Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Icke-destruktiv utvärdering av regional celltäthet inom tumöraggregat efter läkemedelsbehandling

Published: June 21, 2022 doi: 10.3791/64030
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Rensselaer Polytechnic Institute, 2Albany Medical College

Summary

Det nuvarande protokollet utvecklar en bildbaserad teknik för snabb, icke-destruktiv och etikettfri regional celldensitets- och viabilitetsmätning inom 3D-tumöraggregat. Resultaten avslöjade en celldensitetsgradient, med högre celltäthet i kärnregioner än yttre lager vid utveckling av aggregat och övervägande perifer celldöd i HER2 + -aggregat behandlade med Trastuzumab.

Abstract

Multicellulära tumörsfäroidmodeller (MCTS) har visat ökande användbarhet för in vitro-studier av cancerprogression och läkemedelsupptäckt. Dessa relativt enkla avaskulära konstruktioner efterliknar viktiga aspekter av in vivo-tumörer , såsom 3D-struktur och patofysiologiska gradienter. MCTS-modeller kan ge insikter om cancercellsbeteende under sfäroidutveckling och som svar på läkemedel; deras erforderliga storlek begränsar dock drastiskt de verktyg som används för icke-destruktiv bedömning. Optisk koherenstomografi strukturell avbildning och Imaris 3D-analysprogramvara utforskas för snabb, icke-destruktiv och etikettfri mätning av regional celltäthet inom MCTS. Detta tillvägagångssätt används för att bedöma MCTS under en 4-dagars mognadsperiod och under en förlängd 5-dagars behandling med Trastuzumab, ett kliniskt relevant anti-HER2-läkemedel. Kortfattat skapades AU565 HER2 + bröstcancer MCTS via flytande överlägg med eller utan tillsats av Matrigel (en källarmembranmatris) för att utforska aggregat av olika morfologier (tjockare, skivliknande 2.5D-aggregat respektive platta 2D-aggregat). Celldensitet inom den yttre regionen, övergångsregionen och den inre kärnan karakteriserades i mogna MCTS, vilket avslöjade en celldensitetsgradient med högre celltäthet i kärnregioner jämfört med yttre lager. Matrisadditionen omfördelade celltätheten och förbättrade denna gradient, vilket minskade den yttre zondensiteten och ökade cellkomprimeringen i kärnorna. Celltäthet kvantifierades efter läkemedelsbehandling (0 timmar, 24 timmar, 5 dagar) inom gradvis djupare 100 μm zoner för att bedöma potentiella regionala skillnader i läkemedelssvar. Vid den sista tidpunkten verkade nästan all celldöd vara begränsad till de yttre 200 μm av varje aggregat, medan celler djupare i aggregatet verkade i stort sett opåverkade, vilket illustrerar regionala skillnader i läkemedelssvaret, möjligen på grund av begränsningar i läkemedelspenetration. Det nuvarande protokollet ger en unik teknik för att icke-destruktivt kvantifiera regional celltäthet i täta cellulära vävnader och mäta den i längdriktningen.

Introduction

Forskare har till stor del vänt sig till bänkskiva 3D-odling in vitro-system för att studera några av de viktigaste funktionerna i tumörprogression. Mycket av denna forskning har letts av återuppkomsten av flercelliga tumörsfäroider (MCTS) och mer komplexa organoider 1,2. Även om dessa modeller är avaskulära, ger de ett kraftfullt verktyg för att rekapitulera fysiologiska och patologiska processer som uppträder in vivo 3,4,5. I synnerhet kan medelstora modeller (300-500 μm diameter) efterlikna viktiga tumörfunktioner såsom 3D-struktur, patofysiologiska gradienter och metastatisk signalering på grund av hypoxi i kärnan. Det är väl dokumenterat att dessa modeller visar de karakteristiska koncentriska skikten som ses i vaskulära in vivo-tumörer, nämligen ett yttre lager av proliferativa celler, ett övergångsskikt av senescenta / vilande celler och celler som upplever hypoxi i kärnan 3,6,7,8,9 . Unik insikt kan erhållas från dessa modeller genom att karakterisera cellbeteende inom dessa lager, under utveckling och som svar på läkemedlet. Den nödvändiga MCTS-storleken, som är nödvändig för att utveckla gradienterna som gör dem till så kraftfulla in vitro-modeller, begränsar dock drastiskt de verktyg som används för icke-destruktiv bedömning. Faktum är att en av de största utmaningarna med icke-destruktiv analys av MTCS är att kvantifiera detaljer i cellskala. Ljusfälts- och faskontrastmikroskopi används rutinmässigt för att bedöma 3D MCTS tillväxt och utveckling icke-destruktivt. Dessa modaliteter är dock begränsade till 2D-projektioner och saknar kapacitet att visualisera den avgörande 3D-strukturen för dessa modeller 10,11,12,13. Information om cytotoxicitet och cellproliferation samlas vanligtvis in genom fluorescerande avbildning (dvs. ljusplåtmikroskopi, konfokalmikroskopi) eller ex vivo immunohistologisk färgning 14,15,16. Även om dessa metoder ger värdefull, högupplöst information om vävnadsstruktur, celltäthet och cellulär funktion, kräver de ofta provberedning såsom optisk rensning, fixering / färgning eller inbäddning som förhindrar longitudinella analyser.

Optical Coherence Tomography (OCT) är en icke-destruktiv strukturell bildmodalitet som har potential att övervinna några av de utmaningar som nämns ovan. Den har mobilupplösning och ett tillräckligt brett synfält (upp till 10 mm x 10 mm) som kan visualisera hela flercelliga aggregat 17,18,19. Viktigt, på grund av den synliga karaktären hos det använda ljuset, är denna teknik helt icke-destruktiv och etikettfri17. Prover kan också avbildas på plats utan att kräva provberedning, så att prover kan tas direkt från inkubatorn, snabbt skannas med OCT (skanningstid ~ 5-10 min) och sedan återföras till inkubatorn, vilket möjliggör longitudinell karakterisering. Många studier som försöker använda OCT för att analysera tumörsfäroidbeteende har nyligen dykt upp. använde OCT för att icke-destruktivt detektera nekrotiska kärnor inom stora tumörsfäroidmodeller och noterade att levande och döda cellregioner har märkbara skillnader i optisk dämpning, som kan användas för etikettfri viabilitetsövervakning20. genomförde brytningsindexmätningar (RI) av human tjocktarmscancer (HCT116) sfäroider avbildade med OCT för att studera förekomsten av hypoxi i proverna21. Deras mätningar var inte tillräckliga för direkta slutsatser, även om de observerade lägre RI på platser som korrelerade med platsen, men inte storleken, av nekrotiska kärnor, som senare identifierades via konfokalmikroskopi. använde OCT för att visualisera och kvantifiera regional vävnadsviabilitet hos bröstcancertumörmodeller22. De rapporterade två OCT-baserade metoder för att visualisera vävnadsdynamik och visade en måttlig korrelation mellan skillnader i dessa mätvärden och mikroskopiidentifierade regioner av levande / döda celler.

Vårt publicerade arbete med OCT byggde på denna tidigare litteratur för att etablera ett kvantitativt, icke-destruktivt tillvägagångssätt för att mäta 3D-morfologin och cellantalet inom MCTSs bröstcancermodeller under utveckling10,23. Med hjälp av Imaris 3D-renderingsprogram för bildanalys för att räkna antalet cellstora objekt (dvs. fläckar) som avbildades i OCT-volymskanningarna mättes cellantalet icke-destruktivt i MCTS som statistiskt liknade de som bestämdes via hemocytometer vid aggregerad dissociation. På grund av OCT: s strukturella natur kan emellertid cellmembran som fortfarande finns efter celldöd genom nekros felaktigt räknas som levande celler. Dessutom utvidgades denna karakterisering till att icke-destruktivt spåra cellviabilitet inom enskilda aggregat som utsattes för en läkemedelsregim med lovande framgång10. Viktigt var att det noterades att liknande cellviabilitet rapporterades från vår OCT-Imaris-metod med vad som jämfördes i dessa prover vid dissociation. Denna icke-destruktiva och etikettfria cellmetod gör det möjligt att räkna celler inom 3D-konstruktioner och täta aggregat i längdriktningen utan att offra konstruktionen / aggregatstrukturen.

Det aktuella arbetet rapporterar ett förbättrat tillvägagångssätt för att direkt kvantifiera regional celltäthet inom täta aggregat genom att utnyttja OCT-Imaris förmåga att mäta både 3D-aggregatmorfologi och cellnummer. Detta metodologiska framsteg ger en mer detaljerad bild av cellernas rumsliga fördelning och spridning inom de karakteristiska koncentriska skikten i MCTS-modeller. I stället för att bara beräkna en total genomsnittlig aggregerad celltäthet kan sådana lokala densitetsmätningar avslöja celldensitetsgradienter, såsom de som är associerade med komprimering. Denna regionala bedömning tillämpas också på aggregat som behandlas med en kemoterapeutisk för att bedöma regionalt läkemedelssvar, mätt genom förändringar i lokal celltäthet. Denna kombination av OCT och avancerade avbildningsanalysmetoder ger kvantifiering av regional cellviabilitet, som kan användas för att utforska läkemedelspenetration baserat på vilka regioner som upplever minskningar i celltäthet. Detta är den första rapporten för att icke-destruktivt kvantifiera regional celltäthet och livskraft som svar på läkemedlet i täta cellulära vävnader och mäta det longitudinellt. Sådan karakterisering av tredimensionell celltäthet och rumslig fördelning genom hela MCTS kan bidra till att optimera läkemedelsleverans vid cancerbehandling och förbättra förståelsen för cancermodellprogression.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

AU565 (HER2+) och MDA-MB-231 bröstcancercellinjer användes för denna studie (se materialtabell).

1. Förbereda tumöraggregat

  1. Förbered AU565 (HER2+) bröstcancercelltillväxtmedier med Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 basalmedium (+) i L-glutamin kompletterat med 10% (v/v) fetalt bovint serum och 1% penicillin/streptomycin (se materialtabell).
  2. Förbered MDA-MB-231 trippelnegativa bröstcancercelltillväxtmedier med Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM) kompletterat med 10% (v/v) fetalt bovint serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin och 2 mM L-glutamin (se materialtabell).
  3. Förbered 70% -90% konfluenta cellkulturer av båda cellinjerna (~ 3-4 dagars beredning) under standardförhållanden (37 ° C, 5% CO2, 95% relativ fuktighet). Lossa cellmonolager från sina odlingskolvar enligt standard trypsiniseringsmetod.
    OBS: Förhindra överexponering av celler för trypsinet, vilket påverkar deras livskraft.
    1. För AU565-celler, aspirera cellmedia från kolven med hjälp av en pipett (eller, om tillgängligt, med en vakuumpump ansluten via slangar till en autoklaverad glaspipettspets) och ersätt med 2 ml trypsin-EDTA. Lämna kolven i 3 min vid rumstemperatur och flytta sedan till inkubatorn i ytterligare 4 minuter. Tillsätt sedan 6 ml tillväxtmedia till kolven för att neutralisera trypsinet.
    2. För MDA-MB-231-celler, aspirera cellmedia från kolven på samma sätt som utfördes i steg 1.3.1 och ersätt med 1,5 ml trypsin-EDTA. Efter 7 minuters inkubation tillsätt 8,5 ml tillväxtmedia till kolven för att neutralisera trypsinet.
  4. Tillsätt 10 μL av cellsuspensionen till en hemocytometer för att bestämma antalet celler i suspensionen24. Återsuspendera celler i media vid önskad koncentration av 2,5 × 105 celler/ml.
  5. Fördela 50 μl cellsuspension i varje brunn på en rund bottenplatta med icke-vidhäftande platta med 96 brunnar. För suspensioner framställda utan Matrigel (källarmembranmatris, se materialtabell), tillsätt 50 μL vanligt tillväxtmedium till varje brunn.
    1. För suspensioner som beretts med källarmembranmatrisen, ta bort matrisflaskan från -20 °C förvaring och placera den i kylen för att tina över natten. Förbered en behållare med tillväxtmedia och kyl i 10 minuter för att kyla.
    2. Använd en frusen pipettspets och tillsätt matrisen till kylda medier så att den slutliga koncentrationen av denna lösning är 5%. Tillsätt 50 μL av detta medium till varje brunn, så att den slutliga koncentrationen av matris i dessa brunnar är 2, 5% 3.
      OBS: I tidigare arbete bedömdes aggregerad morfologi för dessa cellinjer10,25 och fann att MDA-MB-231-aggregat bildar sfäroider med tillsats av membranmatrisen, medan MDA-MB-231-kulturer utan matrisen och AU565 +/- matrisen alla bildar diskformade aggregat. Kvantifierad sfäricitet på >0,8 på en skala från 0 (plan) - 1,0 (perfekt sfär) användes för att identifiera tillräckligt sfäriska aggregat och förväntades därmed ha det nödvändiga förhållandet mellan yta och volym för in vivo-liknande beteende26,27.
  6. Centrifugera plattorna vid 123 x g i 10 min vid rumstemperatur omedelbart efter sådd för att säkerställa uppsamling av en cellpellets i botten av varje brunn.
    OBS: Detta steg måste ske så snabbt efter sådd som möjligt. Författarna observerade att för mycket tid mellan dessa steg gör att cellerna kan sätta sig över botten och sidorna av varje brunn, vilket hämmar deras förmåga att samla och aggregera i botten av brunnen.
  7. Inkubera plattorna i 4 dagar, vid vilken tidpunkt cellaggregaten anses vara mogna.
    OBS: AU565-aggregat framställda med källarmembranmatrisen kräver ytterligare 5-dagars odlingsperiod för läkemedelssvarsstudien (totalt 9 dagar, mediaförändring dag 4).

2. Administrering av Trastuzumab (TZM) till AU565 cellaggregat

  1. Bered 500 μg/ml TZM-lösning (se materialtabell) i AU565 tillväxtmedier. På dag 4, tillsätt 10 μL av denna lösning till varje brunn, så att den slutliga koncentrationen i varje brunn är 50 μg / ml.
  2. Kulturaggregat i ytterligare 5 dagar efter tillägg av TZM och bedöma vid viktiga tidpunkter.
    OBS: För den aktuella studien användes tidpunkter på 0 h (omedelbart före drogning), 24 h och 120 h efter läkemedlet för att analysera läkemedlet.

3. Optisk koherenstomografiavbildning

OBS: Prover häri avbildades med optisk koherenstomografi (OCT) under varje mognadsdag (1-4), och sedan igen på dag 5 (24 h efter läkemedelstillägg) och dag 9 (120 h efter läkemedelstillsats) för utvalda drogade aggregat. Ett kommersiellt Spektral-Domän optisk koherenstomografisystem (SDOCT, se materialtabell) för OCT-avbildning användes för den aktuella studien. Även om detta tillvägagångssätt är mottagligt för nästan alla OCT-system, och proceduren som följs kommer att vara i allmänhet liknande mellan olika system, är några av de detaljerade stegen som följer specifika för den nuvarande utrustningen.

  1. Använd ett OCT-system för strukturell avbildning. Ställ in A-skanningshastigheten på 5,5 kHz för högupplöst bildinsamling. Ställ in brytningsindexet till 1,33 för prover i ett flytande medium. Ställ in voxelstorleken på 1,10 x 1,10 x 2,58 μm3.
  2. I fönstret Bildparametrar till höger på skärmen ställer du in synfältet (FOV) genom att mata in X-, Y- och Z-värden (i mm) så att provet omfattas av detta intresseområde.
    OBS: Synfältet för dessa studier var vanligtvis inställt på 1,5 x 1,5 x 0,5 mm3. Se till att provet passar inom detta område genom att växla "Vinkel" -ingången mellan 0 och 90 grader och utföra visuell bekräftelse.
  3. Klicka på 3D-förvärvsläge och klicka sedan på Spela in för att samla in 3D-volymsökningen av provet.

4. Bildanalys

  1. Exportera OCT-filen till programvaruformatet (Imaris, se Materialtabell).
    1. Öppna OCT-filen i programvaruutvecklingspaketet. Klicka på Exportera, ställ in filtypen till .jpg och exportera bilderna till en tom mapp.
    2. Öppna bildbehandlingsprogrammet (FIJI, se Materialförteckning) och importera bildsekvensen från mappen där de exporterade JPEG-filerna lagras. Använd programvara för att sammanfoga bildsekvensen och spara sedan filen som en TIFF-bild.
  2. Skapa en volymrekonstruktion enligt stegen nedan.
    1. Öppna Imaris och navigera till den konverterade TIFF-filen i Arena. Gå till Redigera > Bildegenskaper och mata in voxelstorleken (i μm) från OCT-bilden i motsvarande XYZ-rutor. Klicka sedan på OK.
      I exempelobjektträdet till vänster på skärmen avmarkerar du fliken Volym för att förhindra programvarufördröjning.
    2. Klicka på Lägg till nya ytor ovanför objektträdet. I menyn under trädet klickar du på Hoppa över automatisk skapande och redigerar manuellt. I fönstret Visningsjustering skjuter du de röda och svarta pilarna manuellt för att förbättra kontrasten mellan provet och bakgrunden och förbättra provvisualiseringen.
    3. Justera segmentpositionen till segmentet vid ena kanten av provet, dvs. där provsignalen först visas. Använd escape-tangenten för att ändra musen från navigeringsläget till väljläget och klicka sedan på Rita. Spåra konturen för regionen som visar signalen manuellt.
    4. Flytta fram segmentpositionen genom att ange nästa position i inmatningsrutan. Denna nästa position måste vara ≤ 100 skivor längre in i provet än den föregående. Spåra regionen som visar signalen manuellt.
    5. Upprepa steg 4.2.4 genom provets tjocklek tills provets motsatta kant har uppnåtts. Klicka sedan på Skapa yta i den vänstra menyn för att sy ihop dessa skivor och slutföra volymrekonstruktionen.
    6. Klicka på Redigera och klicka sedan på Maskval. Detta skapar en ny kanal i fönstret Visningsjustering som endast innehåller det isolerade exemplet. Morfologiska egenskaper hos urvalet finns nu på fliken Statistik > Detaljerad .
      OBS: Detta tillvägagångssätt följdes för att bestämma de sfäriciteter och volymer som rapporterades inom denna aktuella studie.
  3. Hämta ett provs totala celltäthet enligt stegen nedan.
    1. Ovanför objektträdet väljer du Lägg till nya fläckar. I menyn Algoritminställningar avmarkerar du alla rutor. Klicka på den blå pilen för att gå till källkanalskärmen.
      1. I rullgardinsmenyn som visas väljer du den maskerade kanal som skapades i steg 5.2.8, vanligtvis med namnet Kanal 2. Mata in den genomsnittliga celldiametern för provet i rutan med XY-diameter. Se till att bakgrunds subtraktion är markerad.
        OBS: För detta arbete med AU565- och MDA-MB-231-celler var diametern inställd på 10 μm. Det här valet baseras på cellstorlek (förklaras i avsnittet Diskussion).
    2. Klicka på den blå pilen för att gå till skärmen Klassificera fläckar . I diagrammet längst ned på menyn klickar du på och drar den vänstra kanten av den gula tröskeln till diagrammets vänstra kant, så att alla objekt inkluderas i den gula skuggade tröskeln. Klicka sedan på den gröna pilen för att slutföra skapandet av platsen.
    3. Få antalet identifierade objekt (dvs. antal provceller) genom att klicka på Statistik > Övergripande > Totalt antal fläckar.
    4. För att bestämma den genomsnittliga aggregerade celltätheten, dividera aggregatets cellantal (mätt i steg 4.3.3) med aggregatvolymen (bestämd i steg 4.2.6).
  4. Bedöm den regionala densiteten i koncentriska lager av sfäriska aggregat (Figur 1A).
    1. Efter morfologisk och celldensitetsanalys, bedöma den regionala densiteten. Klicka på ytan som skapades i steg 4.2.5 och navigera till fliken Surfaces Style / Quality . Ändra markeringen till mittpunkt och ändra pixelbredden till ≤20 för bästa synlighet. Navigera till Statistik > Detaljerad > position och registrera platsen för mittplatsen.
    2. Välj Lägg till ny referensram på menyn ovanför objektträdet. Markera rutorna Synlig och Fix bredvid XY i menyn. Klicka och dra i mitten av referensramsikonen så att den är i linje med mittpunkten. Avmarkera rutorna Synlig XY och Åtgärda och markera dem för XZ.
      1. Återigen klickar du och drar mitten av referensramikonen så att den är i linje med mittpunkten. Slutligen, upprepa detta för YZ-planet, alternerande mellan dessa tre fasta plan tills referensramen är perfekt i linje med mittpunkten. Dubbelklicka på referensramen i objektträdet och byt namn på den till Center eller Liknande.
    3. Klicka på de platser som skapades i steg 4.3 och navigera till Statistik > Detaljerad > Position Referensram. Klicka på Position X-referensramen tills den sorterar från högsta till lägsta värde. Spela in det högsta värdet - detta indikerar provets längsta kant, dvs provradie.
      OBS: Eftersom proverna som används här är cirkulära i XY-planet kan beräkningar utföras längs X- eller Y-axeln med liknande resultat. För prover som inte uppvisar XY-symmetri (asymmetrisk, ellipsoid, oregelbundna geometrier etc.) rekommenderas att dessa analyser utförs längs flera axlar.
    4. Navigera till Statistik. I det nedre högra hörnet av menyn klickar du på Exportera all statistik till fil och sparar data i ett kalkylblad.
    5. Utför manuella beräkningar för att identifiera koncentriska lager längs X-axeln.
      OBS: Prover som användes i denna studie var cirka 500 μm i diameter; således finns det två yttre 200 μm tjocka koncentriska zoner och en inre 100 μm tjock centralzon. Det rekommenderas att behålla zoner som är 200 μm tjocka eftersom diffusionsbeteenden förväntas förändras över detta avstånd 7,28,29,30. I enlighet med detta resonemang rekommenderas det också att använda mer koncentriska zoner för större prover och vice versa för mindre prover.
    6. Ställ in ett yttre skiktområde på 200 μm genom att subtrahera 200 μm från den yttre radien som finns i steg 4.4.3. Således kommer det yttre området att omfatta fläckar med X-positioner mellanX-radie och Xyttre, inre kant (figur 1A, orange region).
    7. Ställ in ett övergångsområde genom att subtrahera 200 μm från Xyttre, inre kant. Övergångsområdet kommer att omfatta fläckar med X-positioner mellan Xyttre, inre kant och Xövergångs-, innerkant (figur 1A, rosa region).
    8. Ange en central kärnregion som omfattar de återstående fläckarna mellan provcentrum och Xövergångs-, innerkant (bild 1A, blå region).
    9. Öppna den sparade kalkylbladsfilen som skapades i steg 4.4.4. Navigera till fliken Avstånd från ursprungsreferensram.
    10. Beräkna antalet punkter i kärnområdet med hjälp av funktionen COUNTIF (Kolumnx, "< Xövergångs-, innerkant"), där Kolumnx är kolumnen "Avstånd från ursprungsreferensram". Det resulterande värdet är cellnumret i det här området. Dela detta värde med regionens volym för att erhålla celldensitet.
    11. På liknande sätt beräknar du antalet celler i övergångsområdet med 'COUNTIF (Kolumnx, "< Xyttre,innerkant") - COUNTIF(Kolumnx, "> Xövergångs-,innerkant").
    12. Beräkna antalet celler i det yttre området med hjälp av 'COUNTIF (Kolumnx,"> Xövergång,innerkant").
  5. Bedöm den regionala celltätheten i icke-sfäriska prover via "Regionala pluggar" (figur 1B).
    OBS: För icke-sfäriska prover som inte har koncentriska lager utvecklas metoden "Regional Plug" för att sampla lokal celltäthet på olika radiella djup i hela aggregatet.
    1. Upprepa stegen 4.4.1–4.4.3 för att ställa in den centrala referensramen (figur 1B, den centrala gula cirkeln) och få fram den totala provradien.
    2. Utföra manuella beräkningar för att identifiera placeringen av referensramar inom övergångsregionerna och yttre regioner så att celltätheten kan bedömas i provet på dessa platser.
      1. För att beräkna den yttre platsen, subtrahera 50 μm från provradievärdet från steg 4.5.1 och använd detta värde som X-position.
        OBS: Använd samma Y- och Z-positionsvärden som registrerades i steg 4.5.1 för alla pluggar inom ett givet prov för att mäta celltätheten längs provets X-axel (figur 1B, den gula cirkeln längst till vänster).
      2. Ovanför objektträdet klickar du på Lägg till nya platser och klickar på Hoppa över automatisk skapande, Redigera manuellt. Med pekaren i "välj" -läge håller du ned skift + klick för att placera en plats på skärmen. I den vänstra menyn anger du XYZ-positionsvärdena som beräknats ovan. Justera XY- och Z-diametrarna till ≤20 för bästa sikt.
      3. Upprepa steg 4.4.2 för att lägga till en referensram på den här platsen. Byt namn på den här referensramen i objektträdets yttre eller liknande.
      4. För att beräkna övergångsplatsen (mittpunkten), hitta medelvärdet avX-mittpositionsvärdet ochX-ytterpositionsvärdena . Använd det här värdet som X-position för övergångsreferensramen. Som ovan, använd samma Y- och Z-värden som registrerades i steg 4.5.1 för alla pluggar inom ett givet prov för att mäta celltätheten längs provets X-axel (figur 1B, mellersta gul cirkel).
      5. Upprepa steg 4.4.2 för att placera den mellersta referensramen på den här platsen och döpa om den till "övergångsram" eller liknande när den har skapats.
    3. Klicka på de platser som skapades i steg 4.3 och navigera till Statistik. I det nedre högra hörnet av menyn klickar du på Exportera all statistik till fil och sparar data i ett kalkylblad.
    4. Öppna kalkylbladet. Navigera till fliken Avstånd från ursprungsreferensram. Varje objekts avstånd till referensramarna visas i kolumn A och grupperingen av referensramar för varje objekt visas i kolumn G. Använd funktionen 'MOD' för att numeriskt tilldela varje avstånd till motsvarande referensram, där 0 är mittramen, 1 är övergångs- och 2 är den yttre.
    5. Filtrera värdena i den här kolumnen för att arbeta med avstånden i varje referensram. Beräkna antalet objekt inom 50 mikrometer från ramen för var och en av referensramarna med funktionen "COUNTIF (Kolumnx, "≤50"), där Kolumnx är kolumnen "Avstånd från ursprungsreferensram" för varje grupp. Det resulterande värdet motsvarar antalet celler i den regionala kontakten. Dela detta värde med volymen på 100-μm-kontakten för att få celldensitet.
  6. Utför metoden Spatially-Refined Regional Plug (bild 1C).
    OBS: Detta tillvägagångssätt användes för att bedöma regional cellviabilitet som svar på läkemedelsapplikation. Att inkludera fler referensramar förbättrar upplösningen av celldensiteter som kan beräknas i hela modelltjockleken.
    1. Upprepa steg 4.4.1–4.4.3 för att ställa in mittreferensramen (figur 1C, den centrala gula cirkeln) och få fram provradien.
    2. Utför manuella beräkningar för att bestämma ytterligare platser av intresse. Det gör du genom att lägga till 100 μm tillX-mittvärdet och sedan använda Y- och Z-värdena för mittpunkten för att definiera den första platsen längs mittaxeln. Lägg till en referensram till denna position som i steg 4.4.2 (figur 1C, gul cirkel intill mittcirkeln).
      OBS: Lägg till färre μm i detta steg om du söker spårning av högre upplösningstäthet.
    3. Upprepa steg 4.6.2 och tillsätt 100 μm (eller önskat antal μm) till varje sekventiell X-plats för att upprätta en axel med lika fördelade pluggar genom provets tjocklek. Placera den sista referensramen ≤50 μm från provets yttre radie (figur 1C, gula cirklar).
    4. Upprepa steg 4.5.3-4.5.5 för att få cellantal inom varje plugg med en diameter på 100 μm. Dela dessa värden med volymen på varje motsvarande kontakt för att få lokal celltäthet.
    5. Upprepa alla steg i detta avsnitt för OCT-data som samlats in vid varje tidpunkt för läkemedelsprövningen. Att jämföra cellantal på varje plats genom behandlingstidsförloppet bör avslöja var celltätheten minskar (dvs. regioner som upplever celldöd) och följaktligen hur djupt läkemedlet tränger in (dvs. vilka lager som ser en minskning av celltätheten jämfört med de som upprätthåller eller visar en ökning av celldensitetsnivåerna).

Figure 1
(A) Metoden med koncentriska skikt (skal) för att bedöma regional celltäthet i sfäriska aggregat. (B) Den regionala pluggmetoden utvecklades för att utvärdera lokal celltäthet i icke-sfäriska aggregat, där små (100 μm diameter) sfäriska pluggar (visas i gult) används som densitetsindikatorer vid varje zon / tjocklek. (C) Den rumsligt förfinade regionala pluggmetoden används för läkemedelspenetrationsstudier. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I en tidigare publikation etablerades en metod för icke-destruktiv mätning av global celltäthet inom cellulära aggregat med oct10. Häri utvidgas denna teknik för att bedöma den regionala celltätheten hos utvecklande cellaggregat. Figur 1 visar ett schema över denna förlängning, där celltätheten kan utvärderas i koncentriska lager av en sfäroid eller mer lokalt genom att istället titta på små (100 μm diameter) sfäriska pluggar, betecknade med de gula cirklarna i figur 1B, C. MDA-MB-231 tumörsfäroider bedömdes initialt genom att ställa in en mittpunkt i aggregatet och räkna antalet objekt / celler i sekventiella koncentriska lager av sfäroiden. Dessa resultat presenteras i figur 2. Elevens t-testning avslöjade signifikant högre celltäthet i sfäroidkärnan än i övergångskärnan (p = 4,3e-4) och yttre lager (p = 4,0e-6). Detta resultat indikerar komprimering i sfäroidkärnan efter 4 dagar.

Figure 2
Figur 2: Skillnader i regional densitet beräknad med koncentrisk skiktmetod för sfäriska MDA-MB-231-aggregat. Figuren illustrerar en radiell celldensitetsgradient med celler (n = 3) tätast packade i den aggregerade kärnan och den lokala celltätheten minskar med avståndet från kärnan. Det genomsnittliga totala antalet celler visas med en blå linje. Skalstrecket för infälld bild är 100 μm. Data som visas som medelvärde ± SD (*= p < 0,05, ***= p < 0,001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

En begränsning med denna koncentriska skiktteknik är dock att den endast kan användas på sfäriska aggregat. Således anpassades cellräkningsmetoden för att etablera en Regional Plug-metod, som samplar små zoner på sekventiella platser genom aggregatet, liknande en virtuell biopsi. Dessa pluggar ger mätningar av den lokala celltätheten på specifika djup. Denna teknik validerades mot den koncentriska skiktmetoden genom att utföra analyser på samma MDA-MB-231-sfäroider (figur 3). Resultaten visade god överensstämmelse mellan de regionala plugg- och koncentriska skiktmetoderna för dessa sfäriska aggregat. Elevens t-tester visade inga statistiska skillnader mellan metoderna för att mäta de yttre och övergångsskikten (p = 0,243 respektive 0,484) och en liten men signifikant skillnad vid beräkning av densiteterna vid den aggregerade kärnan (p = 0,017).

Figure 3
Figur 3: Koncentriska zon- och regionala pluggmetoder ger liknande resultat för kvantifiering av celltäthet i sfäriska MDA-MB-231-aggregat (n = 3). Data som visas som medelvärde ± SD (* = p < 0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Denna teknik tillämpades sedan för att bedöma både sfäriska och icke-sfäriska tumöraggregat på mognadsdag 4 (figur 4), och observerade en liknande trend mot kärnkomprimering för alla testade morfologier, oavsett celltyp. Denna trend var mest framträdande i de prover som framställts med Matrigel (källarmembranmatrisen), en tillsats som är känd för att främja aggregering men vars exogena faktorer och sammansättning är dåligt karakteriserade 31,32,33. Intressant nog verkar tillsatsen av matrisen inte påverka volymen eller cellantalet och verkar därmed ha försumbart inflytande på cellproliferation. Snarare verkar matrisadditionen omfördela celltätheten, vilket främjar signifikant kärnkomprimering och minskar celldensiteten i de yttre skikten. Dessa resultat indikerar också att AU565-celler verkar mindre känsliga för matrismedierade aggregeringseffekter än MDA-MB-231-celler. Dessa fynd ger värdefull inblick i de fysiska mekanismer genom vilka matrisen möjliggör aggregering av celler i olika bröstcancercellinjer. Viktigt är att den regionala pluggmetoden passar alla MCTS som visar sfäriska eller icke-sfäriska aggregatgeometrier.

Figure 4
Figur 4: Matrisaddition främjar mer aggregering och omfördelar celltäthet i cancercellinjer. För både MDA-MB-231 (A,B) och AU565 (C,D) cellinjer minskar matrisaddition densiteten i den yttre zonen och ökar komprimeringen i mitten (n = 3) utan att märkbart ändra det totala cellantalet. Genomsnittligt totalt antal celler visas med blå linjer. Infällda skalstänger = 100 μm. Data som visas som medelvärde ± SD (*= p < 0,05, **= p < 0,01, ***= p < 0,001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Därefter användes denna regionala pluggmetod för att spåra celldöd i TZM-behandlade tumöraggregat icke-destruktivt. AU565 MCTS framställda med membranmatrisen behandlades med TZM på dag 4 av utvecklingen och odlades till dag 9, med viktiga OCT-avbildningstidpunkter vid 0 h (pre-läkemedel), 24 h och 120 h (5 dagar). Den rumsligt definierade regionala pluggmetoden tillämpades vid varje tidpunkt, med pluggar inställda var 100 μm genom hela tjockleken på varje aggregat, vilket visas av de gula cirklarna i figur 1C. Storleken på mittpluggen hölls konstant medan den yttre pluggen tilläts fluktuera i diameter, vilket motsvarade ändrad aggregatstorlek. Mindre fluktuationer i celltäthet observerades över tid inom de inre 500 μm av varje aggregat, vilket indikerar minimal celldöd (figur 5). Faktum är att de flesta celldödsfall inträffade i de yttre 200 μm av varje aggregat, särskilt i de yttersta 100 μm, som försvann helt vid 120 h-tidpunkten för alla analyserade aggregat. Visualiseringen av celldöd som indikativt läkemedelssvar mestadels i de yttre skikten av MCTS överensstämmer med läkemedelspenetrationsproblem av TZM, ett kliniskt relevant antikroppsläkemedel med en molekylvikt på 145 kDa34. Faktum är att läkemedlet förlitar sig på passiv diffusion genom dessa täta cellulära modeller, vilket förväntas utmana dess förmåga att tränga djupare än 200 μm in i modellerna.

Figure 5
Figur 5: Cellviabilitet som svar på läkemedlet, mätt över hela aggregattjockleken. Pluggen vid den inre kärnan hölls konstant vid 100 μm diameter, medan den i den yttre zonen tilläts fluktuera med förändrad aggregatstorlek. (A) Regional celltäthet som svar på TZM-tillägg avslöjade att celldöden till stor del var begränsad till de yttre 200 μm, särskilt de yttre 100 μm, som försvann helt efter 120 timmars behandling. Aggregatens inre tjocklek på 500 μm observerade liten förändring i cellantalet (n = 3). Genomsnittligt totalt antal celler visas med motsvarande färgade linjer för varje tidpunkt. (B) Värmekartdiagram som representerar förändringen i den genomsnittliga celltätheten ± som svar på läkemedlet som en funktion av den aggregerade tjockleken. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Betydelse
Flercelliga tumörsfäroider (MCTS) är kraftfulla 3D-in vitro-modeller för att studera tumörprogression och läkemedelsscreening 1,2,3. Att främja nyttan av dessa relativt enkla aggregatmodeller är starkt beroende av karakteriseringen av deras nyckelfunktioner, såsom morfologi och celltäthet, som är kända för att påverka både tumörmodellprogression och terapeutiskt svar. Deras erforderliga storlek medför dock utmaningar vid utvärderingen av dessa egenskaper, särskilt för icke-destruktiva analyser. Den presenterade metoden ger ett nytt verktyg för longitudinell och etikettfri kvantifiering av celltäthet och viabilitet inom diskreta regioner av täta 3D-aggregatmodeller. Samma aggregat kan avbildas på nytt med Optical Coherence Tomography (OCT) under flera utvecklingsdagar. Dessa volymetriska skanningar kan analyseras för att karakterisera hur celltätheten utvecklas regionalt under MCTS-mognad. Samma principer gäller för analys av drogade aggregat, som kan avbildas i längdriktningen under en given läkemedelsregim för att bestämma var celltätheten minskar, dvs. var läkemedlet aktivt kan döda celler. Detta tillvägagångssätt förbättras avsevärt jämfört med tidigare metoder för att erhålla liknande cellskaleinformation, som traditionellt kräver fixering, färgning och /eller sektionering, vilket utesluter longitudinella analyser. Faktum är att detta verktyg har potential att dramatiskt minska antalet prover som behövs för en given studie eftersom samma prover kan analyseras i följd. Detta förväntas också ge mervärde vid varje tidpunkt eftersom utvecklingen kan spåras inom ett enda aggregat när den svarar på en given stimulans, snarare än att förlita sig på korrelerade data från åldersmatchade terminalprover. Utöver denna MCTS-applikation som demonstreras häri kan denna OCT-Imaris-metod studera andra cellulära aggregat, embryoidkroppar, mer komplexa organoider eller vävnadsprover upp till några millimeter tjocka. Detta protokoll kommer att förbättra förståelsen av cellkomprimering under aggregatutveckling och läkemedelssvar inom täta aggregatmodeller.

Ändringar
Det presenterade protokollet optimerades för analys av MDA-MB-231 och AU565 MCTSS-modeller. Modeller gjorda med andra cellinjer är tillämpliga; Viss protokolloptimering kan dock krävas på grund av förändringar i genomsnittlig cellstorlek och aggregerad morfologi. En separat studie utfördes där MDA-MB-231- och AU565-celler pläterades i 2D och erhöll en genomsnittlig cellstorlek via mikroskopi. Denna diameter användes som XY-diametern inom Imaris "spots" -funktion så att objekt av denna ungefärliga storlek räknades. Om du ändrar det här värdet ändras antalet objekt som finns i provet10, och mer exakta resultat förväntas när dessa indata nära matchar cellstorleken. Således måste en lämplig XY-diameter informeras av den genomsnittliga cellstorleken för den använda celltypen.

Kritiska steg och felsökning
Ett av de kritiska stegen under OCT-avbildning är valet av skanningsupplösning. Den pixelstorlek som användaren anger måste vara tillräckligt liten så att flera pixlar behövs för att utgöra medelstorleken för den celltyp som används. Detta förbättrar noggrannheten i "spots" -analysen inom Imaris genom att förbättra OCT: s upplösning av cellerna och minska möjligheten att stokastiskt pixelbrus kommer att påverka cellräkningen negativt.

Isolering av provet inom Imaris referensram påverkar i hög grad utgångsvärdena för celltäthet. När användaren utför detta steg åtföljs det av en nivå av subjektivitet och bias som måste tillämpas konsekvent i alla provanalyser. När du isolerar provet i volymskanningen för att påbörja Imaris-analysen måste du vara noga med att spåra aggregerade konturer exakt och undvika att artefakter inkluderas (dvs. reflektioner från substrat eller mediehöjd).

Korrekt placering av referensramar under regional plugganalys är ett annat kritiskt steg. Som anges i inledningen är de tre kritiska zonerna att analysera under modellutveckling den proliferativa yttre regionen, övergångsregionen bestående av senescenta / vilande celler och den hypoxiska kärnan. Placeringen av referensramar i mitten av varje lager förväntas ge den mest exakta uppskattningen av celltätheten inom det området. Denna referensramplacering är av ännu större betydelse för de detaljerade regionala plugganalyser som används här för läkemedelsstudien, eftersom jämnt fördelade zoner måste upprättas för att analysera läkemedelssvar mer exakt.

Begränsningar och framtida forskning
Huvudbegränsningen för den föreslagna metoden är den användarbaserade segment-för-skiva-spårningen som utförs inom Imaris för att isolera aggregatet i OCT-volymskanningen. Detta är ett kritiskt steg för exakta resultat, vilket är något subjektivt och därför förväntas ge en viss nivå av variabilitet mellan användare. För att ta itu med detta försöker vi för närvarande införliva en kantdetekteringsalgoritm som utförs inom Matlab (eller liknande) innan vi laddar upp skanningen till Imaris. Denna algoritm bör objektivt identifiera provkanter i progressiva B-skanningssegment, varefter de föreslagna analyserna kan utföras på denna förisolerade provregion. Att ta itu med denna begränsning kommer att ta bort användarbaserad variation och förväntas leda till bredare tillämplighet av detta OCT-baserade verktyg.

OCT: s förmåga att exakt avbilda levande celler i aggregat under läkemedelsbehandling är beroende av det sätt på vilket läkemedlet verkar. Det tidigare arbetet avslöjade kvantitativa felaktigheter i antalet levande celler som rapporterats från OCT / Imaris som svar på Doxorubicin, ett välkänt läkemedel mot cancer som dödar celler via nekros och apoptos10. Detta antas bero på de kvarvarande cellmembranen under nekros, som förväntas dyka upp som levande celler under strukturell avbildning. TZM är känt för att döda celler främst via apoptos35; Således, när celler dör, måste de brytas ner i bitar som är tillräckligt små för att inte spåras / räknas av OCT. Även om ytterligare valideringstester med ett apoptotiskt läkemedel behövs, visar våra tidiga pilotexperiment den utmärkta överenskommelsen mellan OCT / Imaris till dissocierade cellantal i MCTS drogade med TZM (opublicerade data). Därför förväntas de levande cellresultaten som presenteras här vara mer exakta än nekrosinducerande läkemedel. Denna distinktion måste hållas i åtanke när man tillämpar detta tillvägagångssätt för viabilitetstestning i drogade aggregat.

Framtida forskning inom icke-destruktiv utvärdering av tumöraggregat förväntas förbättra förståelsen för hur de utvecklas och svarar på både yttre stimuli och läkemedelsbehandling. Utveckling av analysverktyg, som det som presenteras här, bör utöka modellnyttan och förbättra resultatnoggrannheten, särskilt inom effektfulla applikationer som läkemedelsscreening och leverans/ effektbedömning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av NIH R01 BRG CA207725 (MB/DTC) och NIH R01 CA233188 (MB). Vi vill tacka AMC Pharmacy för Trastuzumab för dessa experiment.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well plates Greiner Bio-One  650970 CellStar Cell-Repellent Surface, https://shop.gbo.com/en/usa/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-repellent-surface/
0.25% trypsin, 2.21 mM EDTA Corning 25-053-CI
AU565 breast cancer cells ATCC
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Corning 10-013-CV
Fetal Bovine Serum ATCC 30-2020
FIJI software open-source (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/
Hemocytometer Fisher Scientific 0267151B
Imaris image analysis software Bitplane Current version 9.8
L-glutamine Lonza 17-605E
Matrigel Corning 354263
MDA-MB-231 breast cancer cells ATCC
Microscope Zeiss Z1 AxioVision
Penicilin streptomycin Corning 30-0002CI
Plate centrifuge Eppendorf
RPMI medium 1640 Gibco 11875-085
Spectral Domain Optical Coherence Tomography ThorLabs TEL220C1
T75 cell culture flasks Greiner Bio-One  658175
Trastuzumab Remnant clinical samples of Trastuzumab were used in this study, generously gifted by the Albany Medical College Pharmacy. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutherland, R., JA, M., Inch, W. Growth of multicell spheroids in tissue culture as a model of nodular carcinomas. Journal of the National Cancer Institute. 46 (1), 113-120 (1971).
  2. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  3. Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional. Analytical Biochemistry. 437 (1), 17-19 (2013).
  4. Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model. Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).
  5. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
  6. Jiang, Y., Pjesivac-Grbovic, J., Cantrell, C., Freyer, J. P. A multiscale model for avascular tumor growth. Biophysical Journal. 89 (6), 3884-3894 (2005).
  7. Freyei, J. P., Sutherland, R. M. Regulation of growth saturation and development of necrosisin EMT6/R0 multicellular spheroids by the glucose and oxygen supply. Cancer Research. 46 (7), 3504-3512 (1986).
  8. Desoize, B., Jardillier, J. C. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance. Critical Reviews in Oncology Hematology. 36 (2-3), 193-207 (2000).
  9. Mellor, H. R., Ferguson, D. J. P., Callaghan, R. A model of quiescent tumour microregions for evaluating multicellular resistance to chemotherapeutic drugs. British Journal of Cancer. 93 (3), 302-309 (2005).
  10. Roberge, C. L., et al. Non-destructive tumor aggregate morphology and viability quantification at cellular resolution, during development and in response to drug. Acta Biomaterialia. 117, 322-334 (2020).
  11. Piccinini, F., Tesei, A., Bevilacqua, A. Single-image based methods used for non-invasive volume estimation of cancer spheroids a practical assessing approach based on entry-level equipment. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 135, 51-60 (2016).
  12. Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).
  13. Song, Y., et al. Patient-derived multicellular tumor spheroids towards optimized treatment for patients with hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 1-13 (2018).
  14. LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 7 (9), 819-830 (2012).
  15. Hakanson, M., Textor, M., Charnley, M. Engineered 3D environments to elucidate the effect of environmental parameters on drug response in cancer. Integrative Biology. 3 (1), 31-38 (2011).
  16. Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
  17. Huang, D., et al. Optical coherence tomography HHS public access. Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).
  18. Zhong, H. Q., et al. Enhancement of permeability of glycerol with ultrasound in human normal and cancer breast tissues in vitro using optical coherence tomography. Laser Physics Letters. 7 (5), 388-395 (2010).
  19. Fujimoto, J., Swanson, E. The development, commercialization, and impact of optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), (2016).
  20. Huang, Y., et al. Optical coherence tomography detects necrotic regions and volumetrically quantifies multicellular tumor spheroids. Cancer Research. 77 (21), 6011-6020 (2017).
  21. Hari, N., Patel, P., Ross, J., Hicks, K., Vanholsbeeck, F. Optical coherence tomography complements confocal microscopy for investigation of multicellular tumour spheroids. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
  22. El-Sadek, I. A., et al. Three-dimensional dynamics optical coherence tomography for tumor spheroid evaluation. Biomedical Optics Express. 12 (11), 6844 (2021).
  23. Kingsley, D. M., et al. Laser-based 3D bioprinting for spatial and size control of tumor spheroids and embryoid bodies. Acta Biomateralia. 95, 357-370 (2019).
  24. Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
  25. Roberge, C. L., Rudkouskaya, A., Barroso, M., Corr, D. T. Longitudinal, label-free assessment of cell density and viability in multicellular tumor spheroids via optical coherence tomography. Summer Biomechanics, Bioengineering, and Biotransport Conference. , (2020).
  26. Bellotti, C., Duchi, S., Bevilacqua, A., Lucarelli, E., Piccinini, F. Long term morphological characterization of mesenchymal stromal cells 3D spheroids built with a rapid method based on entry-level equipment. Cytotechnology. 68 (6), 2479-2490 (2016).
  27. Noto, A., et al. Stearoyl-CoA desaturase-1 is a key factor for lung cancer-initiating cells. Cell Death & Disease. 4 (12), 947 (2013).
  28. Riffle, S., Hegde, R. S. Modeling tumor cell adaptations to hypoxia in multicellular tumor spheroids. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 36, 102 (2017).
  29. Wilson, W. R., Hay, M. P. Targeting hypoxia in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11, 393-410 (2011).
  30. Grimes, D. R., Kelly, C., Bloch, K., Partridge, M. A method for estimating the oxygen consumption rate in multicellular tumour spheroids. Journal of the Royal Society Interface. 11 (92), 20131124 (2014).
  31. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  32. Pozzi, S., et al. Meet me halfway: Are in vitro 3D cancer models on the way to replace in vivo models for nanomedicine development. Advanced Drug Delivery Reviews. 175, 113760 (2021).
  33. Nguyen, E. H., Daly, W. T., Belair, D. G., Le, N. N., Murphy, W. L. High throughput screening format identifies synthetic mimics of matrigel for tubulogenesis screening. , Available from: https://abstracts.biomaterials.org/data/papers/2015/abstracts/547.pdf (2015).
  34. Duchnowska, R., Szczylik, C. Central nervous system metastases in breast cancer patients administered trastuzumab. Cancer Treatment Reviews. 31 (4), 312-318 (2005).
  35. Zazo, S., et al. Generation, characterization, and maintenance of trastuzumab-resistant HER2+ breast cancer cell lines. American Journal of Cancer Research. 6 (11), 2661-2678 (2016).

Tags

Cancerforskning nummer 184
Icke-destruktiv utvärdering av regional celltäthet inom tumöraggregat efter läkemedelsbehandling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Roberge, C. L., Wang, L., Barroso,… More

Roberge, C. L., Wang, L., Barroso, M., Corr, D. T. Non-Destructive Evaluation of Regional Cell Density Within Tumor Aggregates Following Drug Treatment. J. Vis. Exp. (184), e64030, doi:10.3791/64030 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter