksanalysatorprogram for mitokondriestresstesten. Forkortelse: FCCP = carbonylcyanid-4 (trifluorometoksy) fenylhydrazon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette metodepapiret beskriver en optimalisert protokoll for vurdering av cellulær bioenergetikk (glykolyse og OxPHOS) i HSPCer for mus ved hjelp av Seahorse ekstracellulær fluksanalysator. Denne enheten er et kraftig verktøy som samtidig måler ECAR og OCR av levende celler, som er beregninger av henholdsvis glykolyse og mitokondrie respirasjon. Dermed kan den brukes til å vurdere cellulær bioenergi i sanntid. Videre tilbyr den 96-brønns mikroplatebaserte plattformen høy gjennomstrømnings kvantifisering med høy følsomhet, slik at samtidig analyse av flere prøver ved hjelp av en enkelt plate, sammenlignet med et annet høyoppløselig respirometer, Oroboros O2k, som bare kan analysere 2 prøver samtidig, eller den klassiske Clark-elektroden20.

Den ekstracellulære fluksanalysatoren har primært blitt brukt til analyse av tilhengercelletyper, da det krever at celler er til stede i en monolayer, noe som gjør det mer utfordrende å analysere celler som vokser i suspensjon. Videre, etter legemiddelinjeksjon fra havnen, oppstår turbulens under blandingssyklusen for narkotikamedier i brønnene før målingene, noe som kan løsne cellene. Derfor må cellene festes fast til bunnen av brønnen. Protokollene beskrevet her har brukt en celle-lim formulering av ikke-immunogene polyfenolic proteiner ekstrahert fra den marine blåskjell, Mytilus edulis, for å forberede en tilhenger monolayer av murine HSPCs.

En annen begrensning ved denne teknologien er per analysekostnaden, som er veldig høy sammenlignet med Clark-type elektroden og Oroboros O2k. Patronene er relativt dyre og kan ikke brukes på nytt. Det er anslått at kostnaden for den ekstracellulære fluksanalysatoren i seg selv er ~ 4 ganger høyere enn Oroboros O2k20. Men gitt halvautomatisering og høy gjennomstrømningsevnen til den ekstracellulære fluksanalysatoren, kan en mye større mengde data samles inn per kjøring enn med O2k.

Resultatene som er oppnådd her viser at 2,5 × 105 HSPCer per brønn er nødvendig for å få pålitelige data ved hjelp av en 96-brønns ekstracellulær fluksanalysator. Dette legger til en annen utfordring i å utføre fluxanalyser ved hjelp av HSPCer, som er vanskelige å oppnå i store mengder fra en mus og krever strømningscytometrisk sortering for å oppnå en ren befolkning. Videre gir strømningssortering betydelig tid til eksperimentet og kan endre den metabolske fenotypen til stamcellene. For å overvinne begrensningene forbundet med strømningscytometribasert rensing, brukte strategien som ble diskutert her avstamningsspesifikke antistoffer bundet til magnetiske perler for å tømme avstamningsforsesatte forfedre, og dermed berike de avstamningsnegative HSPCene. For ytterligere å berike mer primitive HSPCer, kan et ekstra cKit-berikelsestrinn legges til; Dette kommer imidlertid med kostnaden for ekstra eks vivo-tid (~ 1,5 timer) og en reduksjon i cellenummer. Bruken av en slik protokoll vil kreve optimalisering utenfor omfanget av denne protokollen.

For å opprettholde sin pluripotens må HSC-er forbli passivitet og fortrinnsvis ligge i det hypoksiske miljøet inne i benmargen 9,21. Quiescent HSC antas å stole hovedsakelig på glykolyse for å oppfylle sine beskjedne energibehov, da høye nivåer av ROS, et biprodukt av mitokondrie-respirasjon, er skadelig for deres stemness 2,3. HSC-er har relativt høy, men i stor grad inaktiv mitokondriemasse, og opprettholder cellulær ROS på lave nivåer for å tillate vedlikehold av HSCs pluripotency9. Men under engasjement og differensiering blir mitokondrier den primære kilden til ATP-produksjon i HSC 5,9. Dermed spiller mitokondrier en nøkkelfunksjon i overgangen av HSC-er fra passivis til den metabolsk aktive tilstanden som kreves for deres avstamningsforpliktelse og differensiering. I tillegg til å produsere ATP via OxPHOS, spiller mitokondrier mange andre viktige roller i hematopoietisk celle homeostase, inkludert ROS-regulering, apoptose, kalsiumsignalering og syntesen av heme og mange andre kritiske metabolitt-mellomprodukter9. Endringer i mitokondriefunksjoner kan ha betydelig innvirkning på HSC/stamcelledifferensieringsveier og kan bidra til ulike hematologiske lidelser, som hematopoietiske maligniteter, medfødt dyserytropoiesis og sideroblastiske anemier, og myelodysplastiske syndromer13. I ondartede hematopoietiske celler spiller dysfunksjonelle mitokondrier en kritisk rolle i å gi motstand mot apoptose indusert av ulike cytotoksiske legemidler13.

På grunn av mitokondrienes sentrale rolle i å opprettholde HSC / stamcelle homeostase, kan verdifull innsikt i de fysiologiske statusene til disse cellene oppnås ved å vurdere deres mitokondrie OxPHOS under normale og stressforhold. Identifisering av nye modulatorer av mitokondrieaktiviteter kan identifisere nye terapeutiske mål for behandling av hematologiske abnormiteter. Protokollen som er beskrevet i dette dokumentet kan brukes til å screene effekten av kjemiske forbindelser eller metabolske CRISPR-biblioteker på OCR og ECAR av HSC under normale og patologiske forhold, for eksempel HSC-er høstet fra genetisk konstruerte musemodeller av hematologiske lidelser. Slik screening kan også være nyttig for å belyse metabolske veier som opprettholder HSC-styrke i deres hypoksiske nisje, noe som vil være nyttig for å utarbeide strategier for in vitro-utvidelse av HSC samtidig som de opprettholder pluripotensen for terapeutiske formål. Gitt den høye gjennomstrømningen av denne analysen, kan protokollen som er beskrevet her lett tilpasses for å screene et stort antall bioenergetiske modulatorer i HSC, hematopoietiske forfedre og ondartede hematopoietiske celler.

Oppsummert beskriver metodene som presenteres her optimaliserte protokoller for måling av ECAR og OCR i primærmus HSPCer ved hjelp av den ekstracellulære fluksanalysatoren. Resultater hentet fra glykolysestresstesten har vist at 2,5 × 105 celler per brønn og 2 μM oligomycin er optimale for videre analyse. Ved hjelp av 2,5 × 105 celler per brønn og 2 μM oligomycin ble mitokondriestresstesten utført for å optimalisere FCCP-konsentrasjonen, og 2 μM FCCP ble funnet å indusere maksimal OCR. Selv om den nåværende studien hovedsakelig er fokusert på muse-HSPCer, kan protokollen og denne tilnærmingen enkelt tilpasses for å optimalisere analyseforholdene for alle typer suspensjonsceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikt.

Acknowledgments

Arbeidet i Lombard-laboratoriet støttes av NIH (NIGMS R01GM101171, NIEHS R21ES032305), DoD (CA190267, CA170628, NF170044 og ME200030) og Glenn Foundation for Medical Research. Arbeidet i Li-laboratoriet støttes av NIH (NHLBI 5R01HL150707).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 μm filter Corning 430626 Used to filter-sterilize the assay media
100 mM sodium pyruvate Life Technologies 11360-070 Component of mitochondrial stress test assay medium
15 mL conical Falcon tubes Corning 352096 Used during HSPCs harvest and to prepare assay drug solutions
200 mM L-glutamine Life Technologies 25030-081 Component of glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media
2-Deoxy-D-glucose (2-DG) Sigma-Aldrich D8375 3rd drug injection during glycolysis stress test
5x Enrichment buffer (MojoSort) Biolegend 480017 Used for washings during HSPCs harvest
Ammonium chloride (NH4Cl) Fisher Scientific A661-3 Component of ACK lysis buffer
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674 3rd drug injection during mitochondrial stress test
Bio-Rad DC protein assay kit Bio-Rad 500-0112 Used as per manufacturer's instructions
Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) Sigma-Aldrich C2920 2nd drug injection during mitochondrial stress test
Cell-Tak Corning 354240 Cell adhesive. Used for coating cell microplates
Countes 3 Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific For cell counting
EDTA Fisher Scientific O2793-500 Component of ACK lysis buffer and RIPA lysis buffer
Falcon 70 μm filter Fisher Scientific 08-771-2 Used as cells strainer during HSPCs harvest
Gibco Fetal bovine serum (FBS) Fisher Scientific 26400044 Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest
Gibco HBSS Fisher Scientific 14175095 Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest
Glucose Sigma-Aldrich G7528 Component of mitochondrial stress test assay medium and first injection of glycolysis stress test
Oligomycin Sigma-Aldrich O4876 2nd drug injection during glycolysis stress test and 1st drug injection during mitochondrial stress test
PBS Life Technologies 10010-049 Used to wash cells after assay for protein quantification
Potassium bicarbonate (KHCO3) Fisher Scientific P235-500 Component of ACK lysis buffer
Protease Inhibitor Cocktail (PIC) Roche 11836170001 Supplied as tablets. One tablet was dissolved in 10 mL of RIPA buffer to make 1x PIC.
Rat biotin antimouse-B220, Clone ID: RA3-6B2 Biolegend 103203 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD2, Clone ID: RM2-5 Biolegend 100103 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD3, Clone ID: 17A2 Biolegend 100243 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3 Biolegend 100603 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7 Biolegend 100703 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5 Biolegend 108403 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119 Biolegend 116203 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rotenone Sigma-Aldrich R8875 3rd drug injection during mitochondrial stress test
Seahorse XFe96 extracellular flux analyzer Seahorse Biosciences now Agilent For ECAR and OCR measurments in real time.
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 Used to make Cell-adhesive solution for microplate coating
Sodium chloride (NaCl) Fisher BP358 Component of RIPA lysis buffer
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750 Component of RIPA lysis buffer
Sodium Fluoride (NaF) Sigma-Aldrich S7920 Component of RIPA lysis buffer
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S8045 Prepared 1 N solution. Used for pH normalization
Streptavidin Nanobeads (MojoSort) Biolegend 480015 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Tris-HCl Fisher BP153 Component of RIPA lysis buffer
XF base medium Agilent 102353-100 base medium used to prepare glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media
XF prep station Seahorse Biosciences Used for non-CO2 37 °C incubations
XFe96 extracellular FluxPak Agilent 102416-100 or 102601-100 Includes assay cartridges with utility plates, loading guide flats for loading
drugs onto the assay cartridge, XF calibrant solution, and XF cell culture microplate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rieger, M. A., Schroeder, T. Hematopoiesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008250 (2012).
  2. Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial role in stemness and differentiation of hematopoietic stem cells. Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).
  3. Snoeck, H. W. Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).
  4. Bujko, K., Kucia, M., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 49-77 (2019).
  5. Ito, K., Suda, T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).
  6. Norddahl, G. L., et al. Accumulating mitochondrial DNA mutations drive premature hematopoietic aging phenotypes distinct from physiological stem cell aging. Cell Stem Cell. 8 (5), 499-510 (2011).
  7. de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-independent methods reveal elevated mitochondrial mass in hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
  8. Kim, M., Cooper, D. D., Hayes, S. F., Spangrude, G. J. Rhodamine-123 staining in hematopoietic stem cells of young mice indicates mitochondrial activation rather than dye efflux. Blood. 91 (11), 4106-4117 (1998).
  9. Filippi, M. D., Ghaffari, S. Mitochondria in the maintenance of hematopoietic stem cells: new perspectives and opportunities. Blood. 133 (18), 1943-1952 (2019).
  10. Inoue, S., et al. Mitochondrial respiration defects modulate differentiation but not proliferation of hematopoietic stem and progenitor cells. FEBS Letters. 584 (15), 3402-3409 (2010).
  11. Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
  12. Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders - A step towards mitochondria based therapeutic strategies. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1863 (5), 1066-1077 (2017).
  13. Fontenay, M., Cathelin, S., Amiot, M., Gyan, E., Solary, E. Mitochondria in hematopoiesis and hematological diseases. Oncogene. 25 (34), 4757-4767 (2006).
  14. Nadanaciva, S., et al. Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).
  15. Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511 (2010).
  16. Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).
  17. Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics, Fourth Edition. Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. , Academic Press. Ch. 9 255-302 (2013).
  18. Aft, R. L., Zhang, F. W., Gius, D. Evaluation of 2-deoxy-D-glucose as a chemotherapeutic agent: mechanism of cell death. British Journal of Cancer. 87 (7), 805-812 (2002).
  19. Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54918 (2016).
  20. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  21. Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).

Tags

Biologi utgave 175 hematopoietiske stamceller hematopoietiske stamceller glykolyse mitokondrie respirasjon oksidativ fosforylering ekstracellulær forsuringshastighet oksygenforbruk ekstracellulær flux ikke-tilhengerceller
Vurdering av cellulær bioenergi i mus hematopoietisk stamme og primitive stamceller ved hjelp av extracellulær flux analysator
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kumar, S., Jones, M., Li, Q.,… More

Kumar, S., Jones, M., Li, Q., Lombard, D. B. Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer. J. Vis. Exp. (175), e63045, doi:10.3791/63045 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter