Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Ikke-destruktiv evaluering af regional celletæthed inden for tumoraggregater efter lægemiddelbehandling

Published: June 21, 2022 doi: 10.3791/64030
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Rensselaer Polytechnic Institute, 2Albany Medical College

Summary

Den nuværende protokol udvikler en billedbaseret teknik til hurtig, ikke-destruktiv og etiketfri regional celletæthed og levedygtighedsmåling inden for 3D-tumoraggregater. Resultaterne afslørede en celletæthedsgradient med højere celletætheder i kerneområder end ydre lag i udviklingsaggregater og overvejende perifer celledød i HER2+ aggregater behandlet med Trastuzumab.

Abstract

Multicellulære tumor spheroid (MCTS'er) modeller har vist stigende nytteværdi for in vitro undersøgelse af kræftprogression og lægemiddelopdagelse. Disse relativt enkle avaskulære konstruktioner efterligner nøgleaspekter af in vivo tumorer, såsom 3D-struktur og patofysiologiske gradienter. MCTS-modeller kan give indsigt i kræftcelleadfærd under sfæroidudvikling og som reaktion på lægemidler; deres nødvendige størrelse begrænser imidlertid drastisk de værktøjer, der anvendes til ikke-destruktiv vurdering. Optisk kohærens Tomografi strukturel billeddannelse og Imaris 3D-analysesoftware udforskes til hurtig, ikke-destruktiv og etiketfri måling af regional celletæthed inden for MCTS'er. Denne tilgang anvendes til at vurdere MCTS'er over en 4-dages modningstid og gennem en forlænget 5-dages behandling med Trastuzumab, et klinisk relevant anti-HER2-lægemiddel. Kort fortalt blev AU565 HER2+ brystkræft-MCTS'er skabt via flydende overlay med eller uden tilsætning af Matrigel (en kældermembranmatrix) for at udforske aggregater af forskellige morfologier (henholdsvis tykkere, disklignende 2.5D-aggregater eller flade 2D-aggregater). Celletæthed inden for det ydre område, overgangsregionen og den indre kerne blev karakteriseret i modne MCTS'er, hvilket afslørede en celletæthedsgradient med højere celletætheder i kerneområder sammenlignet med ydre lag. Matrixtilsætningen omfordelte celletætheden og forbedrede denne gradient, hvilket reducerede ydre zonetæthed og øgede cellekomprimeringen i kernerne. Celletætheden blev kvantificeret efter lægemiddelbehandling (0 timer, 24 timer, 5 dage) inden for gradvist dybere 100 μm zoner for at vurdere potentielle regionale forskelle i lægemiddelrespons. På det endelige tidspunkt syntes næsten al celledød at være begrænset til de ydre 200 μm af hvert aggregat, mens celler dybere i aggregatet syntes stort set upåvirket, hvilket illustrerer regionale forskelle i lægemiddelresponset, muligvis på grund af begrænsninger i lægemiddelindtrængning. Den nuværende protokol giver en unik teknik til ikke-destruktivt at kvantificere regional celletæthed i tætte cellulære væv og måle den i længderetningen.

Introduction

Forskere har stort set henvendt sig til benchtop 3D-kultur in vitro-systemer for at studere nogle af de vigtigste træk ved tumorprogression. Meget af denne forskning er blevet ledet af genopståelsen af multicellulære tumorfæroider (MCTS'er) og mere komplekse organoider 1,2. Selvom disse modeller er avaskulære, giver de et kraftfuldt værktøj til rekapitulering af fysiologiske og patologiske processer, der forekommer in vivo 3,4,5. Især mellemstore modeller (300-500 μm diameter) kan efterligne nøgletumorfunktioner såsom 3D-struktur, patofysiologiske gradienter og metastatisk signalering på grund af hypoxi i kernen. Det er veldokumenteret, at disse modeller viser de karakteristiske koncentriske lag, der ses i vaskulariserede in vivo-tumorer, nemlig et ydre lag af proliferative celler, et overgangslag af senescente/hvilende celler og celler, der oplever hypoxi i kernen 3,6,7,8,9 . Unik indsigt kan opnås fra disse modeller ved at karakterisere celleadfærd inden for disse lag, under udvikling og som reaktion på lægemidlet. Den nødvendige MCTS-størrelse, der er nødvendig for at udvikle gradienterne, der gør dem til så kraftfulde in vitro-modeller, begrænser imidlertid drastisk de værktøjer, der anvendes til ikke-destruktiv vurdering. Faktisk er en af de største udfordringer med ikke-destruktiv analyse af MTCS'er kvantificering af celleskaladetaljer. Lysfelt- og fasekontrastmikroskopi bruges rutinemæssigt til at vurdere 3D MCTS'er vækst og udvikling ikke-destruktivt. Disse modaliteter er imidlertid begrænset til 2D-fremskrivninger og mangler kapacitet til at visualisere den afgørende 3D-struktur af disse modeller 10,11,12,13. Oplysninger om cytotoksicitet og celleproliferation indsamles typisk gennem fluorescerende billeddannelse (dvs. lysarkmikroskopi, konfokal mikroskopi) eller ex vivo immunohistologisk farvning 14,15,16. Mens disse tilgange giver værdifuld information i høj opløsning om vævsstruktur, cellulær tæthed og cellulær funktion, kræver de ofte prøveforberedelse såsom optisk rydning, fastgørelse / farvning eller indlejring, der forhindrer langsgående analyser.

Optisk kohærenstomografi (OCT) er en ikke-destruktiv strukturel billeddannelsesmodalitet, der har potentialet til at overvinde nogle af de ovennævnte udfordringer. Det kan prale af cellulær opløsning og et tilstrækkeligt bredt synsfelt (op til 10 mm x 10 mm), der er i stand til at visualisere hele flercellede aggregater 17,18,19. På grund af det anvendte lyss synlige natur er det vigtigt, at denne teknik er fuldstændig ikke-destruktiv og etiketfri17. Prøver kan også afbildes in situ uden at kræve prøveforberedelse, således at prøver kan tages direkte fra inkubatoren, hurtigt scannes med OCT (scanningsvarighed ~ 5-10 min) og derefter returneres til inkubatoren, hvilket muliggør langsgående karakterisering. Mange undersøgelser, der søger at bruge OCT til at analysere tumor sfæroid adfærd er for nylig dukket op. I en af de mest spændende demonstrationer brugte Huang et al. OCT til ikke-destruktivt at detektere nekrotiske kerner inden for store tumorfæroide modeller og bemærkede, at levende og døde celleområder har mærkbare forskelle i optisk dæmpning, som kan bruges til etiketfri levedygtighedsovervågning20. Tilsvarende udførte Hari et al. brydningsindeks (RI) målinger af human tyktarmskræft (HCT116) sfæroider afbildet med OCT for at studere tilstedeværelsen af hypoxi i prøverne21. Deres målinger var ikke tilstrækkelige til direkte slutninger, selvom de observerede lavere RI på steder, der korrelerede med stedet, men ikke størrelsen, af nekrotiske kerner, senere identificeret via konfokal mikroskopi. Abd El-Sadek et al. brugte OCT til at visualisere og kvantificere regional vævslevedygtighed af brystkræfttumormodeller22. De rapporterede to OCT-baserede metoder til visualisering af vævsdynamik og viste en moderat sammenhæng mellem forskelle i disse målinger og mikroskopi-identificerede regioner af levende / døde celler.

Vores offentliggjorte arbejde ved hjælp af OCT byggede på denne tidligere litteratur for at etablere en kvantitativ, ikke-destruktiv tilgang til måling af 3D-morfologien og celletallet inden for MCTS'er brystkræftmodeller under udvikling10,23. Ved hjælp af Imaris 3D-gengivelsesbilledanalysesoftware til at tælle antallet af objekter i cellestørrelse (dvs. pletter) afbildet inden for OCT-volumenscanningerne blev celletællingerne ikke-destruktivt målt i MCTS'er, der statistisk lignede dem, der blev bestemt via hæmocytometer ved samlet dissociation. På grund af OCT's strukturelle karakter kan cellemembraner, der stadig er til stede efter celledød ved nekrose, imidlertid fejlagtigt tælles som levende celler. Desuden blev denne karakterisering udvidet til ikke-destruktivt at spore cellelevedygtighed inden for individuelle aggregater, der blev udsat for et lægemiddelregime med lovende succes10. Det er vigtigt, at det blev bemærket, at lignende cellelevedygtighed blev rapporteret fra vores OCT-Imaris-tilgang med det, der blev benchmarket inden for disse prøver ved dissociation. Denne ikke-destruktive og etiketfrie celletilgang gør det muligt at tælle celler inden for 3D-konstruktioner og tætte aggregater i længderetningen uden at ofre konstruktionen / aggregatstrukturen.

Dette arbejde rapporterer om en forbedret tilgang til direkte kvantificering af regional celletæthed inden for tætte aggregater ved at udnytte OCT-Imaris evne til at måle både 3D-aggregeret morfologi og celleantal. Dette metodologiske fremskridt giver et mere detaljeret billede af cellernes rumlige fordeling og spredning inden for de karakteristiske koncentriske lag af MCTS-modeller. I stedet for blot at beregne en samlet gennemsnitlig samlet celletæthed kan sådanne lokale densitetsmålinger afsløre celletæthedsgradienter, såsom dem, der er forbundet med komprimering. Denne regionale vurdering anvendes også på aggregater behandlet med kemoterapeutisk til vurdering af regionalt lægemiddelrespons målt ved ændringer i lokal celletæthed. Denne kombination af OCT og avancerede billedanalysemetoder giver kvantificering af regional cellelevedygtighed, som kan bruges til at undersøge lægemiddelindtrængning baseret på hvilke regioner der oplever fald i celletæthed. Dette er den første rapport til ikke-destruktiv kvantificering af regional celletæthed og levedygtighed som reaktion på lægemidlet i tætte cellulære væv og måler det i længderetningen. En sådan karakterisering af tredimensionel celletæthed og rumlig fordeling gennem hele MCTS'er kan hjælpe med at optimere lægemiddelafgivelse i kræftbehandling og forbedre forståelsen af kræftmodelprogression.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

AU565 (HER2+) og MDA-MB-231 brystkræftcellelinjer blev anvendt til denne undersøgelse (se Materialetabel).

1. Forberedelse af tumoraggregater

  1. Forbered AU565 (HER2+) brystkræftcellevækstmedier ved hjælp af Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 basalmedium (+) i L-glutamin suppleret med 10% (v / v) føtalt bovint serum og 1% penicillin / streptomycin (se materialetabel).
  2. Forbered MDA-MB-231 triple-negative brystkræftcellevækstmedier ved hjælp af Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) suppleret med 10% (v / v) føtalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin / streptomycin og 2 mM L-glutamin (se materialetabel).
  3. Forbered 70% -90% sammenflydende cellekulturer af begge cellelinjer (~ 3-4 dages forberedelse) under standardbetingelser (37 ° C, 5% CO2, 95% relativ fugtighed). Løsrive cellemonolag fra deres kulturkolber efter standard trypsiniseringsmetode.
    BEMÆRK: Undgå overeksponering af celler til trypsin, hvilket påvirker deres levedygtighed.
    1. For AU565-celler skal der aspireres cellemedier fra kolben ved hjælp af en pipette (eller, hvis en sådan forefindes, ved hjælp af en vakuumpumpe, der via slange er forbundet til en autoklaveret glaspipettespids) og udskiftes med 2 ml Trypsin-EDTA. Lad kolben stå i 3 minutter ved stuetemperatur, og flyt derefter til inkubatoren i yderligere 4 minutter. Derefter tilsættes 6 ml vækstmedier til kolben for at neutralisere trypsin.
    2. For MDA-MB-231-celler skal der aspireres cellemedier fra kolben på samme måde som udført i trin 1.3.1, og der erstattes med 1,5 ml Trypsin-EDTA. Efter 7 minutters inkubation tilsættes 8,5 ml vækstmedier til kolben for at neutralisere trypsin.
  4. Der tilsættes 10 μL af cellesuspensionen til et hæmocytometer for at bestemme antallet af celler i suspensionen24. Resuspend celler i medier ved den ønskede koncentration på 2,5 × 105 celler / ml.
  5. Der hældes 50 μL cellesuspension i hver brønd i en rundbundet, ikke-klæbende 96-brøndplade. For suspensioner fremstillet uden Matrigel (kældermembranmatrix, se Materialetabel) tilsættes 50 μL almindeligt vækstmedie til hver brønd.
    1. For suspensioner fremstillet med kældermembranmatrixen fjernes matrixhætteglasset fra -20 °C opbevaring og anbringes i køleskabet for at tø op natten over. Forbered en beholder med vækstmedier og afkøles i 10 minutter for at køle af.
    2. Ved hjælp af en frossen pipettespids tilsættes matrixen til kølemedier, således at den endelige koncentration af denne opløsning er 5%. Der tilsættes 50 μL af dette medie til hver brønd, således at den endelige koncentration af matrix i disse brønde er 2,5%3.
      BEMÆRK: I tidligere arbejde blev den samlede morfologi vurderet for disse cellelinjer10,25 og fandt ud af, at MDA-MB-231-aggregater danner sfæroider med tilsætning af membranmatrixen, mens MDA-MB-231-kulturer uden matrix og AU565 +/- matrix alle danner diskformede aggregater. Kvantificeret sfæriskhed af >0,8 på en skala fra 0 (plan) - 1,0 (perfekt kugle) blev brugt til at identificere tilstrækkeligt sfæriske aggregater og forventedes således at have det nødvendige overflade-til-volumen-forhold for in vivo-lignende adfærd26,27.
  6. Pladerne centrifugeres ved 123 x g i 10 minutter ved stuetemperatur umiddelbart efter såning for at sikre opsamling af en cellepille i bunden af hver brønd.
    BEMÆRK: Dette trin skal finde sted så hurtigt efter såning som muligt. Forfatterne observerede, at for meget tid mellem disse trin gør det muligt for cellerne at slå sig ned over bunden og siderne af hver brønd, hvilket hæmmer deres evne til at samle og aggregere i bunden af brønden.
  7. Inkuber pladerne i 4 dage, på hvilket tidspunkt celleaggregaterne anses for at være modnet.
    BEMÆRK: AU565-aggregater fremstillet med kældermembranmatrixen kræver en yderligere 5-dages dyrkningsperiode for lægemiddelresponsundersøgelsen (9 dage i alt, medieændring på dag 4).

2. Administration af Trastuzumab (TZM) til AU565 celleaggregater

  1. 500 μg/ml TZM-opløsning fremstilles (se materialetabel) i AU565-vækstmedier. På dag 4 tilsættes 10 μL af denne opløsning til hver brønd, således at den endelige koncentration i hver brønd er 50 μg/ml.
  2. Kulturaggregater i yderligere 5 dage efter tilsætning af TZM og vurderer på vigtige tidspunkter.
    BEMÆRK: For denne undersøgelse blev tidspunkter på 0 timer (umiddelbart før medicinering), 24 timer og 120 timer efter lægemidlet brugt til at analysere lægemidlet.

3. Optisk kohærens tomografi billeddannelse

BEMÆRK: Prøver heri blev afbildet med optisk kohærenstomografi (OCT) i løbet af hver modningsdag (1-4) og derefter igen på dag 5 (24 timer efter lægemiddeltilsætning) og dag 9 (120 timer efter lægemiddeltilsætning) for udvalgte lægemiddelaggregater. Et kommercielt spektral-domæne optisk kohærenstomografi (SDOCT, se materialetabel) system til OCT-billeddannelse blev brugt til den aktuelle undersøgelse. Selv om denne fremgangsmåde kan anvendes i næsten alle OLT-systemer, og den procedure, der følges, generelt vil være ens mellem forskellige systemer, er nogle af de detaljerede trin, der følger, specifikke for det nuværende udstyr.

  1. Brug et OCT-system til strukturel billeddannelse. Indstil A-scanningshastigheden til 5,5 kHz for billedsamling i høj opløsning. Brydningsindekset indstilles til 1,33 for prøver i et flydende medium. Indstil voxelstørrelsen til 1,10 x 1,10 x 2,58 μm3.
  2. I vinduet Billedparametre i højre side af skærmen skal du indstille synsfeltet (FOV) ved at indtaste X-, Y- og Z-værdier (i mm), så prøven er omfattet af dette område af interesse.
    BEMÆRK: FOV for disse undersøgelser blev typisk sat til 1,5 x 1,5 x 0,5 mm3. Sørg for, at prøven passer inden for dette område ved at skifte 'Vinkel' -indgangen mellem 0 og 90 grader og udføre visuel bekræftelse.
  3. Klik på 3D Acquisition Mode, og klik derefter på Record for at indsamle 3D-volumenscanningen af prøven.

4. Billedanalyse

  1. Eksporter OCT-filen til softwareformatet (Imaris, se Materialetabel).
    1. Åbn OCT-filen i softwareudviklingssættet. Klik på Eksporter, indstil filtypen til .jpg, og eksporter billederne til en tom mappe.
    2. Åbn billedbehandlingssoftwaren (FIJI, se Materialetabel), og importer billedsekvensen fra den mappe, hvor de eksporterede JPEG'er er gemt. Brug software til at sy billedsekvensen sammen, og gem derefter denne fil som et TIFF-billede.
  2. Opret en volumenrekonstruktion ved at følge nedenstående trin.
    1. Åbn Imaris, og naviger til den konverterede TIFF-fil i Arena. Gå til Rediger > billedegenskaber , og indtast voxelstørrelsen (i μm) fra OCT-billedet i de tilsvarende XYZ-felter. Klik derefter på OK.
      BEMÆRK: I eksempelobjekttræet i venstre side af skærmen skal du fravælge fanen Lydstyrke for at forhindre softwareforsinkelse.
    2. Klik på Tilføj nye overflader over objekttræet. I menuen under træet skal du klikke på Spring automatisk oprettelse over og redigere manuelt. I vinduet Skærmjustering skal du manuelt skubbe de røde og sorte pile for at forbedre kontrasten mellem prøven og baggrunden og forbedre eksempelvisualiseringen.
    3. Juster 'Slice-positionen' til skiven i den ene kant af prøven, dvs. hvor prøvesignalet først vises. Brug escape-tasten til at ændre musen fra navigationstilstand til vælg-tilstand, og klik derefter på Tegn. Spor manuelt omridset af det område, der viser signalet.
    4. Fremskynd udsnitspositionen ved at indtaste den næste placering i indtastningsfeltet. Denne næste position skal være ≤100 skiver længere inde i prøven end den foregående. Spor manuelt det område, der viser signalet.
    5. Trin 4.2.4 gentages gennem prøvens tykkelse, indtil prøvens modsatte kant er nået. Klik derefter på Opret overflade i menuen til venstre for at sy disse skiver sammen og fuldføre volumenrekonstruktionen.
    6. Klik på Rediger, og klik derefter på Maskevalg. Dette opretter en ny kanal i vinduet Skærmjustering, der kun indeholder det isolerede eksempel. Morfologiske egenskaber ved prøven kan nu findes i fanen Statistik > Detaljeret .
      BEMÆRK: Denne fremgangsmåde blev fulgt for at bestemme de sfæriciteter og mængder, der blev rapporteret i denne aktuelle undersøgelse.
  3. Få en prøves samlede celletæthed ved at følge nedenstående trin.
    1. Over objekttræet skal du vælge Tilføj nye pletter. I menuen Algoritmeindstillinger skal du fravælge alle felter. Klik på den blå pil for at gå til kildekanalskærmen.
      1. I rullemenuen, der vises, skal du vælge den maskerede kanal, der blev oprettet i trin 5.2.8, typisk kaldet Kanal 2. Indtast den gennemsnitlige cellediameter for prøven i boksen med XY-diameter. Sørg for, at baggrundsstraktion er markeret.
        BEMÆRK: For dette arbejde med AU565- og MDA-MB-231-celler blev diameteren indstillet til 10 μm. Denne markering er baseret på cellestørrelse (forklaret i afsnittet Diskussion).
    2. Klik på den blå pil for at gå til skærmen Klassificer pletter . I grafen nederst i menuen skal du klikke og trække venstre kant af den gule tærskel til venstre kant af grafen, så alle objekter er inkluderet i den gule skraverede tærskel. Klik derefter på den grønne pil for at fuldføre oprettelsen af stedet.
    3. Få antallet af identificerede objekter (dvs. prøvecelleantal) ved at klikke på Statistik > Samlet > Samlet antal pletter.
    4. For at bestemme den gennemsnitlige aggregerede celletæthed divideres aggregatets celleantal (målt i trin 4.3.3) med et samlet volumen (bestemt i trin 4.2.6).
  4. Vurder den regionale tæthed i koncentriske lag af sfæriske aggregater (Figur 1A).
    1. Efter morfologisk og celletæthedsanalyse vurderes den regionale tæthed. Klik på den overflade, der blev oprettet i trin 4.2.5, og naviger til fanen Overflader Stil / Kvalitet . Skift markering til Midtpunkt, og skift pixelbredde til ≤20 for at opnå den bedste synlighed. Naviger til Statistik > Detaljeret > position , og registrer placeringen af det midterste sted.
    2. Vælg Tilføj ny referenceramme i menuen over objekttræet. Marker afkrydsningsfeltet Synlig og Ret ud for XY i menuen. Klik og træk midten af referencerammeikonet, så det er på linje med midtpunktet. Fravælg felterne XY Visible og Fix , og vælg dem for XZ.
      1. Klik igen og træk midten af referencerammeikonet, så det er på linje med midtpunktet. Til sidst gentages dette for YZ-planet, skiftevis mellem disse tre faste planer, indtil referencerammen passer perfekt til midtpunktet. Dobbeltklik på referencerammen i objekttræet, og omdøb den til Center eller Lignende.
    3. Klik på de pletter, der blev oprettet i trin 4.3, og naviger til Statistik > Detaljeret > position referenceramme. Klik på Position X Reference Frame, indtil den sorterer fra højeste til laveste værdi. Optag den højeste værdi - dette angiver den fjerneste kant af prøven, dvs. prøveradius.
      BEMÆRK: Da de prøver, der anvendes her, er cirkulære i XY-planet, kan beregninger udføres langs X- eller Y-aksen med lignende resultater. For prøver, der ikke udviser X-Y-symmetri (asymmetrisk, ellipsoid, uregelmæssig geometri osv.), Anbefales det at udføre disse analyser langs flere akser.
    4. Naviger til Statistik. I nederste højre hjørne af menuen skal du klikke på Eksporter alle statistikker til fil og gemme data i et regneark.
    5. Udfør manuelle beregninger for at identificere koncentriske lag langs X-aksen.
      BEMÆRK: Prøver anvendt i denne undersøgelse var ca. 500 μm i diameter; således er der to ydre 200 μm tykke koncentriske zoner og en indre 100 μm tyk central zone. Det anbefales at opretholde zoner, der er 200 μm tykke, fordi diffusionsadfærden forventes at ændre sig over denne afstand 7,28,29,30. I overensstemmelse med dette ræsonnement anbefales det også at anvende mere koncentriske zoner til større prøver og omvendt til mindre prøver.
    6. Der indstilles et ydre lagområde på 200 μm ved at trække 200 μm fra den ydre radius, der findes i trin 4.4.3. Således vil det ydre område omfatte pletter med X-positioner mellemX-radius og Xydre, indre kant (figur 1A, orange region).
    7. Indstil et overgangsområde ved at trække 200 μm fra Xydre, indre kant. Overgangsregionen vil omfatte pletter med X-positioner mellem Xydre, indre kant og Xovergangs-, indre kant (figur 1A, lyserød region).
    8. Indstil et centralt kerneområde, der omfatter de resterende pletter mellem prøvecentret og Xovergangs-, indre kant (figur 1A, blåt område).
    9. Åbn den gemte regnearksfil, der blev oprettet i trin 4.4.4. Gå til fanen Afstand fra Origin-referenceramme.
    10. Beregn antallet af pletter i kerneområdet ved hjælp af funktionen ' COUNTIF (Kolonnex, "< Xovergang, indre kant"), hvor kolonnex er kolonnen 'Afstand fra oprindelsesreferenceramme'. Den resulterende værdi er cellenummeret i dette område. Divider denne værdi med volumenet af regionen for at opnå celletæthed.
    11. På samme måde beregnes antallet af celler i overgangsregionen ved hjælp af 'COUNTIF (kolonnex, "< Xydre, indre kant") - COUNTIF (kolonnex, "> Xovergang, indre kant").
    12. Beregn antallet af celler i det ydre område ved hjælp af 'COUNTIF (kolonnex,"> Xovergangs-, indre kant").
  5. Vurder den regionale celletæthed i ikke-sfæriske prøver via 'Regionale stik' (figur 1B).
    BEMÆRK: For ikke-sfæriske prøver, der ikke har koncentriske lag, er 'Regional Plug'-metoden udviklet til at prøve lokal celletæthed på forskellige radiale dybder i hele aggregatet.
    1. Trin 4.4.1-4.4.3 gentages for at indstille den centrale referenceramme (figur 1B, den centrale gule cirkel) og opnå den samlede prøveradius.
    2. Udfør manuelle beregninger for at identificere placeringen af referencerammer inden for overgangs- og yderområderne, således at celletætheden kan vurderes i prøven på disse steder.
      1. For at beregne den ydre placering trækkes 50 μm fra prøvens radiusværdi fra trin 4.5.1 og bruge denne værdi som X-position.
        BEMÆRK: Brug de samme Y- og Z-positionsværdier, der er registreret i trin 4.5.1, for alle stik i en given prøve til at måle celletætheden langs prøvens X-akse (figur 1B, venstre gule cirkel).
      2. Over objekttræet skal du klikke på Tilføj nye pletter og klikke på Spring over automatisk oprettelse, Rediger manuelt. Når markøren er i 'vælg'-tilstand, skal du holde skift + klik nede for at placere et sted på skærmen. I menuen til venstre skal du indtaste XYZ-positionsværdierne beregnet ovenfor. Juster XY- og Z-diametrene til ≤20 for at få det bedste udsyn.
      3. Gentag trin 4.4.2 for at tilføje en referenceramme på denne stedplacering. Omdøb denne referenceramme i objekttræets ydre eller lignende.
      4. Hvis du vil beregne overgangsplaceringen (midtpunktet), skal du finde gennemsnittet afX-centerpositionsværdien ogX-værdierne for den ydre position. Brug denne værdi som X-position for overgangsreferencerammen. Som ovenfor skal de samme Y- og Z-værdier, der er registreret i trin 4.5.1, anvendes for alle stik i en given prøve til at måle celletætheden langs prøvens X-akse (figur 1B, midterste gule cirkel).
      5. Gentag trin 4.4.2 for at placere den midterste referenceramme på denne placering, og omdøb den til "overgang" eller lignende, når den er oprettet.
    3. Klik på de spots, der blev oprettet i trin 4.3, og gå til Statistik. I nederste højre hjørne af menuen skal du klikke på Eksporter alle statistikker til fil og gemme data i et regneark.
    4. Åbn regnearket. Gå til fanen Afstand fra Origin-referenceramme. Hvert objekts afstand til referencerammerne vises i kolonne A, og grupperingen af referencerammer for hvert objekt vises i kolonne G. Brug funktionen 'MOD' til numerisk at tildele hver afstand til den tilsvarende referenceramme, hvor 0 er midterrammen, 1 er overgangen, og 2 er den ydre.
    5. Filtrer værdierne i denne kolonne for at arbejde med afstandene i hver referenceramme. For hver af referencerammerne beregnes antallet af objekter inden for 50 mikrometer fra rammen ved hjælp af funktionen »COUNTIF (kolonnex, »≤50«), hvor kolonnex er kolonnen »Afstand fra oprindelsesreferenceramme« for hver gruppe. Den resulterende værdi svarer til antallet af celler i det regionale stik. Divider denne værdi med volumenet af 100-μm-stikket for at opnå celletæthed.
  6. Udfør den rumligt raffinerede regionale stikmetode (figur 1C).
    BEMÆRK: Denne tilgang blev brugt til at vurdere regional cellelevedygtighed som reaktion på lægemiddelapplikation. Inkludering af flere referencerammer forbedrer opløsningen af celletætheder, der kan beregnes i hele modeltykkelsen.
    1. Trin 4.4.1-4.4.3 gentages for at indstille den midterste referenceramme (figur 1C, central gul cirkel) og opnå prøveradiussen.
    2. Udfør manuelle beregninger for at bestemme yderligere steder af interesse. For at gøre dette skal du tilføje 100 μm tilX-centerværdien og derefter bruge Y- og Z-værdierne for midtpunktet til at definere den første placering langs midteraksen. Tilføj en referenceramme til denne position som i trin 4.4.2 (figur 1C, gul cirkel ved siden af midtercirklen).
      BEMÆRK: Tilføj færre μm på dette trin, hvis du søger sporing af højere opløsningstæthed.
    3. Trin 4.6.2 gentages, idet der tilsættes 100 μm (eller det ønskede antal μm) til hver sekventiel X-placering for at etablere en akse af propper med lige stor afstand gennem prøvens tykkelse. Den sidste referenceramme anbringes ≤50 μm væk fra prøvens ydre radius (figur 1C, gule cirkler).
    4. Trin 4.5.3-4.5.5 gentages for at opnå celletal inden for hvert stik med en diameter på 100 μm. Divider disse værdier med volumenet af hvert tilsvarende stik for at opnå lokal celletæthed.
    5. Gentag alle trin i dette afsnit for OCT-data indsamlet på hvert tidspunkt i lægemiddelforsøget. Sammenligning af celletal på hvert sted gennem behandlingstidsforløbet bør afsløre, hvor celletætheden er faldende (dvs. regioner, der oplever celledød) og følgelig hvor dybt lægemidlet trænger ind (dvs. hvilke lag ser et fald i celletætheden i forhold til dem, der opretholder eller viser en stigning i celletæthedsniveauer).

Figure 1
Figur 1: Skematisk illustration. (A) Den koncentriske lag (skaller) tilgang til vurdering af regional celletæthed i sfæriske aggregater. (B) Den regionale stikmetode blev udviklet til at evaluere lokal celletæthed i ikke-sfæriske aggregater, hvor små (100 μm diameter) sfæriske propper (vist med gult) anvendes som densitetsindikatorer ved hver zone/tykkelse. (C) Den rumligt raffinerede regionale stikmetode anvendes til undersøgelser af lægemiddelindtrængning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I en tidligere publikation blev der etableret en metode til ikke-destruktiv måling af global celletæthed inden for cellulære aggregater ved hjælp af OCT10. Heri udvides denne teknik til at vurdere den regionale celletæthed af udviklende celleaggregater. Figur 1 viser en skematisk oversigt over denne udvidelse, hvor celletætheden kan evalueres i koncentriske lag af en sfæroid eller mere lokalt ved i stedet at se på små (100 μm diameter) sfæriske stik, betegnet med de gule cirkler i figur 1B, C. MDA-MB-231 tumorsfæroider blev oprindeligt vurderet ved at indstille et midtpunkt inden for aggregatet og tælle antallet af objekter / celler i sekventielle koncentriske lag af sfæroiden. Disse resultater fremgår af figur 2. Elevens t-test afslørede signifikant højere celletæthed i den sfæroide kerne end i overgangslaget (p = 4,3e-4) og ydre lag (p = 4,0e-6). Dette resultat indikerer komprimering i den sfæriske kerne efter 4 dage.

Figure 2
Figur 2: Forskelle i regional densitet beregnet ved koncentrisk lagtilgang for sfæriske MDA-MB-231-aggregater. Figuren illustrerer en radial celletæthedsgradient med celler (n = 3) tættest pakket i den samlede kerne, og den lokale celletæthed falder med afstanden fra kernen. Det gennemsnitlige samlede celleantal vises med en blå linje. Skalalinjen for det indsatte billede er 100 μm. Data vist som middelværdi ± SD (*= p < 0,05, ***= p < 0,001). Klik her for at se en større version af denne figur.

En begrænsning af denne koncentriske lagteknik er imidlertid, at den kun kan bruges på sfæriske aggregater. Celletællingsmetoden blev således tilpasset til at etablere en Regional Plug-metode, der prøver små zoner på sekventielle steder gennem aggregatet, der ligner en virtuel biopsi. Disse stik giver målinger af den lokale celletæthed på bestemte dybder. Denne teknik blev valideret mod den koncentriske lagtilgang ved at udføre analyser på de samme MDA-MB-231 sfæroider (figur 3). Resultaterne viste god overensstemmelse mellem de regionale stik- og koncentriske lagmetoder for disse sfæriske aggregater. Elevens t-test viste ingen statistiske forskelle mellem metoderne til måling af yder- og overgangslagene (henholdsvis p = 0,243 og 0,484) og en lille, men signifikant forskel ved beregning af tæthederne ved den samlede kerne (p = 0,017).

Figure 3
Figur 3: Koncentriske zone- og regionale stikmetoder giver lignende resultater til kvantificering af celletæthed i sfæriske MDA-MB-231-aggregater (n = 3). Data vist som middelværdi ± SD (* = p < 0,05). Klik her for at se en større version af denne figur.

Denne teknik blev derefter anvendt til at vurdere både sfæriske og ikke-sfæriske tumoraggregater på dag 4 af modenhed (figur 4) og observerede en lignende tendens til kernekomprimering for alle testede morfologier, uanset celletype. Denne tendens var mest fremtrædende i prøverne fremstillet med Matrigel (kældermembranmatrixen), et additiv, der er kendt for at fremme aggregering, men hvis eksogene faktorer og sammensætning er dårligt karakteriseret 31,32,33. Interessant nok synes tilføjelsen af matrixen ikke at påvirke volumenet eller celletallet og synes således at have ubetydelig indflydelse på celleproliferation. Matrixtilsætningen ser snarere ud til at omfordele celletætheden, hvilket fremmer betydelig kernekomprimering og faldende celletæthed i de ydre lag. Disse resultater indikerer også, at AU565-celler ser ud til at være mindre følsomme over for matrixmedierede aggregeringseffekter end MDA-MB-231-celler. Disse resultater giver værdifuld indsigt i de fysiske mekanismer, hvormed matrixen muliggør celleaggregering i forskellige brystkræftcellelinjer. Det er vigtigt, at den regionale stiktilgang passer til alle MCTS'er, der viser sfæriske eller ikke-sfæriske aggregatgeometrier.

Figure 4
Figur 4: Matrixtilsætning fremmer mere aggregering og omfordeler celletæthed i kræftcellelinjer. For både MDA-MB-231 (A,B) og AU565 (C,D) cellelinjer reducerer matrixtilsætning densiteten i den ydre zone og øger komprimeringen i midten (n = 3) uden mærkbart at ændre det samlede celletal. Gennemsnitlige samlede celleantal vises med blå linjer. Indsatte skalastænger = 100 μm. Data vist som middelværdi ± SD (*= p < 0,05, **= p < 0,01, ***= p < 0,001). Klik her for at se en større version af denne figur.

Dernæst blev denne regionale stiktilgang brugt til at spore celledød i TZM-behandlede tumoraggregater ikke-destruktivt. AU565 MCTS'er fremstillet med membranmatrixen blev behandlet med TZM på dag 4 af udviklingen og dyrket gennem dag 9 med vigtige OCT-billeddannelsestidspunkter ved 0 timer (præ-lægemiddel), 24 timer og 120 timer (5 dage). Den rumligt definerede regionale stikmetode blev anvendt på hvert tidspunkt med stik indstillet hver 100 μm i hele tykkelsen af hvert aggregat, som vist ved de gule cirkler i figur 1C. Størrelsen på centerstikket blev holdt konstant, mens det ydre stik fik lov til at svinge i diameter, svarende til skiftende aggregatstørrelse. Mindre udsving i celletæthed blev observeret over tid inden for de indre 500 μm af hvert aggregat, hvilket indikerer minimal celledød (figur 5). Faktisk forekom de fleste celledødsfald i de ydre 200 μm af hvert aggregat, især i de yderste 100 μm, som forsvandt fuldstændigt ved 120 timers tidspunktet for alle analyserede aggregater. Visualiseringen af celledød som vejledende lægemiddelrespons hovedsagelig i de ydre lag af MCTS'er er i overensstemmelse med lægemiddelindtrængningsproblemer af TZM, et klinisk relevant antistoflægemiddel med en molekylvægt på 145 kDa34. Faktisk er lægemidlet afhængig af passiv diffusion gennem disse tætte cellulære modeller, hvilket forventes at udfordre dets evne til at trænge dybere end 200 μm ind i modellerne.

Figure 5
Figur 5: Cellelevedygtighed som reaktion på lægemidlet målt i hele den samlede tykkelse. Stikket ved den indre kerne blev holdt konstant ved 100 μm diameter, mens det i den ydre zone fik lov til at svinge med skiftende aggregatstørrelse. (A) Regional celletæthed som reaktion på TZM-tilsætning afslørede, at celledød stort set var begrænset til de ydre 200 μm, især de ydre 100 μm, som forsvandt fuldstændigt efter 120 timers behandling. Den indre 500 μm tykkelse af aggregaterne observerede lidt ændring i celletal (n = 3). Gennemsnitlige samlede celleantal vises med tilsvarende farvede linjer for hvert tidspunkt. Data vises som gennemsnitlige ± SD. (B) Varmekortdiagram, der repræsenterer ændringen i den gennemsnitlige celletæthed som reaktion på lægemidlet som en funktion af den samlede tykkelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Betydning
Multicellulære tumor sfæroider (MCTS'er) er kraftfulde 3D in vitro-modeller til undersøgelse af tumorprogression og lægemiddelscreening 1,2,3. Fremme af nytten af disse relativt enkle aggregerede modeller er stærkt afhængig af karakteriseringen af deres nøglefunktioner, såsom morfologi og celletæthed, som vides at påvirke både tumormodelprogression og terapeutisk respons. Deres nødvendige størrelse medfører imidlertid udfordringer ved evaluering af disse egenskaber, især for ikke-destruktive analyser. Den præsenterede metode giver et nyt værktøj til langsgående og etiketfri kvantificering af celletæthed og levedygtighed inden for diskrete regioner i tætte 3D-aggregerede modeller. Det samme aggregat kan afbildes med OPTISK KOHÆRENSTOMOGRAFI (OCT) over flere udviklingsdage. Disse volumetriske scanninger kan analyseres for at karakterisere, hvordan celletætheden udvikler sig regionalt under MCTS-modning. De samme principper gælder for analysen af lægemiddelaggregater, som kan afbildes i længderetningen gennem et givet lægemiddelregime for at bestemme, hvor celletætheden er faldende, dvs. hvor lægemidlet aktivt kan dræbe celler. Denne fremgangsmåde forbedres betydeligt i forhold til tidligere metoder til opnåelse af lignende celleskalaoplysninger, som traditionelt kræver fiksering, farvning og / eller sektionering, hvilket udelukker langsgående analyser. Faktisk har dette værktøj potentialet til dramatisk at reducere antallet af prøver, der er nødvendige for en given undersøgelse, da de samme prøver kan analyseres fortløbende. Dette forventes også at tilføre merværdi på hvert tidspunkt, da udviklingen kan spores inden for et enkelt aggregat, da det reagerer på en given stimulus, snarere end at stole på korrelerede data fra aldersmatchede terminalprøver. Ud over denne MCTS-applikation, der er demonstreret heri, kan denne OCT-Imaris-metode studere andre cellulære aggregater, embryoide kroppe, mere komplekse organoider eller vævsprøver op til et par millimeter tykke. Denne protokol vil forbedre forståelsen af cellekomprimering under aggregeret udvikling og lægemiddelrespons inden for tætte aggregerede modeller.

Ændringer
Den præsenterede protokol blev optimeret til analyse af MDA-MB-231 og AU565 MCTSS modeller. Modeller lavet ved hjælp af andre cellelinjer er anvendelige; der kan dog være behov for en vis protokoloptimering på grund af ændringer i gennemsnitlig cellestørrelse og aggregeret morfologi. En separat undersøgelse blev udført, hvor MDA-MB-231 og AU565 celler blev belagt i 2D og opnåede en gennemsnitlig cellestørrelse via mikroskopi. Denne diameter blev brugt som XY-diameter inden for Imaris "spots" -funktionen, således at objekter af denne omtrentlige størrelse blev talt. Hvis du ændrer denne værdi, ændres antallet af objekter, der er placeret i eksempel10, og der forventes mere nøjagtige resultater, når dette input nøje svarer til cellestørrelsen. Således skal en passende XY-diameter informeres af den gennemsnitlige cellestørrelse for den anvendte celletype.

Kritiske trin og fejlfinding
Et af de kritiske trin under OCT-billeddannelse er valget af scanningsopløsning. Den pixelstørrelse, som brugeren indstiller, skal være tilstrækkelig lille til, at der er behov for flere pixel for at omfatte den gennemsnitlige størrelse af den celletype, der anvendes. Dette forbedrer nøjagtigheden af "spots" -analysen inden for Imaris ved at forbedre OCT's opløsning af cellerne og reducere muligheden for, at stokastisk pixelstøj vil påvirke celletællingen negativt.

Isolering af prøven inden for Imaris-referencerammen påvirker i høj grad outputværdierne for celletæthed. Når brugeren udfører dette trin, ledsages det af et niveau af subjektivitet og bias, der skal anvendes konsekvent på tværs af alle prøveanalyser. Når prøven isoleres inden for volumenscanningen for at starte Imaris-analysen, skal man sørge for at spore aggregerede konturer nøjagtigt og undgå inkludering af artefakter (dvs. refleksioner fra substrater eller mediehøjde).

Korrekt placering af referencerammer under regional stikanalyse er et andet kritisk skridt. Som nævnt i indledningen er de tre kritiske zoner, der skal analyseres under modeludvikling, den proliferative ydre region, overgangsregionen bestående af senescente / hvilende celler og den hypoxiske kerne. Placeringen af referencerammer i midten af hvert lag forventes at give den mest nøjagtige estimering af celletætheden inden for det pågældende område. Denne referencerammeplacering er af endnu større betydning for de detaljerede regionale stikanalyser, der anvendes heri til lægemiddelundersøgelsen, da der skal etableres jævnt fordelte zoner for at analysere lægemiddelrespons mere præcist.

Begrænsninger og fremtidig forskning
Den vigtigste begrænsning ved den foreslåede metode er den brugerbaserede skive-for-skive-sporing, der udføres inden for Imaris for at isolere aggregatet inden for OCT-volumenscanningen. Dette er et kritisk skridt for nøjagtige resultater, som er noget subjektive og derfor forventes at give en vis grad af variation mellem brugere. For at løse dette søger vi i øjeblikket at inkorporere en kantdetekteringsalgoritme udført i Matlab (eller lignende) inden upload af scanningen til Imaris. Denne algoritme skal objektivt identificere prøvekanter i progressive B-scanningsskiver, hvorefter de foreslåede analyser kan udføres på dette forisolerede prøveområde. En løsning på denne begrænsning vil fjerne brugerbaserede variationer og forventes at føre til en bredere anvendelse af dette OLT-baserede værktøj.

OCT's evne til nøjagtigt at afbilde levende celler i aggregater under lægemiddelbehandling er betinget af den tilstand af celledød, som lægemidlet opererer på. Det tidligere arbejde afslørede kvantitative unøjagtigheder i antallet af levende celler rapporteret fra OCT / Imaris som reaktion på Doxorubicin, et velkendt lægemiddel mod kræft, der dræber celler via nekrose og apoptose10. Dette antages at skyldes de resterende cellemembraner under nekrose, som forventes at fremstå som levende celler under strukturel billeddannelse. TZM er kendt for at dræbe celler primært via apoptose35; Når celler dør, skal de således nedbrydes i stykker, der er tilstrækkeligt små til ikke at blive sporet / talt af OCT. Selvom der er behov for yderligere valideringstest med et apoptotisk lægemiddel, viser vores tidlige pilotforsøg OCT / Imaris fremragende enighed om dissocierede celletal i MCTS'er medicineret med TZM (upublicerede data). Derfor forventes de levende celleresultater, der præsenteres heri, at være mere nøjagtige end nekrosefremkaldende lægemidler. Denne sondring skal tages i betragtning, når denne tilgang anvendes til levedygtighedstest i lægemiddelaggregater.

Fremtidig forskning i ikke-destruktiv evaluering af tumoraggregater forventes at forbedre forståelsen af, hvordan de udvikler og reagerer på både eksterne stimuli og lægemiddelbehandling. Udvikling af analytiske værktøjer, som det, der præsenteres heri, bør udvide modelværktøjet og forbedre resultatnøjagtigheden, især inden for effektive applikationer såsom lægemiddelscreening og leverings- / effektivitetsvurdering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af NIH R01 BRG CA207725 (MB/DTC) og NIH R01 CA233188 (MB). Vi vil gerne takke AMC Pharmacy for Trastuzumab leveret til disse eksperimenter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well plates Greiner Bio-One  650970 CellStar Cell-Repellent Surface, https://shop.gbo.com/en/usa/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-repellent-surface/
0.25% trypsin, 2.21 mM EDTA Corning 25-053-CI
AU565 breast cancer cells ATCC
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Corning 10-013-CV
Fetal Bovine Serum ATCC 30-2020
FIJI software open-source (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/
Hemocytometer Fisher Scientific 0267151B
Imaris image analysis software Bitplane Current version 9.8
L-glutamine Lonza 17-605E
Matrigel Corning 354263
MDA-MB-231 breast cancer cells ATCC
Microscope Zeiss Z1 AxioVision
Penicilin streptomycin Corning 30-0002CI
Plate centrifuge Eppendorf
RPMI medium 1640 Gibco 11875-085
Spectral Domain Optical Coherence Tomography ThorLabs TEL220C1
T75 cell culture flasks Greiner Bio-One  658175
Trastuzumab Remnant clinical samples of Trastuzumab were used in this study, generously gifted by the Albany Medical College Pharmacy. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutherland, R., JA, M., Inch, W. Growth of multicell spheroids in tissue culture as a model of nodular carcinomas. Journal of the National Cancer Institute. 46 (1), 113-120 (1971).
  2. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  3. Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional. Analytical Biochemistry. 437 (1), 17-19 (2013).
  4. Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model. Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).
  5. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
  6. Jiang, Y., Pjesivac-Grbovic, J., Cantrell, C., Freyer, J. P. A multiscale model for avascular tumor growth. Biophysical Journal. 89 (6), 3884-3894 (2005).
  7. Freyei, J. P., Sutherland, R. M. Regulation of growth saturation and development of necrosisin EMT6/R0 multicellular spheroids by the glucose and oxygen supply. Cancer Research. 46 (7), 3504-3512 (1986).
  8. Desoize, B., Jardillier, J. C. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance. Critical Reviews in Oncology Hematology. 36 (2-3), 193-207 (2000).
  9. Mellor, H. R., Ferguson, D. J. P., Callaghan, R. A model of quiescent tumour microregions for evaluating multicellular resistance to chemotherapeutic drugs. British Journal of Cancer. 93 (3), 302-309 (2005).
  10. Roberge, C. L., et al. Non-destructive tumor aggregate morphology and viability quantification at cellular resolution, during development and in response to drug. Acta Biomaterialia. 117, 322-334 (2020).
  11. Piccinini, F., Tesei, A., Bevilacqua, A. Single-image based methods used for non-invasive volume estimation of cancer spheroids a practical assessing approach based on entry-level equipment. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 135, 51-60 (2016).
  12. Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).
  13. Song, Y., et al. Patient-derived multicellular tumor spheroids towards optimized treatment for patients with hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 1-13 (2018).
  14. LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 7 (9), 819-830 (2012).
  15. Hakanson, M., Textor, M., Charnley, M. Engineered 3D environments to elucidate the effect of environmental parameters on drug response in cancer. Integrative Biology. 3 (1), 31-38 (2011).
  16. Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
  17. Huang, D., et al. Optical coherence tomography HHS public access. Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).
  18. Zhong, H. Q., et al. Enhancement of permeability of glycerol with ultrasound in human normal and cancer breast tissues in vitro using optical coherence tomography. Laser Physics Letters. 7 (5), 388-395 (2010).
  19. Fujimoto, J., Swanson, E. The development, commercialization, and impact of optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), (2016).
  20. Huang, Y., et al. Optical coherence tomography detects necrotic regions and volumetrically quantifies multicellular tumor spheroids. Cancer Research. 77 (21), 6011-6020 (2017).
  21. Hari, N., Patel, P., Ross, J., Hicks, K., Vanholsbeeck, F. Optical coherence tomography complements confocal microscopy for investigation of multicellular tumour spheroids. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
  22. El-Sadek, I. A., et al. Three-dimensional dynamics optical coherence tomography for tumor spheroid evaluation. Biomedical Optics Express. 12 (11), 6844 (2021).
  23. Kingsley, D. M., et al. Laser-based 3D bioprinting for spatial and size control of tumor spheroids and embryoid bodies. Acta Biomateralia. 95, 357-370 (2019).
  24. Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
  25. Roberge, C. L., Rudkouskaya, A., Barroso, M., Corr, D. T. Longitudinal, label-free assessment of cell density and viability in multicellular tumor spheroids via optical coherence tomography. Summer Biomechanics, Bioengineering, and Biotransport Conference. , (2020).
  26. Bellotti, C., Duchi, S., Bevilacqua, A., Lucarelli, E., Piccinini, F. Long term morphological characterization of mesenchymal stromal cells 3D spheroids built with a rapid method based on entry-level equipment. Cytotechnology. 68 (6), 2479-2490 (2016).
  27. Noto, A., et al. Stearoyl-CoA desaturase-1 is a key factor for lung cancer-initiating cells. Cell Death & Disease. 4 (12), 947 (2013).
  28. Riffle, S., Hegde, R. S. Modeling tumor cell adaptations to hypoxia in multicellular tumor spheroids. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 36, 102 (2017).
  29. Wilson, W. R., Hay, M. P. Targeting hypoxia in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11, 393-410 (2011).
  30. Grimes, D. R., Kelly, C., Bloch, K., Partridge, M. A method for estimating the oxygen consumption rate in multicellular tumour spheroids. Journal of the Royal Society Interface. 11 (92), 20131124 (2014).
  31. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  32. Pozzi, S., et al. Meet me halfway: Are in vitro 3D cancer models on the way to replace in vivo models for nanomedicine development. Advanced Drug Delivery Reviews. 175, 113760 (2021).
  33. Nguyen, E. H., Daly, W. T., Belair, D. G., Le, N. N., Murphy, W. L. High throughput screening format identifies synthetic mimics of matrigel for tubulogenesis screening. , Available from: https://abstracts.biomaterials.org/data/papers/2015/abstracts/547.pdf (2015).
  34. Duchnowska, R., Szczylik, C. Central nervous system metastases in breast cancer patients administered trastuzumab. Cancer Treatment Reviews. 31 (4), 312-318 (2005).
  35. Zazo, S., et al. Generation, characterization, and maintenance of trastuzumab-resistant HER2+ breast cancer cell lines. American Journal of Cancer Research. 6 (11), 2661-2678 (2016).

Tags

Kræftforskning nummer 184
Ikke-destruktiv evaluering af regional celletæthed inden for tumoraggregater efter lægemiddelbehandling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Roberge, C. L., Wang, L., Barroso,… More

Roberge, C. L., Wang, L., Barroso, M., Corr, D. T. Non-Destructive Evaluation of Regional Cell Density Within Tumor Aggregates Following Drug Treatment. J. Vis. Exp. (184), e64030, doi:10.3791/64030 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter