Summary
본 프로토콜은 3D 종양 응집체 내에서 신속하고, 비파괴적이며, 라벨이 없는 지역 세포 밀도 및 생존력 측정을 위한 이미지 기반 기술을 개발한다. 연구 결과는 세포 밀도 구배를 밝혀 냈으며, 트라스투주맙으로 처리된 HER2+ 응집체에서 응집체를 개발하고 주로 말초 세포 사멸을 발달시키는 데 있어서 외층보다 코어 영역에서 더 높은 세포 밀도를 보였다.
Abstract
다세포 종양 스페로이드 (MCTSs) 모델은 암 진행 및 약물 발견 의 시험관내 연구에 대한 증가하는 유용성을 입증했다. 이러한 비교적 간단한 무혈관 구축물은 3D 구조 및 병리생리학적 구배와 같은 생체내 종양의 주요 측면을 모방한다. MCTSs 모델은 스페로이드 발달 중 및 약물에 대한 반응으로 암 세포 행동에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 그러나 필요한 크기는 비파괴 평가에 사용되는 도구를 크게 제한합니다. 광학 일관성 단층 촬영 구조 이미징 및 Imaris 3D 분석 소프트웨어는 MCTS 내의 지역 세포 밀도를 신속하고 비파괴적이며 라벨 없이 측정하기 위해 탐구됩니다. 이 접근법은 4 일간의 성숙 기간 동안 그리고 임상 적으로 관련된 항 HER2 약물 인 Trastuzumab을 사용한 연장 된 5 일 치료를 통해 MCTS를 평가하는 데 사용됩니다. 간략하게, AU565 HER2+ 유방암 MCTS는 마트리겔(기저막 매트릭스)의 첨가 유무에 관계없이 액체 오버레이를 통해 생성되어 다양한 형태학(각각 두껍고 디스크형 2.5D 응집체 또는 평평한 2D 응집체)의 응집체를 탐색했습니다. 외부 영역, 전이 영역 및 내부 코어 내의 세포 밀도는 성숙된 MCTS를 특징으로 하여, 외부 층에 비해 코어 영역에서 더 높은 세포 밀도를 갖는 세포 밀도 구배를 드러냈다. 매트릭스 추가는 셀 밀도를 재분배하고 이러한 구배를 향상시켜 외부 영역 밀도를 감소시키고 코어에서 셀 압축을 증가시켰다. 세포 밀도는 약물 반응의 잠재적인 지역적 차이를 평가하기 위해 점진적으로 더 깊은 100 μm 구역 내에서 약물 처리 (0 h, 24 h, 5일) 후에 정량화하였다. 최종 시점까지, 거의 모든 세포 사멸은 각 응집체의 외부 200 μm에 제약을 받는 것으로 나타났고, 응집체 내의 더 깊은 세포는 크게 영향을 받지 않는 것으로 나타났으며, 이는 약물 침투의 한계로 인한 약물 반응의 지역적 차이를 예시하였다. 현재의 프로토콜은 조밀 한 세포 조직 내의 지역 세포 밀도를 비파괴적으로 정량화하고 종으로 측정하는 독특한 기술을 제공합니다.
Introduction
연구자들은 종양 진행의 주요 특징 중 일부를 연구하기 위해 벤치 탑 3D 배양 시험관 내 시스템으로 크게 전환했습니다. 이 연구의 대부분은 다세포 종양 구상체 (MCTS)와 더 복잡한 오가노이드 1,2의 재 출현에 의해 주도되었습니다. 이러한 모델은 avascular이지만, 생체 내 3,4,5에서 발생하는 생리 학적 및 병리학 적 과정을 되풀이하기위한 강력한 도구를 제공합니다. 특히, 중간 크기 모델 (직경 300-500 μm)은 코어 내 저산소증으로 인한 3D 구조, 병리 생리학적 구배 및 전이성 신호전달과 같은 주요 종양 특징을 모방 할 수 있습니다. 이 모델들은 혈관화된 생체 내 종양에서 볼 수 있는 특징적인 동심원층, 즉 증식성 세포의 외층, 노화/정지 세포의 과도기적 층, 그리고 코어에서 저산소증을 경험하는 세포를 나타낸다는 것은 잘 문서화되어 있다 3,6,7,8,9 . 독특한 통찰력은 이러한 층 내에서, 개발 중 및 약물에 대한 반응으로 세포 행동을 특성화함으로써 이러한 모델로부터 얻을 수 있습니다. 그러나 강력한 시험관 내 모델을 만드는 그라디언트를 개발하는 데 필요한 필수 MCTS 크기는 비파괴 평가에 사용되는 도구를 크게 제한합니다. 실제로 MTCS의 비파괴 분석에서 가장 큰 과제 중 하나는 세포 규모 세부 사항을 정량화하는 것입니다. 밝은 필드 및 위상차 현미경은 3D MCTS의 성장과 발달을 비파괴적으로 평가하기 위해 일상적으로 활용됩니다. 그러나 이러한 양식은 2D 프로젝션 으로 제한되며 이러한 모델10,11,12,13의 중요한 3D 구조를 시각화 할 수있는 능력이 부족합니다. 세포독성 및 세포 증식에 대한 정보는 전형적으로 형광 이미징 (즉, 광-시트 현미경, 공초점 현미경) 또는 생체외 면역조직학적 염색14,15,16을 통해 수집된다. 이러한 접근법은 조직 구조, 세포 밀도 및 세포 기능에 대한 귀중한 고해상도 정보를 제공하지만 종방향 분석을 방지하는 광학 클리어링, 고정 / 염색 또는 임베딩과 같은 샘플 준비가 필요한 경우가 많습니다.
OCT(Optical Coherence Tomography)는 위에서 언급한 도전 과제 중 일부를 극복할 수 있는 잠재력을 가진 비파괴 구조 이미징 양식입니다. 이 제품은 세포 분해능과 전체 다세포 응집체 17,18,19를 시각화 할 수있는 충분히 넓은 시야각 (최대 10mm x10mm)을 자랑합니다. 중요하게도, 사용된 빛의 가시적 특성으로 인해, 이 기술은 완전히 비파괴적이고 라벨이 없다17. 또한 샘플을 시료 준비 없이도 현장에서 이미징할 수 있으므로 인큐베이터에서 샘플을 직접 채취하여 OCT(스캔 지속 시간 ~ 5-10분)로 신속하게 스캔한 다음 인큐베이터로 반환하여 종방향 특성화가 가능합니다. OCT를 사용하여 종양 스페로이드 행동을 분석하려는 많은 연구가 최근에 나타났습니다. 가장 흥미로운 시연 중 하나에서, Huang et al.은 OCT를 사용하여 대형 종양 스페로이드 모델 내에서 괴사 성 코어를 비파괴적으로 검출했으며, 살아있는 세포 영역과 죽은 세포 영역이 광학 감쇠의 눈에 띄는 차이를 가지고 있으며, 이는 라벨이없는 생존력 모니터링(20)에 활용 될 수 있음을 지적했다. 유사하게, Hari 등은 샘플21 내의 저산소증의 존재를 연구하기 위해 OCT로 영상화된 인간 결장암 (HCT116) 구상체의 굴절률 (RI) 측정을 수행하였다. 그들의 측정은 직접적인 추론에 충분하지 않았지만, 괴사 성 코어의 크기는 아니지만 부위와 상관 관계가있는 위치에서 더 낮은 RI를 관찰했으며 나중에 공초점 현미경을 통해 확인되었습니다. Abd El-Sadek et al.은 OCT를 사용하여 유방암 종양 모델22의 지역 조직 생존력을 시각화하고 정량화했습니다. 그들은 조직 역학을 시각화하기위한 두 가지 OCT 기반 방법을보고했으며 이러한 메트릭의 차이와 살아있는 / 죽은 세포의 현미경 검사로 확인 된 영역 사이의 중간 상관 관계를 보여주었습니다.
OCT를 사용하여10,23 개발 중에 MCTSs 유방암 모델 내에서 3D 형태 및 세포 수를 측정하기위한 정량적이고 비파괴적인 접근법을 수립하기 위해이 이전 문헌을 기반으로 한 우리의 출판 된 연구. Imaris 3D 렌더링 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 OCT 볼륨 스캔 내에서 이미지화된 세포 크기 개체(즉, 반점)의 수를 계수하기 위해, 세포 카운트는 응집 해리 시 혈구세포계를 통해 결정된 것과 통계적으로 유사한 MCTS에서 비파괴적으로 측정되었다. 그러나, OCT의 구조적 특성으로 인해, 괴사에 의한 세포 사멸 후에도 여전히 존재하는 세포막은 살아있는 세포로 잘못 계산될 수 있다. 더욱이, 이러한 특성화는 유망한 성공을 갖는 약물 처방을 실시한 개별 응집체 내의 세포 생존력을 비파괴적으로 추적하도록 확장되었다(10). 중요하게도, 유사한 세포 생존율이 우리의 OCT-Imaris 접근법으로부터 해리시 이들 샘플 내에서 벤치마킹된 것과 함께 보고되었다는 것이 주목되었다. 이 비파괴적이고 라벨이 없는 셀 접근법은 세포가 구성물/응집체 구조를 희생하지 않고 종방향으로 3D 구조물 및 조밀한 응집체 내에서 계수될 수 있게 한다.
본 연구는 OCT-Imaris가 3D 응집체 형태학과 세포 수를 측정하는 능력을 활용하여 조밀 응집체 내의 지역 세포 밀도를 직접 정량화하는 개선 된 접근법을보고합니다. 이러한 방법론적 발전은 MCTS 모델의 특징적인 동심원 층 내에서 세포의 공간적 분포와 증식에 대한 보다 상세한 그림을 제공한다. 단순히 전체 평균 응집체 세포 밀도를 계산하는 대신, 이러한 국소 밀도 측정은 다짐과 관련된 것과 같은 세포 밀도 구배를 나타낼 수 있다. 이 지역 평가는 또한 국소 세포 밀도의 변화에 의해 측정되는 국소 약물 반응을 평가하기 위해 화학요법으로 처리된 응집체에도 적용된다. OCT와 고급 이미징 분석 방법의 이러한 조합은 지역 세포 생존력의 정량화를 제공하며, 이는 세포 밀도의 감소를 경험하는 영역을 기반으로 약물 침투를 탐구하는 데 사용될 수 있습니다. 이것은 조밀 한 세포 조직 내의 약물에 반응하여 지역 세포 밀도와 생존력을 비파괴적으로 정량화하고 종으로 측정하는 첫 번째 보고서입니다. 전체 MCTS에 걸친 입체 세포 밀도 및 공간 분포의 이러한 특성화는 암 치료에서 약물 전달을 최적화하고 암 모델 진행에 대한 이해를 향상시키는 데 도움이 될 수 있습니다.
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Protocol
AU565 (HER2+) 및 MDA-MB-231 유방암 세포주를 본 연구에 사용하였다 ( 물질의 표 참조).
1. 종양 응집체 준비
- 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(RPMI) 1640 기본 배지(+)를 사용하여 10%(v/v) 태아 소 혈청과 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 L-글루타민을 사용하여 AU565(HER2+) 유방암 세포 성장 배지를 준비 합니다(자료 표 참조).
- 10% (v/v) 태아 소 혈청 (FBS), 100 U/mL의 페니실린/스트렙토마이신 및 2 mM의 L-글루타민으로 보충된 둘베코의 변형 이글 배지(DMEM)를 사용하여 MDA-MB-231 삼중 음성 유방암 세포 성장 배지를 준비 하십시오(표 참조).
- 표준 조건(37°C, 5%CO2, 95% 상대 습도)에서 두 세포주의 70%-90% 합류 세포 배양물(준비의 ∼3-4일)을 준비한다. 표준 트립신화 방법에 따라 배양 플라스크에서 세포 단층을 분리합니다.
참고 : 트립신에 대한 세포의 과다 노출을 방지하여 생존력에 영향을 미칩니다.- AU565 세포의 경우, 플라스크로부터의 흡인물 세포 배지를 피펫을 사용하여(또는 가능한 경우, 튜브를 통해 오토클레이브 유리 피펫 팁에 연결된 진공 펌프를 사용하여) 2 mL 트립신-EDTA로 교체한다. 플라스크를 실온에서 3 분 동안 방치 한 다음 4 분 동안 인큐베이터로 이동하십시오. 그 후, 6 mL의 성장 배지를 플라스크에 첨가하여 트립신을 중화시킨다.
- MDA-MB-231 세포의 경우, 단계 1.3.1에서 수행된 것과 동일한 방법으로 플라스크로부터의 흡인물 세포 배지를 1.5 mL 트립신-EDTA로 교체한다. 7분 배양 후, 8.5 mL의 성장 배지를 플라스크에 첨가하여 트립신을 중화시킨다.
- 10 μL의 세포 현탁액을 혈구분석기에 첨가하여 현탁액24 중의 세포 수를 결정한다. 세포를 2.5 × 10 5 cells/mL의 원하는 농도로 배지에 재현탁하십시오.
- 50 μL의 세포 현탁액을 둥근 바닥, 비부착성, 96-웰 플레이트의 각 웰에 분주한다. 마트리겔 없이 제조된 현탁액(기저막 매트릭스, 표 재료 참조)의 경우, 각 웰에 50μL의 일반 성장 배지를 첨가한다.
- 기저막 매트릭스로 제조된 현탁액의 경우, 매트릭스 바이알을 -20°C에서 꺼내 보관하고 냉장고에 넣어 밤새 해동시킨다. 성장 매체가있는 용기를 준비하고 10 분 동안 냉장 보관하여 차갑게하십시오.
- 냉동 피펫 팁을 사용하여이 용액의 최종 농도가 5 %가되도록 매트릭스를 냉각 된 매체에 첨가하십시오. 이 배지 50μL를 각 웰에 첨가하여 이들 웰에서 매트릭스의 최종 농도가 2.5%3가 되도록 한다.
참고: 이전 연구에서, 응집체 형태학은 이들 세포주10,25에 대해 평가되었고, MDA-MB-231 응집체가 막 매트릭스의 첨가와 함께 구상체를 형성하는 반면, MDA-MB-231 매트릭스 및 AU565+/- 매트릭스가 없는 배양물은 모두 디스크형 응집체를 형성한다는 것을 발견하였다. 0(평면) - 1.0(완벽한 구체)으로부터의 스케일로 >0.8의 정량화된 구형도를 사용하여 충분히 구형 응집체를 식별하였고, 따라서 생체내 유사 거동26,27에 대한 필수 표면 대 부피비를 가질 것으로 예상되었다.
- 플레이트를 시딩 직후에 실온에서 10분 동안 123 x g 에서 원심분리하여 각 웰의 바닥에서 세포 펠릿의 수집을 보장한다.
참고: 이 단계는 시드 후 가능한 한 빨리 수행해야 합니다. 저자들은 이러한 단계 사이에 너무 많은 시간이 걸리면 세포가 각 웰의 바닥과 측면을 가로 질러 정착하여 우물 바닥에서 수집하고 응집하는 능력을 저해한다는 것을 관찰했습니다. - 플레이트를 4일 동안 인큐베이션하고, 이때 세포 응집체가 성숙된 것으로 간주된다.
참고: 기저막 매트릭스로 제조된 AU565 응집체는 약물 반응 연구를 위해 추가적인 5일 배양 기간이 필요합니다(총 9일, 4일째에 배지 변화).
2. AU565 세포 응집체에 트라스투주맙(TZM)의 투여
- AU565 성장 배지에서 500 μg/mL의 TZM 용액( 물질 표 참조)을 준비합니다. 4일째에 이 용액 10μL를 각 웰에 첨가하여 각 웰 내의 최종 농도가 50μg/mL가 되도록 합니다.
- 배양물은 TZM의 첨가 후 5일 동안 추가로 집계되고 주요 시점에 평가된다.
참고 : 본 연구를 위해 0 h (약물 투여 직전), 24 h 및 120 h 후 약물 분석 시점을 사용했습니다.
3. 광학 일관성 단층 촬영 이미징
참고: 본 명세서의 샘플은 성숙의 매일(1-4) 동안 광학 일관성 단층촬영(OCT)으로 이미지화되었고, 이어서 선택된 약물 응집체에 대해 5일째(약물-첨가 후 24시간) 및 9일째(약물-첨가 후 120시간)에 다시 이미지화되었다. OCT 이미징을 위한 상업적 Spectral-Domain Optical Coherence Tomography (SDOCT, Table of Materials) 시스템을 현재 연구에 사용하였다. 이 접근법은 거의 모든 OCT 시스템에 적용 가능하고 따르는 절차는 일반적으로 서로 다른 시스템간에 유사하지만 다음 세부 단계 중 일부는 현재 장비에 따라 다릅니다.
- 구조 이미징을 위해 OCT 시스템을 활용하십시오. 고해상도 이미지 수집을 위해 A-스캔 속도를 5.5kHz로 설정합니다. 액체 매질의 샘플에 대해 굴절률을 1.33으로 설정합니다. 복셀 크기를 1.10 x 1.10 x 2.58μm3로 설정합니다.
- 화면 오른쪽의 이미지 매개 변수 창에서 X, Y 및 Z 값(mm)을 입력하여 샘플이 이 관심 영역 내에 포함되도록 시야각(FOV)을 설정합니다.
참고: 이들 연구를 위한 FOV는 전형적으로 1.5 x 1.5 x 0.5mm3로 설정되었다. 표본이 0도에서 90도 사이의 '각도' 입력을 번갈아 가며 시각적 확인을 수행하여 이 영역에 맞는지 확인합니다. - 3D 획득 모드를 클릭한 다음 기록을 클릭하여 샘플의 3D 볼륨 스캔을 수집합니다.
4. 이미지 분석
- OCT 파일을 소프트웨어 형식으로 내보냅니다(Imaris, 자료 표 참조).
- 소프트웨어 개발 키트에서 OCT 파일을 엽니다. 내보내기를 클릭하고 파일 형식을 .jpg로 설정 한 다음 이미지를 빈 폴더로 내보냅니다.
- 이미지 처리 소프트웨어(FIJI, 자료 표 참조)를 열고 내보낸 JPEG가 저장된 폴더에서 이미지 시퀀스를 가져옵니다. 소프트웨어를 사용하여 이미지 시퀀스를 함께 스티치한 다음 이 파일을 TIFF 이미지로 저장합니다.
- 아래 단계에 따라 볼륨 재구성을 만듭니다.
- Imaris를 열고 아레나 내에서 변환된 TIFF 파일로 이동합니다. > 이미지 속성 편집 으로 이동하여 OCT 이미지의 복셀 크기(μm)를 해당 XYZ 상자에 입력합니다. 그런 다음 확인을 클릭하십시오.
참고: 화면 왼쪽에 있는 샘플 개체 트리에서 볼륨 탭을 선택 취소하여 소프트웨어 지연을 방지하십시오. - 객체 트리 위에 있는 새 서피스 추가 를 클릭합니다. 트리 아래의 메뉴에서 자동 생성 건너 뛰기를 클릭하고 수동으로 편집하십시오. 디스플레이 조정 창 내에서 빨간색과 검은색 화살표를 수동으로 밀어 샘플과 배경 간의 대비를 향상시키고 샘플 시각화를 개선합니다.
- '슬라이스 위치'를 샘플의 한쪽 가장자리, 즉 샘플 신호가 처음 나타나는 슬라이스로 조정합니다. 이스케이프 키를 사용하여 마우스를 탐색 모드에서 선택 모드로 변경한 다음 그리기를 클릭합니다. 신호를 표시하는 영역의 윤곽선을 수동으로 추적합니다.
- 입력 상자에 다음 위치를 입력하여 슬라이스 위치를 진행합니다. 이 다음 위치는 이전 위치보다 샘플에 ≤100개 더 안쪽으로 슬라이스되어야 합니다. 신호를 표시하는 영역을 수동으로 추적합니다.
- 샘플의 반대쪽 가장자리에 도달할 때까지 샘플 두께를 통해 4.2.4단계를 반복합니다. 그런 다음 왼쪽 메뉴에서 서피스 만들기 를 클릭하여 이러한 슬라이스를 함께 스티치하고 볼륨 재구성을 완료합니다.
- 편집을 클릭하고 마스크 선택을 클릭하십시오. 이렇게 하면 디스플레이 조정 창에 격리된 샘플만 포함된 새 채널이 만들어집니다. 샘플의 형태학적 특성은 이제 통계 > 세부 정보 탭에서 찾을 수 있습니다.
참고: 이 접근법은 이 현재 연구에서 보고된 구형도와 부피를 결정하기 위해 수행되었습니다.
- Imaris를 열고 아레나 내에서 변환된 TIFF 파일로 이동합니다. > 이미지 속성 편집 으로 이동하여 OCT 이미지의 복셀 크기(μm)를 해당 XYZ 상자에 입력합니다. 그런 다음 확인을 클릭하십시오.
- 아래 단계에 따라 샘플의 총 세포 밀도를 얻습니다.
- 개체 트리 위에서 새 스폿 추가를 선택합니다. 알고리즘 설정 메뉴에서 모든 상자의 선택을 취소합니다. 파란색 화살표 를 클릭하여 소스 채널 화면으로 이동합니다.
- 나타나는 드롭다운 메뉴에서 5.2.8단계에서 만든 마스크된 채널(일반적으로 채널 2)을 선택합니다. XY 직경 상자에 샘플의 평균 셀 직경을 입력합니다. 배경 빼 기가 선택되어 있는지 확인합니다.
참고: AU565 및 MDA-MB-231 셀에 대한 이 작업의 경우 직경을 10μm로 설정했습니다. 이 선택은 셀 크기를 기반으로 합니다(토론 섹션에 설명되어 있음).
- 나타나는 드롭다운 메뉴에서 5.2.8단계에서 만든 마스크된 채널(일반적으로 채널 2)을 선택합니다. XY 직경 상자에 샘플의 평균 셀 직경을 입력합니다. 배경 빼 기가 선택되어 있는지 확인합니다.
- 파란색 화살표를 클릭하여 스팟 분류 화면으로 이동합니다. 메뉴 아래쪽에 있는 그래프에서 노란색 임계값의 왼쪽 가장자리를 클릭하고 그래프의 왼쪽 가장자리로 드래그하여 모든 개체가 노란색 음영처리된 임계값에 포함되도록 합니다. 그런 다음 녹색 화살표를 클릭하여 스팟 생성을 완료합니다.
- 통계> 전체 > 총 스팟 수를 클릭하여 식별된 개체 수(예: 샘플 셀 수)를 가져옵니다.
- 평균 응집체 세포 밀도를 결정하려면, 응집체의 셀 카운트(단계 4.3.3에서 측정됨)를 응집체 부피(단계 4.2.6에서 결정)로 나눈다.
- 개체 트리 위에서 새 스폿 추가를 선택합니다. 알고리즘 설정 메뉴에서 모든 상자의 선택을 취소합니다. 파란색 화살표 를 클릭하여 소스 채널 화면으로 이동합니다.
- 구형 응집체의 동심원 층에서 지역 밀도를 평가합니다 (그림 1A).
- 형태학적 및 세포 밀도 분석에 이어서, 국부적 밀도를 평가한다. 4.2.5단계에서 생성한 서피스를 클릭하고 서피스 스타일/품질 탭으로 이동합니다. 선택 영역을 중심점으로 변경하고 픽셀 너비를 ≤20으로 변경하여 최상의 가시성을 제공합니다. 통계 > 자세한 > 위치로 이동하여 중앙 지점의 위치를 기록합니다.
- 객체 트리 위의 메뉴에서 새 참조 프레임 추가 를 선택합니다. 메뉴에서 XY 옆에 있는 표시 및 수정 상자를 선택합니다. 참조 프레임 아이콘의 중심을 클릭하고 드래그하여 중심 점과 일치하도록 합니다. XY 표시 및 수정 상자를 선택 해제하고 XZ에 대해 선택합니다.
- 다시 한 번 참조 프레임 아이콘의 중심을 클릭하고 드래그하여 중심 지점과 일치하도록 합니다. 마지막으로, YZ 평면에 대해 이 작업을 반복하고, 참조 프레임이 중심 지점과 완벽하게 정렬될 때까지 이 세 개의 고정 평면을 번갈아 가며 반복합니다. 개체 트리에서 참조 프레임을 두 번 클릭하고 가운데 또는 유사 이름을 바꿉니다.
- 4.3단계에서 생성된 스팟을 클릭하고 통계 > 상세 > 위치 참조 프레임으로 이동합니다. 위치 X 참조 프레임 이 가장 높은 값에서 가장 낮은 값으로 정렬될 때까지 클릭합니다. 가장 높은 값을 기록하십시오 - 이것은 샘플의 가장 먼 가장자리, 즉 샘플 반지름을 나타냅니다.
참고: 여기에 사용된 샘플은 XY 평면에서 원형이므로 비슷한 결과를 가진 X 또는 Y 축을 따라 계산을 수행할 수 있습니다. X-Y 대칭(비대칭, 타원체, 불규칙한 형상 등)을 나타내지 않는 샘플의 경우 여러 축을 따라 이러한 분석을 수행하는 것이 좋습니다. - 통계로 이동합니다. 메뉴의 오른쪽 하단에서 모든 통계를 파일로 내보내기를 클릭하고 데이터를 스프레드 시트에 저장하십시오.
- 수동 계산을 수행하여 X축을 따라 동심원 레이어를 식별합니다.
참고: 이 연구에 사용된 샘플은 직경이 약 500μm였습니다. 따라서, 두 개의 외부 200μm 두께의 동심원 구역과 하나의 내부 100μm 두께의 중앙 구역이 있다. 이 거리 7,28,29,30에서 확산 거동이 바뀔 것으로 예상되기 때문에 200 μm 두께의 구역을 유지하는 것이 좋습니다. 이러한 추론에 따라 더 큰 샘플에는 더 많은 동심원 영역을 사용하고 더 작은 샘플에는 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. - 단계 4.4.3에서 찾은 외부 반지름에서 200μm를 빼서 200μm 외층 영역을 설정합니다. 따라서 외부 영역은 X반경 과 X바깥쪽, 내부 가장자리 사이의 X 위치가있는 지점을 포함합니다 (그림 1A, 주황색 영역).
- X외부, 내부 가장자리에서 200μm를 빼서 과도기 영역을 설정합니다. 과도기 영역은 X바깥쪽, 안쪽 가장자리 및 X과도 기, 내부 가장자리 사이에 X 위치가 있는 점을 포함합니다(그림 1A, 분홍색 영역).
- 샘플 중심과 X과도기, 내부 모서리 사이의 나머지 점을 포함하는 중앙 코어 영역을 설정합니다(그림 1A, 파란색 영역).
- 4.4.4단계에서 만든 저장된 스프레드시트 파일을 엽니다. 원점 참조 프레임으로부터의 거리 탭으로 이동합니다.
- 함수의 COUNTIF (열 x, "< X과도기, 내부 가장자리")를 사용하여 코어 영역의 스팟 수를 계산합니다. 여기서 열x는 '원점 참조 프레임으로부터의 거리'열입니다. 결과 값은 이 영역의 셀 번호입니다. 이 값을 영역의 부피로 나누어 세포 밀도를 구한다.
- 비슷한 방식으로, 'COUNTIF (열 x, "< X 외부, 내부 가장자리") - COUNTIF (열x, "> X 과도기,내부 가장자리")를 사용하여과도기 영역의 셀 수를 계산하십시오.
- 'COUNTIF(열x,'> X과도기, 안쪽 가장자리')를 사용하여 외부 영역의 셀 수를 계산합니다.
- 'Regional Plugs'를 통해 비구형 샘플의 영역 세포 밀도를 평가합니다(그림 1B).
참고: 동심원층이 없는 비구형 샘플의 경우, 'Regional Plug' 방법이 개발되어 골재 전체에 걸쳐 다양한 방사상 깊이에서 로컬 셀 밀도를 샘플링합니다.- 4.4.1-4.4.3단계를 반복하여 중앙 참조 프레임(그림 1B, 중앙 노란색 원)을 설정하고 총 샘플 반지름을 구합니다.
- 수동 계산을 수행하여 이러한 위치의 샘플에서 셀 밀도를 평가할 수 있도록 과도기 및 외부 영역 내에 참조 프레임의 배치를 식별합니다.
- 외부 위치를 계산하려면 4.5.1단계에서 샘플 반지름 값에서 50μm를 빼고 이 값을 X 위치로 사용합니다.
참고: 주어진 샘플 내의 모든 플러그에 대해 4.5.1단계에서 기록한 것과 동일한 Y 및 Z 위치 값을 사용하여 샘플의 X축을 따라 셀 밀도를 측정합니다(그림 1B, 가장 왼쪽 노란색 원). - 객체 트리 위에서 새 스팟 추가를 클릭하고 자동 생성 건너 뛰기, 수동 편집을 클릭하십시오. 포인터가 '선택'모드에있는 상태에서 Shift + 클릭을 누른 상태에서 화면에 자리를 놓습니다. 왼쪽 메뉴에서 위에서 계산한 XYZ 위치 값을 입력합니다. 최상의 가시성을 위해 XY 및 Z 직경을 ≤20으로 조정하십시오.
- 4.4.2단계를 반복하여 이 지점 위치에 참조 프레임을 추가합니다. 이 참조 프레임의 이름을 객체 트리의 외부 또는 이와 유사한 이름으로 바꿉니다.
- 전환점(중간점) 위치를 계산하려면 X중심 위치 값과 X외부 위치 값의 평균을 찾습니다. 이 값을 전환 참조 프레임의 X 위치로 사용합니다. 위와 같이 주어진 샘플 내의 모든 플러그에 대해 단계 4.5.1에 기록된 동일한 Y 및 Z 값을 사용하여 샘플의 X축을 따라 셀 밀도를 측정합니다(그림 1B, 중간 노란색 원).
- 4.4.2단계를 반복하여 중간 참조 프레임을 이 위치에 배치하고 생성된 후 '전환' 또는 이와 유사한 이름을 바꿉니다.
- 외부 위치를 계산하려면 4.5.1단계에서 샘플 반지름 값에서 50μm를 빼고 이 값을 X 위치로 사용합니다.
- 4.3단계에서 만든 스팟을 클릭하고 통계로 이동합니다. 메뉴의 오른쪽 하단에서 모든 통계를 파일로 내보내기를 클릭하고 데이터를 스프레드 시트에 저장하십시오.
- 스프레드시트를 엽니다. 원점 참조 프레임으로부터의 거리 탭으로 이동합니다. 참조 프레임에 대한 각 객체의 거리는 열 A에 표시되고 각 객체에 대한 참조 프레임의 그룹화는 G 열에 표시됩니다. 'MOD' 함수를 사용하여 각 거리를 해당 참조 프레임에 수치로 할당합니다. 여기서 0은 중심 프레임, 1은 전환, 2는 바깥쪽입니다.
- 이 열의 값을 필터링하여 각 참조 프레임의 거리에 대해 작업합니다. 각 참조 프레임에 대해 'COUNTIF(열 x, "≤50" 열) 함수를 사용하여 프레임의 50마이크로미터 이내의 개체 수를 계산합니다. 여기서 열x는 각 그룹에 대한 '원점 참조 프레임으로부터의 거리' 열입니다. 결과 값은 해당 지역 플러그의 셀 수에 해당합니다. 이 값을 100-μm 플러그의 부피로 나누어 셀 밀도를 얻는다.
- 공간적으로 세련된 지역 플러그 방법을 수행합니다(그림 1C).
참고: 이 접근법은 약물 적용에 대한 반응에서 국소 세포 생존력을 평가하기 위해 사용되었다. 더 많은 기준 프레임을 포함하면 모델 두께 전체에서 계산할 수 있는 셀 밀도의 분해능이 향상됩니다.- 4.4.1-4.4.3단계를 반복하여 중심 참조 프레임(그림 1C, 중앙 노란색 원)을 설정하고 샘플 반지름을 가져옵니다.
- 수동 계산을 수행하여 추가 관심 위치를 결정합니다. 이렇게 하려면 X 중심 값에 100μm를 추가한 다음 중심점의 Y 및 Z 값을 사용하여중심 축을 따라 첫 번째 위치를 정의합니다. 4.4.2단계에서와 같이 이 위치에 참조 프레임을 추가합니다(그림 1C, 중심 원에 인접한 노란색 원).
참고: 더 높은 분해능 밀도 추적을 원하는 경우 이 단계에서 더 적은 μm를 추가하십시오. - 4.6.2단계를 반복하여 각 순차적 X-위치에 100μm(또는 원하는 개수)를 추가하여 샘플의 두께를 통해 동일한 간격의 플러그의 축을 설정합니다. 마지막 기준 프레임을 샘플의 외부 반지름에서 ≤50μm 떨어진 곳에 놓습니다(그림 1C, 노란색 원).
- 4.5.3-4.5.5단계를 반복하여 각 100μm 직경 플러그 내의 셀 카운트를 얻습니다. 이 값을 각 해당 플러그의 부피로 나누어 로컬 셀 밀도를 얻습니다.
- 약물 시험의 각 시점에서 수집된 OCT 데이터에 대해 이 섹션의 모든 단계를 반복합니다. 치료 시간 과정을 통해 각 위치에서의 세포 수를 비교하는 것은 세포 밀도가 감소하는 곳 (즉, 세포 사멸을 경험하는 영역)과 결과적으로 약물이 얼마나 깊이 침투하고 있는지를 밝혀야합니다 (즉, 세포 밀도의 감소를 보는 층 과 세포 밀도 수준의 증가를 유지하거나 표시하는 층).
그림 1: 개략적인 그림. (A) 구형 응집체에서 지역 세포 밀도를 평가하기 위한 동심층(쉘) 접근법. (B) 지역 플러그 방법은 비구형 응집체의 국소 세포 밀도를 평가하기 위해 개발되었으며, 작은 (직경 100 μm) 구형 플러그 (노란색으로 표시)가 각 구역 / 두께에서 밀도 지표로 사용됩니다. (C) 공간적으로 정제된 국소 플러그 방법은 약물 침투 연구에 사용된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Representative Results
이전 간행물에서, OCT10을 사용하여 세포 응집체 내의 글로벌 세포 밀도의 비파괴적 측정을 위한 방법이 확립되었다. 본원에서, 이러한 기술은 발달하는 세포 응집체의 국소 세포 밀도를 평가하기 위해 확장된다. 도 1은 이러한 확장의 개략도를 보여주며, 여기서 셀 밀도는 도 1B,C의 노란색 원으로 표시된 작은 (직경 100 μm) 구형 플러그 대신에 보아서 국부적으로 스페로이드 이상의 동심원층에서 평가될 수 있다. MDA-MB-231 종양 구상체는 응집체 내에 중심점을 설정하고 구상체의 순차적 동심원 층에서 개체 / 세포의 수를 계산하여 초기에 평가되었습니다. 이러한 결과는 도 2에 제시되어 있다. 스튜던트 t-테스트는 전이(p = 4.3e-4) 및 외층(p = 4.0e-6)에서보다 스페로이드 코어에서 유의하게 더 높은 세포 밀도를 나타냈다. 이 결과는 4일 후 스페로이드 코어에서의 압축을 나타낸다.
그림 2: 구형 MDA-MB-231 응집체에 대한 동심층 접근법에 의해 계산된 지역 밀도의 차이. 도면은 응집체 코어에 가장 조밀하게 패킹된 셀(n=3)을 갖는 방사형 셀 밀도 구배와, 코어로부터의 거리에 따라 감소하는 로컬 셀 밀도를 예시한다. 평균 총 셀 수는 파란색 선으로 표시됩니다. 인셋 이미지의 스케일 바는 100 μm이다. 데이터는 평균 ± SD로 나타내었다 (*= p < 0.05, ***= p < 0.001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그러나, 이러한 동심층 기술의 한계는 구형 응집체에만 사용될 수 있다는 것이다. 따라서, 세포 계수 접근법은 가상 생검과 유사하게 응집체를 통해 순차적 위치에서 작은 구역을 샘플링하는 Regional Plug 방법을 확립하도록 적응되었다. 이 플러그는 특정 깊이에서 로컬 셀 밀도의 측정을 제공합니다. 이 기술은 동일한 MDA-MB-231 구상체에 대한 분석을 수행하여 동심층 접근법에 대해 검증되었습니다(그림 3). 결과는 이러한 구형 응집체에 대한 지역 플러그와 동심원 층 접근법 사이의 좋은 일치를 보였다. 스튜던트 t-테스트는 외부 및 과도기 층을 측정하기위한 접근법 (각각 p = 0.243 및 0.484)과 집계 코어에서 밀도를 계산할 때 약간이지만 유의한 차이 (p = 0.017) 사이에 통계적 차이가 없음을 보여주었습니다.
그림 3: 동심원 영역 및 지역 플러그 접근법은 구형 MDA-MB-231 응집체에서 셀 밀도를 정량화하는 데 유사한 결과를 제공합니다(n=3). 데이터는 평균 ± SD (* = p < 0.05)로 나타내었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 기술은 성숙 4일째에 구형 및 비구형 종양 응집체 모두를 평가하기 위해 적용되었고(도 4), 세포 유형에 관계없이 시험된 모든 형태학에 대해 코어 압축에 대한 유사한 경향을 관찰하였다. 이러한 경향은 응집을 촉진하는 것으로 알려진 첨가제 인 Matrigel (기저막 매트릭스)으로 제조 된 샘플에서 가장 두드러졌지만 외인성 인자 및 조성은31,32,33으로 잘 특성화되지 않았습니다. 흥미롭게도, 매트릭스의 첨가는 부피 또는 세포 수에 영향을 미치는 것으로 보이지 않으며, 따라서 세포 증식에 무시할 수 있는 영향을 미치는 것으로 보인다. 오히려, 매트릭스 첨가는 셀 밀도를 재분배하고, 상당한 코어 압축을 촉진하고, 외부 층에서 셀 밀도를 감소시키는 것으로 보인다. 이들 결과는 또한 AU565 세포가 MDA-MB-231 세포보다 매트릭스 매개 응집 효과에 덜 민감하게 나타난다는 것을 나타낸다. 이러한 발견은 매트릭스가 다른 유방암 세포주에서 세포 응집을 가능하게하는 물리적 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 중요한 것은 지역 플러그 접근 방식이 구형 또는 비구형 집계 형상을 표시하는 모든 MCTS에 적합해야 한다는 것입니다.
그림 4: 매트릭스 첨가는 더 많은 응집을 촉진하고 암 세포주에 세포 밀도를 재분배한다. MDA-MB-231 (A,B) 및 AU565 (C,D) 세포주 둘 다에 대해, 매트릭스 첨가는 전체 세포 수를 상당히 변화시키지 않으면서 외부 구역에서의 밀도를 감소시키고 중심(n=3)에서의 압축을 증가시킨다. 평균 총 셀 카운트는 파란색 선으로 표시됩니다. 삽입 스케일 바 = 100 μm. 데이터는 평균 ± SD로 나타내었다 (*= p < 0.05, **= p < 0.01, ***= p < 0.001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
다음으로, 이러한 지역적 플러그 접근법을 사용하여 TZM 처리된 종양 응집체에서 세포 사멸을 비파괴적으로 추적하였다. 막 매트릭스로 제조된 AU565 MCTSs를 개발 4일째에 TZM으로 처리하고, 9일째까지 배양하였으며, 주요 OCT 이미징 시점을 0 h (pre-drug), 24 h 및 120 h (5 일)로 하였다. 공간적으로 정의된 지역 플러그 방법은 그림 1C의 노란색 원으로 표시된 것처럼 각 골재의 전체 두께에 걸쳐 100μm마다 플러그를 설정하여 각 시점에서 적용되었습니다. 중앙 플러그의 크기는 일정하게 유지되었지만 외부 플러그는 골재 크기 변화에 따라 직경이 변동하도록 허용되었습니다. 세포 밀도의 사소한 변동은 각 응집체의 내부 500 μm 내에서 시간에 따라 관찰되었으며, 이는 최소한의 세포 사멸을 나타낸다 (도 5). 실제로, 대부분의 세포 사멸은 각 응집체의 외부 200 μm에서, 특히 최외곽 100 μm에서 발생했으며, 이는 분석된 모든 응집체에 대해 120 h 시점까지 완전히 사라졌다. MCTSs의 외층에서 주로 지시하는 약물 반응으로서의 세포 사멸의 시각화는 분자량이 145kDa34인 임상적으로 관련된 항체 약물인 TZM의 약물 침투 문제와 일치한다. 실제로이 약물은 이러한 조밀 한 세포 모델을 통한 수동 확산에 의존하며, 이는 모델에 200 μm 이상 침투하는 능력에 도전 할 것으로 예상됩니다.
도 5: 약물에 대한 반응에서의 세포 생존율, 응집체 두께 전체에 걸쳐 측정됨. 내부 코어에서의 플러그는 직경 100 μm에서 일정하게 유지되었고, 외부 구역에서의 플러그는 응집체 크기 변화에 따라 변동하도록 허용되었다. (a) TZM 첨가에 반응하는 국소 세포 밀도는 세포 사멸이 외부 200 μm, 특히 외부 100 μm에 크게 제약을 받았으며, 이는 120 시간의 처리 후에 완전히 사라졌다. 응집체의 내부 500 μm 두께에서는 세포 수의 변화가 거의 관찰되지 않았다 (n = 3). 평균 총 셀 카운트는 각 시점에 대해 상응하는 컬러 라인과 함께 표시됩니다. 데이터는 평균 ± SD. (B) 응집체 두께의 함수로서 약물에 반응하는 평균 세포 밀도의 변화를 나타내는 히트 맵 플롯으로서 도시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
중요성
다세포 종양 구상체 (MCTS)는 종양 진행 및 약물 스크리닝 1,2,3을 연구하기위한 강력한 3D 시험관 내 모델입니다. 이러한 비교적 간단한 응집체 모델의 유용성을 향상시키는 것은 종양 모델 진행 및 치료 반응 모두에 영향을 미치는 것으로 알려진 형태학 및 세포 밀도와 같은 주요 특징의 특성화에 크게 의존합니다. 그러나 필수 크기는 이러한 특성, 특히 비파괴 분석의 경우 이러한 특성을 평가하는 데 어려움을 겪습니다. 제시된 방법은 조밀 한 3D 응집체 모델의 개별 영역 내에서 세포 밀도 및 생존력의 종방향 및 라벨없는 정량화를위한 새로운 도구를 제공합니다. 동일한 집계는 여러 개발 일에 걸쳐 OCT(광학 일관성 단층 촬영)로 다시 이미징할 수 있습니다. 이러한 체적 스캔을 분석하여 MCTSs 성숙 동안 세포 밀도가 지역적으로 어떻게 진화하는지를 특성화할 수 있습니다. 이러한 동일한 원리는 약물 응집체의 분석에 적용되며, 이는 주어진 약물 요법 전반에 걸쳐 종방향으로 이미지화되어 세포 밀도가 감소하는 곳, 즉 약물이 적극적으로 세포를 죽일 수있는 곳을 결정할 수 있습니다. 이 접근법은 전통적으로 고정, 염색 및 / 또는 절편이 필요한 유사한 세포 규모 정보를 얻기 위한 이전 방법에 비해 크게 향상되어 종방향 분석을 배제합니다. 실제로이 도구는 동일한 샘플을 연속적으로 분석 할 수 있으므로 주어진 연구에 필요한 샘플 수를 극적으로 줄일 수 있습니다. 이것은 또한 연령 일치 터미널 샘플의 상관 관계에 의존하기보다는 주어진 자극에 반응하기 때문에 개발이 단일 집계 내에서 추적 될 수 있기 때문에 각 시점에서 부가가치를 도입 할 것으로 예상됩니다. 본원에 입증된 이러한 MCTS 적용 외에도, 이 OCT-Imaris 방법은 수 밀리미터 두께의 다른 세포 응집체, 배아체, 보다 복잡한 오가노이드 또는 조직 샘플을 연구할 수 있다. 이 프로토콜은 밀도가 높은 응집체 모델 내에서 응집체 개발 및 약물 반응 동안 세포 다짐에 대한 이해를 향상시킬 것이다.
수정
제시된 프로토콜은 MDA-MB-231 및 AU565 MCTSS 모델의 분석에 최적화되었습니다. 다른 세포주를 사용하여 만들어진 모델이 적용가능하다; 그러나, 일부 프로토콜 최적화는 평균 세포 크기 및 응집체 모폴로지의 변화로 인해 요구될 수 있다. MDA-MB-231 및 AU565 세포를 2D로 플레이팅하고 현미경을 통해 평균 세포 크기를 얻는 별도의 연구가 수행되었습니다. 이 직경은 Imaris "반점" 함수 내의 XY 직경으로 활용되어 이 대략적인 크기의 물체가 계산되도록 했습니다. 이 값을 변경하면 샘플10 내에 있는 개체 수가 변경되며, 이 입력이 셀 크기와 거의 일치할 때 더 정확한 결과가 예상됩니다. 따라서, 적합한 XY 직경은 사용된 셀 유형에 대한 평균 셀 크기에 의해 알려져야 한다.
중요한 단계 및 문제 해결
OCT 이미징 중 중요한 단계 중 하나는 스캔 해상도를 선택하는 것입니다. 사용자에 의해 설정된 픽셀 크기는 사용되는 셀 타입의 평균 크기를 구성하기 위해 다수의 픽셀들이 필요하도록 충분히 작아야 한다. 이것은 OCT의 세포 분해능을 개선하고 확률적 픽셀 잡음이 셀 카운팅에 부정적인 영향을 미칠 가능성을 줄임으로써 Imaris 내의 "반점"분석의 정확도를 향상시킵니다.
Imaris 기준 프레임 내에서 샘플의 분리는 셀 밀도에 대한 출력 값에 큰 영향을 미칩니다. 사용자가 이 단계를 수행할 때 모든 샘플 분석에 일관되게 적용되어야 하는 주관성과 편향성이 수반됩니다. Imaris 분석을 시작하기 위해 볼륨 스캔 내에서 샘플을 분리할 때, 집계 윤곽선을 정확하게 추적하고 아티팩트(즉, 기판 또는 매체 높이로부터의 반사)의 포함을 피하기 위해 주의를 기울여야 합니다.
지역 플러그 분석 중에 참조 프레임을 적절하게 배치하는 것은 또 다른 중요한 단계입니다. 소개에서 언급했듯이, 모델 개발 중에 분석해야 할 세 가지 중요한 영역은 증식 성 외부 영역, 노화 / 정지 세포로 구성된 과도기 영역 및 저산소 코어입니다. 각 층의 중심 내에 기준 프레임을 배치하는 것은 그 영역 내의 셀 밀도의 가장 정확한 추정을 산출할 것으로 예상된다. 이러한 기준 프레임 배치는 약물 반응을 보다 정확하게 분석하기 위해 균등하게 이격된 구역이 설정되어야 하기 때문에 약물 연구를 위해 본원에 사용된 상세한 국소 플러그 분석에 더욱 중요하다.
한계와 향후 연구
제안된 방법의 주요 한계는 OCT 볼륨 스캔 내에서 응집체를 분리하기 위해 Imaris 내에서 수행되는 사용자 기반 슬라이스 바이 슬라이스 트레이싱이다. 이는 정확한 결과를 얻기 위한 중요한 단계로, 다소 주관적이므로 일정 수준의 사용자 간 변동성을 부여할 것으로 예상됩니다. 이를 해결하기 위해 현재 스캔을 Imaris에 업로드하기 전에 Matlab(또는 이와 유사한) 내에서 수행되는 에지 감지 알고리즘을 통합하려고 합니다. 이 알고리즘은 프로그레시브 B-스캔 슬라이스에서 샘플 에지를 객관적으로 식별해야 하며, 그 후에 제안된 분석이 사전 격리된 샘플 영역에서 수행될 수 있습니다. 이 제한을 해결하면 사용자 기반 변동성이 제거되고 이 OCT 기반 도구의 적용 가능성이 더 넓어질 것으로 예상됩니다.
약물 치료 중에 응집체 내의 살아있는 세포를 정확하게 이미지화하는 OCT의 능력은 약물이 작동하는 세포 사멸 방식에 달려 있습니다. 이전 연구는 괴사와 아폽토시스를 통해 세포를 죽이는 잘 알려진 항암제 인 독소루비신에 대한 반응으로 OCT / Imaris에서보고 된 살아있는 세포 수의 양적 부정확성을 밝혀 냈습니다10. 이는 괴사 동안 남은 세포막에 기인하는 것으로 추정되며, 이는 구조적 이미징 동안 살아있는 세포로서 나타날 것으로 예상된다. TZM은 주로 아폽토시스를 통해 세포를 사멸시키는 것으로 알려져 있다35; 따라서 세포가 죽으면 OCT에 의해 추적 / 계산되지 않도록 충분히 작은 조각으로 분해되어야합니다. 아폽토시스 약물에 대한 추가 검증 테스트가 필요하지만, 우리의 초기 파일럿 실험은 TZM (공개되지 않은 데이터)으로 약물 투여 된 MCTS의 해리 된 세포 수에 대한 OCT / Imaris의 탁월한 합의를 보여줍니다. 따라서, 본원에 제시된 살아있는 세포 결과는 괴사 유발 약물보다 더 정확할 것으로 예상된다. 이 구별은 약물 응집체의 생존력 테스트를 위해이 접근법을 적용 할 때 명심해야합니다.
종양 응집체의 비파괴 평가에 대한 미래의 연구는 외부 자극과 약물 치료 둘 다에 어떻게 발전하고 반응하는지에 대한 이해를 향상시킬 것으로 기대된다. 여기에 제시된 것과 같은 분석 도구의 개발은 모델 유용성을 확장하고 특히 약물 스크리닝 및 전달 / 효능 평가와 같은 영향력있는 응용 프로그램 내에서 결과 정확도를 향상시켜야합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
본 연구는 NIH R01 BRG CA207725 (MB/DTC) 및 NIH R01 CA233188 (MB)에 의해 지원되었다. 우리는 이러한 실험에 제공된 Trastuzumab에 대해 AMC 약국에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well plates | Greiner Bio-One | 650970 | CellStar Cell-Repellent Surface, https://shop.gbo.com/en/usa/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-repellent-surface/ |
| 0.25% trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| AU565 breast cancer cells | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| FIJI software | open-source | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267151B | |
| Imaris image analysis software | Bitplane | Current version 9.8 | |
| L-glutamine | Lonza | 17-605E | |
| Matrigel | Corning | 354263 | |
| MDA-MB-231 breast cancer cells | ATCC | ||
| Microscope | Zeiss | Z1 AxioVision | |
| Penicilin streptomycin | Corning | 30-0002CI | |
| Plate centrifuge | Eppendorf | ||
| RPMI medium 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| Spectral Domain Optical Coherence Tomography | ThorLabs | TEL220C1 | |
| T75 cell culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 | |
| Trastuzumab | Remnant clinical samples of Trastuzumab were used in this study, generously gifted by the Albany Medical College Pharmacy. |
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