Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Ikke-destruktiv evaluering av regional celletetthet innen tumoraggregater etter medikamentell behandling

Published: June 21, 2022 doi: 10.3791/64030
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Rensselaer Polytechnic Institute, 2Albany Medical College

Summary

Den nåværende protokollen utvikler en bildebasert teknikk for rask, ikke-destruktiv og etikettfri regional celletetthet og levedyktighetsmåling innen 3D-tumoraggregater. Funn viste en celletetthetsgradient, med høyere celletetthet i kjerneregioner enn ytre lag i utviklingsaggregater og overveiende perifer celledød i HER2+ aggregater behandlet med trastuzumab.

Abstract

Multicellulære tumorsfæroidmodeller (MCTSer) har vist økende nytteverdi for in vitro-studier av kreftprogresjon og legemiddeloppdagelse. Disse relativt enkle avaskulære konstruksjonene etterligner viktige aspekter ved in vivo svulster, som 3D-struktur og patofysiologiske gradienter. MCTS-modeller kan gi innsikt i kreftcelleadferd under sfæroidutvikling og som respons på medisiner; Imidlertid begrenser deres nødvendige størrelse drastisk verktøyene som brukes til ikke-destruktiv vurdering. Optisk koherens Tomografi strukturell avbildning og Imaris 3D-analyseprogramvare utforskes for rask, ikke-destruktiv og etikettfri måling av regional celletetthet i MCTSer. Denne tilnærmingen brukes til å vurdere MCTSer over en 4-dagers modningsperiode og gjennom en utvidet 5-dagers behandling med Trastuzumab, et klinisk relevant anti-HER2-legemiddel. Kort fortalt ble AU565 HER2+ brystkreft MCTSer opprettet via væskeoverlegg med eller uten tilsetning av Matrigel (en kjellermembranmatrise) for å utforske aggregater av forskjellige morfologier (henholdsvis tykkere, disklignende 2.5D aggregater eller flate 2D aggregater). Celletetthet i ytre region, overgangsområde og indre kjerne ble karakterisert i modne MCTSer, og avslørte en celletetthetsgradient med høyere celletetthet i kjerneområder sammenlignet med ytre lag. Matrisetilsetningen omfordelte celletetthet og forbedret denne gradienten, reduserte ytre sonetetthet og økte cellekomprimeringen i kjernene. Celletetthet ble kvantifisert etter medikamentell behandling (0 timer, 24 timer, 5 dager) innen gradvis dypere 100 μm soner for å vurdere potensielle regionale forskjeller i legemiddelrespons. Ved det endelige tidspunktet syntes nesten all celledød å være begrenset til de ytre 200 μm av hvert aggregat, mens celler dypere i aggregatet virket stort sett upåvirket, noe som illustrerer regionale forskjeller i legemiddelresponsen, muligens på grunn av begrensninger i narkotikapenetrasjon. Den nåværende protokollen gir en unik teknikk for å ikke-destruktivt kvantifisere regional celletetthet i tette cellulære vev og måle den i lengderetningen.

Introduction

Forskere har i stor grad vendt seg til stasjonære 3D-kultur in vitro-systemer for å studere noen av de viktigste funksjonene i tumorprogresjon. Mye av denne forskningen har blitt ledet av gjenoppkomsten av multicellulære tumorsfæroider (MCTSer) og mer komplekse organoider 1,2. Selv om disse modellene er avaskulære, gir de et kraftig verktøy for å rekapitulere fysiologiske og patologiske prosesser som forekommer in vivo 3,4,5. Spesielt kan mellomstore modeller (300-500 μm diameter) etterligne viktige tumorfunksjoner som 3D-struktur, patofysiologiske gradienter og metastatisk signalering på grunn av hypoksi i kjernen. Det er godt dokumentert at disse modellene viser de karakteristiske konsentriske lagene som ses i vaskulariserte in vivo svulster, nemlig et ytre lag av proliferative celler, et overgangslag av senescent / hvilende celler og celler som opplever hypoksi i kjernen 3,6,7,8,9 . Unik innsikt kan oppnås fra disse modellene ved å karakterisere celleadferd i disse lagene, under utvikling og som respons på stoffet. Imidlertid begrenser den nødvendige MCTS-størrelsen, som er nødvendig for å utvikle gradientene som gjør dem til så kraftige in vitro-modeller, drastisk verktøyene som brukes til ikke-destruktiv vurdering. Faktisk er en av de største utfordringene med ikke-destruktiv analyse av MTCS-er kvantifisering av celleskaladetaljer. Lysfelt- og fasekontrastmikroskopi brukes rutinemessig for å vurdere 3D MCTSs vekst og utvikling ikke-destruktivt. Imidlertid er disse modalitetene begrenset til 2D-projeksjoner, og mangler kapasitet til å visualisere den avgjørende 3D-strukturen til disse modellene 10,11,12,13. Informasjon om cytotoksisitet og celleproliferasjon samles vanligvis inn ved fluorescerende avbildning (dvs. lysarkmikroskopi, konfokal mikroskopi) eller ex vivo immunohistologisk farging 14,15,16. Selv om disse tilnærmingene gir verdifull, høyoppløselig informasjon om vevsstruktur, cellulær tetthet og cellulær funksjon, krever de ofte prøvepreparering som optisk rydding, festing / farging eller innebygging som forhindrer langsgående analyser.

Optisk koherenstomografi (OCT) er en ikke-destruktiv strukturell bildebehandlingsmodalitet som har potensial til å overvinne noen av utfordringene nevnt ovenfor. Den har cellulær oppløsning og et tilstrekkelig bredt synsfelt (opptil 10 mm x 10 mm) som er i stand til å visualisere hele flercellede aggregater 17,18,19. Viktigere, på grunn av den synlige naturen til lyset som brukes, er denne teknikken helt ikke-destruktiv og etikettfri17. Prøver kan også avbildes in situ uten å kreve prøvepreparering, slik at prøver kan tas rett fra inkubatoren, raskt skannes med OCT (skanningsvarighet ~ 5-10 min), og deretter returneres til inkubatoren, noe som muliggjør langsgående karakterisering. Mange studier som søker å bruke OCT til å analysere tumorsfæroid oppførsel har nylig dukket opp. I en av de mest spennende demonstrasjonene brukte Huang og medarbeidere OCT til ikke-destruktivt å oppdage nekrotiske kjerner i store tumorsfæroidmodeller, og bemerket at levende og døde celleregioner har merkbare forskjeller i optisk demping, som kan brukes til etikettfri levedyktighetsovervåking20. Tilsvarende gjennomførte Hari og medarbeidere brytningsindeksmålinger (RI) av human tykktarmskreft (HCT116) sfæroider avbildet med OCT for å studere tilstedeværelsen av hypoksi i prøvene21. Deres målinger var ikke tilstrekkelige for direkte slutninger, selv om de observerte lavere RI på steder som korrelerte med stedet, men ikke størrelsen, av nekrotiske kjerner, senere identifisert via konfokal mikroskopi. Abd El-Sadek og medarbeidere brukte OCT til å visualisere og kvantifisere regional vevs levedyktighet av brystkreftsvulstmodeller22. De rapporterte to OCT-baserte metoder for visualisering av vevsdynamikk og viste en moderat korrelasjon mellom forskjeller i disse beregningene og mikroskopi-identifiserte regioner av levende / døde celler.

Vårt publiserte arbeid ved hjelp av OCT bygget på denne tidligere litteraturen for å etablere en kvantitativ, ikke-destruktiv tilnærming for å måle 3D-morfologi og celletall i MCTSs brystkreftmodeller under utvikling10,23. Ved å bruke Imaris 3D-gjengivelsesbildeanalyseprogramvare for å telle antall objekter i cellestørrelse (dvs. flekker) som ble avbildet i OCT-volumskanningene, ble celletellingene ikke-destruktivt målt i MCTSer som var statistisk lik de som ble bestemt via hemocytometer ved samlet dissosiasjon. På grunn av OCT's strukturelle natur kan cellemembraner som fortsatt er tilstede etter celledød ved nekrose, feilaktig telles som levende celler. Videre ble denne karakteriseringen utvidet til ikke-destruktivt sporcelle levedyktighet innenfor individuelle aggregater utsatt for et legemiddelregime med lovende suksess10. Det ble bemerket at lignende celle levedyktighet ble rapportert fra vår OCT-Imaris-tilnærming med det som ble benchmarket i disse prøvene ved dissosiasjon. Denne ikke-destruktive og etikettfrie celletilnærmingen gjør det mulig å telle celler i 3D-konstruksjoner og tette aggregater i lengderetningen uten å ofre konstruksjons- / aggregatstrukturen.

Det nåværende arbeidet rapporterer en forbedret tilnærming til direkte kvantifisering av regional celletetthet i tette aggregater ved å utnytte OCT-Imaris evne til å måle både 3D-aggregatmorfologi og cellenummer. Denne metodologiske utviklingen gir et mer detaljert bilde av cellenes romlige fordeling og spredning innenfor de karakteristiske konsentriske lagene i MCTS-modeller. I stedet for bare å beregne en samlet gjennomsnittlig samlet celletetthet, kan slike lokale tetthetsmålinger avsløre celletetthetsgradienter, for eksempel de som er forbundet med komprimering. Denne regionale vurderingen brukes også på aggregater behandlet med kjemoterapeutisk for å vurdere regional legemiddelrespons, målt ved endringer i lokal celletetthet. Denne kombinasjonen av OCT og avanserte bildeanalysemetoder gir kvantifisering av regional celle levedyktighet, som kan brukes til å utforske stoffpenetrasjon basert på hvilke regioner som opplever reduksjoner i celletetthet. Dette er den første rapporten som ikke-destruktivt kvantifiserer regional celletetthet og levedyktighet som svar på stoffet i tette cellulære vev og måler det i lengderetningen. Slik karakterisering av tredimensjonal celletetthet og romlig fordeling gjennom hele MCTSer kan bidra til å optimalisere legemiddellevering i kreftbehandling og forbedre forståelsen av kreftmodellprogresjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

AU565 (HER2+) og MDA-MB-231 brystkreftcellelinjer ble brukt i denne studien (se materialtabell).

1. Forberedelse av tumoraggregater

  1. Forbered AU565 (HER2+) brystkreftcellevekstmedier ved bruk av Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 basalt medium (+) i L-glutamin supplert med 10% (v / v) føtalt bovint serum og 1% penicillin / streptomycin (se materialtabell).
  2. Forbered MDA-MB-231 trippel-negativ brystkreftcellevekstmedium ved bruk av Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM) supplert med 10% (v / v) føtalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin / streptomycin og 2 mM L-glutamin (se materialtabell).
  3. Forbered 70% -90% sammenflytende cellekulturer av begge cellelinjene (~ 3-4 dager med forberedelse) under standardforhold (37 ° C, 5% CO2, 95% relativ fuktighet). Løsne cellemonolag fra deres kulturflasker etter standard trypsiniseringsmetode.
    MERK: Forhindre overeksponering av celler til trypsin, noe som påvirker deres levedyktighet.
    1. For AU565-celler aspirerer du cellemedier fra kolben ved hjelp av en pipette (eller, hvis tilgjengelig, ved hjelp av en vakuumpumpe koblet via slange til en autoklavert glasspipettespiss) og erstattes med 2 ml Trypsin-EDTA. La kolben stå i 3 minutter ved romtemperatur, og flytt deretter til inkubatoren i 4 ekstra minutter. Etterpå legger du 6 ml vekstmedier til kolben for å nøytralisere trypsinet.
    2. For MDA-MB-231-celler aspirerer du cellemedier fra kolben på samme måte som utført i trinn 1.3.1 og erstattes med 1,5 ml Trypsin-EDTA. Etter 7 minutters inkubasjon tilsettes 8,5 ml vekstmedier til kolben for å nøytralisere trypsin.
  4. Tilsett 10 μL av cellesuspensjonen til et hemocytometer for å bestemme antall celler i suspensjonen24. Resuspenderingsceller i media ved ønsket konsentrasjon på 2,5 × 105 celler/ml.
  5. Dispenser 50 μL cellesuspensjon i hver brønn av en rundbunnet, ikke-klebende, 96-brønns plate. For suspensjoner fremstilt uten Matrigel (kjellermembranmatrise, se materialtabell), tilsett 50 μL vanlig vekstmedium til hver brønn.
    1. For suspensjoner tilberedt med kjellermembranmatrisen, fjern matrikshetteglasset fra -20 °C og sett det i kjøleskapet for å tine over natten. Forbered en beholder med vekstmedier og sett i kjøleskap i 10 minutter for å avkjøles.
    2. Ved hjelp av en frossen pipettespiss, tilsett matriksen til kjølte medier slik at den endelige konsentrasjonen av denne løsningen er 5%. Tilsett 50 μL av dette mediet til hver brønn, slik at den endelige konsentrasjonen av matriks i disse brønnene er 2,5%3.
      MERK: I tidligere arbeid ble den samlede morfologien vurdert for disse cellelinjene10,25, og fant at MDA-MB-231 aggregater danner sfæroider med tilsetning av membranmatrisen, mens MDA-MB-231 kulturer uten matrisen og AU565 +/- matrisen alle danner diskformede aggregater. Kvantifisert sfærisitet av >0,8 på en skala fra 0 (plan) - 1,0 (perfekt sfære) ble brukt til å identifisere tilstrekkelig sfæriske aggregater og dermed forventet å ha det nødvendige overflate-til-volum-forholdet for in vivo-lignende oppførsel26,27.
  6. Sentrifuger platene ved 123 x g i 10 minutter ved romtemperatur umiddelbart etter såing for å sikre oppsamling av en cellepellet i bunnen av hver brønn.
    MERK: Dette trinnet må skje så raskt etter såing som mulig. Forfatterne observerte at for mye tid mellom disse trinnene gjør at cellene kan bosette seg over bunnen og sidene av hver brønn, og hemmer deres evne til å samle og aggregere på bunnen av brønnen.
  7. Inkuber platene i 4 dager, da celleaggregatene anses å være modnet.
    MERK: AU565-aggregater fremstilt med kjellermembranmatrisen krever en ekstra 5-dagers dyrkningsperiode for legemiddelresponsstudien (9 dager totalt, medieendring på dag 4).

2. Administrering av trastuzumab (TZM) til AU565 celleaggregater

  1. Klargjør 500 μg/ml TZM-oppløsning (se materialtabell) i AU565 vekstmedier. På dag 4 tilsettes 10 μL av denne oppløsningen til hver brønn, slik at den endelige konsentrasjonen i hver brønn er 50 μg/ml.
  2. Kulturaggregater i 5 ekstra dager etter tillegg av TZM og vurdere på viktige tidspunkter.
    MERK: For denne studien ble tidspunkter på 0 timer (umiddelbart før medisinering), 24 timer og 120 timer etter legemiddel brukt til å analysere stoffet.

3. Optisk Koherens Tomografi bildebehandling

MERK: Prøvene her ble avbildet med Optical Coherence Tomography (OCT) i løpet av hver modningsdag (1-4), og deretter igjen på dag 5 (24 timer etter legemiddeltilsetning) og dag 9 (120 timer etter tilsetning av legemiddel) for utvalgte dopede aggregater. Et kommersielt Spectral-Domain Optical Coherence Tomography (SDOCT, se Table of Materials) system for OCT-avbildning ble brukt i den aktuelle studien. Selv om denne tilnærmingen er mottagelig for nesten alle OCT-systemer, og prosedyren som følges generelt vil være lik mellom forskjellige systemer, er noen av de detaljerte trinnene som følger spesifikke for det nåværende utstyret.

  1. Bruk et OCT-system for strukturell bildebehandling. Sett A-skannehastigheten til 5,5 kHz for bildesamling med høy oppløsning. Sett brytningsindeksen til 1, 33 for prøver i et flytende medium. Sett voxelstørrelsen til 1,10 x 1,10 x 2,58 μm3.
  2. I vinduet Bildeparametere på høyre side av skjermen angir du synsfeltet (FOV) ved å skrive inn X-, Y- og Z-verdier (i mm) slik at eksemplet omfattes av dette interesseområdet.
    MERK: FOV for disse studiene ble vanligvis satt til 1,5 x 1,5 x 0,5 mm3. Forsikre deg om at prøven passer innenfor dette området ved å veksle 'Vinkel'-inngangen mellom 0 og 90 grader og utføre visuell bekreftelse.
  3. Klikk på 3D-anskaffelsesmodus, og klikk deretter på Record for å samle inn 3D-volumskanningen av prøven.

4. Bildeanalyse

  1. Eksporter OCT-filen til programvareformatet (Imaris, se Materialtabell).
    1. Åpne filen OCT i programvareutviklingspakken. Klikk på Eksporter, sett filtypen til .jpg, og eksporter bildene til en tom mappe.
    2. Åpne bildebehandlingsprogramvaren (FIJI, se Materialtabell) og importer bildesekvensen fra mappen der de eksporterte JPEG-filene er lagret. Bruk programvare til å sy sammen bildesekvensen, og lagre deretter denne filen som et TIFF-bilde.
  2. Opprett en volumrekonstruksjon ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Åpne Imaris og naviger til den konverterte TIFF-filen i Arena. Gå til Rediger > bildeegenskaper og skriv inn voxelstørrelsen (i μm) fra OCT-bildet i de tilsvarende XYZ-boksene. Klikk deretter på OK.
      MERK: I eksempelobjekttreet på venstre side av skjermen fjerner du merket for Volum-fanen for å forhindre programvareforsinkelse.
    2. Klikk på Legg til nye overflater over objekttreet. I menyen under treet klikker du på Hopp over automatisk oppretting og rediger manuelt. I vinduet Skjermjustering skyver du de røde og svarte pilene manuelt for å forbedre kontrasten mellom prøven og bakgrunnen og forbedre eksempelvisualiseringen.
    3. Juster stykkeposisjonen til stykket på den ene kanten av prøven, dvs. der eksempelsignalet først vises. Bruk escape-tasten til å endre musen fra navigasjonsmodus til Select-modus, og klikk deretter på Draw. Spor omrisset av regionen som viser signalet manuelt.
    4. Forskynd stykkeposisjonen ved å skrive inn neste posisjon i inndataboksen. Denne neste posisjonen må være ≤100 skiver lenger inn i prøven enn den forrige. Spor regionen som viser signalet manuelt.
    5. Gjenta trinn 4.2.4 gjennom tykkelsen på prøven til den motsatte kanten av prøven er nådd. Klikk deretter på Opprett overflate i menyen til venstre for å sy disse skivene sammen og fullføre volumrekonstruksjonen.
    6. Klikk på Rediger, og klikk deretter på Maskevalg. Dette oppretter en ny kanal i visningsjusteringsvinduet som bare inneholder det isolerte eksemplet. Morfologiske egenskaper ved utvalget finnes nå i kategorien Statistikk > Detaljert .
      MERK: Denne tilnærmingen ble fulgt for å bestemme sfæricities og volumer rapportert i denne nåværende studien.
  3. Få tak i den totale celletettheten til en prøve ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Over objekttreet velger du Legg til nye flekker. På menyen Algoritmeinnstillinger fjerner du merket for alle boksene. Klikk på den blå pilen for å gå til Kildekanal-skjermen.
      1. Fra rullegardinmenyen som vises, velger du den maskerte kanalen som ble opprettet i trinn 5.2.8, vanligvis kalt Kanal 2. Skriv inn den gjennomsnittlige cellediameteren for prøven i boksen XY-diameter. Kontroller at bakgrunns subtraksjon er merket av.
        MERK: For dette arbeidet med AU565 og MDA-MB-231 celler ble diameteren satt til 10 μm. Dette valget er basert på cellestørrelse (forklart i Diskusjon-delen).
    2. Klikk på den blå pilen for å gå til skjermbildet Klassifiser flekker . I diagrammet nederst på menyen klikker du og drar venstre kant av den gule terskelen til venstre kant av grafen, slik at alle objekter er inkludert i den gule skyggefulle terskelen. Klikk deretter på den grønne pilen for å fullføre flekkopprettingen.
    3. Få tak i antall identifiserte objekter (dvs. antall prøveceller) ved å klikke på Statistikk > Samlet > totalt antall flekker.
    4. For å bestemme gjennomsnittlig samlet celletetthet deler du aggregatets celleantall (målt i trinn 4.3.3) med aggregert volum (bestemt i trinn 4.2.6).
  4. Vurdere den regionale tettheten i konsentriske lag av sfæriske aggregater (Figur 1A).
    1. Etter morfologisk og celletetthetsanalyse, vurder regional tetthet. Klikk på overflaten som ble opprettet i trinn 4.2.5, og naviger til fanen Overflater stil / kvalitet . Endre det merkede området til Midtpunkt , og endre bildepunktbredden til ≤20 for best synlighet. Naviger til Statistikk > Detaljert > posisjon og registrer plasseringen av midtpunktet.
    2. Velg Legg til ny referanseramme på menyen over objekttreet. Merk av for Synlig og Reparer ved siden av XY i menyen. Klikk og dra midten av referanserammeikonet slik at det er på linje med midtpunktet. Fjern merket for XY Visible - og Fix-boksene , og velg dem for XZ.
      1. Igjen, klikk og dra midten av referanserammeikonet slik at det er på linje med midtpunktet. Til slutt, gjenta dette for YZ-planet, vekslende mellom disse tre faste planene til referanserammen stemmer perfekt overens med midtpunktet. Dobbeltklikk referanserammen i objekttreet og gi den nytt navn til Senter eller Lignende.
    3. Klikk på flekkene som ble opprettet i trinn 4.3, og naviger til Statistikk > Detaljert > posisjonsreferanseramme. Klikk på Posisjon X Referanseramme til den sorterer fra høyeste til laveste verdi. Registrer den høyeste verdien - dette indikerer den lengste kanten av prøven, dvs. prøveradius.
      MERK: Siden prøvene som brukes her er sirkulære i XY-planet, kan beregninger utføres langs X- eller Y-aksen med lignende resultater. For prøver som ikke utviser X-Y-symmetri (asymmetrisk, ellipsoide, uregelmessig geometri, etc.), anbefales det å utføre disse analysene langs flere akser.
    4. Naviger til Statistikk. Nederst til høyre i menyen klikker du på Eksporter all statistikk til fil og lagrer data i et regneark.
    5. Utfør manuelle beregninger for å identifisere konsentriske lag langs X-aksen.
      MERK: Prøvene som ble brukt i denne studien var omtrent 500 μm i diameter; dermed er det to ytre 200 μm tykke konsentriske soner og en indre 100 μm tykk sentral sone. Det anbefales å opprettholde soner som er 200 μm tykke fordi diffusjonsadferdene forventes å endre seg over denne avstanden 7,28,29,30. I tråd med dette resonnementet anbefales det også å bruke flere konsentriske soner for større prøver og omvendt for mindre prøver.
    6. Angi en ytre lagregion på 200 μm ved å trekke 200 μm fra den ytre radiusen som finnes i trinn 4.4.3. Dermed vil den ytre regionen omfatte flekker med X-posisjoner mellom Xradius og Xytre, indre kant (figur 1A, oransje region).
    7. Angi en overgangsregion ved å trekke 200 μm fra Xytre, indre kant. Overgangsområdet vil omfatte flekker med X-posisjoner mellom X ytre,indre kant og Xovergangs-, indre kant (figur 1A, rosa region).
    8. Angi et sentralt kjerneområde som omfatter de gjenværende flekkene mellom prøvesenteret og Xovergangs-,indre kant (figur 1A, blå region).
    9. Åpne den lagrede regnearkfilen som ble opprettet i trinn 4.4.4. Naviger til fanen Referanseramme for avstand fra Origin.
    10. Beregn antall flekker i kjerneområdet ved hjelp av funksjonen' COUNTIF (Kolonnex, "< Xovergangs-, indre kant"), der Kolonnex er kolonnen 'Avstand fra opprinnelsesreferanseramme'. Den resulterende verdien er cellenummeret i dette området. Del denne verdien med volumet av regionen for å oppnå celletetthet.
    11. På lignende måte beregner du antall celler i overgangsområdet ved hjelp av 'COUNTIF (Kolonnex, "< Xytre, indre kant") - COUNTIF (Kolonnex, "> Xovergang, indre kant").
    12. Beregn antall celler i det ytre området ved hjelp av 'COUNTIF (Kolonnex,"> Xovergangs-, indre kant").
  5. Vurder den regionale celletettheten i ikke-sfæriske prøver via 'Regional Plugs' (figur 1B).
    MERK: For ikke-sfæriske prøver som ikke har konsentriske lag, er "Regional Plug" -metoden utviklet for å prøve lokal celletetthet på forskjellige radiale dyp i hele aggregatet.
    1. Gjenta trinn 4.4.1-4.4.3 for å angi den sentrale referanserammen (figur 1B, sentral gul sirkel) og få den totale prøveradiusen.
    2. Utfør manuelle beregninger for å identifisere plasseringen av referanserammer i overgangs- og ytre regioner slik at celletetthet kan vurderes i prøven på disse stedene.
      1. Hvis du vil beregne den ytre plasseringen, trekker du 50 μm fra prøveradiusverdien fra trinn 4.5.1 og bruker denne verdien som X-posisjon.
        MERK: Bruk de samme Y- og Z-posisjonsverdiene registrert i trinn 4.5.1 for alle plugger i en gitt prøve for å måle celletetthet langs X-aksen til prøven (figur 1B, gul sirkel lengst til venstre).
      2. Over objekttreet klikker du på Legg til nye flekker og klikker på Hopp over automatisk oppretting, rediger manuelt. Med pekeren i "velg" -modus, hold shift + klikk for å plassere et sted på skjermen. I menyen til venstre skriver du inn XYZ-posisjonsverdiene beregnet ovenfor. Juster XY- og Z-diametrene til ≤20 for best synlighet.
      3. Gjenta trinn 4.4.2 for å legge til en referanseramme på dette stedet. Gi nytt navn til denne referanserammen i objekttreet ytre eller lignende.
      4. Hvis du vil beregne overgangsplasseringen (midtpunktet), finner du gjennomsnittet av verdien forX-senterposisjonen og Xytre posisjonsverdier. Bruk denne verdien som X-posisjon for overgangsreferanserammen. Som ovenfor bruker du de samme Y- og Z-verdiene som er registrert i trinn 4.5.1 for alle plugger i en gitt prøve for å måle celletettheten langs X-aksen til prøven (figur 1B, midtre gul sirkel).
      5. Gjenta trinn 4.4.2 for å plassere den midterste referanserammen på dette stedet, og gi den navnet "overgang" eller lignende når den er opprettet.
    3. Klikk på flekkene som ble opprettet i trinn 4.3, og naviger til Statistikk. Nederst til høyre i menyen klikker du på Eksporter all statistikk til fil og lagrer data i et regneark.
    4. Åpne regnearket. Naviger til fanen Referanseramme for avstand fra Origin. Hvert objekts avstand til referanserammene vises i kolonne A, og grupperingen av referanserammer for hvert objekt vises i kolonne G. Bruk MOD-funksjonen til å tilordne hver avstand numerisk til den tilsvarende referanserammen, der 0 er midtrammen, 1 er overgangen og 2 er den ytre.
    5. Filtrer verdiene i denne kolonnen for å arbeide med avstandene i hver referanseramme. For hver av referanserammene beregner du antall objekter innenfor 50 mikrometer av rammen ved hjelp av funksjonen 'COUNTIF (Columnx, "≤50"), der Kolonnex er kolonnen 'Distance from Origin Reference Frame' for hver gruppe. Den resulterende verdien tilsvarer antall celler i den regionale pluggen. Del denne verdien med volumet av 100-μm pluggen for å oppnå celletetthet.
  6. Utfør Spatially-Refined Regional Plug-metoden (figur 1C).
    MERK: Denne tilnærmingen ble brukt til å vurdere regional celle levedyktighet som svar på narkotika søknad. Hvis du inkluderer flere referanserammer, forbedres oppløsningen til celletettheten som kan beregnes gjennom hele modelltykkelsen.
    1. Gjenta trinn 4.4.1-4.4.3 for å angi den midterste referanserammen (figur 1C, sentral gul sirkel) og få prøveradiusen.
    2. Utfør manuelle beregninger for å bestemme flere steder av interesse. Hvis du vil gjøre dette, legger du til 100 μm iX-senterverdien , og deretter bruker du Y- og Z-verdiene for midtpunktet til å definere den første plasseringen langs midtaksen. Legg til en referanseramme til denne posisjonen som i trinn 4.4.2 (figur 1C, gul sirkel ved siden av midtsirkelen).
      MERK: Legg til færre μm på dette trinnet hvis du ønsker tetthetssporing med høyere oppløsning.
    3. Gjenta trinn 4.6.2, og legg til 100 μm (eller ønsket antall μm) til hver sekvensielle X-plassering for å etablere en akse med like avstand plugger gjennom tykkelsen på prøven. Plasser den siste referanserammen ≤50 μm unna den ytre radiusen til prøven (figur 1C, gule sirkler).
    4. Gjenta trinn 4.5.3-4.5.5 for å oppnå celletall innenfor hver plugg med en diameter på 100 μm. Del disse verdiene med volumet til hver tilsvarende plugg for å oppnå lokal celletetthet.
    5. Gjenta alle trinnene i denne delen for OCT-data som samles inn på hvert tidspunkt i legemiddelstudien. Sammenligning av celletall på hvert sted gjennom behandlingstidsforløpet bør avsløre hvor celletettheten avtar (dvs. regioner som opplever celledød) og følgelig hvor dypt stoffet trenger inn (dvs. hvilke lag ser et fall i celletetthet vs. de som opprettholder eller viser en økning i celletetthetsnivåer).

Figure 1
Figur 1: Skjematisk illustrasjon. (A) Den konsentriske lag (skall) tilnærming for å vurdere regional celletetthet i sfæriske aggregater. (B) Den regionale pluggmetoden ble utviklet for å evaluere lokal celletetthet i ikke-sfæriske aggregater, der små (100 μm diameter) sfæriske plugger (vist i gult) brukes som tetthetsindikatorer ved hver sone / tykkelse. (C) Den romlig raffinerte regionale pluggmetoden brukes til legemiddelpenetrasjonsstudier. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I en tidligere publikasjon ble det etablert en metode for ikke-destruktiv måling av global celletetthet i celleaggregater ved bruk av OCT10. Heri er denne teknikken utvidet for å vurdere den regionale celletettheten til utviklende celleaggregater. Figur 1 viser et skjema av denne forlengelsen, hvor celletetthet kan evalueres i konsentriske lag av en sfæroid eller mer lokalt ved å se i stedet på små (100 μm diameter) sfæriske plugger, betegnet med de gule sirklene i figur 1B, C. MDA-MB-231 tumorsfæroider ble vurdert innledningsvis ved å sette et senterpunkt innenfor aggregatet og telle antall objekter/celler i sekvensielle konsentriske lag av sfæroiden. Disse resultatene er presentert i figur 2. Studentens t-testing viste signifikant høyere celletetthet i sfæroidkjernen enn i overgangs- (p = 4,3e-4) og ytre lag (p = 4,0e-6). Dette resultatet indikerer komprimering i sfæroidkjernen etter 4 dager.

Figure 2
Figur 2: Forskjeller i regional tetthet beregnet ved konsentrisk lagtilnærming for sfæriske MDA-MB-231 aggregater. Figuren illustrerer en radial celletetthetsgradient med celler (n = 3) tettest pakket i den samlede kjernen, og den lokale celletettheten avtar med avstand fra kjernen. Gjennomsnittlig totalt celleantall vises med en blå linje. Skalalinjen for det innfelte bildet er 100 μm. Data vist som gjennomsnittlig ± SD (*= p < 0,05, ***= p < 0,001). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

En begrensning av denne konsentriske lagteknikken er imidlertid at den bare kan brukes på sfæriske aggregater. Dermed ble celletellingsmetoden tilpasset for å etablere en Regional Plug-metode, som prøver små soner på sekvensielle steder gjennom aggregatet, som ligner på en virtuell biopsi. Disse pluggene gir målinger av den lokale celletettheten på bestemte dyp. Denne teknikken ble validert mot konsentrisk lagtilnærming ved å utføre analyser på de samme MDA-MB-231 sfæroidene (figur 3). Resultatene viste godt samsvar mellom de regionale plugg- og konsentriske lagtilnærmingene for disse sfæriske aggregatene. Studentens t-tester viste ingen statistiske forskjeller mellom tilnærmingene for måling av ytter- og overgangslag (henholdsvis p = 0,243 og 0,484) og en liten, men signifikant forskjell ved beregning av tetthetene i aggregatkjernen (p = 0,017).

Figure 3
Figur 3: Konsentrisk sone og regionale pluggtilnærminger gir lignende resultater for kvantifisering av celletetthet i sfæriske MDA-MB-231 aggregater (n = 3). Data vist som gjennomsnitt ± SD (* = p < 0,05). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Denne teknikken ble deretter brukt til å vurdere både sfæriske og ikke-sfæriske tumoraggregater på dag 4 av modenhet (figur 4), og observerte en lignende trend mot kjernekomprimering for alle testede morfologier, uavhengig av celletype. Denne trenden var mest fremtredende i prøvene fremstilt med Matrigel (kjellermembranmatrisen), et additiv kjent for å fremme aggregering, men hvis eksogene faktorer og sammensetning er dårlig karakterisert 31,32,33. Interessant nok ser det ikke ut til at tilsetningen av matrisen påvirker volumet eller celletallet og ser dermed ut til å ha ubetydelig innflytelse på celleproliferasjon. Snarere ser matrisetilsetningen ut til å omfordele celletetthet, fremme betydelig kjernekomprimering og redusere celletettheten i de ytre lagene. Disse resultatene indikerer også at AU565-celler virker mindre følsomme for matrisemedierte aggregeringseffekter enn MDA-MB-231-celler. Disse funnene gir verdifull innsikt i de fysiske mekanismene som matrisen muliggjør celleaggregering i forskjellige brystkreftcellelinjer. Det er viktig at den regionale pluggtilnærmingen passer til alle MCTS-er som viser sfæriske eller ikke-sfæriske aggregatgeometrier.

Figure 4
Figur 4: Matrise addisjon fremmer mer aggregering og omfordeler celletetthet i kreftcellelinjer. For både MDA-MB-231 (A,B) og AU565 (C,D) cellelinjer reduserer matrisetilsetning tettheten i den ytre sonen og øker komprimeringen i midten (n = 3) uten å endre det totale celletallet nevneverdig. Gjennomsnittlig totalt antall celler vises med blå linjer. Innfelte skalastenger = 100 μm. Data vist som gjennomsnitt ± SD (*= p < 0,05, **= p < 0,01, ***= p < 0,001). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Deretter ble denne regionale pluggtilnærmingen brukt til å spore celledød i TZM-behandlede tumoraggregater ikke-destruktivt. AU565 MCTSer fremstilt med membranmatrisen ble behandlet med TZM på dag 4 av utviklingen, og dyrket gjennom dag 9, med viktige OCT-avbildningstidspunkter ved 0 timer (premedikament), 24 timer og 120 timer (5 dager). Den romlig definerte regionale pluggmetoden ble brukt på hvert tidspunkt, med plugger satt hver 100 μm gjennom hele tykkelsen på hvert aggregat, som vist ved de gule sirklene i figur 1C. Størrelsen på senterpluggen ble holdt konstant mens den ytre pluggen fikk lov til å svinge i diameter, tilsvarende endring av aggregatstørrelse. Mindre svingninger i celletetthet ble observert over tid innenfor de indre 500 μm av hvert aggregat, noe som indikerer minimal celledød (figur 5). Faktisk skjedde de fleste celledødsfall i de ytre 200 μm av hvert aggregat, spesielt i de ytterste 100 μm, som forsvant helt ved 120 timers tidspunkt for alle analyserte aggregater. Visualiseringen av celledød som indikativ legemiddelrespons hovedsakelig i de ytre lagene av MCTSer er i samsvar med legemiddelpenetrasjonsproblemer av TZM, et klinisk relevant antistoffmedikament med en molekylvekt på 145 kDa34. Faktisk er stoffet avhengig av passiv diffusjon gjennom disse tette cellulære modellene, som forventes å utfordre sin evne til å trenge dypere enn 200 μm inn i modellene.

Figure 5
Figur 5: Cellens levedyktighet som respons på stoffet, målt i hele den samlede tykkelsen. Pluggen i den indre kjernen ble holdt konstant på 100 μm diameter, mens den i den ytre sonen fikk lov til å svinge med skiftende aggregatstørrelse. (A) Regional celletetthet som respons på TZM-addisjon viste at celledød i stor grad var begrenset til ytre 200 μm, spesielt ytre 100 μm, som forsvant helt etter 120 timers behandling. Den indre tykkelsen på aggregatene på 500 μm observerte liten endring i celletall (n = 3). Gjennomsnittlig totalt antall celler vises med tilsvarende fargede linjer for hvert tidspunkt. Data er vist som gjennomsnittlig ± SD. (B) Varmekartplott som representerer endringen i gjennomsnittlig celletetthet som svar på stoffet som en funksjon av den samlede tykkelsen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Betydning
Multicellulære tumorsfæroider (MCTSer) er kraftige 3D in vitro-modeller for å studere tumorprogresjon og medikamentscreening 1,2,3. Å fremme nytten av disse relativt enkle aggregatmodellene er avhengig av karakteriseringen av deres nøkkelegenskaper, som morfologi og celletetthet, som er kjent for å påvirke både tumormodellprogresjon og terapeutisk respons. Deres nødvendige størrelse introduserer imidlertid utfordringer med å evaluere disse egenskapene, spesielt for ikke-destruktive analyser. Den presenterte metoden gir et nytt verktøy for langsgående og etikettfri kvantifisering av celletetthet og levedyktighet innenfor diskrete regioner av tette 3D-aggregatmodeller. Det samme aggregatet kan avbildes på nytt med Optical Coherence Tomography (OCT) over flere utviklingsdager. Disse volumetriske skanningene kan analyseres for å karakterisere hvordan celletetthet utvikler seg regionalt under MODNING AV MCTSer. De samme prinsippene gjelder for analyse av dopede aggregater, som kan avbildes i lengderetningen gjennom et gitt legemiddelregime for å bestemme hvor celletettheten avtar, dvs. hvor stoffet aktivt kan drepe celler. Denne tilnærmingen forbedres betydelig i forhold til tidligere metoder for å skaffe lignende celleskalainformasjon, som tradisjonelt krever fiksering, farging og / eller seksjonering, og utelukker dermed langsgående analyser. Faktisk har dette verktøyet potensial til å dramatisk redusere antall prøver som trengs for en gitt studie, da de samme prøvene kan analyseres fortløpende. Dette forventes også å introdusere merverdi på hvert tidspunkt, da utviklingen kan spores innenfor et enkelt aggregat når det reagerer på en gitt stimulus, i stedet for å stole på korrelerte data fra aldersmatchede terminalprøver. Utover denne MCTS-applikasjonen som er demonstrert her, kan denne OCT-Imaris-metoden studere andre cellulære aggregater, embryoide kropper, mer komplekse organoider eller vevsprøver opp til noen få millimeter tykke. Denne protokollen vil forbedre forståelsen av cellekomprimering under aggregatutvikling og legemiddelrespons innenfor tette aggregatmodeller.

Endringer
Den presenterte protokollen ble optimalisert for analyse av MDA-MB-231 og AU565 MCTSS-modeller. Modeller laget med andre cellelinjer er anvendelige; Det kan imidlertid være nødvendig med noe protokolloptimalisering på grunn av endringer i gjennomsnittlig cellestørrelse og samlet morfologi. En egen studie ble utført der MDA-MB-231 og AU565 celler ble belagt i 2D og oppnådd en gjennomsnittlig cellestørrelse via mikroskopi. Denne diameteren ble brukt som XY-diameteren innenfor Imaris "flekker" -funksjonen slik at gjenstander av denne omtrentlige størrelsen ble talt. Hvis du endrer denne verdien, endres antall objekter i prøven10, og det forventes mer nøyaktige resultater når denne inndataene samsvarer tett med cellestørrelsen. Dermed må en passende XY-diameter informeres av den gjennomsnittlige cellestørrelsen for den brukte celletypen.

Kritiske trinn og feilsøking
Et av de kritiske trinnene under OCT-bildebehandling er valget av skanneoppløsning. Pikselstørrelsen som er angitt av brukeren, må være tilstrekkelig liten til at flere piksler er nødvendig for å utgjøre den gjennomsnittlige størrelsen på celletypen som brukes. Dette forbedrer nøyaktigheten av "spots" -analysen i Imaris ved å forbedre ATs oppløsning av cellene og redusere muligheten for at stokastisk pikselstøy vil påvirke celletellingen negativt.

Isolering av prøven i Imaris-referanserammen har stor innvirkning på utdataverdiene for celletetthet. Når brukeren utfører dette trinnet, ledsages det av et nivå av subjektivitet og skjevhet som må brukes konsekvent på tvers av alle utvalgsanalyser. Når prøven isoleres i volumskanningen for å starte Imaris-analyse, må det tas hensyn til å spore aggregerte konturer nøyaktig og unngå inkludering av artefakter (dvs. refleksjoner fra substrater eller mediehøyde).

Riktig plassering av referanserammer under regional plugganalyse er et annet kritisk skritt. Som nevnt i innledningen er de tre kritiske sonene som skal analyseres under modellutvikling den proliferative ytre regionen, overgangsregionen bestående av senescent / hvilende celler og den hypoksiske kjernen. Plasseringen av referanserammer i midten av hvert lag forventes å gi den mest nøyaktige estimeringen av celletettheten i det området. Denne referanserammen er av enda større betydning for de detaljerte regionale plugganalysene som brukes her for legemiddelstudien, da det må etableres jevnt fordelte soner for å analysere legemiddelrespons mer nøyaktig.

Begrensninger og fremtidig forskning
Hovedbegrensningen for den foreslåtte metoden er den brukerbaserte slice-by-slice-sporingen som utføres i Imaris for å isolere aggregatet i OCT-volumskanningen. Dette er et kritisk skritt for nøyaktige resultater, noe som er noe subjektivt og derfor forventes å gi et visst nivå av inter-user variabilitet. For å løse dette søker vi for tiden å inkorporere en kantdeteksjonsalgoritme utført i Matlab (eller lignende) før vi laster opp skanningen til Imaris. Denne algoritmen bør objektivt identifisere prøvekanter i progressive B-scan-skiver, hvoretter de foreslåtte analysene kan utføres på dette forhåndsisolerte prøveområdet. Adressering av denne begrensningen vil fjerne brukerbasert variabilitet og forventes å føre til bredere anvendelighet av dette OCT-baserte verktøyet.

OCT evne til nøyaktig å avbilde levende celler i aggregater under narkotikabehandling er betinget av modusen for celledød som stoffet opererer på. Det tidligere arbeidet avslørte kvantitative unøyaktigheter i levende celletall rapportert fra OCT / Imaris som svar på Doxorubicin, et velkjent anti-kreftmedisin som dreper celler via nekrose og apoptose10. Dette antas å skyldes de resterende cellemembranene under nekrose, som forventes å vises som levende celler under strukturell avbildning. TZM er kjent for å drepe celler primært via apoptose35; derfor, når celler dør, må de bryte ned i stykker som er tilstrekkelig små til ikke å bli sporet / talt av OCT. Selv om det er behov for ytterligere valideringstesting med et apoptotisk legemiddel, viser våre tidlige piloteksperimenter den utmerkede avtalen mellom OCT / Imaris og dissosierte celletall i MCTS-er dopet med TZM (upubliserte data). Derfor forventes de levende celleresultatene som presenteres her, å være mer nøyaktige enn nekrosefremkallende legemidler. Dette skillet må tas i betraktning når man anvender denne tilnærmingen for levedyktighetstesting i dopede aggregater.

Fremtidig forskning i den ikke-destruktive evalueringen av tumoraggregater forventes å forbedre forståelsen av hvordan de utvikler og reagerer på både ytre stimuli og narkotikabehandling. Utvikling av analyseverktøy, slik som det som presenteres her, bør utvide modellnytten og forbedre resultatnøyaktigheten, særlig innenfor virkningsfulle anvendelser som legemiddelscreening og leverings-/effektvurdering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av NIH R01 BRG CA207725 (MB/DTC) og NIH R01 CA233188 (MB). Vi vil gjerne takke AMC Pharmacy for Trastuzumab gitt for disse forsøkene.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well plates Greiner Bio-One  650970 CellStar Cell-Repellent Surface, https://shop.gbo.com/en/usa/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-repellent-surface/
0.25% trypsin, 2.21 mM EDTA Corning 25-053-CI
AU565 breast cancer cells ATCC
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Corning 10-013-CV
Fetal Bovine Serum ATCC 30-2020
FIJI software open-source (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/
Hemocytometer Fisher Scientific 0267151B
Imaris image analysis software Bitplane Current version 9.8
L-glutamine Lonza 17-605E
Matrigel Corning 354263
MDA-MB-231 breast cancer cells ATCC
Microscope Zeiss Z1 AxioVision
Penicilin streptomycin Corning 30-0002CI
Plate centrifuge Eppendorf
RPMI medium 1640 Gibco 11875-085
Spectral Domain Optical Coherence Tomography ThorLabs TEL220C1
T75 cell culture flasks Greiner Bio-One  658175
Trastuzumab Remnant clinical samples of Trastuzumab were used in this study, generously gifted by the Albany Medical College Pharmacy. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutherland, R., JA, M., Inch, W. Growth of multicell spheroids in tissue culture as a model of nodular carcinomas. Journal of the National Cancer Institute. 46 (1), 113-120 (1971).
  2. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  3. Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional. Analytical Biochemistry. 437 (1), 17-19 (2013).
  4. Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model. Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).
  5. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
  6. Jiang, Y., Pjesivac-Grbovic, J., Cantrell, C., Freyer, J. P. A multiscale model for avascular tumor growth. Biophysical Journal. 89 (6), 3884-3894 (2005).
  7. Freyei, J. P., Sutherland, R. M. Regulation of growth saturation and development of necrosisin EMT6/R0 multicellular spheroids by the glucose and oxygen supply. Cancer Research. 46 (7), 3504-3512 (1986).
  8. Desoize, B., Jardillier, J. C. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance. Critical Reviews in Oncology Hematology. 36 (2-3), 193-207 (2000).
  9. Mellor, H. R., Ferguson, D. J. P., Callaghan, R. A model of quiescent tumour microregions for evaluating multicellular resistance to chemotherapeutic drugs. British Journal of Cancer. 93 (3), 302-309 (2005).
  10. Roberge, C. L., et al. Non-destructive tumor aggregate morphology and viability quantification at cellular resolution, during development and in response to drug. Acta Biomaterialia. 117, 322-334 (2020).
  11. Piccinini, F., Tesei, A., Bevilacqua, A. Single-image based methods used for non-invasive volume estimation of cancer spheroids a practical assessing approach based on entry-level equipment. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 135, 51-60 (2016).
  12. Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).
  13. Song, Y., et al. Patient-derived multicellular tumor spheroids towards optimized treatment for patients with hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 1-13 (2018).
  14. LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 7 (9), 819-830 (2012).
  15. Hakanson, M., Textor, M., Charnley, M. Engineered 3D environments to elucidate the effect of environmental parameters on drug response in cancer. Integrative Biology. 3 (1), 31-38 (2011).
  16. Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
  17. Huang, D., et al. Optical coherence tomography HHS public access. Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).
  18. Zhong, H. Q., et al. Enhancement of permeability of glycerol with ultrasound in human normal and cancer breast tissues in vitro using optical coherence tomography. Laser Physics Letters. 7 (5), 388-395 (2010).
  19. Fujimoto, J., Swanson, E. The development, commercialization, and impact of optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), (2016).
  20. Huang, Y., et al. Optical coherence tomography detects necrotic regions and volumetrically quantifies multicellular tumor spheroids. Cancer Research. 77 (21), 6011-6020 (2017).
  21. Hari, N., Patel, P., Ross, J., Hicks, K., Vanholsbeeck, F. Optical coherence tomography complements confocal microscopy for investigation of multicellular tumour spheroids. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
  22. El-Sadek, I. A., et al. Three-dimensional dynamics optical coherence tomography for tumor spheroid evaluation. Biomedical Optics Express. 12 (11), 6844 (2021).
  23. Kingsley, D. M., et al. Laser-based 3D bioprinting for spatial and size control of tumor spheroids and embryoid bodies. Acta Biomateralia. 95, 357-370 (2019).
  24. Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
  25. Roberge, C. L., Rudkouskaya, A., Barroso, M., Corr, D. T. Longitudinal, label-free assessment of cell density and viability in multicellular tumor spheroids via optical coherence tomography. Summer Biomechanics, Bioengineering, and Biotransport Conference. , (2020).
  26. Bellotti, C., Duchi, S., Bevilacqua, A., Lucarelli, E., Piccinini, F. Long term morphological characterization of mesenchymal stromal cells 3D spheroids built with a rapid method based on entry-level equipment. Cytotechnology. 68 (6), 2479-2490 (2016).
  27. Noto, A., et al. Stearoyl-CoA desaturase-1 is a key factor for lung cancer-initiating cells. Cell Death & Disease. 4 (12), 947 (2013).
  28. Riffle, S., Hegde, R. S. Modeling tumor cell adaptations to hypoxia in multicellular tumor spheroids. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 36, 102 (2017).
  29. Wilson, W. R., Hay, M. P. Targeting hypoxia in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11, 393-410 (2011).
  30. Grimes, D. R., Kelly, C., Bloch, K., Partridge, M. A method for estimating the oxygen consumption rate in multicellular tumour spheroids. Journal of the Royal Society Interface. 11 (92), 20131124 (2014).
  31. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  32. Pozzi, S., et al. Meet me halfway: Are in vitro 3D cancer models on the way to replace in vivo models for nanomedicine development. Advanced Drug Delivery Reviews. 175, 113760 (2021).
  33. Nguyen, E. H., Daly, W. T., Belair, D. G., Le, N. N., Murphy, W. L. High throughput screening format identifies synthetic mimics of matrigel for tubulogenesis screening. , Available from: https://abstracts.biomaterials.org/data/papers/2015/abstracts/547.pdf (2015).
  34. Duchnowska, R., Szczylik, C. Central nervous system metastases in breast cancer patients administered trastuzumab. Cancer Treatment Reviews. 31 (4), 312-318 (2005).
  35. Zazo, S., et al. Generation, characterization, and maintenance of trastuzumab-resistant HER2+ breast cancer cell lines. American Journal of Cancer Research. 6 (11), 2661-2678 (2016).

Tags

Kreftforskning utgave 184
Ikke-destruktiv evaluering av regional celletetthet innen tumoraggregater etter medikamentell behandling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Roberge, C. L., Wang, L., Barroso,… More

Roberge, C. L., Wang, L., Barroso, M., Corr, D. T. Non-Destructive Evaluation of Regional Cell Density Within Tumor Aggregates Following Drug Treatment. J. Vis. Exp. (184), e64030, doi:10.3791/64030 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter