Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

ड्रग उपचार के बाद ट्यूमर समुच्चय के भीतर क्षेत्रीय सेल घनत्व का गैर-विनाशकारी मूल्यांकन

Published: June 21, 2022 doi: 10.3791/64030
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Rensselaer Polytechnic Institute, 2Albany Medical College

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल तेजी से, गैर विनाशकारी, और लेबल मुक्त क्षेत्रीय सेल घनत्व और 3 डी ट्यूमर समुच्चय के भीतर व्यवहार्यता माप के लिए एक छवि आधारित तकनीक विकसित करता है। निष्कर्षों से पता चला कि एक सेल-घनत्व ढाल, विकासशील समुच्चय में बाहरी परतों की तुलना में कोर क्षेत्रों में उच्च कोशिका घनत्व के साथ और मुख्य रूप से परिधीय कोशिका मृत्यु एचईआर 2 + समुच्चय में ट्रेस्टुजुमाब के साथ इलाज किया जाता है।

Abstract

बहुकोशिकीय ट्यूमर स्फेरॉइड (एमसीटीएस) मॉडल ने कैंसर की प्रगति और दवा की खोज के इन विट्रो अध्ययन के लिए बढ़ती उपयोगिता का प्रदर्शन किया है। ये अपेक्षाकृत सरल एवैस्कुलर निर्माण विवो ट्यूमर के प्रमुख पहलुओं की नकल करते हैं, जैसे कि 3 डी संरचना और पैथोफिजियोलॉजिकल ग्रेडिएंट। एमसीटीएस मॉडल गोलाकार विकास के दौरान और दवाओं के जवाब में कैंसर सेल व्यवहार में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं; हालाँकि, उनका अपेक्षित आकार गैर-विनाशकारी मूल्यांकन के लिए उपयोग किए जाने वाले उपकरणों को काफी सीमित करता है। एमसीटीएस के भीतर क्षेत्रीय सेल घनत्व के तेजी से, गैर-विनाशकारी और लेबल मुक्त माप के लिए ऑप्टिकल कोहेरेंस टोमोग्राफी संरचनात्मक इमेजिंग और इमारिस 3 डी विश्लेषण सॉफ्टवेयर का पता लगाया जाता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग 4-दिवसीय परिपक्वता अवधि में एमसीटीएस का आकलन करने के लिए किया जाता है और नैदानिक रूप से प्रासंगिक एंटी-एचईआर 2 दवा ट्रास्टुज़ुमाब के साथ विस्तारित 5-दिवसीय उपचार के दौरान किया जाता है। संक्षेप में, एयू 565 एचईआर 2 + स्तन कैंसर एमसीटीएस को विभिन्न आकृति विज्ञान (मोटा, डिस्क जैसे 2.5 डी समुच्चय या फ्लैट 2 डी समुच्चय, क्रमशः) के समुच्चय का पता लगाने के लिए मैट्रिगेल (एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स) के अलावा या बिना तरल ओवरले के माध्यम से बनाया गया था। बाहरी क्षेत्र, संक्रमणकालीन क्षेत्र और आंतरिक कोर के भीतर सेल घनत्व परिपक्व एमसीटीएस में विशेषता थी, जो बाहरी परतों की तुलना में कोर क्षेत्रों में उच्च सेल घनत्व के साथ एक सेल-घनत्व ढाल का खुलासा करता है। मैट्रिक्स जोड़ ने सेल घनत्व को पुनर्वितरित किया और इस ढाल को बढ़ाया, बाहरी क्षेत्र घनत्व को कम किया और कोर में सेल संघनन में वृद्धि की। दवा प्रतिक्रिया में संभावित क्षेत्रीय मतभेदों का आकलन करने के लिए उत्तरोत्तर गहरे 100 μm क्षेत्रों के भीतर दवा उपचार (0 घंटे, 24 घंटे, 5 दिन) के बाद सेल घनत्व की मात्रा निर्धारित की गई थी। अंतिम समय बिंदु तक, लगभग सभी कोशिका मृत्यु प्रत्येक कुल के बाहरी 200 μm के लिए विवश दिखाई दीं, जबकि कुल में गहरी कोशिकाएं काफी हद तक अप्रभावित दिखाई दीं, जो दवा की प्रतिक्रिया में क्षेत्रीय मतभेदों को दर्शाती हैं, संभवतः दवा प्रवेश में सीमाओं के कारण। वर्तमान प्रोटोकॉल घने सेलुलर ऊतकों के भीतर गैर विनाशकारी क्षेत्रीय सेल घनत्व की मात्रा निर्धारित करने और इसे अनुदैर्ध्य रूप से मापने के लिए एक अनूठी तकनीक प्रदान करता है।

Introduction

शोधकर्ताओं ने ट्यूमर प्रगति की कुछ प्रमुख विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए बड़े पैमाने पर इन विट्रो सिस्टम में बेंचटॉप 3 डी संस्कृति की ओर रुख किया है। इस शोध का अधिकांश हिस्सा बहुकोशिकीय ट्यूमर स्फेरॉइड (एमसीटीएस) और अधिक जटिल ऑर्गेनोइड 1,2 के फिर से उभरने के नेतृत्व में किया गया है। यद्यपि ये मॉडल एवैस्कुलर हैं, वे विवो 3,4,5 में होने वाली शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं को पुन: पेश करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करते हैं। विशेष रूप से, मध्यम आकार के मॉडल (300-500 μm व्यास) कोर के भीतर हाइपोक्सिया के कारण 3 डी संरचना, पैथोफिजियोलॉजिकल ग्रेडिएंट और मेटास्टैटिक सिग्नलिंग जैसी प्रमुख ट्यूमर विशेषताओं की नकल कर सकते हैं। यह अच्छी तरह से प्रलेखित है कि ये मॉडल विवो ट्यूमर में संवहनी में देखी जाने वाली विशेषता संकेंद्रित परतों को प्रदर्शित करते हैं, अर्थात्, प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं की एक बाहरी परत, सेनेसेंट / क्विसेंट कोशिकाओं की एक संक्रमणकालीन परत, और कोर 3,6,7,8,9 में हाइपोक्सिया का अनुभव करने वाली कोशिकाएं . इन परतों के भीतर, विकास के दौरान और दवा के जवाब में सेल व्यवहार की विशेषता के द्वारा इन मॉडलों से अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्राप्त की जा सकती है। हालांकि, अपेक्षित एमसीटीएस आकार, ग्रेडिएंट विकसित करने के लिए आवश्यक है जो उन्हें इन विट्रो मॉडल में इतना शक्तिशाली बनाता है, गैर-विनाशकारी मूल्यांकन के लिए उपयोग किए जाने वाले उपकरणों को काफी सीमित करता है। दरअसल, एमटीसीएस के गैर-विनाशकारी विश्लेषण के साथ सबसे बड़ी चुनौतियों में से एक सेल-स्केल विवरणों की मात्रा निर्धारित कर रहा है। ब्राइट-फील्ड और फेज-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी का उपयोग नियमित रूप से 3 डी एमसीटीएस विकास और विकास गैर-विनाशकारी रूप से आकलन करने के लिए किया जाता है। हालांकि, ये तौर-तरीके 2 डी अनुमानों तक सीमित हैं, इन मॉडलों की महत्वपूर्ण 3 डी संरचना की कल्पना करने की क्षमता का अभावहै 10,11,12,13। साइटोटॉक्सिसिटी और सेल प्रसार पर जानकारी आमतौर पर फ्लोरोसेंट इमेजिंग (यानी, लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी) या पूर्व विवो इम्यूनोहिस्टोलॉजिकल धुंधला 14,15,16 के माध्यम से एकत्र की जाती है। जबकि ये दृष्टिकोण ऊतक संरचना, सेलुलर घनत्व और सेलुलर फ़ंक्शन पर मूल्यवान, उच्च-रिज़ॉल्यूशन जानकारी प्रदान करते हैं, उन्हें अक्सर ऑप्टिकल क्लियरिंग, फिक्सिंग / धुंधला, या एम्बेडिंग जैसे नमूना तैयारी की आवश्यकता होती है जो अनुदैर्ध्य विश्लेषण को रोकता है।

ऑप्टिकल कोहेरेंस टोमोग्राफी (ओसीटी) एक गैर-विनाशकारी संरचनात्मक इमेजिंग पद्धति है जिसमें ऊपर उल्लिखित कुछ चुनौतियों को दूर करने की क्षमता है। यह सेलुलर रिज़ॉल्यूशन और देखने का पर्याप्त रूप से विस्तृत क्षेत्र (10 मिमी x 10 मिमी तक) समेटे हुए है जो पूरे बहुकोशिकीय समुच्चय 17,18,19 की कल्पना करने में सक्षम है। महत्वपूर्ण बात यह है कि उपयोग किए गए प्रकाश की दृश्यमान प्रकृति के कारण, यह तकनीक पूरी तरह से गैर-विनाशकारी और लेबल मुक्त17 है। इसके अलावा, नमूनों को नमूना तैयारी की आवश्यकता के बिना सीटू में चित्रित किया जा सकता है, जैसे कि नमूने इनक्यूबेटर से सीधे लिए जा सकते हैं, जल्दी से ओसीटी (स्कैन अवधि ~ 5-10 मिनट) के साथ स्कैन किया जा सकता है, फिर इनक्यूबेटर में लौट आया, अनुदैर्ध्य लक्षण वर्णन को सक्षम किया जा सकता है। ट्यूमर स्फेरॉइड व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए ओसीटी का उपयोग करने की मांग करने वाले कई अध्ययन हाल ही में उभरे हैं। सबसे रोमांचक प्रदर्शनों में से एक में, हुआंग एट अल ने बड़े ट्यूमर स्फेरॉइड मॉडल के भीतर गैर-विनाशकारी रूप से नेक्रोटिक कोर का पता लगाने के लिए ओसीटी का उपयोग किया, यह देखते हुए कि जीवित और मृत सेल क्षेत्रों में ऑप्टिकल क्षीणन में स्पष्ट अंतर है, जिसका उपयोग लेबल मुक्त व्यवहार्यता निगरानी20 के लिए किया जा सकता है। इसी तरह, हरि एट अल ने नमूनों के भीतर हाइपोक्सिया की उपस्थिति का अध्ययन करने के लिए ओसीटी के साथ इमेज किए गए मानव बृहदान्त्र कैंसर (एचसीटी 116) स्फेरॉइड के अपवर्तक सूचकांक (आरआई) माप का आयोजन किया। उनके माप प्रत्यक्ष अनुमानों के लिए पर्याप्त नहीं थे, हालांकि उन्होंने साइट के साथ सहसंबद्ध स्थानों में कम आरआई का निरीक्षण किया, हालांकि आकार नहीं, नेक्रोटिक कोर का, बाद में कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से पहचाना गया। अब्द एल-सादेक एट अल स्तन कैंसर ट्यूमर मॉडल की क्षेत्रीय ऊतक व्यवहार्यता की कल्पना और मात्रा निर्धारित करने के लिए ओसीटी का उपयोग किया22. उन्होंने ऊतक गतिशीलता की कल्पना करने के लिए दो ओसीटी-आधारित तरीकों की सूचना दी और इन मैट्रिक्स और जीवित / मृत कोशिकाओं के माइक्रोस्कोपी-पहचाने गए क्षेत्रों में अंतर के बीच एक मध्यम सहसंबंध दिखाया।

विकास 10,23 के दौरान एमसीटीएस स्तन कैंसर मॉडल के भीतर 3 डी आकृति विज्ञान और सेल गिनती को मापने के लिए मात्रात्मक, गैर-विनाशकारी दृष्टिकोण स्थापित करनेके लिए इस पूर्व साहित्य पर निर्मित ओसीटी का उपयोग करके हमारा प्रकाशित काम। ओसीटी वॉल्यूम स्कैन के भीतर इमेज किए गए सेल-आकार की वस्तुओं (यानी, स्पॉट) की संख्या की गणना करने के लिए इमारिस 3 डी रेंडरिंग इमेज एनालिसिस सॉफ़्टवेयर का उपयोग करते हुए, सेल काउंट एमसीटीएस में गैर-विनाशकारी रूप से मापा गया था जो सांख्यिकीय रूप से कुल पृथक्करण पर हेमोसाइटोमीटर के माध्यम से निर्धारित लोगों के समान थे। हालांकि, ओसीटी की संरचनात्मक प्रकृति के कारण, परिगलन द्वारा कोशिका मृत्यु के बाद भी मौजूद कोशिका झिल्ली को गलती से जीवित कोशिकाओं के रूप में गिना जा सकता है। इसके अलावा, इस लक्षण वर्णन को आशाजनक सफलता10 के साथ एक दवा आहार के अधीन व्यक्तिगत समुच्चय के भीतर गैर-विनाशकारी ट्रैक सेल व्यवहार्यता तक बढ़ाया गया था। महत्वपूर्ण रूप से, यह ध्यान दिया गया था कि हमारे ओसीटी-इमारिस दृष्टिकोण से इसी तरह की सेल व्यवहार्यता की सूचना दी गई थी, जो पृथक्करण पर इन नमूनों के भीतर बेंचमार्क किया गया था। यह गैर-विनाशकारी और लेबल मुक्त सेल दृष्टिकोण कोशिकाओं को निर्माण / कुल संरचना का त्याग किए बिना अनुदैर्ध्य रूप से 3 डी निर्माणों और घने समुच्चय के भीतर गिना जा सकता है।

वर्तमान कार्य 3 डी समग्र आकृति विज्ञान और सेल नंबर दोनों को मापने के लिए ओसीटी-इमारिस की क्षमता का लाभ उठाकर घने समुच्चय के भीतर क्षेत्रीय सेल घनत्व को सीधे मापने के लिए एक बेहतर दृष्टिकोण की रिपोर्ट करता है। यह पद्धतिगत उन्नति एमसीटीएस मॉडल की विशेषता संकेंद्रित परतों के भीतर कोशिकाओं के स्थानिक वितरण और प्रसार की अधिक विस्तृत तस्वीर प्रदान करती है। केवल एक समग्र औसत कुल सेल घनत्व की गणना करने के बजाय, इस तरह के स्थानीय घनत्व माप सेल घनत्व ग्रेडिएंट को प्रकट कर सकते हैं, जैसे कि संघनन से जुड़े लोग। यह क्षेत्रीय मूल्यांकन क्षेत्रीय दवा प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए एक कीमोथेरेप्यूटिक के साथ इलाज किए गए समुच्चय पर भी लागू होता है, जैसा कि स्थानीय सेल घनत्व में परिवर्तन से मापा जाता है। ओसीटी और उन्नत इमेजिंग विश्लेषण विधियों का यह संयोजन क्षेत्रीय सेल व्यवहार्यता का परिमाणीकरण प्रदान करता है, जिसका उपयोग दवा प्रवेश का पता लगाने के लिए किया जा सकता है जिसके आधार पर सेल घनत्व में क्षेत्रों का अनुभव कम हो जाता है। घने सेलुलर ऊतकों के भीतर दवा के जवाब में क्षेत्रीय सेल घनत्व और व्यवहार्यता को गैर-विनाशकारी रूप से मापने और इसे अनुदैर्ध्य रूप से मापने के लिए यह पहली रिपोर्ट है। पूरे एमसीटीएस में त्रि-आयामी सेल घनत्व और स्थानिक वितरण के इस तरह के लक्षण वर्णन से कैंसर के उपचार में दवा वितरण को अनुकूलित करने और कैंसर मॉडल प्रगति की समझ में सुधार करने में मदद मिल सकती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

एयू 565 (एचईआर 2 +) और एमडीए-एमबी -231 स्तन कैंसर सेल लाइनों का उपयोग वर्तमान अध्ययन के लिए किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।

1. ट्यूमर समुच्चय तैयार करना

  1. रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (आरपीएमआई) 1640 बेसल माध्यम (+) का उपयोग करके एयू 565 (एचईआर 2 +) स्तन कैंसर सेल ग्रोथ मीडिया तैयार करें एल-ग्लूटामाइन में 10% (वी / वी) भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. 10% (वी / वी) भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 100 यू / एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, और एल-ग्लूटामाइन के 2 एमएम ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ पूरक डलबेको के संशोधित ईगल के माध्यम (डीएमईएम) का उपयोग करके एमडीए-एमबी -231 ट्रिपल-नेगेटिव स्तन कैंसर सेल ग्रोथ मीडिया तैयार करें।
  3. मानक स्थितियों (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, 95% सापेक्ष आर्द्रता) में दोनों सेल लाइनों (~ 3-4 दिनों की तैयारी) के 70% -90% संगम सेल संस्कृतियों को तैयार करें। मानक ट्रिप्सिनाइजेशन विधि के बाद अपनी संस्कृति फ्लास्क से सेल मोनोलेयर को अलग करें।
    नोट: ट्रिप्सिन के लिए कोशिकाओं के ओवरएक्सपोजर को रोकें, उनकी व्यवहार्यता को प्रभावित करें।
    1. एयू 565 कोशिकाओं के लिए, एक पिपेट का उपयोग करके फ्लास्क से सेल मीडिया को एस्पिरेट करें (या, यदि उपलब्ध हो, तो एक ऑटोक्लेव ग्लास पिपेट टिप के लिए ट्यूबिंग के माध्यम से जुड़े वैक्यूम पंप का उपयोग करके) और 2 एमएल ट्रिप्सिन-ईडीटीए के साथ प्रतिस्थापित करें। कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए फ्लास्क छोड़ दें, और फिर 4 अतिरिक्त मिनट के लिए इनक्यूबेटर में जाएं। बाद में, ट्रिप्सिन को बेअसर करने के लिए फ्लास्क में 6 मिलीलीटर विकास मीडिया जोड़ें।
    2. एमडीए-एमबी -231 कोशिकाओं के लिए, चरण 1.3.1 में किए गए तरीके से फ्लास्क से सेल मीडिया को एस्पिरेट करें और 1.5 एमएल ट्रिप्सिन-ईडीटीए के साथ प्रतिस्थापित करें। इनक्यूबेशन के 7 मिनट के बाद, ट्रिप्सिन को बेअसर करने के लिए फ्लास्क में 8.5 मिलीलीटर विकास मीडिया जोड़ें।
  4. निलंबन24 में कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए एक हेमोसाइटोमीटर के लिए सेल निलंबन के 10 μL जोड़ें। एमएल के 2.5 × 105 कोशिकाओं / एमएल की वांछित एकाग्रता पर मीडिया में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  5. एक गोल-तल, गैर-अनुयायी, 96-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन के 50 μL वितरित करें। मैट्रिगेल (तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स, सामग्री की तालिका देखें) के बिना तैयार निलंबन के लिए, प्रत्येक कुएं में सादे विकास मीडिया के 50 μL जोड़ें।
    1. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ तैयार निलंबन के लिए, -20 डिग्री सेल्सियस भंडारण से मैट्रिक्स शीशी को हटा दें और इसे रात भर पिघलने के लिए रेफ्रिजरेटर में रखें। विकास मीडिया के साथ एक कंटेनर तैयार करें और ठंडा करने के लिए 10 मिनट के लिए ठंडा करें।
    2. एक जमे हुए पिपेट टिप का उपयोग करके, मैट्रिक्स को ठंडा मीडिया में जोड़ें जैसे कि इस समाधान की अंतिम एकाग्रता 5% है। प्रत्येक कुएं में इस मीडिया के 50 μL जोड़ें, जैसे कि इन कुओं में मैट्रिक्स की अंतिम एकाग्रता 2.5% 3 है।
      नोट: पूर्व कार्य में, इन सेल लाइनों10,25 के लिए कुल आकृति विज्ञान का मूल्यांकन किया गया था, और पाया गया कि एमडीए-एमबी -231 समुच्चय झिल्ली मैट्रिक्स के अलावा स्फेरॉइड बनाते हैं, जबकि मैट्रिक्स के बिना एमडीए-एमबी -231 संस्कृतियां और एयू 565 +/- मैट्रिक्स सभी डिस्क के आकार के समुच्चय बनाते हैं। 0 (विमान) - 1.0 (परिपूर्ण क्षेत्र) के पैमाने पर >0.8 की मात्रात्मक गोलाकारता का उपयोग पर्याप्त गोलाकार समुच्चय की पहचान करने के लिए किया गया था और इस प्रकार विवो जैसे व्यवहार26,27 के लिए अपेक्षित सतह-से-वॉल्यूम अनुपात होने की उम्मीद थी।
  6. प्रत्येक कुएं के तल पर एक सेल गोली के संग्रह को सुनिश्चित करने के लिए तुरंत बोने के बाद कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 123 एक्स जी पर प्लेटों को अपकेंद्रित्र करें।
    नोट: यह कदम जितनी जल्दी हो सके बोने के बाद होना चाहिए। लेखकों ने देखा कि इन चरणों के बीच बहुत अधिक समय कोशिकाओं को प्रत्येक कुएं की बोतलों और किनारों पर बसने की अनुमति देता है, जिससे कुएं के तल पर इकट्ठा करने और एकत्र करने की उनकी क्षमता बाधित होती है।
  7. 4 दिनों के लिए प्लेटों सेते हैं, जिस बिंदु पर सेल समुच्चय परिपक्व माना जाता है।
    नोट: तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ तैयार एयू 565 समुच्चय को दवा प्रतिक्रिया अध्ययन (9 दिन कुल, दिन 4 पर मीडिया परिवर्तन) के लिए अतिरिक्त 5-दिवसीय संस्कृति अवधि की आवश्यकता होती है।

2. एयू 565 सेल समुच्चय के लिए ट्रास्टुज़ुमाब (टीजेडएम) का प्रशासन

  1. एयू 565 विकास मीडिया में टीजेडएम समाधान के 500 μg / एमएल ( सामग्री की तालिका देखें) तैयार करें। दिन 4 पर, प्रत्येक कुएं में इस समाधान के 10 μL जोड़ें, जैसे कि प्रत्येक कुएं के भीतर अंतिम एकाग्रता 50 μg /
  2. संस्कृति टीजेडएम के अतिरिक्त के बाद 5 अतिरिक्त दिनों के लिए समुच्चय करती है और प्रमुख समय बिंदुओं पर आकलन करती है।
    नोट: वर्तमान अध्ययन के लिए, दवा का विश्लेषण करने के लिए 0 घंटे (ड्रगिंग से तुरंत पहले), 24 घंटे और 120 घंटे पोस्ट-ड्रग के समय बिंदुओं का उपयोग किया गया था।

3. ऑप्टिकल सुसंगतता टोमोग्राफी इमेजिंग

नोट: यहां नमूनों को परिपक्वता के प्रत्येक दिन (1-4) के दौरान ऑप्टिकल कोहेरेंस टोमोग्राफी (ओसीटी) के साथ चित्रित किया गया था, और फिर चयनित ड्रग समुच्चय के लिए दिन 5 (24 घंटे पोस्ट-ड्रग-एडिशन) और दिन 9 (120 घंटे पोस्ट-ड्रग-एडिशन) पर फिर से। वर्तमान अध्ययन के लिए ओसीटी इमेजिंग के लिए एक वाणिज्यिक स्पेक्ट्रल-डोमेन ऑप्टिकल कोहेरेंस टोमोग्राफी (एसडीओसीटी, सामग्री की तालिका देखें) प्रणाली का उपयोग किया गया था। यद्यपि यह दृष्टिकोण लगभग किसी भी ओसीटी प्रणाली के लिए उत्तरदायी है, और अनुसरण की जाने वाली प्रक्रिया आम तौर पर विभिन्न प्रणालियों के बीच समान होगी, कुछ विस्तृत चरण जो अनुसरण करते हैं वे वर्तमान उपकरणों के लिए विशिष्ट हैं।

  1. संरचनात्मक इमेजिंग के लिए एक ओसीटी प्रणाली का उपयोग करें। उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवि संग्रह के लिए ए-स्कैन दर को 5.5 किलोहर्ट्ज़ पर सेट करें। एक तरल माध्यम में नमूनों के लिए अपवर्तन के सूचकांक को 1.33 पर सेट करें। वोक्सल आकार को 1.10 x 1.10 x 2.58 μm3 पर सेट करें।
  2. स्क्रीन के दाईं ओर छवि पैरामीटर विंडो में, एक्स, वाई और जेड मानों (मिमी में) इनपुट करके दृश्य क्षेत्र (एफओवी) सेट करें जैसे कि नमूना ब्याज के इस क्षेत्र के भीतर शामिल है।
    नोट: इन अध्ययनों के लिए एफओवी आमतौर पर 1.5 x 1.5 x 0.5 मिमी3 पर सेट किया गया था। सुनिश्चित करें कि नमूना 0 और 90 डिग्री के बीच 'कोण' इनपुट को बारी-बारी से और दृश्य पुष्टि करके इस क्षेत्र के भीतर फिट बैठता है।
  3. 3 डी अधिग्रहण मोड पर क्लिक करें, और उसके बाद नमूना के 3 डी वॉल्यूम स्कैन एकत्र करने के लिए रिकॉर्ड पर क्लिक करें।

4. छवि विश्लेषण

  1. सॉफ़्टवेयर प्रारूप में ओसीटी फ़ाइल निर्यात करें (इमारिस, सामग्री की तालिका देखें)।
    1. सॉफ्टवेयर डेवलपमेंट किट में ओसीटी फ़ाइल खोलें। निर्यात पर क्लिक करें, फ़ाइल प्रकार को .jpg पर सेट करें, और छवियों को एक खाली फ़ोल्डर में निर्यात करें।
    2. छवि प्रसंस्करण सॉफ़्टवेयर खोलें (फिजी, सामग्री की तालिका देखें) और उस फ़ोल्डर से छवि अनुक्रम आयात करें जहां निर्यात किए गए जेपीईजी संग्रहीत किए जाते हैं। छवि अनुक्रम को एक साथ सिलाई करने के लिए सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें, और तब इस फ़ाइल को टीआईएफएफ छवि के रूप में सहेजें।
  2. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए वॉल्यूम पुनर्निर्माण बनाएँ।
    1. इमारिस खोलें और एरिना के भीतर परिवर्तित टीआईएफएफ फ़ाइल पर नेविगेट करें। छवि गुणों को संपादित करने > पर जाएं और ओसीटी छवि से वोक्सल आकार (μm में) को संबंधित XYZ बक्से में इनपुट करें। फिर ओके पर क्लिक करें।
      नोट:: स्क्रीन के बाईं ओर नमूना ऑब्जेक्ट ट्री के भीतर, सॉफ़्टवेयर अंतराल को रोकने के लिए वॉल्यूम टैब का चयन रद्द करें।
    2. ऑब्जेक्ट्स ट्री के ऊपर नई सतहों को जोड़ें पर क्लिक करें। पेड़ के नीचे मेनू में, स्वचालित निर्माण छोड़ें पर क्लिक करें और मैन्युअल रूप से संपादित करें। प्रदर्शन समायोजन विंडो के भीतर, मैन्युअल रूप से नमूना और पृष्ठभूमि के बीच विपरीत बढ़ाने और नमूना दृश्य में सुधार करने के लिए लाल और काले तीर स्लाइड।
    3. नमूने के एक किनारे पर टुकड़ा करने के लिए 'स्लाइस स्थिति' समायोजित करें, यानी, जहां नमूना संकेत पहली बार प्रकट होता है। नेविगेशन मोड से माउस का चयन करें मोड में बदलने के लिए एस्केप कुंजी का उपयोग करें, और उसके बाद ड्रा पर क्लिक करें। मैन्युअल रूप से सिग्नल प्रदर्शित करने वाले क्षेत्र की रूपरेखा का पता लगाएं।
    4. इनपुट बॉक्स में अगली स्थिति दर्ज करके स्लाइस स्थिति को आगे बढ़ाएं। यह अगली स्थिति पहले की तुलना में नमूने में ≤100 स्लाइस आगे होनी चाहिए। मैन्युअल रूप से सिग्नल प्रदर्शित करने वाले क्षेत्र का पता लगाएं।
    5. नमूना के विपरीत किनारे तक पहुँच जाता है जब तक नमूना की मोटाई के माध्यम से चरण 4.2.4 दोहराएँ। फिर, इन स्लाइसों को एक साथ सिलाई करने और वॉल्यूम पुनर्निर्माण को पूरा करने के लिए बाएं मेनू में सतह बनाएं पर क्लिक करें।
    6. संपादित करें पर क्लिक करें, और फिर मास्क चयन पर क्लिक करें। यह प्रदर्शन समायोजन विंडो में केवल पृथक नमूना युक्त एक नया चैनल बनाता है। नमूने की आकृति विज्ञान विशेषताओं को अब सांख्यिकी > विस्तृत टैब में पाया जा सकता है।
      नोट: इस वर्तमान अध्ययन के भीतर रिपोर्ट की गई गोलाकारताओं और संस्करणों को निर्धारित करने के लिए इस दृष्टिकोण का पालन किया गया था।
  3. नीचे दिए गए चरणों के बाद एक नमूना की कुल सेल घनत्व प्राप्त करें।
    1. ऑब्जेक्ट ट्री के ऊपर, नए स्पॉट जोड़ें का चयन करें। एल्गोरिथ्म सेटिंग्स मेनू में, सभी बक्सों का चयन रद्द करें। स्रोत चैनल स्क्रीन पर जाने के लिए ब्लू एरो पर क्लिक करें।
      1. दिखाई देने वाले ड्रॉप-डाउन मेनू से, चरण 5.2.8 में बनाए गए नकाबपोश चैनल का चयन करें, जिसे आमतौर पर चैनल 2 नाम दिया जाता है। एक्सवाई व्यास बॉक्स में नमूने के लिए औसत सेल व्यास इनपुट करें। सुनिश्चित करें कि पृष्ठभूमि घटाव की जाँच की गई है।
        नोट: एयू 565 और एमडीए-एमबी -231 कोशिकाओं के साथ इस काम के लिए, व्यास 10 μm पर सेट किया गया था। यह चयन कक्ष आकार (चर्चा अनुभाग में समझाया गया) पर आधारित है.
    2. स्पॉट वर्गीकृत करें स्क्रीन पर जाने के लिए ब्लू एरो पर क्लिक करें। मेनू के निचले भाग में ग्राफ़ में, पीले थ्रेसहोल्ड के बाएं किनारे को ग्राफ़ के बाएं किनारे पर क्लिक करें और खींचें, जैसे कि सभी ऑब्जेक्ट्स पीले छायांकित थ्रेशोल्ड में शामिल हों। फिर, स्पॉट निर्माण को पूरा करने के लिए ग्रीन एरो पर क्लिक करें।
    3. सांख्यिकी > पर क्लिक करके पहचानी गई वस्तुओं की संख्या (यानी, नमूना सेल गिनती) प्राप्त करें स्पॉट की कुल संख्या >।
    4. औसत कुल सेल घनत्व निर्धारित करने के लिए, कुल की सेल गिनती (चरण 4.3.3 में मापा जाता है) को कुल मात्रा (चरण 4.2.6 में निर्धारित) से विभाजित करें।
  4. गोलाकार समुच्चय की संकेंद्रित परतों में क्षेत्रीय घनत्व का आकलन करें (चित्र 1 ए).
    1. रूपात्मक और कोशिका घनत्व विश्लेषण के बाद, क्षेत्रीय घनत्व का आकलन करें। चरण 4.2.5 में बनाई गई सतह पर क्लिक करें और सतह शैली / गुणवत्ता टैब पर नेविगेट करें। चयन को केंद्र बिंदु में परिवर्तित करें और सर्वोत्तम दृश्यता के लिए पिक्सेल चौड़ाई ≤20 में परिवर्तित करें. विस्तृत > स्थिति > सांख्यिकी पर नेविगेट करें और केंद्र स्थान का स्थान रिकॉर्ड करें।
    2. ऑब्जेक्ट ट्री के ऊपर मेनू से नया संदर्भ फ़्रेम जोड़ें का चयन करें। मेनू में XY के बगल में दृश्यमान और ठीक बॉक्स की जाँच करें। संदर्भ फ्रेम आइकन के केंद्र पर क्लिक करें और खींचें जैसे कि यह केंद्र स्थान के अनुरूप है। एक्सवाई दृश्यमान और फिक्स बॉक्स को अचयनित करें और उन्हें एक्सजेड के लिए चुनें।
      1. एक बार फिर, संदर्भ फ्रेम आइकन के केंद्र पर क्लिक करें और खींचें जैसे कि यह केंद्र स्थान के अनुरूप है। अंत में, वाईजेड विमान के लिए इसे दोहराएं, इन तीन निश्चित विमानों के बीच बारी-बारी से जब तक कि संदर्भ फ्रेम पूरी तरह से केंद्र स्थान के साथ संरेखित न हो जाए। ऑब्जेक्ट ट्री में संदर्भ फ्रेम पर डबल क्लिक करें और इसे केंद्र या समान नाम दें।
    3. चरण 4.3 में बनाए गए स्थानों पर क्लिक करें और विस्तृत > स्थिति संदर्भ फ्रेम > सांख्यिकी पर नेविगेट करें। स्थिति एक्स संदर्भ फ्रेम पर क्लिक करें जब तक कि यह उच्चतम से निम्नतम मूल्य तक न हो जाए। उच्चतम मूल्य रिकॉर्ड करें - यह नमूने के सबसे दूर के किनारे को इंगित करता है, यानी, नमूना त्रिज्या।
      नोट: चूंकि यहां उपयोग किए जाने वाले नमूने एक्सवाई विमान में परिपत्र हैं, इसलिए गणना समान परिणामों के साथ एक्स या वाई अक्ष के साथ की जा सकती है। उन नमूनों के लिए जो एक्स-वाई समरूपता (असममित, दीर्घवृत्त, अनियमित ज्यामिति, आदि) प्रदर्शित नहीं करते हैं, इन विश्लेषणों को कई अक्षों के साथ करने की सिफारिश की जाती है।
    4. सांख्यिकी पर नेविगेट करें। मेनू के निचले-दाएं कोने में, फ़ाइल में सभी सांख्यिकी निर्यात करें पर क्लिक करें और डेटा को स्प्रेडशीट में सहेजें।
    5. एक्स-अक्ष के साथ गाढ़ा परतों की पहचान करने के लिए मैन्युअल गणना करें।
      नोट: इस अध्ययन में उपयोग किए गए नमूने व्यास में लगभग 500 μm थे; इस प्रकार, दो बाहरी 200 μm मोटी गाढ़ा क्षेत्र और एक आंतरिक 100 μm मोटी केंद्रीय क्षेत्र हैं। 200 μm मोटी क्षेत्रों को बनाए रखने की सिफारिश की जाती है क्योंकि प्रसार व्यवहार इस दूरी 7,28,29,30 पर बदलने की उम्मीद है। इस तर्क को ध्यान में रखते हुए, बड़े नमूनों के लिए अधिक संकेंद्रित क्षेत्रों का उपयोग करने की भी सिफारिश की जाती है और छोटे नमूनों के लिए इसके विपरीत।
    6. चरण 4.4.3 में पाए गए बाहरी त्रिज्या से 200 μm घटाकर 200 μm बाहरी परत क्षेत्र सेट करें। इस प्रकार, बाहरी क्षेत्र एक्सत्रिज्या और एक्स बाहरी, आंतरिक किनारे (चित्रा 1 ए, नारंगी क्षेत्र) के बीचएक्स-पदों के साथ धब्बे को शामिल करेगा।
    7. एक्सबाहरी, आंतरिक-किनारे से 200 μm घटाकर एक संक्रमणकालीन क्षेत्र सेट करें। संक्रमणकालीन क्षेत्र में एक्सबाहरी, आंतरिक-किनारे, और एक्स संक्रमणकालीन, आंतरिक-किनारे (चित्रा 1 ए, गुलाबी क्षेत्र) के बीचएक्स-पदों के साथ धब्बे शामिल होंगे।
    8. नमूना केंद्र और एक्ससंक्रमणकालीन, आंतरिक किनारे (चित्रा 1 ए, नीले क्षेत्र) के बीच शेष धब्बे को शामिल करते हुए एक केंद्रीय कोर क्षेत्र सेट करें।
    9. चरण 4.4.4 में बनाई गई सहेजी गई स्प्रेडशीट फ़ाइल खोलें। मूल संदर्भ फ़्रेम से दूरी टैब पर नेविगेट करें.
    10. फ़ंक्शन काउंटिफ (कॉलम एक्स, "एक्स संक्रमणकालीन, आंतरिक-किनारे <") का उपयोग करके कोर क्षेत्र में स्पॉट की संख्या की गणना करें, जहां कॉलमएक्स 'उत्पत्ति संदर्भ फ्रेम से दूरी' कॉलम है। परिणामी मान इस क्षेत्र में सेल नंबर है। सेल घनत्व प्राप्त करने के लिए इस मान को क्षेत्र की मात्रा से विभाजित करें।
    11. इसी तरह, 'काउंटिफ (कॉलमएक्स, "एक्सबाहरी, आंतरिक-किनारे") का उपयोग करके संक्रमणकालीन क्षेत्र में कोशिकाओं की संख्या < की गणना करें - काउंटिफ (कॉलमएक्स, "> एक्ससंक्रमणकालीन, आंतरिक-किनारे")।
    12. 'काउंटिफ (कॉलमएक्स," > एक्स संक्रमणकालीन, आंतरिक-किनारे") का उपयोग करके बाहरी क्षेत्र में कोशिकाओं की संख्या की गणना करें।
  5. 'क्षेत्रीय प्लग' (चित्रा 1 बी) के माध्यम से गैर गोलाकार नमूनों में क्षेत्रीय सेल घनत्व का आकलन करें।
    नोट: गैर-गोलाकार नमूनों के लिए जिनमें गाढ़ा परतें नहीं हैं, 'क्षेत्रीय प्लग' विधि कुल मिलाकर विभिन्न रेडियल गहराई पर स्थानीय सेल घनत्व का नमूना लेने के लिए विकसित की गई है।
    1. केंद्रीय संदर्भ फ्रेम (चित्रा 1 बी, केंद्रीय पीला सर्कल) सेट करने और कुल नमूना त्रिज्या प्राप्त करने के लिए चरण 4.4.1-4.4.3 दोहराएं।
    2. संक्रमणकालीन और बाहरी क्षेत्रों के भीतर संदर्भ फ्रेम के प्लेसमेंट की पहचान करने के लिए मैनुअल गणना करें जैसे कि इन स्थानों पर नमूने में सेल घनत्व का आकलन किया जा सकता है।
      1. बाहरी स्थान की गणना करने के लिए, चरण 4.5.1 से नमूना त्रिज्या मान से 50 μm घटाएं और इस मान को एक्स-स्थिति के रूप में उपयोग करें।
        नोट: नमूना के एक्स अक्ष (चित्रा 1 बी, सबसे बाएं पीले सर्कल) के साथ सेल घनत्व को मापने के लिए किसी दिए गए नमूने के भीतर सभी प्लग के लिए चरण 4.5.1 में दर्ज एक ही वाई और जेड स्थिति मूल्यों का उपयोग करें।
      2. ऑब्जेक्ट ट्री के ऊपर, नए स्पॉट जोड़ें पर क्लिक करें और स्वचालित निर्माण छोड़ें, मैन्युअल रूप से संपादित करें पर क्लिक करें। 'चयन' मोड में सूचक के साथ, स्क्रीन पर एक स्थान रखने के लिए शिफ्ट + क्लिक रखें। बाएं मेनू में, ऊपर गणना की गई एक्सवाईजेड स्थिति मानों को इनपुट करें। सर्वोत्तम दृश्यता के लिए एक्सवाई और जेड व्यास को ≤20 में समायोजित करें।
      3. इस स्थान स्थान पर एक संदर्भ फ़्रेम जोड़ने के लिए चरण 4.4.2 दोहराएँ। ऑब्जेक्ट ट्री बाहरी या समान में इस संदर्भ फ़्रेम का नाम बदलें।
      4. संक्रमणकालीन (मध्यबिंदु) स्थान की गणना करने के लिए, Xकेंद्र स्थिति मान और Xबाहरी स्थिति मानों का औसत ज्ञात कीजिये। संक्रमणकालीन संदर्भ फ़्रेम के लिए X स्थिति के रूप में इस मान का उपयोग करें। ऊपर के रूप में, नमूना के एक्स अक्ष (चित्रा 1 बी, मध्य पीला सर्कल) के साथ सेल घनत्व को मापने के लिए किसी दिए गए नमूने के भीतर सभी प्लग के लिए चरण 4.5.1 में दर्ज एक ही वाई और जेड मूल्यों का उपयोग करें।
      5. इस स्थान पर मध्य संदर्भ फ्रेम रखने के लिए चरण 4.4.2 दोहराएं, एक बार बनाए जाने के बाद इसका नाम बदलकर 'संक्रमणकालीन' या इसी तरह का नाम बदलें।
    3. चरण 4.3 में बनाए गए स्थानों पर क्लिक करें और सांख्यिकी पर नेविगेट करें। मेनू के निचले-दाएं कोने में, फ़ाइल में सभी सांख्यिकी निर्यात करें पर क्लिक करें और डेटा को स्प्रेडशीट में सहेजें।
    4. स्प्रेडशीट खोलें। मूल संदर्भ फ़्रेम से दूरी टैब पर नेविगेट करें. संदर्भ फ्रेम के लिए प्रत्येक ऑब्जेक्ट की दूरी कॉलम ए में दिखाई गई है, और प्रत्येक ऑब्जेक्ट के लिए संदर्भ फ्रेम का समूहीकरण कॉलम जी में दिखाया गया है प्रत्येक दूरी को संख्यात्मक रूप से इसके संबंधित संदर्भ फ्रेम में असाइन करने के लिए 'एमओडी' फ़ंक्शन का उपयोग करें, जहां 0 केंद्र फ्रेम है, 1 संक्रमणकालीन है, और 2 बाहरी है।
    5. प्रत्येक संदर्भ फ़्रेम में दूरी के साथ कार्य करने के लिए इस स्तंभ में मानफ़िल्टर करें. प्रत्येक संदर्भ फ्रेम के लिए, फ़ंक्शन 'काउंटिफ (कॉलमएक्स, "≤50") का उपयोग करके फ्रेम के 50 माइक्रोमीटर के भीतर वस्तुओं की संख्या की गणना करें, जहां कॉलमएक्स प्रत्येक समूह के लिए 'उत्पत्ति संदर्भ फ्रेम से दूरी' कॉलम है। परिणामी मान उस क्षेत्रीय प्लग में कक्षों की संख्या से मेल खाता है। सेल घनत्व प्राप्त करने के लिए इस मान को 100-μm प्लग की मात्रा से विभाजित करें।
  6. स्थानिक रूप से परिष्कृत क्षेत्रीय प्लग विधि (चित्रा 1 सी) करें।
    नोट: इस दृष्टिकोण का उपयोग दवा अनुप्रयोग के जवाब में क्षेत्रीय सेल व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए किया गया था। अधिक संदर्भ फ्रेम शामिल करने से पूरे मॉडल मोटाई में गणना करने में सक्षम सेल घनत्व के रिज़ॉल्यूशन में सुधार होता है।
    1. केंद्र संदर्भ फ्रेम (चित्रा 1 सी, केंद्रीय पीला सर्कल) सेट करने और नमूना त्रिज्या प्राप्त करने के लिए चरण 4.4.1-4.4.3 दोहराएं।
    2. ब्याज के अतिरिक्त स्थानों को निर्धारित करने के लिए मैन्युअल गणना करें। ऐसा करने के लिए, X केंद्र मान में 100 μm जोड़ें, और उसके बादकेंद्र अक्ष के साथ पहले स्थान को परिभाषित करने के लिए केंद्र बिंदु के Y और Z मानों का उपयोग करें। चरण 4.4.2 (चित्रा 1 सी, केंद्र सर्कल से सटे पीले सर्कल) के रूप में इस स्थिति में एक संदर्भ फ्रेम जोड़ें।
      नोट: उच्च संकल्प घनत्व ट्रैकिंग की मांग कर रहे हैं, तो इस चरण में कम μm जोड़ें।
    3. नमूने की मोटाई के माध्यम से समान रूप से दूरी वाले प्लग की धुरी स्थापित करने के लिए प्रत्येक अनुक्रमिक एक्स-स्थान में 100 μm (या μm की वांछित संख्या) जोड़ने, चरण 4.6.2 दोहराएँ। नमूना (चित्रा 1 सी, पीले हलकों) के बाहरी त्रिज्या से दूर अंतिम संदर्भ फ्रेम ≤50 μm रखें।
    4. प्रत्येक 100 μm व्यास प्लग के भीतर सेल गिनती प्राप्त करने के लिए चरण 4.5.3-4.5.5 दोहराएँ। स्थानीय सेल घनत्व प्राप्त करने के लिए प्रत्येक संबंधित प्लग की मात्रा से इन मानों को विभाजित करें।
    5. दवा परीक्षण के प्रत्येक समय बिंदु पर एकत्र किए गए ओसीटी डेटा के लिए इस अनुभाग में सभी चरणों को दोहराएं। उपचार समय पाठ्यक्रम के माध्यम से प्रत्येक स्थान पर सेल गिनती की तुलना करने से पता चलना चाहिए कि कोशिका घनत्व कहां कम हो रहा है (यानी, कोशिका मृत्यु का अनुभव करने वाले क्षेत्र) और, परिणामस्वरूप, दवा कितनी गहरी मर्मज्ञ है (यानी, कौन सी परतें सेल घनत्व में गिरावट देखती हैं बनाम जो सेल घनत्व के स्तर में वृद्धि को बनाए रखते हैं या प्रदर्शित करते हैं)।

Figure 1
चित्रा 1: योजनाबद्ध चित्रण( ए) गोलाकार समुच्चय में क्षेत्रीय सेल घनत्व का आकलन करने के लिए गाढ़ा परत (गोले) दृष्टिकोण। (बी) क्षेत्रीय प्लग विधि गैर-गोलाकार समुच्चय में स्थानीय सेल घनत्व का मूल्यांकन करने के लिए विकसित की गई थी, जहां छोटे (100 μm व्यास) गोलाकार प्लग (पीले रंग में दिखाए गए) का उपयोग प्रत्येक क्षेत्र / मोटाई पर घनत्व संकेतक के रूप में किया जाता है। (सी) स्थानिक रूप से परिष्कृत क्षेत्रीय प्लग विधि दवा प्रवेश अध्ययन के लिए नियोजित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

एक पूर्व प्रकाशन में, ओसीटी10 का उपयोग करके सेलुलर समुच्चय के भीतर वैश्विक सेल घनत्व के गैर-विनाशकारी माप के लिए एक विधि स्थापित की गई थी। इसमें, इस तकनीक को विकासशील सेल समुच्चय के क्षेत्रीय सेल घनत्व का आकलन करने के लिए बढ़ाया गया है। चित्रा 1 इस विस्तार की एक योजनाबद्ध दिखाता है, जहां सेल घनत्व का मूल्यांकन एक गोलाकार या अधिक स्थानीय रूप से छोटे (100 μm व्यास) गोलाकार प्लग को देखकर किया जा सकता है, जो चित्रा 1 बी, सी में पीले हलकों द्वारा दर्शाया गया है। एमडीए-एमबी -231 ट्यूमर स्फेरॉइड का मूल्यांकन शुरू में कुल के भीतर एक केंद्र बिंदु स्थापित करके और गोलाकार की अनुक्रमिक संकेंद्रित परतों में वस्तुओं / इन परिणामों को चित्रा 2 में प्रस्तुत किया गया है। छात्र के टी-परीक्षण से संक्रमणकालीन (पी = 4.3 ई -4) और बाहरी परतों (पी = 4.0 ई -6) की तुलना में गोलाकार कोर में काफी अधिक सेल घनत्व का पता चला। यह परिणाम 4 दिनों के बाद गोलाकार कोर में संघनन को इंगित करता है।

Figure 2
चित्रा 2: गोलाकार एमडीए-एमबी -231 समुच्चय के लिए गाढ़ा परत दृष्टिकोण द्वारा गणना की गई क्षेत्रीय घनत्व में अंतर। यह आंकड़ा कोशिकाओं (एन = 3) के साथ एक रेडियल सेल-घनत्व ढाल को दर्शाता है जो कुल कोर में सबसे घनी पैक किया जाता है, और कोर से दूरी के साथ स्थानीय सेल घनत्व कम हो जाता है। औसत कुल सेल गिनती एक नीली रेखा के साथ दिखाया गया है। इनसेट छवि के लिए स्केल बार 100 μm है। एसडी ± मतलब के रूप में दिखाया गया डेटा (*= पी < 0.05, ***= पी < 0.001)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

हालांकि, इस गाढ़ा परत तकनीक की एक सीमा यह है कि इसका उपयोग केवल गोलाकार समुच्चय पर किया जा सकता है। इस प्रकार, सेल गिनती दृष्टिकोण को एक क्षेत्रीय प्लग विधि स्थापित करने के लिए अनुकूलित किया गया था, जो एक आभासी बायोप्सी के समान कुल के माध्यम से अनुक्रमिक स्थानों पर छोटे क्षेत्रों का नमूना लेता है। ये प्लग विशिष्ट गहराई पर स्थानीय सेल घनत्व के माप प्रदान करते हैं। इस तकनीक को एक ही एमडीए-एमबी -231 स्फेरॉइड (चित्रा 3) पर विश्लेषण करके गाढ़ा परत दृष्टिकोण के खिलाफ मान्य किया गया था। परिणामों ने इन गोलाकार समुच्चय के लिए क्षेत्रीय प्लग और गाढ़ा परत दृष्टिकोण के बीच अच्छा समझौता दिखाया। छात्र के टी-परीक्षणों से बाहरी और संक्रमणकालीन परतों (पी = 0.243 और 0.484, क्रमशः) को मापने के लिए दृष्टिकोणों के बीच कोई सांख्यिकीय अंतर नहीं पता चला और कुल कोर (पी = 0.017) पर घनत्व की गणना करते समय मामूली लेकिन महत्वपूर्ण अंतर।

Figure 3
चित्रा 3: संकेंद्रित क्षेत्र और क्षेत्रीय प्लग दृष्टिकोण गोलाकार एमडीए-एमबी -231 समुच्चय (एन = 3) में सेल घनत्व की मात्रा निर्धारित करने के लिए समान परिणाम प्रदान करते हैं। एसडी (* = पी < 0.05) ± माध्य के रूप में दिखाया गया डेटा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इस तकनीक को तब परिपक्वता (चित्रा 4) के दिन 4 पर गोलाकार और गैर-गोलाकार ट्यूमर समुच्चय दोनों का आकलन करने के लिए लागू किया गया था, सेल प्रकार के बावजूद परीक्षण किए गए सभी आकृति विज्ञान के लिए कोर संघनन की ओर एक समान प्रवृत्ति का अवलोकन करते हुए। मैट्रिगेल (तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स) के साथ तैयार किए गए नमूनों में यह प्रवृत्ति सबसे प्रमुख थी, एक योजक जो एकत्रीकरण को बढ़ावा देने के लिए जाना जाता है, फिर भी जिसके बहिर्जात कारकों और संरचनाको खराब रूप से 31,32,33 की विशेषता है। दिलचस्प बात यह है कि मैट्रिक्स के अलावा मात्रा या सेल गिनती को प्रभावित नहीं करता है और इस प्रकार सेल प्रसार पर नगण्य प्रभाव पड़ता है। इसके बजाय, मैट्रिक्स जोड़ सेल घनत्व को पुनर्वितरित करने, महत्वपूर्ण कोर संघनन को बढ़ावा देने और बाहरी परतों में सेल घनत्व को कम करने के लिए प्रकट होता है। ये परिणाम यह भी इंगित करते हैं कि एयू 565 कोशिकाएं एमडीए-एमबी -231 कोशिकाओं की तुलना में मैट्रिक्स-मध्यस्थता एकत्रीकरण प्रभावों के प्रति कम संवेदनशील दिखाई देती हैं। ये निष्कर्ष भौतिक तंत्र में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं जिसके द्वारा मैट्रिक्स विभिन्न स्तन कैंसर सेल लाइनों में सेल एकत्रीकरण को सक्षम बनाता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि क्षेत्रीय प्लग दृष्टिकोण गोलाकार या गैर-गोलाकार कुल ज्यामिति प्रदर्शित करने वाले किसी भी एमसीटीएस के अनुरूप होना चाहिए।

Figure 4
चित्रा 4: मैट्रिक्स जोड़ अधिक एकत्रीकरण को बढ़ावा देता है और कैंसर सेल लाइनों में सेल घनत्व को पुनर्वितरित करता है। एमडीए-एमबी -231 (ए, बी) और एयू 565 (सी, डी) सेल लाइनों दोनों के लिए, मैट्रिक्स जोड़ बाहरी क्षेत्र में घनत्व को कम करता है और समग्र सेल गिनती को सराहनीय रूप से बदले बिना केंद्र (एन = 3) में संघनन बढ़ाता है। औसत कुल सेल गिनती नीली रेखाओं के साथ दिखाई जाती है। इनसेट स्केल बार = 100 μm। एसडी ± माध्य के रूप में दिखाए गए डेटा (*= पी < 0.05, **= पी < 0.01, ***= पी < 0.001)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अगला, इस क्षेत्रीय प्लग दृष्टिकोण का उपयोग टीजेडएम-उपचारित ट्यूमर समुच्चय गैर-विनाशकारी रूप से कोशिका मृत्यु को ट्रैक करने के लिए किया गया था। झिल्ली मैट्रिक्स के साथ तैयार एयू 565 एमसीटीएस को विकास के दिन 4 पर टीजेडएम के साथ इलाज किया गया था, और दिन 9 के माध्यम से सुसंस्कृत किया गया था, जिसमें 0 घंटे (पूर्व-दवा), 24 घंटे और 120 घंटे (5 दिन) पर प्रमुख ओसीटी इमेजिंग टाइमपॉइंट थे। स्थानिक रूप से परिभाषित क्षेत्रीय प्लग विधि प्रत्येक टाइमपॉइंट पर लागू की गई थी, जिसमें प्लग प्रत्येक कुल की पूरी मोटाई में हर 100 μm सेट किए गए थे, जैसा कि चित्रा 1 सी में पीले हलकों द्वारा दिखाया गया है। केंद्र प्लग का आकार स्थिर रखा गया था, जबकि बाहरी प्लग को व्यास में उतार-चढ़ाव करने की अनुमति दी गई थी, जो कुल आकार बदलने के अनुरूप था। सेल घनत्व में मामूली उतार-चढ़ाव प्रत्येक कुल के आंतरिक 500 μm के भीतर समय के साथ मनाया गया, न्यूनतम कोशिका मृत्यु (चित्रा 5) का संकेत। दरअसल, अधिकांश कोशिका मृत्यु प्रत्येक समुच्चय के बाहरी 200 μm में हुई, विशेष रूप से सबसे बाहरी 100 μm में, जो विश्लेषण किए गए सभी समुच्चय के लिए 120 घंटे के समय बिंदु तक पूरी तरह से गायब हो गई। सांकेतिक दवा प्रतिक्रिया के रूप में कोशिका मृत्यु का दृश्य ज्यादातर एमसीटीएस की बाहरी परतों में टीजेडएम के दवा प्रवेश मुद्दों के अनुरूप है, जो 145 केडीए34 के आणविक भार के साथ एक नैदानिक रूप से प्रासंगिक एंटीबॉडी दवा है। दरअसल, दवा इन घने सेलुलर मॉडल के माध्यम से निष्क्रिय प्रसार पर निर्भर करती है, जो मॉडल में 200 μm से अधिक गहराई से प्रवेश करने की अपनी क्षमता को चुनौती देने की उम्मीद है।

Figure 5
चित्रा 5: दवा के जवाब में सेल व्यवहार्यता, कुल मोटाई में मापा जाता है। आंतरिक कोर पर प्लग को 100 μm व्यास पर स्थिर रखा गया था, जबकि बाहरी क्षेत्र में कुल आकार बदलने के साथ उतार-चढ़ाव की अनुमति दी गई थी। (ए) टीजेडएम जोड़ के जवाब में क्षेत्रीय कोशिका घनत्व से पता चला कि कोशिका मृत्यु काफी हद तक बाहरी 200 μm, विशेष रूप से बाहरी 100 μm के लिए विवश थी, जो उपचार के 120 घंटे के बाद पूरी तरह से गायब हो गई थी। समुच्चय की आंतरिक 500 μm मोटाई सेल गिनती (एन = 3) में थोड़ा बदलाव देखा। औसत कुल सेल गिनती प्रत्येक टाइमपॉइंट के लिए संबंधित रंगीन लाइनों के साथ दिखाई जाती है। डेटा को औसत ± एसडी के रूप में दिखाया गया है (बी) हीट-मैप प्लॉट कुल मोटाई के एक समारोह के रूप में दवा के जवाब में औसत सेल घनत्व में परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

अर्थ
बहुकोशिकीय ट्यूमर स्फेरॉइड (एमसीटीएस) ट्यूमर प्रगति और दवा स्क्रीनिंग 1,2,3 का अध्ययन करने के लिए शक्तिशाली 3 डी इन विट्रो मॉडल हैं। इन अपेक्षाकृत सरल कुल मॉडल की उपयोगिता को आगे बढ़ाना उनकी प्रमुख विशेषताओं, जैसे आकृति विज्ञान और सेल घनत्व के लक्षण वर्णन पर बहुत अधिक निर्भर करता है, जो ट्यूमर मॉडल प्रगति और चिकित्सीय प्रतिक्रिया दोनों को प्रभावित करने के लिए जाने जाते हैं। हालांकि, उनका अपेक्षित आकार इन विशेषताओं के मूल्यांकन में चुनौतियों का परिचय देता है, विशेष रूप से गैर-विनाशकारी विश्लेषण के लिए। प्रस्तुत विधि घने 3 डी कुल मॉडल के असतत क्षेत्रों के भीतर सेल घनत्व और व्यवहार्यता के अनुदैर्ध्य और लेबल मुक्त मात्रा का ठहराव के लिए एक नया उपकरण प्रदान करती है। एक ही समुच्चय को कई विकास दिनों में ऑप्टिकल कोहेरेंस टोमोग्राफी (ओसीटी) के साथ फिर से चित्रित किया जा सकता है। इन वॉल्यूमेट्रिक स्कैन का विश्लेषण यह बताने के लिए किया जा सकता है कि एमसीटीएस परिपक्वता के दौरान सेल घनत्व क्षेत्रीय रूप से कैसे विकसित होता है। ये वही सिद्धांत ड्रग्स समुच्चय के विश्लेषण पर लागू होते हैं, जिन्हें किसी दिए गए दवा आहार में अनुदैर्ध्य रूप से चित्रित किया जा सकता है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि सेल घनत्व कहां कम हो रहा है, यानी, जहां दवा सक्रिय रूप से कोशिकाओं को मार सकती है। यह दृष्टिकोण समान सेल-स्केल जानकारी प्राप्त करने के लिए पूर्व विधियों में काफी सुधार करता है, जिसके लिए पारंपरिक रूप से निर्धारण, धुंधला और / या सेक्शनिंग की आवश्यकता होती है, इस प्रकार अनुदैर्ध्य विश्लेषण को रोकना। दरअसल, इस उपकरण में किसी दिए गए अध्ययन के लिए आवश्यक नमूनों की संख्या को नाटकीय रूप से कम करने की क्षमता है क्योंकि एक ही नमूने का लगातार विश्लेषण किया जा सकता है। यह प्रत्येक समय बिंदु पर अतिरिक्त मूल्य पेश करने की भी उम्मीद है क्योंकि विकास को एक एकल कुल के भीतर ट्रैक किया जा सकता है क्योंकि यह आयु-मिलान वाले टर्मिनल नमूनों से सहसंबद्ध डेटा पर भरोसा करने के बजाय किसी दिए गए उत्तेजना का जवाब देता है। यहां प्रदर्शित इस एमसीटीएस एप्लिकेशन से परे, यह ओसीटी-इमारिस विधि अन्य सेलुलर समुच्चय, भ्रूण निकायों, अधिक जटिल ऑर्गेनोइड, या ऊतक के नमूनों का अध्ययन कुछ मिलीमीटर मोटी तक कर सकती है। यह प्रोटोकॉल घने कुल मॉडल के भीतर समग्र विकास और दवा प्रतिक्रिया के दौरान सेल संघनन की समझ में सुधार करेगा।

संशोधन
प्रस्तुत प्रोटोकॉल एमडीए-एमबी -231 और एयू 565 एमसीटीएसएस मॉडल के विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया गया था। अन्य सेल लाइनों का उपयोग करके बनाए गए मॉडल लागू होते हैं; हालांकि, औसत सेल आकार और कुल आकृति विज्ञान में परिवर्तन के कारण कुछ प्रोटोकॉल अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। एक अलग अध्ययन किया गया था जिसमें एमडीए-एमबी -231 और एयू 565 कोशिकाओं को 2 डी में चढ़ाया गया था और माइक्रोस्कोपी के माध्यम से औसत सेल आकार प्राप्त किया गया था। इस व्यास का उपयोग इमारिस "स्पॉट" फ़ंक्शन के भीतर एक्सवाई व्यास के रूप में किया गया था जैसे कि इस अनुमानित आकार की वस्तुओं को गिना जाता था। इस मान को परिवर्तित करने से नमूना10 के भीतर स्थित ऑब्जेक्ट्स की संख्या परिवर्तित हो जाती है, और जब यह इनपुट कक्ष आकार से निकटता से मेल खाता है, तो अधिक सटीक परिणाम अपेक्षित होते हैं. इस प्रकार, एक उपयुक्त एक्सवाई व्यास को उपयोग किए गए सेल प्रकार के लिए औसत सेल आकार द्वारा सूचित किया जाना चाहिए।

महत्वपूर्ण चरण और समस्या निवारण
ओसीटी इमेजिंग के दौरान महत्वपूर्ण चरणों में से एक स्कैन रिज़ॉल्यूशन का चयन है। उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित पिक्सेल आकार पर्याप्त रूप से छोटा होना चाहिए जैसे कि उपयोग किए जा रहे सेल प्रकार के औसत आकार को शामिल करने के लिए कई पिक्सेल की आवश्यकता होती है। यह कोशिकाओं के ओसीटी के संकल्प में सुधार करके और इस संभावना को कम करके इमारिस के भीतर "स्पॉट" विश्लेषण की सटीकता में सुधार करता है कि स्टोकेस्टिक पिक्सेल शोर सेल गिनती को नकारात्मक रूप से प्रभावित करेगा।

इमारिस संदर्भ फ्रेम के भीतर नमूने का अलगाव सेल घनत्व के लिए आउटपुट मूल्यों को बहुत प्रभावित करता है। जैसा कि उपयोगकर्ता इस चरण को करता है, यह व्यक्तिपरकता और पूर्वाग्रह के स्तर के साथ होता है जिसे सभी नमूना विश्लेषणों में लगातार लागू किया जाना चाहिए। इमारिस विश्लेषण शुरू करने के लिए वॉल्यूम स्कैन के भीतर नमूने को अलग करते समय, कुल रूपरेखा को सही ढंग से ट्रेस करने और कलाकृतियों (यानी, सब्सट्रेट या मीडिया ऊंचाई से प्रतिबिंब) को शामिल करने से बचने के लिए देखभाल की जानी चाहिए।

क्षेत्रीय प्लग विश्लेषण के दौरान संदर्भ फ्रेम का उचित प्लेसमेंट एक और महत्वपूर्ण कदम है। जैसा कि परिचय में कहा गया है, मॉडल विकास के दौरान विश्लेषण करने के लिए तीन महत्वपूर्ण क्षेत्र प्रोलिफेरेटिव बाहरी क्षेत्र, संक्रमणकालीन क्षेत्र जिसमें सेनेसेंट / प्रत्येक परत के केंद्र के भीतर संदर्भ फ्रेम की नियुक्ति से उस क्षेत्र के भीतर सेल घनत्व का सबसे सटीक अनुमान प्राप्त होने की उम्मीद है। यह संदर्भ फ्रेम प्लेसमेंट दवा अध्ययन के लिए यहां उपयोग किए जाने वाले विस्तृत क्षेत्रीय प्लग विश्लेषणों के लिए और भी अधिक महत्व का है, क्योंकि दवा प्रतिक्रिया का अधिक सटीक विश्लेषण करने के लिए समान रूप से दूरी वाले क्षेत्रों को स्थापित किया जाना चाहिए।

सीमाएं और भविष्य के अनुसंधान
प्रस्तावित विधि की मुख्य सीमा ओसीटी वॉल्यूम स्कैन के भीतर कुल को अलग करने के लिए इमारिस के भीतर किए गए उपयोगकर्ता-आधारित स्लाइस-बाय-स्लाइस ट्रेसिंग है। यह सटीक परिणामों के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है, जो कुछ हद तक व्यक्तिपरक है और इसलिए, अंतर-उपयोगकर्ता परिवर्तनशीलता के कुछ स्तर प्रदान करने की उम्मीद है। इसे संबोधित करने के लिए, हम वर्तमान में इमारिस में स्कैन अपलोड करने से पहले मैटलैब (या इसी तरह) के भीतर किए गए एज-डिटेक्शन एल्गोरिदम को शामिल करने की मांग कर रहे हैं। इस एल्गोरिथ्म को प्रगतिशील बी-स्कैन स्लाइस में नमूना किनारों की निष्पक्ष रूप से पहचान करनी चाहिए, जिसके बाद प्रस्तावित विश्लेषण इस पूर्व-पृथक नमूना क्षेत्र पर किया जा सकता है। इस सीमा को संबोधित करने से उपयोगकर्ता-आधारित परिवर्तनशीलता को हटा दिया जाएगा और इस ओसीटी-आधारित टूल की व्यापक प्रयोज्यता की उम्मीद है।

दवा उपचार के दौरान समुच्चय के भीतर जीवित कोशिकाओं को सटीक रूप से चित्रित करने के लिए ओसीटी की क्षमता कोशिका मृत्यु के मोड पर आकस्मिक है जिस पर दवा संचालित होती है। पहले के काम से पता चला कि लाइव सेल गिनती में मात्रात्मक अशुद्धियों का पता चला ओसीटी / इमारिस डॉक्सोरुबिसिन के जवाब में, एक प्रसिद्ध कैंसर विरोधी दवा जो परिगलन और एपोप्टोसिस10 के माध्यम से कोशिकाओं को मारती है। यह परिगलन के दौरान बचे हुए कोशिका झिल्ली के कारण होने की परिकल्पना की जाती है, जो संरचनात्मक इमेजिंग के दौरान जीवित कोशिकाओं के रूप में दिखाई देने की उम्मीद है। टीजेडएम मुख्य रूप से एपोप्टोसिस35 के माध्यम से कोशिकाओं को मारने के लिए जाना जाता है; इस प्रकार, जब कोशिकाएं मर जाती हैं, तो उन्हें ओसीटी द्वारा ट्रैक / गिनती नहीं करने के लिए पर्याप्त रूप से छोटे टुकड़ों में टूटना चाहिए। यद्यपि एक एपोप्टोटिक दवा के साथ आगे सत्यापन परीक्षण की आवश्यकता है, हमारे शुरुआती पायलट प्रयोगटीजेडएम (अप्रकाशित डेटा) के साथ ड्रग्स किए गए एमसीटीएस में अलग सेल गिनती के लिए ओसीटी / इसलिए, यहां प्रस्तुत लाइव सेल परिणाम परिगलन-उत्प्रेरण दवाओं की तुलना में अधिक सटीक होने का अनुमान है। ड्रग्स समुच्चय में व्यवहार्यता परीक्षण के लिए इस दृष्टिकोण को लागू करते समय इस अंतर को ध्यान में रखा जाना चाहिए।

ट्यूमर समुच्चय के गैर-विनाशकारी मूल्यांकन में भविष्य के शोध से यह समझने में सुधार होने की उम्मीद है कि वे बाहरी उत्तेजनाओं और दवा उपचार दोनों को कैसे विकसित और प्रतिक्रिया देते हैं। विश्लेषणात्मक उपकरणों का विकास, जैसे कि यहां प्रस्तुत किया गया है, मॉडल उपयोगिता का विस्तार करना चाहिए और परिणाम सटीकता में सुधार करना चाहिए, विशेष रूप से दवा स्क्रीनिंग और वितरण / प्रभावकारिता मूल्यांकन जैसे प्रभावशाली अनुप्रयोगों के भीतर।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को एनआईएच आर 01 बीआरजी सीए 207725 (एमबी / डीटीसी) और एनआईएच आर 01 सीए 233188 (एमबी) द्वारा समर्थित किया गया था। हम इन प्रयोगों के लिए प्रदान किए गए ट्रास्टुज़ुमाब के लिए एएमसी फार्मेसी को धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well plates Greiner Bio-One  650970 CellStar Cell-Repellent Surface, https://shop.gbo.com/en/usa/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-repellent-surface/
0.25% trypsin, 2.21 mM EDTA Corning 25-053-CI
AU565 breast cancer cells ATCC
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Corning 10-013-CV
Fetal Bovine Serum ATCC 30-2020
FIJI software open-source (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/
Hemocytometer Fisher Scientific 0267151B
Imaris image analysis software Bitplane Current version 9.8
L-glutamine Lonza 17-605E
Matrigel Corning 354263
MDA-MB-231 breast cancer cells ATCC
Microscope Zeiss Z1 AxioVision
Penicilin streptomycin Corning 30-0002CI
Plate centrifuge Eppendorf
RPMI medium 1640 Gibco 11875-085
Spectral Domain Optical Coherence Tomography ThorLabs TEL220C1
T75 cell culture flasks Greiner Bio-One  658175
Trastuzumab Remnant clinical samples of Trastuzumab were used in this study, generously gifted by the Albany Medical College Pharmacy. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutherland, R., JA, M., Inch, W. Growth of multicell spheroids in tissue culture as a model of nodular carcinomas. Journal of the National Cancer Institute. 46 (1), 113-120 (1971).
  2. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  3. Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional. Analytical Biochemistry. 437 (1), 17-19 (2013).
  4. Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model. Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).
  5. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
  6. Jiang, Y., Pjesivac-Grbovic, J., Cantrell, C., Freyer, J. P. A multiscale model for avascular tumor growth. Biophysical Journal. 89 (6), 3884-3894 (2005).
  7. Freyei, J. P., Sutherland, R. M. Regulation of growth saturation and development of necrosisin EMT6/R0 multicellular spheroids by the glucose and oxygen supply. Cancer Research. 46 (7), 3504-3512 (1986).
  8. Desoize, B., Jardillier, J. C. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance. Critical Reviews in Oncology Hematology. 36 (2-3), 193-207 (2000).
  9. Mellor, H. R., Ferguson, D. J. P., Callaghan, R. A model of quiescent tumour microregions for evaluating multicellular resistance to chemotherapeutic drugs. British Journal of Cancer. 93 (3), 302-309 (2005).
  10. Roberge, C. L., et al. Non-destructive tumor aggregate morphology and viability quantification at cellular resolution, during development and in response to drug. Acta Biomaterialia. 117, 322-334 (2020).
  11. Piccinini, F., Tesei, A., Bevilacqua, A. Single-image based methods used for non-invasive volume estimation of cancer spheroids a practical assessing approach based on entry-level equipment. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 135, 51-60 (2016).
  12. Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).
  13. Song, Y., et al. Patient-derived multicellular tumor spheroids towards optimized treatment for patients with hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 1-13 (2018).
  14. LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 7 (9), 819-830 (2012).
  15. Hakanson, M., Textor, M., Charnley, M. Engineered 3D environments to elucidate the effect of environmental parameters on drug response in cancer. Integrative Biology. 3 (1), 31-38 (2011).
  16. Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
  17. Huang, D., et al. Optical coherence tomography HHS public access. Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).
  18. Zhong, H. Q., et al. Enhancement of permeability of glycerol with ultrasound in human normal and cancer breast tissues in vitro using optical coherence tomography. Laser Physics Letters. 7 (5), 388-395 (2010).
  19. Fujimoto, J., Swanson, E. The development, commercialization, and impact of optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), (2016).
  20. Huang, Y., et al. Optical coherence tomography detects necrotic regions and volumetrically quantifies multicellular tumor spheroids. Cancer Research. 77 (21), 6011-6020 (2017).
  21. Hari, N., Patel, P., Ross, J., Hicks, K., Vanholsbeeck, F. Optical coherence tomography complements confocal microscopy for investigation of multicellular tumour spheroids. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
  22. El-Sadek, I. A., et al. Three-dimensional dynamics optical coherence tomography for tumor spheroid evaluation. Biomedical Optics Express. 12 (11), 6844 (2021).
  23. Kingsley, D. M., et al. Laser-based 3D bioprinting for spatial and size control of tumor spheroids and embryoid bodies. Acta Biomateralia. 95, 357-370 (2019).
  24. Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
  25. Roberge, C. L., Rudkouskaya, A., Barroso, M., Corr, D. T. Longitudinal, label-free assessment of cell density and viability in multicellular tumor spheroids via optical coherence tomography. Summer Biomechanics, Bioengineering, and Biotransport Conference. , (2020).
  26. Bellotti, C., Duchi, S., Bevilacqua, A., Lucarelli, E., Piccinini, F. Long term morphological characterization of mesenchymal stromal cells 3D spheroids built with a rapid method based on entry-level equipment. Cytotechnology. 68 (6), 2479-2490 (2016).
  27. Noto, A., et al. Stearoyl-CoA desaturase-1 is a key factor for lung cancer-initiating cells. Cell Death & Disease. 4 (12), 947 (2013).
  28. Riffle, S., Hegde, R. S. Modeling tumor cell adaptations to hypoxia in multicellular tumor spheroids. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 36, 102 (2017).
  29. Wilson, W. R., Hay, M. P. Targeting hypoxia in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11, 393-410 (2011).
  30. Grimes, D. R., Kelly, C., Bloch, K., Partridge, M. A method for estimating the oxygen consumption rate in multicellular tumour spheroids. Journal of the Royal Society Interface. 11 (92), 20131124 (2014).
  31. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  32. Pozzi, S., et al. Meet me halfway: Are in vitro 3D cancer models on the way to replace in vivo models for nanomedicine development. Advanced Drug Delivery Reviews. 175, 113760 (2021).
  33. Nguyen, E. H., Daly, W. T., Belair, D. G., Le, N. N., Murphy, W. L. High throughput screening format identifies synthetic mimics of matrigel for tubulogenesis screening. , Available from: https://abstracts.biomaterials.org/data/papers/2015/abstracts/547.pdf (2015).
  34. Duchnowska, R., Szczylik, C. Central nervous system metastases in breast cancer patients administered trastuzumab. Cancer Treatment Reviews. 31 (4), 312-318 (2005).
  35. Zazo, S., et al. Generation, characterization, and maintenance of trastuzumab-resistant HER2+ breast cancer cell lines. American Journal of Cancer Research. 6 (11), 2661-2678 (2016).

Tags

कैंसर अनुसंधान अंक 184
ड्रग उपचार के बाद ट्यूमर समुच्चय के भीतर क्षेत्रीय सेल घनत्व का गैर-विनाशकारी मूल्यांकन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Roberge, C. L., Wang, L., Barroso,… More

Roberge, C. L., Wang, L., Barroso, M., Corr, D. T. Non-Destructive Evaluation of Regional Cell Density Within Tumor Aggregates Following Drug Treatment. J. Vis. Exp. (184), e64030, doi:10.3791/64030 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter