Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

تقييم غير مدمر لكثافة الخلايا الإقليمية داخل مجاميع الورم بعد العلاج بالعقاقير

Published: June 21, 2022 doi: 10.3791/64030
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Rensselaer Polytechnic Institute, 2Albany Medical College

Summary

يطور البروتوكول الحالي تقنية قائمة على الصور لقياس كثافة الخلايا الإقليمية السريعة وغير المدمرة والخالية من الملصقات وقابلية البقاء داخل مجاميع الأورام 3D. كشفت النتائج عن تدرج كثافة الخلايا، مع كثافات خلايا أعلى في المناطق الأساسية من الطبقات الخارجية في المجاميع النامية وموت الخلايا الطرفية في الغالب في مجاميع HER2+ المعالجة باستخدام Trastuzumab.

Abstract

أظهرت نماذج الورم الكروي متعدد الخلايا (MCTSs) فائدة متزايدة للدراسة في المختبر لتطور السرطان واكتشاف الأدوية. هذه التركيبات اللاوعائية البسيطة نسبيا تحاكي الجوانب الرئيسية للأورام في الجسم الحي ، مثل بنية 3D والتدرجات الفسيولوجية المرضية. يمكن أن توفر نماذج MCTSs رؤى ثاقبة حول سلوك الخلايا السرطانية أثناء التطور الكروي واستجابة للعقاقير. ومع ذلك ، فإن حجمها المطلوب يحد بشكل كبير من الأدوات المستخدمة في التقييم غير المدمر. يتم استكشاف التصوير الهيكلي للتصوير المقطعي بالتماسك البصري وبرنامج تحليل Imaris 3D لقياس سريع وغير مدمر وخالي من الملصقات لكثافة الخلايا الإقليمية داخل MCTSs. يستخدم هذا النهج لتقييم MCTSs على مدى فترة نضج مدتها 4 أيام وطوال فترة علاج ممتدة لمدة 5 أيام باستخدام Trastuzumab ، وهو دواء مضاد ل HER2 ذي صلة سريريا. باختصار ، تم إنشاء AU565 HER2 + سرطان الثدي MCTSs عن طريق تراكب السائل مع أو بدون إضافة Matrigel (مصفوفة غشاء قبوي) لاستكشاف مجاميع من مورفولوجيات مختلفة (أكثر سمكا ، مثل القرص 2.5D المجاميع أو المجاميع 2D مسطحة ، على التوالي). تميزت كثافة الخلايا داخل المنطقة الخارجية والمنطقة الانتقالية والنواة الداخلية في MCTSs الناضجة ، مما كشف عن تدرج كثافة الخلايا مع كثافات خلوية أعلى في المناطق الأساسية مقارنة بالطبقات الخارجية. أعادت إضافة المصفوفة توزيع كثافة الخلايا وعززت هذا التدرج ، مما قلل من كثافة المنطقة الخارجية وزاد من ضغط الخلايا في النوى. تم قياس كثافة الخلايا كميا بعد العلاج من تعاطي المخدرات (0 ساعة ، 24 ساعة ، 5 أيام) داخل مناطق أعمق تدريجيا 100 ميكرومتر لتقييم الاختلافات الإقليمية المحتملة في الاستجابة للعقاقير. وبحلول النقطة الزمنية الأخيرة، بدا أن جميع وفيات الخلايا تقريبا مقيدة ب 200 ميكرومتر من كل مجموعة، في حين بدت الخلايا الأعمق في المجموع غير متأثرة إلى حد كبير، مما يوضح الاختلافات الإقليمية في الاستجابة للدواء، ربما بسبب القيود المفروضة على تغلغل المخدرات. يوفر البروتوكول الحالي تقنية فريدة من نوعها لتحديد كثافة الخلايا الإقليمية داخل الأنسجة الخلوية الكثيفة بشكل غير مدمر وقياسها طوليا.

Introduction

تحول الباحثون إلى حد كبير إلى ثقافة 3D على مقاعد البدلاء في الأنظمة المختبرية لدراسة بعض السمات الرئيسية لتطور الورم. وقد قاد الكثير من هذا البحث من خلال عودة ظهور الأورام الكروية متعددة الخلايا (MCTSs) والمواد العضوية الأكثر تعقيدا 1,2. على الرغم من أن هذه النماذج هي الأوعية الدموية ، إلا أنها توفر أداة قوية لتلخيص العمليات الفسيولوجية والمرضية التي تحدث في الجسم الحي3،4،5. على وجه الخصوص ، يمكن للنماذج متوسطة الحجم (قطرها 300-500 ميكرومتر) محاكاة ميزات الورم الرئيسية مثل بنية 3D ، والتدرجات الفسيولوجية المرضية ، والإشارات النقيلية بسبب نقص الأكسجة داخل القلب. من الموثق جيدا أن هذه النماذج تعرض الطبقات متحدة المركز المميزة التي شوهدت في أورام الأوعية الدموية في الجسم الحي ، وهي طبقة خارجية من الخلايا التكاثرية ، وطبقة انتقالية من الخلايا الشائخة / الهادئة ، والخلايا التي تعاني من نقص الأكسجة في القلب3،6،7،8،9 . يمكن الحصول على رؤية فريدة من نوعها من هذه النماذج من خلال توصيف سلوك الخلايا داخل هذه الطبقات ، أثناء التطوير والاستجابة للدواء. ومع ذلك ، فإن حجم MCTS المطلوب ، الضروري لتطوير التدرجات التي تجعلها قوية في النماذج المختبرية ، يحد بشكل كبير من الأدوات المستخدمة في التقييم غير المدمر. والواقع أن أحد أكبر التحديات التي تواجه التحليل غير المدمر للمركبات المتوسطة الأجل يتمثل في تحديد التفاصيل على نطاق الخلايا. يتم استخدام المجهر الساطع المجال وتباين الطور بشكل روتيني لتقييم نمو وتطوير 3D MCTSs بشكل غير مدمر. ومع ذلك ، تقتصر هذه الطرائق على إسقاطات ثنائية الأبعاد ، تفتقر إلى القدرة على تصور الهيكل ثلاثي الأبعاد الحاسم لهذه النماذج10،11،12،13. عادة ما يتم جمع المعلومات حول السمية الخلوية وتكاثر الخلايا من خلال التصوير الفلوري (أي المجهر الضوئي ، المجهر البؤري) أو التلطيخ المناعي خارج الجسم الحي 14،15،16. في حين أن هذه الأساليب توفر معلومات قيمة وعالية الدقة عن بنية الأنسجة والكثافة الخلوية والوظيفة الخلوية ، فإنها غالبا ما تتطلب إعداد عينات مثل التطهير البصري أو التثبيت / التلطيخ أو التضمين الذي يمنع التحليلات الطولية.

التصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT) هو طريقة تصوير هيكلي غير مدمرة لديها القدرة على التغلب على بعض التحديات المذكورة أعلاه. إنه يتميز بدقة خلوية ومجال رؤية واسع بما فيه الكفاية (يصل إلى 10 مم × 10 مم) قادر على تصور المجاميع متعددة الخلايا بالكامل17،18،19. الأهم من ذلك ، نظرا للطبيعة المرئية للضوء المستخدم ، فإن هذه التقنية غير مدمرة تماما وخالية من الملصقات17. أيضا ، يمكن تصوير العينات في الموقع دون الحاجة إلى إعداد العينات ، بحيث يمكن أخذ العينات مباشرة من الحاضنة ، ومسحها ضوئيا بسرعة باستخدام OCT (مدة المسح ~ 5-10 دقائق) ، ثم إعادتها إلى الحاضنة ، مما يتيح التوصيف الطولي. ظهرت مؤخرا العديد من الدراسات التي تسعى إلى استخدام OCT لتحليل السلوك الكروي للورم. في واحدة من أكثر العروض إثارة ، استخدم هوانغ وآخرون OCT للكشف عن النوى الميتة بشكل غير مدمر داخل النماذج الكروية الكبيرة للورم ، مع ملاحظة أن مناطق الخلايا الحية والميتة تمتلك اختلافات ملحوظة في التوهين البصري ، والتي يمكن استخدامها لمراقبة الجدوى الخالية من الملصقات20. وبالمثل ، أجرى هاري وآخرون قياسات معامل الانكسار (RI) لسرطان القولون البشري (HCT116) الكروية التي تم تصويرها باستخدام OCT لدراسة وجود نقص الأكسجة داخل العينات21. لم تكن قياساتهم كافية للاستدلالات المباشرة ، على الرغم من أنهم لاحظوا انخفاض المثيل المحجوز في المواقع التي ترتبط بالموقع ، وإن لم يكن الحجم ، للنوى الميتة ، والتي تم تحديدها لاحقا عن طريق المجهر البؤري. استخدم عبد الصادق وآخرون OCT لتصور وقياس جدوى الأنسجة الإقليمية لنماذج أورام سرطان الثدي22. أبلغوا عن طريقتين قائمتين على OCT لتصور ديناميكيات الأنسجة وأظهروا علاقة معتدلة بين الاختلافات في هذه المقاييس والمناطق المحددة بالفحص المجهري للخلايا الحية / الميتة.

عملنا المنشور باستخدام OCT مبني على هذه الأدبيات السابقة لإنشاء نهج كمي وغير مدمر لقياس مورفولوجيا 3D وعدد الخلايا داخل نماذج سرطان الثدي MCTSs أثناء التطوير10,23. باستخدام برنامج تحليل الصور Imaris 3D لحساب عدد الكائنات بحجم الخلية (أي البقع) التي تم تصويرها ضمن عمليات مسح حجم OCT ، تم قياس عدد الخلايا بشكل غير مدمر في MCTSs التي كانت مشابهة إحصائيا لتلك التي تم تحديدها عبر مقياس الدم عند الانفصال الكلي. ومع ذلك ، نظرا للطبيعة الهيكلية ل OCT ، فإن أغشية الخلايا التي لا تزال موجودة بعد موت الخلايا عن طريق النخر قد تحسب خطأ على أنها خلايا حية. وعلاوة على ذلك، تم توسيع نطاق هذا التوصيف ليشمل بقاء الخلايا غير المدمرة داخل المجاميع الفردية الخاضعة لنظام دوائي مع نجاح واعد10. الأهم من ذلك ، لوحظ أنه تم الإبلاغ عن صلاحية خلية مماثلة من نهجنا OCT-Imaris مع ما تم قياسه داخل هذه العينات عند الانفصال. يتيح نهج الخلايا غير المدمر والخالي من الملصقات حساب الخلايا داخل هياكل 3D والمجاميع الكثيفة طوليا دون التضحية ببنية البناء / الركام.

يشير هذا العمل إلى نهج محسن لتحديد كثافة الخلايا الإقليمية مباشرة داخل المجاميع الكثيفة من خلال الاستفادة من قدرة OCT-Imaris على قياس كل من مورفولوجيا المجموع 3D وعدد الخلايا. يوفر هذا التقدم المنهجي صورة أكثر تفصيلا للتوزيع المكاني للخلايا وانتشارها داخل الطبقات متحدة المركز المميزة لنماذج MCTSs. بدلا من مجرد حساب المتوسط الكلي لكثافة الخلايا الكلية ، يمكن أن تكشف قياسات الكثافة المحلية هذه عن تدرجات كثافة الخلية ، مثل تلك المرتبطة بالضغط. ويطبق هذا التقييم الإقليمي أيضا على المجاميع المعالجة بالعلاج الكيميائي لتقييم الاستجابة الإقليمية للأدوية، كما تقاس بالتغيرات في كثافة الخلايا المحلية. يوفر هذا المزيج من OCT وطرق تحليل التصوير المتقدمة تقديرا كميا لصلاحية الخلايا الإقليمية ، والتي يمكن استخدامها لاستكشاف تغلغل الدواء بناء على المناطق التي تشهد انخفاضا في كثافة الخلايا. هذا هو التقرير الأول الذي يحدد بشكل غير مدمر كثافة الخلايا الإقليمية وقابليتها للحياة استجابة للدواء داخل الأنسجة الخلوية الكثيفة وقياسه طوليا. مثل هذا التوصيف لكثافة الخلايا ثلاثية الأبعاد والتوزيع المكاني في جميع أنحاء MCTSs بأكملها قد يساعد في تحسين توصيل الأدوية في علاج السرطان وتحسين فهم تطور نموذج السرطان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم استخدام خطوط خلايا سرطان الثدي AU565 (HER2+) و MDA-MB-231 لهذه الدراسة (انظر جدول المواد).

1. إعداد مجاميع الورم

  1. تحضير وسائط نمو خلايا سرطان الثدي AU565 (HER2+) باستخدام معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 وسط قاعدي (+) في L-glutamine مكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (v / v) و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين (انظر جدول المواد).
  2. تحضير وسائط نمو خلايا سرطان الثدي الثلاثية السلبية MDA-MB-231 باستخدام وسيط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM) المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (v / v) (FBS) ، و 100 U / مل من البنسلين / الستربتومايسين ، و 2 mM من L-glutamine (انظر جدول المواد).
  3. قم بإعداد 70٪ -90٪ من مزارع الخلايا المتقاربة من كلا الخطين الخلويين (~ 3-4 أيام من التحضير) في الظروف القياسية (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، 95٪ رطوبة نسبية). افصل الطبقات الأحادية للخلايا عن قوارير ثقافتها باتباع طريقة التربسين القياسية.
    ملاحظة: منع التعرض المفرط للخلايا للتريبسين ، مما يؤثر على قدرتها على البقاء.
    1. بالنسبة لخلايا AU565 ، قم بشفط وسائط الخلايا من القارورة باستخدام ماصة (أو ، إذا كان ذلك متاحا ، باستخدام مضخة تفريغ متصلة عبر أنابيب بطرف ماصة زجاجي معقم) واستبدلها ب 2 مل من Trypsin-EDTA. اترك القارورة لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ثم انتقل إلى الحاضنة لمدة 4 دقائق إضافية. بعد ذلك ، أضف 6 مل من وسائط النمو إلى القارورة لتحييد التربسين.
    2. بالنسبة لخلايا MDA-MB-231، قم بشفط وسائط الخلايا من القارورة بنفس الطريقة التي تم تنفيذها في الخطوة 1.3.1 واستبدلها ب 1.5 مل من Trypsin-EDTA. بعد 7 دقائق من الحضانة ، أضف 8.5 مل من وسائط النمو إلى القارورة لتحييد التربسين.
  4. أضف 10 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى مقياس الدم لتحديد عدد الخلايا في التعليق24. أعد تعليق الخلايا في الوسائط بالتركيز المطلوب من 2.5 × 105 خلايا / مل.
  5. قم بتوزيع 50 ميكرولتر من تعليق الخلايا في كل بئر من لوحة مستديرة القاع ، غير ملتصقة ، 96 بئرا. بالنسبة للمعلقات المعدة بدون Matrigel (مصفوفة الغشاء السفلي ، انظر جدول المواد) ، أضف 50 ميكرولتر من وسائط النمو العادي إلى كل بئر.
    1. بالنسبة للمعلقات المعدة باستخدام مصفوفة الغشاء السفلي ، قم بإزالة قارورة المصفوفة من تخزين -20 درجة مئوية وضعها في الثلاجة لتذوب بين عشية وضحاها. قم بإعداد حاوية تحتوي على وسائط نمو ووضعها في الثلاجة لمدة 10 دقائق حتى تبرد.
    2. باستخدام طرف ماصة مجمد ، أضف المصفوفة إلى الوسائط المبردة بحيث يكون التركيز النهائي لهذا المحلول 5٪. أضف 50 ميكرولتر من هذا الوسط إلى كل بئر ، بحيث يكون التركيز النهائي للمصفوفة في هذه الآبار 2.5٪ 3.
      ملاحظة: في العمل السابق ، تم تقييم مورفولوجيا الركام لهذه الخطوط الخلوية10,25 ، ووجد أن مجاميع MDA-MB-231 تشكل كرويات مع إضافة مصفوفة الغشاء ، في حين أن مزارع MDA-MB-231 بدون المصفوفة و AU565 +/- matrix كلها تشكل مجاميع على شكل قرص. تم استخدام كروية كمية من >0.8 على مقياس من 0 (مستوى) - 1.0 (كرة مثالية) لتحديد المجاميع الكروية بما فيه الكفاية وبالتالي من المتوقع أن يكون لها نسبة السطح إلى الحجم المطلوبة للسلوك الشبيه بالجسم الحي 26,27.
  6. قم بالطرد المركزي للألواح عند 123 × g لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مباشرة بعد البذر لضمان جمع حبيبات الخلايا في قاع كل بئر.
    ملاحظة: يجب أن تتم هذه الخطوة في أسرع وقت ممكن بعد البذر. لاحظ المؤلفون أن الكثير من الوقت بين هذه الخطوات يسمح للخلايا بالاستقرار عبر قيعان وجوانب كل بئر ، مما يثبط قدرتها على التجمع والتجميع في قاع البئر.
  7. احتضان الألواح لمدة 4 أيام ، وعند هذه النقطة تعتبر مجاميع الخلايا ناضجة.
    ملاحظة: تتطلب مجاميع AU565 المعدة باستخدام مصفوفة الغشاء السفلي فترة استزراع إضافية مدتها 5 أيام لدراسة الاستجابة للأدوية (إجمالي 9 أيام ، تغيير الوسائط في اليوم 4).

2. إدارة تراستوزوماب (TZM) إلى مجاميع الخلايا AU565

  1. قم بإعداد 500 ميكروغرام / مل من محلول TZM (انظر جدول المواد) في وسائط النمو AU565. في اليوم 4 ، أضف 10 ميكرولتر من هذا المحلول إلى كل بئر ، بحيث يكون التركيز النهائي داخل كل بئر 50 ميكروغرام / مل.
  2. تجمع الثقافة لمدة 5 أيام إضافية بعد إضافة TZM ويتم تقييمها في النقاط الزمنية الرئيسية.
    ملاحظة: بالنسبة لهذه الدراسة ، تم استخدام نقاط زمنية من 0 ساعة (مباشرة قبل التخدير) ، و 24 ساعة ، و 120 ساعة بعد الدواء لتحليل الدواء.

3. التصوير المقطعي بالتماسك البصري

ملاحظة: تم تصوير العينات الواردة هنا باستخدام التصوير المقطعي بالتماسك البصري (OCT) خلال كل يوم من أيام النضج (1-4) ، ثم مرة أخرى في اليوم 5 (24 ساعة بعد إضافة الدواء) واليوم 9 (120 ساعة بعد إضافة الدواء) لمجاميع مخدرة مختارة. تم استخدام نظام تجاري للتصوير المقطعي بالتماسك البصري في مجال الطيف (SDOCT ، انظر جدول المواد) لتصوير OCT للدراسة الحالية. على الرغم من أن هذا النهج قابل لأي نظام OCT تقريبا ، وأن الإجراء المتبع سيكون مشابها بشكل عام بين الأنظمة المختلفة ، إلا أن بعض الخطوات التفصيلية التالية خاصة بالمعدات الحالية.

  1. استخدام نظام OCT للتصوير الهيكلي. اضبط معدل المسح الضوئي A على 5.5 كيلو هرتز لجمع الصور عالية الدقة. اضبط مؤشر الانكسار على 1.33 للعينات في وسط سائل. اضبط حجم voxel على 1.10 × 1.10 × 2.58 ميكرومتر3.
  2. في نافذة معلمات الصورة على الجانب الأيسر من الشاشة، قم بتعيين مجال الرؤية (FOV) عن طريق إدخال قيم X وY وZ (بالملليمتر) بحيث يتم تضمين العينة داخل هذه المنطقة محل الاهتمام.
    ملاحظة: تم تعيين FOV لهذه الدراسات عادة إلى 1.5 × 1.5 × 0.5 مم3. تأكد من أن العينة تتناسب مع هذه المنطقة عن طريق تناوب إدخال "الزاوية" بين 0 و 90 درجة وإجراء تأكيد بصري.
  3. انقر فوق وضع الاستحواذ 3D ، ثم انقر فوق سجل لجمع فحص وحدة التخزين 3D للعينة.

4. تحليل الصور

  1. قم بتصدير ملف OCT إلى تنسيق البرنامج (Imaris، انظر جدول المواد).
    1. افتح الملف OCT في مجموعة أدوات تطوير البرامج. انقر فوق تصدير ، واضبط نوع الملف على .jpg ، وقم بتصدير الصور إلى مجلد فارغ.
    2. افتح برنامج معالجة الصور (FIJI، انظر جدول المواد) واستورد تسلسل الصور من المجلد حيث يتم تخزين ملفات JPEG المصدرة. استخدم برنامجا لربط تسلسل الصورة معا، ثم احفظ هذا الملف كصورة TIFF.
  2. إنشاء إعادة بناء وحدة التخزين باتباع الخطوات أدناه.
    1. افتح Imaris وانتقل إلى ملف TIFF المحول داخل Arena. انتقل إلى تحرير خصائص الصورة > وأدخل حجم voxel (بالميكرومتر) من صورة OCT في مربعات XYZ المقابلة. ثم انقر فوق موافق.
      ملاحظة: داخل شجرة كائن العينة على الجانب الأيسر من الشاشة، قم بإلغاء تحديد علامة التبويب مستوى الصوت لمنع تأخر البرامج.
    2. انقر فوق إضافة أسطح جديدة فوق شجرة الكائنات. في القائمة أسفل الشجرة ، انقر فوق تخطي الإنشاء التلقائي وقم بالتحرير يدويا. ضمن نافذة ضبط العرض ، حرك السهمين الأحمر والأسود يدويا لتحسين التباين بين العينة والخلفية وتحسين تصور العينة.
    3. اضبط "موضع الشريحة" على الشريحة الموجودة على حافة واحدة من العينة، أي حيث تظهر إشارة العينة لأول مرة. استخدم مفتاح الهروب لتغيير الماوس من وضع التنقل إلى وضع التحديد ، ثم انقر فوق رسم. تتبع المخطط التفصيلي للمنطقة التي تعرض الإشارة يدويا.
    4. تقدم موضع الشريحة عن طريق إدخال الموضع التالي في مربع الإدخال. يجب أن يكون هذا الموضع التالي ≤100 شريحة في العينة أكثر من الموضع السابق. تتبع المنطقة التي تعرض الإشارة يدويا.
    5. كرر الخطوة 4.2.4 عبر سمك العينة حتى يتم الوصول إلى الحافة المقابلة للعينة. ثم انقر فوق إنشاء سطح في القائمة اليسرى لخياطة هذه الشرائح معا وإكمال إعادة بناء وحدة التخزين.
    6. انقر فوق تحرير، ثم انقر فوق تحديد القناع. يؤدي ذلك إلى إنشاء قناة جديدة في نافذة ضبط العرض تحتوي على العينة المعزولة فقط. يمكن الآن العثور على الخصائص المورفولوجية للعينة في علامة التبويب "إحصاءات > تفصيلية ".
      ملاحظة: تم اتباع هذا النهج لتحديد كرويات وأحجام تم الإبلاغ عنها في هذه الدراسة الحالية.
  3. احصل على الكثافة الخلوية الكلية للعينة باتباع الخطوات أدناه.
    1. أعلى شجرة الكائن، حدد إضافة بقع جديدة. في القائمة إعدادات الخوارزمية، قم بإلغاء تحديد جميع المربعات. انقر على السهم الأزرق للانتقال إلى شاشة القناة المصدر.
      1. من القائمة المنسدلة التي تظهر، حدد القناة المقنعة التي تم إنشاؤها في الخطوة 5.2.8، والتي تسمى عادة القناة 2. أدخل متوسط قطر الخلية للعينة في مربع قطر XY. تأكد من التحقق من طرح الخلفية .
        ملاحظة: بالنسبة لهذا العمل مع خلايا AU565 وMDA-MB-231، تم تعيين القطر إلى 10 ميكرومتر. يعتمد هذا التحديد على حجم الخلية (موضح في قسم المناقشة).
    2. انقر فوق السهم الأزرق للانتقال إلى شاشة تصنيف المواقع . في الرسم البياني في أسفل القائمة، انقر واسحب الحافة اليسرى للعتبة الصفراء إلى الحافة اليسرى للرسم البياني، بحيث يتم تضمين جميع الكائنات في العتبة الصفراء المظللة. ثم انقر فوق السهم الأخضر لإكمال إنشاء البقعة.
    3. احصل على عدد الكائنات المحددة (أي عدد خلايا العينة) بالنقر فوق إحصائيات > إجمالي > إجمالي عدد النقاط.
    4. لتحديد متوسط كثافة الخلايا المجمعة، اقسم عدد خلايا التجميع (مقاسا في الخطوة 4.3.3) على الحجم الكلي (المحدد في الخطوة 4.2.6).
  4. تقييم الكثافة الإقليمية في الطبقات متحدة المركز من الركام الكروي (الشكل 1 ألف).
    1. بعد التحليل المورفولوجي وكثافة الخلايا ، قم بتقييم الكثافة الإقليمية. انقر فوق السطح الذي تم إنشاؤه في الخطوة 4.2.5 وانتقل إلى علامة التبويب نمط/جودة الأسطح . قم بتغيير التحديد إلى نقطة الوسط وقم بتغيير عرض البكسل إلى ≤20 للحصول على أفضل رؤية. انتقل إلى الإحصائيات > موضع > التفصيلي وسجل موقع المركز المركزي.
    2. حدد إضافة إطار مرجعي جديد من القائمة الموجودة أعلى شجرة الكائن. حدد المربعين مرئي وإصلاح بجوار XY في القائمة. انقر واسحب مركز أيقونة الإطار المرجعي بحيث يكون متماشيا مع البقعة المركزية. قم بإلغاء تحديد مربعي XY Visible و Fix وحددهما ل XZ.
      1. مرة أخرى ، انقر واسحب مركز رمز الإطار المرجعي بحيث يتماشى مع البقعة المركزية. أخيرا ، كرر هذا لمستوى YZ ، بالتناوب بين هذه المستويات الثلاثة الثابتة حتى يتوافق الإطار المرجعي تماما مع البقعة المركزية. انقر نقرا مزدوجا فوق الإطار المرجعي في شجرة الكائن وأعد تسميته في الوسط أو ما شابه ذلك.
    3. انقر فوق النقاط التي تم إنشاؤها في الخطوة 4.3 وانتقل إلى الإحصائيات > الإطار المرجعي التفصيلي > الموضع. انقر فوق الموضع X الإطار المرجعي حتى يتم فرزه من أعلى إلى أدنى قيمة. سجل أعلى قيمة - يشير هذا إلى أبعد حافة للعينة ، أي نصف قطر العينة.
      ملاحظة: نظرا لأن العينات المستخدمة هنا دائرية في المستوى XY ، يمكن إجراء الحسابات على طول المحور X أو Y مع نتائج مماثلة. بالنسبة للعينات التي لا تظهر تناظر X-Y (هندسات غير متماثلة ، إهليلجية ، غير منتظمة ، إلخ) ، يوصى بإجراء هذه التحليلات على طول محاور متعددة.
    4. انتقل إلى الإحصاءات. في الزاوية السفلية اليسرى من القائمة ، انقر فوق تصدير جميع الإحصاءات إلى ملف واحفظ البيانات في جدول بيانات.
    5. قم بإجراء عمليات حسابية يدوية لتحديد الطبقات متحدة المركز على طول المحور X.
      ملاحظة: بلغ قطر العينات المستخدمة في هذه الدراسة حوالي 500 ميكرومتر. وبالتالي ، هناك منطقتان خارجيتان متحدة المركز بسماكة 200 ميكرومتر ومنطقة مركزية داخلية بسماكة 100 ميكرومتر. يوصى بالحفاظ على مناطق بسماكة 200 ميكرومتر لأنه من المتوقع أن تتغير سلوكيات الانتشار على هذه المسافة 7,28,29,30. تمشيا مع هذا المنطق ، يوصى أيضا باستخدام مناطق أكثر مركزية للعينات الأكبر والعكس صحيح للعينات الأصغر.
    6. اضبط منطقة طبقة خارجية مقدارها 200 ميكرومتر بطرح 200 ميكرومتر من نصف القطر الخارجي الموجود في الخطوة 4.4.3. وبالتالي ، ستشمل المنطقة الخارجية بقع ذات مواضع X بيننصف قطر X و Xالخارجي ، الحافة الداخلية (الشكل 1A ، المنطقة البرتقالية).
    7. قم بتعيين منطقة انتقالية عن طريق طرح 200 ميكرومتر من Xالخارجي ، الحافة الداخلية. ستشمل المنطقة الانتقالية نقاطا ذات مواضع X بين X الخارجية ، الداخلية ، و Xالانتقالية ، الداخلية الحافة (الشكل 1A ، المنطقة الوردية).
    8. قم بتعيين منطقة أساسية مركزية تشمل البقع المتبقية بين مركز العينةوالحافة الانتقالية X الداخلية (الشكل 1A ، المنطقة الزرقاء).
    9. افتح ملف جدول البيانات المحفوظ الذي تم إنشاؤه في الخطوة 4.4.4. انتقل إلى علامة التبويب المسافة من الإطار المرجعي الأصلي.
    10. احسب عدد البقع في المنطقة الأساسية باستخدام الدالة" COUNTIF (العمود x، "< Xالانتقالي، الحافة الداخلية")، حيث العمودx هو عمود "المسافة من الإطار المرجعي الأصلي". القيمة الناتجة هي رقم الخلية في هذه المنطقة. اقسم هذه القيمة على حجم المنطقة للحصول على كثافة الخلية.
    11. بطريقة مماثلة ، احسب عدد الخلايا في المنطقة الانتقالية باستخدام "COUNTIF (العمود x ، "< Xالخارجي ، الحافة الداخلية") - COUNTIF (العمودx ، "> Xانتقالي ، داخلي الحافة").
    12. احسب عدد الخلايا في المنطقة الخارجية باستخدام "COUNTIF (العمودx، "> Xالانتقالي، الحافة الداخلية").
  5. تقييم كثافة الخلايا الإقليمية في العينات غير الكروية عبر "المقابس الإقليمية" (الشكل 1B).
    ملاحظة: بالنسبة للعينات غير الكروية التي لا تحتوي على طبقات متحدة المركز، تم تطوير طريقة "القابس الإقليمي" لأخذ عينات من كثافة الخلايا المحلية على أعماق شعاعية مختلفة في جميع أنحاء الركام.
    1. كرر الخطوات 4.4.1-4.4.3 لتعيين الإطار المرجعي المركزي (الشكل 1B، الدائرة الصفراء المركزية) والحصول على نصف قطر العينة الإجمالي.
    2. إجراء حسابات يدوية لتحديد موضع الإطارات المرجعية داخل المناطق الانتقالية والخارجية بحيث يمكن تقييم كثافة الخلايا في العينة في هذه المواقع.
      1. لحساب الموقع الخارجي، اطرح 50 ميكرومتر من قيمة نصف قطر العينة من الخطوة 4.5.1 واستخدم هذه القيمة كموضع X.
        ملاحظة: استخدم نفس قيم الموضع Y وZ المسجلة في الخطوة 4.5.1 لجميع المقابس داخل عينة معينة لقياس كثافة الخلايا على طول المحور X للعينة (الشكل 1B، الدائرة الصفراء في أقصى اليسار).
      2. فوق شجرة الكائن ، انقر فوق إضافة بقع جديدة وانقر فوق تخطي الإنشاء التلقائي ، تحرير يدويا. باستخدام المؤشر في وضع "التحديد" ، اضغط باستمرار على shift + انقر لوضع نقطة على الشاشة. في القائمة اليمنى، أدخل قيم موضع XYZ المحسوبة أعلاه. اضبط أقطار XY وZ على ≤20 للحصول على أفضل رؤية.
      3. كرر الخطوة 4.4.2 لإضافة إطار مرجعي في موقع التركيز هذا. أعد تسمية هذا الإطار المرجعي في شجرة الكائن الخارجية أو ما شابه ذلك.
      4. لحساب الموقع الانتقالي (نقطة الوسط)، أوجد متوسط قيمة موضعمركز X وقيم الموضعالخارجي X. استخدم هذه القيمة كموضع X للإطار المرجعي الانتقالي. كما هو موضح أعلاه، استخدم نفس قيم Y وZ المسجلة في الخطوة 4.5.1 لجميع المقابس داخل عينة معينة لقياس كثافة الخلايا على طول المحور X للعينة (الشكل 1B، الدائرة الصفراء الوسطى).
      5. كرر الخطوة 4.4.2 لوضع الإطار المرجعي الأوسط في هذا الموقع، مع إعادة تسميته "انتقالي" أو ما شابه ذلك بمجرد إنشائه.
    3. انقر على النقاط التي تم إنشاؤها في الخطوة 4.3 وانتقل إلى الإحصاءات. في الزاوية السفلية اليسرى من القائمة ، انقر فوق تصدير جميع الإحصاءات إلى ملف واحفظ البيانات في جدول بيانات.
    4. افتح جدول البيانات. انتقل إلى علامة التبويب المسافة من الإطار المرجعي الأصلي. تظهر مسافة كل كائن إلى الإطارات المرجعية في العمود A، ويظهر تجميع الإطارات المرجعية لكل كائن في العمود G. استخدم الدالة "MOD" لتعيين كل مسافة رقميا إلى إطارها المرجعي المقابل، حيث 0 هو الإطار المركزي، و 1 هو الانتقالي، و 2 هو الخارجي.
    5. قم بتصفية القيم في هذا العمود للعمل مع المسافات في كل إطار مرجعي. لكل إطار من الإطارات المرجعية، احسب عدد الكائنات داخل 50 ميكرومتر من الإطار باستخدام الدالة "COUNTIF (العمود x، "≤50")، حيث العمودx هو عمود "المسافة من الإطار المرجعي الأصلي" لكل مجموعة. تتوافق القيمة الناتجة مع عدد الخلايا في هذا القابس الإقليمي. اقسم هذه القيمة على حجم القابس 100 ميكرومتر للحصول على كثافة الخلية.
  6. قم بإجراء طريقة التوصيل الإقليمي المكرر مكانيا (الشكل 1C).
    ملاحظة: استخدم هذا النهج لتقييم جدوى الخلايا الإقليمية استجابة لتطبيق الدواء. يؤدي تضمين المزيد من الإطارات المرجعية إلى تحسين دقة كثافات الخلايا التي يمكن حسابها في جميع أنحاء سمك النموذج.
    1. كرر الخطوات 4.4.1-4.4.3 لتعيين الإطار المرجعي المركزي (الشكل 1C، الدائرة الصفراء المركزية) والحصول على نصف قطر العينة.
    2. قم بإجراء حسابات يدوية لتحديد مواقع إضافية ذات أهمية. للقيام بذلك، أضف 100 ميكرومتر إلى قيمةمركز X، ثم استخدم قيم Y و Z لنقطة المركز لتحديد الموقع الأول على طول محور المركز. أضف إطارا مرجعيا إلى هذا الموضع كما في الخطوة 4.4.2 (الشكل 1C، دائرة صفراء مجاورة للدائرة المركزية).
      ملاحظة: أضف ميكرومتر أقل في هذه الخطوة إذا كنت تبحث عن تتبع كثافة دقة أعلى.
    3. كرر الخطوات 4.6.2، مع إضافة 100 ميكرومتر (أو العدد المطلوب من ميكرومتر) إلى كل موقع X متسلسل لإنشاء محور من المقابس المتباعدة بالتساوي من خلال سمك العينة. ضع الإطار المرجعي الأخير على بعد ≤50 ميكرومتر من نصف القطر الخارجي للعينة (الشكل 1C، الدوائر الصفراء).
    4. كرر الخطوات 4.5.3-4.5.5 للحصول على عدد الخلايا داخل كل قابس قطره 100 ميكرومتر. اقسم هذه القيم على حجم كل قابس مقابل للحصول على كثافة الخلايا المحلية.
    5. كرر جميع الخطوات الواردة في هذا القسم للحصول على بيانات OCT التي تم جمعها في كل نقطة زمنية من تجربة الدواء. يجب أن تكشف مقارنة عدد الخلايا في كل موقع من خلال الدورة الزمنية للعلاج عن المكان الذي تتناقص فيه كثافة الخلايا (أي المناطق التي تعاني من موت الخلايا) ، وبالتالي مدى عمق اختراق الدواء (أي الطبقات التي تشهد انخفاضا في كثافة الخلايا مقابل تلك التي تحافظ على مستويات كثافة الخلايا أو تعرضها زيادة).

Figure 1
الشكل 1: رسم توضيحي تخطيطي . (أ) نهج الطبقة متحدة المركز (الأصداف) لتقييم كثافة الخلايا الإقليمية في المجاميع الكروية. (ب) تم تطوير طريقة القابس الإقليمية لتقييم كثافة الخلايا المحلية في المجاميع غير الكروية، حيث تستخدم المقابس الكروية الصغيرة (قطرها 100 ميكرومتر) (الموضحة باللون الأصفر) كمؤشرات كثافة في كل منطقة/سمك. (ج) تستخدم طريقة القابس الإقليمية المكررة مكانيا في دراسات تغلغل العقاقير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في منشور سابق ، تم إنشاء طريقة للقياس غير المدمر لكثافة الخلايا العالمية داخل المجاميع الخلوية باستخدامOCT 10. هنا ، يتم توسيع هذه التقنية لتقييم كثافة الخلايا الإقليمية لمجاميع الخلايا النامية. يوضح الشكل 1 مخططا لهذا الامتداد، حيث يمكن تقييم كثافة الخلايا في طبقات متحدة المركز من كروي أو أكثر محليا من خلال النظر بدلا من ذلك إلى المقابس الكروية الصغيرة (قطرها 100 ميكرومتر)، والتي يشار إليها بالدوائر الصفراء في الشكل 1B,C. تم تقييم الكرويات السرطانية MDA-MB-231 في البداية عن طريق تعيين نقطة مركز داخل المجموع وحساب عدد الكائنات / الخلايا في طبقات متحدة المركز متسلسلة من الكروية. وترد هذه النتائج في الشكل 2. كشف اختبار t للطالب عن كثافة خلايا أعلى بكثير في اللب الكروي مقارنة بالطبقات الانتقالية (p = 4.3e-4) والطبقات الخارجية (p = 4.0e-6). تشير هذه النتيجة إلى الضغط في القلب الكروي بعد 4 أيام.

Figure 2
الشكل 2: الاختلافات في الكثافة الإقليمية المحسوبة بنهج الطبقة متحدة المركز لمجاميع MDA-MB-231 الكروية. يوضح الشكل تدرج كثافة الخلايا الشعاعية مع الخلايا (n = 3) الأكثر كثافة في قلب الكلية ، وكثافة الخلايا المحلية تتناقص مع المسافة من النواة. يظهر متوسط إجمالي عدد الخلايا بخط أزرق. شريط المقياس للصورة الداخلية هو 100 ميكرومتر. البيانات المعروضة كمتوسط ± SD (*= p < 0.05, ***= p < 0.001). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ومع ذلك ، فإن أحد قيود تقنية الطبقة متحدة المركز هذه هو أنه لا يمكن استخدامها إلا على المجاميع الكروية. وهكذا ، تم تكييف نهج عد الخلايا لإنشاء طريقة التوصيل الإقليمي ، والتي تأخذ عينات من المناطق الصغيرة في مواقع متسلسلة من خلال المجموع ، أقرب إلى خزعة افتراضية. توفر هذه المقابس قياسات لكثافة الخلايا المحلية على أعماق محددة. تم التحقق من صحة هذه التقنية مقابل نهج الطبقة متحدة المركز من خلال إجراء تحليلات على نفس الكرويات MDA-MB-231 (الشكل 3). وأظهرت النتائج اتفاقا جيدا بين نهج القابس الإقليمي والطبقة متحدة المركز لهذه المجاميع الكروية. لم تكشف اختبارات t للطلاب عن وجود فروق إحصائية بين مناهج قياس الطبقات الخارجية والانتقالية (p = 0.243 و 0.484 على التوالي) وفرق طفيف ولكنه معنوي عند حساب الكثافات في النواة الكلية (p = 0.017).

Figure 3
الشكل 3: تقدم نهج المنطقة متحدة المركز والقابسات الإقليمية نتائج مماثلة لقياس كثافة الخلايا في مجاميع MDA-MB-231 الكروية (n = 3). البيانات المعروضة كمتوسط ± SD (* = p < 0.05). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ثم تم تطبيق هذه التقنية لتقييم كل من مجاميع الورم الكروية وغير الكروية في اليوم 4 من النضج (الشكل 4) ، مع ملاحظة اتجاه مماثل نحو الضغط الأساسي لجميع المورفولوجيات التي تم اختبارها ، بغض النظر عن نوع الخلية. كان هذا الاتجاه أكثر بروزا في العينات المحضرة باستخدام Matrigel (مصفوفة الغشاء السفلي) ، وهي مادة مضافة معروفة بتعزيز التجميع ولكن العوامل الخارجية وتركيبها غير موصوفة بشكل جيد31,32,33. ومن المثير للاهتمام أن إضافة المصفوفة لا يبدو أنها تؤثر على الحجم أو عدد الخلايا ، وبالتالي يبدو أن لها تأثيرا ضئيلا على انتشار الخلايا. بدلا من ذلك ، يبدو أن إضافة المصفوفة تعيد توزيع كثافة الخلايا ، مما يعزز الضغط الأساسي الكبير ويقلل من كثافة الخلايا في الطبقات الخارجية. تشير هذه النتائج أيضا إلى أن خلايا AU565 تبدو أقل حساسية لتأثيرات التجميع بوساطة المصفوفة من خلايا MDA-MB-231. توفر هذه النتائج نظرة ثاقبة قيمة على الآليات الفيزيائية التي تمكن المصفوفة من خلالها من تجميع الخلايا في خطوط خلايا سرطان الثدي المختلفة. الأهم من ذلك ، يجب أن يناسب نهج القابس الإقليمي أي MCTSs تعرض هندسات مجمعة كروية أو غير كروية.

Figure 4
الشكل 4: تشجع إضافة المصفوفة على المزيد من التجميع وتعيد توزيع كثافة الخلايا في خطوط الخلايا السرطانية. بالنسبة لكل من خطوط الخلايا MDA-MB-231 (A,B) وAU565 (C,D)، تقلل إضافة المصفوفة من الكثافة في المنطقة الخارجية وتزيد من الضغط في المركز (n = 3) دون تغيير إجمالي عدد الخلايا بشكل ملحوظ. يظهر متوسط إجمالي عدد الخلايا بخطوط زرقاء. أشرطة المقياس الداخلية = 100 ميكرومتر. البيانات المعروضة كمتوسط ± SD (*= p < 0.05 ، **= p < 0.01 ، ***= p < 0.001 ). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بعد ذلك ، تم استخدام نهج القابس الإقليمي هذا لتتبع موت الخلايا في مجاميع الورم المعالجة ب TZM بشكل غير مدمر. تمت معالجة AU565 MCTSs المعدة باستخدام مصفوفة الغشاء باستخدام TZM في اليوم 4 من التطوير ، وتم زراعتها خلال اليوم 9 ، مع نقاط زمنية رئيسية لتصوير OCT في 0 ساعة (قبل الدواء) ، و 24 ساعة ، و 120 ساعة (5 أيام). تم تطبيق طريقة القابس الإقليمية المحددة مكانيا في كل نقطة زمنية ، مع تعيين المقابس كل 100 ميكرومتر في جميع أنحاء سمك كل مجموعة ، كما هو موضح في الدوائر الصفراء في الشكل 1C. تم تثبيت حجم القابس المركزي ثابتا بينما سمح للقابس الخارجي بالتقلب في القطر ، وهو ما يتوافق مع تغيير حجم الركام. وقد لوحظت تقلبات طفيفة في كثافة الخلايا بمرور الوقت داخل 500 ميكرومتر من كل مجموعة، مما يشير إلى الحد الأدنى من موت الخلايا (الشكل 5). في الواقع ، حدثت معظم وفيات الخلايا في الخارج 200 ميكرومتر من كل مجموع ، وخاصة في الخارج 100 ميكرومتر ، والتي اختفت تماما بحلول النقطة الزمنية 120 ساعة لجميع المجاميع التي تم تحليلها. إن تصور موت الخلايا كاستجابة دوائية إرشادية معظمها في الطبقات الخارجية من MCTSs يتسق مع قضايا اختراق الدواء في TZM ، وهو دواء أجسام مضادة ذي صلة سريريا بوزن جزيئي يبلغ 145 kDa34. في الواقع ، يعتمد الدواء على الانتشار السلبي من خلال هذه النماذج الخلوية الكثيفة ، والتي من المتوقع أن تتحدى قدرته على اختراق أعمق من 200 ميكرومتر في النماذج.

Figure 5
الشكل 5: صلاحية الخلية استجابة للدواء، تقاس في جميع أنحاء السماكة الكلية. تم الحفاظ على القابس في النواة الداخلية ثابتا عند قطر 100 ميكرومتر ، بينما سمح للقابس الموجود في المنطقة الخارجية بالتقلب مع تغيير حجم الركام. (أ) كشفت كثافة الخلايا الإقليمية استجابة لإضافة TZM أن موت الخلايا كان مقيدا إلى حد كبير ب 200 ميكرومتر خارجي، ولا سيما 100 ميكرومتر الخارجي، الذي اختفى تماما بعد 120 ساعة من العلاج. لاحظ سمك 500 ميكرومتر الداخلي للمجاميع تغيرا طفيفا في عدد الخلايا (n = 3). يتم عرض متوسط إجمالي عدد الخلايا مع خطوط ملونة مناظرة لكل نقطة زمنية. تظهر البيانات كمتوسط ± SD. (B) مخطط الخريطة الحرارية الذي يمثل التغير في متوسط كثافة الخلية استجابة للدواء كدالة للسمك الكلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

اهميه
الكرويات الورم متعدد الخلايا (MCTSs) هي نماذج قوية ثلاثية الأبعاد في المختبر لدراسة تطور الورم وفحص المخدرات1،2،3. يعتمد تطوير فائدة هذه النماذج الإجمالية البسيطة نسبيا بشكل كبير على توصيف سماتها الرئيسية ، مثل التشكل وكثافة الخلايا ، والتي من المعروف أنها تؤثر على كل من تطور نموذج الورم والاستجابة العلاجية. ومع ذلك، فإن حجمها المطلوب يطرح تحديات في تقييم هذه الخصائص، وخاصة بالنسبة للتحليلات غير المدمرة. توفر الطريقة المقدمة أداة جديدة للقياس الكمي الطولي والخالي من الملصقات لكثافة الخلايا وقابليتها للحياة داخل مناطق منفصلة من نماذج الركام 3D الكثيفة. يمكن إعادة تصوير نفس التجميع باستخدام التصوير المقطعي بالتماسك البصري (OCT) على مدار أيام تطوير متعددة. يمكن تحليل هذه الفحوصات الحجمية لتوصيف كيفية تطور كثافة الخلايا إقليميا أثناء نضوج MCTSs. تنطبق هذه المبادئ نفسها على تحليل المجاميع المخدرة ، والتي يمكن تصويرها طوليا طوال نظام دوائي معين لتحديد المكان الذي تتناقص فيه كثافة الخلايا ، أي المكان الذي قد يقتل فيه الدواء الخلايا بنشاط. ويتحسن هذا النهج تحسنا كبيرا مقارنة بالطرق السابقة للحصول على معلومات مماثلة على نطاق الخلية، الأمر الذي يتطلب تقليديا التثبيت و/أو التلطيخ و/أو التقسيم، مما يحول دون إجراء تحليلات طولية. في الواقع ، هذه الأداة لديها القدرة على تقليل عدد العينات اللازمة لدراسة معينة بشكل كبير حيث يمكن تحليل نفس العينات على التوالي. ومن المتوقع أيضا أن يؤدي ذلك إلى تقديم قيمة مضافة في كل نقطة زمنية حيث يمكن تتبع التطورات ضمن مجموع واحد أثناء استجابته لحافز معين، بدلا من الاعتماد على البيانات المترابطة من العينات الطرفية المتطابقة مع العمر. بالإضافة إلى تطبيق MCTS الموضح هنا ، يمكن لطريقة OCT-Imaris هذه دراسة المجاميع الخلوية الأخرى أو الأجسام الجنينية أو المواد العضوية الأكثر تعقيدا أو عينات الأنسجة التي يصل سمكها إلى بضعة ملليمترات. سيحسن هذا البروتوكول فهم ضغط الخلايا أثناء التطوير الكلي والاستجابة للأدوية ضمن نماذج مجمعة كثيفة.

التعديلات
تم تحسين البروتوكول المقدم لتحليل نماذج MDA-MB-231 و AU565 MCTSS. النماذج المصنوعة باستخدام خطوط الخلايا الأخرى قابلة للتطبيق. ومع ذلك ، قد تكون هناك حاجة إلى بعض تحسين البروتوكول بسبب التغيرات في متوسط حجم الخلية والتشكل الكلي. تم إجراء دراسة منفصلة تم فيها طلاء خلايا MDA-MB-231 و AU565 في 2D وحصلت على متوسط حجم الخلية عن طريق الفحص المجهري. تم استخدام هذا القطر كقطر XY داخل دالة "البقع" Imaris بحيث تم حساب الأجسام بهذا الحجم التقريبي. يؤدي تغيير هذه القيمة إلى تغيير عدد الكائنات الموجودة داخل العينة10، ومن المتوقع الحصول على نتائج أكثر دقة عندما يتطابق هذا الإدخال بشكل وثيق مع حجم الخلية. وبالتالي ، يجب إبلاغ قطر XY المناسب بمتوسط حجم الخلية لنوع الخلية المستخدمة.

الخطوات الحاسمة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
واحدة من الخطوات الحاسمة أثناء التصوير OCT هي اختيار دقة المسح الضوئي. يجب أن يكون حجم البكسل الذي يحدده المستخدم صغيرا بما فيه الكفاية بحيث تكون هناك حاجة إلى وحدات بكسل متعددة لتضمين متوسط حجم نوع الخلية المستخدمة. هذا يحسن دقة تحليل "البقع" داخل Imaris من خلال تحسين دقة OCT للخلايا وتقليل احتمال أن تؤثر ضوضاء البكسل العشوائية سلبا على عد الخلايا.

يؤثر عزل العينة داخل الإطار المرجعي ل Imaris بشكل كبير على قيم المخرجات لكثافة الخلايا. أثناء تنفيذ المستخدم لهذه الخطوة ، يكون مصحوبا بمستوى من الذاتية والتحيز يجب تطبيقه باستمرار عبر جميع تحليلات العينات. عند عزل العينة داخل فحص الحجم لبدء تحليل Imaris ، يجب توخي الحذر لتتبع الخطوط العريضة المجمعة بدقة وتجنب إدراج القطع الأثرية (أي الانعكاسات من الركائز أو ارتفاع الوسائط).

يعد الموضع السليم للإطارات المرجعية أثناء تحليل القابس الإقليمي خطوة حاسمة أخرى. وكما هو مذكور في المقدمة، فإن المناطق الحرجة الثلاث التي يتعين تحليلها أثناء تطوير النموذج هي المنطقة الخارجية التكاثرية، والمنطقة الانتقالية التي تتكون من خلايا مسنة/هادئة، ونواة نقص الأكسجين. ومن المتوقع أن يؤدي وضع الإطارات المرجعية داخل مركز كل طبقة إلى إجراء أدق تقدير لكثافة الخلايا داخل تلك المنطقة. ويكتسي وضع الإطار المرجعي هذا أهمية أكبر بالنسبة للتحليلات الإقليمية التفصيلية للقابس المستخدمة هنا في دراسة العقاقير، حيث يجب إنشاء مناطق متباعدة بالتساوي لتحليل الاستجابة للعقاقير بدقة أكبر.

القيود والبحوث المستقبلية
القيد الرئيسي للطريقة المقترحة هو تتبع شريحة تلو الأخرى القائم على المستخدم الذي يتم إجراؤه داخل Imaris لعزل التجميع داخل فحص حجم OCT. وهذه خطوة حاسمة للحصول على نتائج دقيقة، وهي خطوة ذاتية إلى حد ما، وبالتالي من المتوقع أن تضفي مستوى معينا من التباين بين المستخدمين. لمعالجة هذا الأمر، نسعى حاليا إلى دمج خوارزمية للكشف عن الحواف يتم إجراؤها داخل Matlab (أو ما شابه ذلك) قبل تحميل الفحص إلى Imaris. يجب أن تحدد هذه الخوارزمية بشكل موضوعي حواف العينة في شرائح المسح B التدريجية ، وبعد ذلك يمكن إجراء التحليلات المقترحة على منطقة العينة المعزولة مسبقا هذه. ستؤدي معالجة هذا القيد إلى إزالة التباين المستند إلى المستخدم ومن المتوقع أن يؤدي إلى إمكانية تطبيق أوسع لهذه الأداة المستندة إلى OCT.

تعتمد قدرة OCT على تصوير الخلايا الحية بدقة داخل المجاميع أثناء العلاج من تعاطي المخدرات على طريقة موت الخلايا التي يعمل عليها الدواء. كشف العمل السابق عن عدم دقة كمية في عدد الخلايا الحية المبلغ عنها من OCT / Imaris استجابة ل Doxorubicin ، وهو دواء معروف مضاد للسرطان يقتل الخلايا عن طريق النخر وموت الخلايا المبرمج10. يفترض أن هذا يرجع إلى أغشية الخلايا المتبقية أثناء النخر ، والتي من المتوقع أن تظهر كخلايا حية أثناء التصوير الهيكلي. من المعروف أن TZM يقتل الخلايا في المقام الأول عن طريق موت الخلايا المبرمج35. وبالتالي ، عندما تموت الخلايا ، يجب أن تتحلل إلى قطع صغيرة بما يكفي لعدم تتبعها / عدها بواسطة OCT. على الرغم من الحاجة إلى مزيد من اختبارات التحقق من الصحة باستخدام دواء استماتة ، إلا أن تجاربنا التجريبية المبكرة تظهر اتفاقا ممتازا بين OCT / Imaris على عدد الخلايا المنفصل في MCTSs المخدرة مع TZM (بيانات غير منشورة). وبالتالي ، من المتوقع أن تكون نتائج الخلايا الحية المعروضة هنا أكثر دقة من الأدوية المسببة للنخر. ويجب أن يؤخذ هذا التمييز في الاعتبار عند تطبيق هذا النهج لاختبار الجدوى في المجاميع المخدرة.

من المتوقع أن تؤدي الأبحاث المستقبلية في التقييم غير المدمر لمجاميع الأورام إلى تحسين فهم كيفية تطورها واستجابتها لكل من المحفزات الخارجية والعلاج بالعقاقير. ومن شأن تطوير أدوات تحليلية، مثل الأداة المعروضة هنا، أن يوسع نطاق فائدة النموذج وأن يحسن دقة النتائج، ولا سيما في إطار التطبيقات المؤثرة مثل فحص الأدوية وتقييم التسليم/الفعالية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذه الدراسة من قبل NIH R01 BRG CA207725 (MB / DTC) و NIH R01 CA233188 (MB). نود أن نشكر صيدلية AMC على Trastuzumab المقدمة لهذه التجارب.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well plates Greiner Bio-One  650970 CellStar Cell-Repellent Surface, https://shop.gbo.com/en/usa/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-repellent-surface/
0.25% trypsin, 2.21 mM EDTA Corning 25-053-CI
AU565 breast cancer cells ATCC
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Corning 10-013-CV
Fetal Bovine Serum ATCC 30-2020
FIJI software open-source (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/
Hemocytometer Fisher Scientific 0267151B
Imaris image analysis software Bitplane Current version 9.8
L-glutamine Lonza 17-605E
Matrigel Corning 354263
MDA-MB-231 breast cancer cells ATCC
Microscope Zeiss Z1 AxioVision
Penicilin streptomycin Corning 30-0002CI
Plate centrifuge Eppendorf
RPMI medium 1640 Gibco 11875-085
Spectral Domain Optical Coherence Tomography ThorLabs TEL220C1
T75 cell culture flasks Greiner Bio-One  658175
Trastuzumab Remnant clinical samples of Trastuzumab were used in this study, generously gifted by the Albany Medical College Pharmacy. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutherland, R., JA, M., Inch, W. Growth of multicell spheroids in tissue culture as a model of nodular carcinomas. Journal of the National Cancer Institute. 46 (1), 113-120 (1971).
  2. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  3. Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional. Analytical Biochemistry. 437 (1), 17-19 (2013).
  4. Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model. Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).
  5. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
  6. Jiang, Y., Pjesivac-Grbovic, J., Cantrell, C., Freyer, J. P. A multiscale model for avascular tumor growth. Biophysical Journal. 89 (6), 3884-3894 (2005).
  7. Freyei, J. P., Sutherland, R. M. Regulation of growth saturation and development of necrosisin EMT6/R0 multicellular spheroids by the glucose and oxygen supply. Cancer Research. 46 (7), 3504-3512 (1986).
  8. Desoize, B., Jardillier, J. C. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance. Critical Reviews in Oncology Hematology. 36 (2-3), 193-207 (2000).
  9. Mellor, H. R., Ferguson, D. J. P., Callaghan, R. A model of quiescent tumour microregions for evaluating multicellular resistance to chemotherapeutic drugs. British Journal of Cancer. 93 (3), 302-309 (2005).
  10. Roberge, C. L., et al. Non-destructive tumor aggregate morphology and viability quantification at cellular resolution, during development and in response to drug. Acta Biomaterialia. 117, 322-334 (2020).
  11. Piccinini, F., Tesei, A., Bevilacqua, A. Single-image based methods used for non-invasive volume estimation of cancer spheroids a practical assessing approach based on entry-level equipment. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 135, 51-60 (2016).
  12. Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).
  13. Song, Y., et al. Patient-derived multicellular tumor spheroids towards optimized treatment for patients with hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 1-13 (2018).
  14. LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 7 (9), 819-830 (2012).
  15. Hakanson, M., Textor, M., Charnley, M. Engineered 3D environments to elucidate the effect of environmental parameters on drug response in cancer. Integrative Biology. 3 (1), 31-38 (2011).
  16. Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
  17. Huang, D., et al. Optical coherence tomography HHS public access. Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).
  18. Zhong, H. Q., et al. Enhancement of permeability of glycerol with ultrasound in human normal and cancer breast tissues in vitro using optical coherence tomography. Laser Physics Letters. 7 (5), 388-395 (2010).
  19. Fujimoto, J., Swanson, E. The development, commercialization, and impact of optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), (2016).
  20. Huang, Y., et al. Optical coherence tomography detects necrotic regions and volumetrically quantifies multicellular tumor spheroids. Cancer Research. 77 (21), 6011-6020 (2017).
  21. Hari, N., Patel, P., Ross, J., Hicks, K., Vanholsbeeck, F. Optical coherence tomography complements confocal microscopy for investigation of multicellular tumour spheroids. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
  22. El-Sadek, I. A., et al. Three-dimensional dynamics optical coherence tomography for tumor spheroid evaluation. Biomedical Optics Express. 12 (11), 6844 (2021).
  23. Kingsley, D. M., et al. Laser-based 3D bioprinting for spatial and size control of tumor spheroids and embryoid bodies. Acta Biomateralia. 95, 357-370 (2019).
  24. Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
  25. Roberge, C. L., Rudkouskaya, A., Barroso, M., Corr, D. T. Longitudinal, label-free assessment of cell density and viability in multicellular tumor spheroids via optical coherence tomography. Summer Biomechanics, Bioengineering, and Biotransport Conference. , (2020).
  26. Bellotti, C., Duchi, S., Bevilacqua, A., Lucarelli, E., Piccinini, F. Long term morphological characterization of mesenchymal stromal cells 3D spheroids built with a rapid method based on entry-level equipment. Cytotechnology. 68 (6), 2479-2490 (2016).
  27. Noto, A., et al. Stearoyl-CoA desaturase-1 is a key factor for lung cancer-initiating cells. Cell Death & Disease. 4 (12), 947 (2013).
  28. Riffle, S., Hegde, R. S. Modeling tumor cell adaptations to hypoxia in multicellular tumor spheroids. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 36, 102 (2017).
  29. Wilson, W. R., Hay, M. P. Targeting hypoxia in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11, 393-410 (2011).
  30. Grimes, D. R., Kelly, C., Bloch, K., Partridge, M. A method for estimating the oxygen consumption rate in multicellular tumour spheroids. Journal of the Royal Society Interface. 11 (92), 20131124 (2014).
  31. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  32. Pozzi, S., et al. Meet me halfway: Are in vitro 3D cancer models on the way to replace in vivo models for nanomedicine development. Advanced Drug Delivery Reviews. 175, 113760 (2021).
  33. Nguyen, E. H., Daly, W. T., Belair, D. G., Le, N. N., Murphy, W. L. High throughput screening format identifies synthetic mimics of matrigel for tubulogenesis screening. , Available from: https://abstracts.biomaterials.org/data/papers/2015/abstracts/547.pdf (2015).
  34. Duchnowska, R., Szczylik, C. Central nervous system metastases in breast cancer patients administered trastuzumab. Cancer Treatment Reviews. 31 (4), 312-318 (2005).
  35. Zazo, S., et al. Generation, characterization, and maintenance of trastuzumab-resistant HER2+ breast cancer cell lines. American Journal of Cancer Research. 6 (11), 2661-2678 (2016).

Tags

أبحاث السرطان، العدد 184،
تقييم غير مدمر لكثافة الخلايا الإقليمية داخل مجاميع الورم بعد العلاج بالعقاقير
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Roberge, C. L., Wang, L., Barroso,… More

Roberge, C. L., Wang, L., Barroso, M., Corr, D. T. Non-Destructive Evaluation of Regional Cell Density Within Tumor Aggregates Following Drug Treatment. J. Vis. Exp. (184), e64030, doi:10.3791/64030 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter