Summary
本方案描述了 通过 立体定位框架两点注射溶血磷脂酰胆碱以在小鼠中产生稳定且可重复的脱髓鞘模型。
Abstract
受体介导的溶血磷脂信号传导有助于各种神经系统疾病的病理生理学，尤其是多发性硬化症（MS）。溶血磷脂酰胆碱（LPC）是一种与炎症相关的内源性溶血磷脂，可诱发快速损伤，对髓鞘脂质有毒性，导致局灶性脱髓鞘。本文给出了立体定向两点LPC注射的详细方案，可直接导致严重脱髓鞘，并通过外科手术在小鼠中快速稳定地复制实验性脱髓鞘损伤。因此，该模型与脱髓鞘疾病，特别是MS高度相关，并且可以促进相关的临床相关研究的进展。此外，使用免疫荧光和Luxol快速蓝色染色方法来描述注射LPC的小鼠胼胝体中脱髓鞘的时间过程。此外，该行为方法用于评估建模后小鼠的认知功能。总体而言， 通过 立体定位框架两点注射溶血磷脂酰胆碱是一种稳定且可重复的方法，可在小鼠中生成脱髓鞘模型以进行进一步研究。
Introduction
受体介导的溶血磷脂信号传导涉及几乎所有器官系统的不同生理过程1.在中枢神经系统（CNS）中，这种信号传导在自身免疫性神经系统疾病（如多发性硬化症（MS））的发病机制中起着关键作用。多发性硬化症是一种慢性免疫介导的疾病，其特征是病理性脱髓鞘和炎症反应，导致神经系统功能障碍和认知障碍2，3。在疾病早期持续复发和缓解后，大多数患者最终进展到继发性进展阶段，这可能对大脑造成不可逆转的损害并导致残疾4。据信，继发性进展病程的病理标志是由炎症性病变引起的脱髓鞘斑块5。现有的MS治疗方法可以显着降低复发的风险。然而，对于进行性MS6引起的长期脱髓鞘损伤，仍然没有有效的治疗方法。因此，需要一个稳定建立且易于重现的模型来研究专注于白质变性的临床前治疗。
脱髓鞘和髓鞘再生是发展为多发性硬化症的两个主要病理过程。脱髓鞘是由促炎表型7的小胶质细胞诱导的轴突周围髓鞘的丧失，它导致神经冲动的缓慢传导并导致神经元和神经系统疾病的丧失。髓鞘再生是由少突胶质细胞介导的内源性修复反应，其中疾病可能导致神经变性和认知障碍8。炎症反应对整个过程至关重要，影响髓鞘损伤和修复的程度。
因此，持续的炎症性脱髓鞘的稳定动物模型对于进一步探索MS的治疗策略具有重要意义，由于MS的复杂性，已经建立了各种类型的动物模型来模拟 体内脱髓鞘病变，包括实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE），毒性脱髓鞘模型，铜绿素（CPZ）和溶酶磷脂酰胆碱（LPC）9.LPC是一种与炎症相关的内源性溶血磷脂，可诱发快速损伤，对髓鞘脂质有毒性，导致局灶性脱髓鞘。根据以前的报告和研究10，11，提供了具有一些修改的两点注射的详细方案。通常，经典的单点LPC注射模型仅在注射部位产生局部脱髓鞘，并且通常伴有自发性髓鞘再生12，13。然而，两点注射LPC模型可以证明LPC可以直接诱导小鼠胼胝体脱髓鞘，并导致更持久的脱髓鞘，髓鞘再生很少。
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Protocol
所有动物程序均经中国华中科技大学同济医学院动物护理委员会批准。本研究使用成年C57BL / 6雄性和雌性小鼠（野生型，WT;20-25g;8-10周龄）。小鼠是从商业来源获得的（见 材料表）。将小鼠饲养在特定的无病原体（SPF）动物设施中 ，随意提供水和食物。在22 °C温度和55%~60%相对湿度的标准条件下，将它们保持在12 h交替的明暗循环中。
1. 液相色谱溶液制备
- 将25mg LPC粉末（见 材料表）与250μL氯仿和甲醇混合溶液（1：1）溶解，制成10%LPC溶液并将其转移到500μL离心管中。
注意：如果LPC未完全溶解，请将离心管置于超声波清洗机中，并在40 kHz下超声处理〜1小时以获得均匀的溶液。 - 将溶液分成3μL /管并储存在-80°C。
注意：该溶液可以储存约2年。 - 手术前，用27μL0.9%NaCl溶液稀释溶液（步骤1.2），并将溶液保持在37°C的恒温水浴中。
注意：在开始注射之前准备溶液。
2. 手术准备
- 使用32 G，2英寸针头连接到5μL注射器（参见 材料表）。确保微升注射器畅通无阻。取出5μL LPC溶液用于制备注射液。
- 在连接到异氟醚汽化器的感应室中麻醉小鼠，其中3%异氟醚与100%氧以约0.3 L / min的速率混合。
- 在呼吸顺畅时，通过缺乏脚趾捏反射来确认麻醉的深度。
- 使用电动剃须刀剃须耳朵之间的鼠标头部。在手术过程中涂抹润滑眼药水以防止角膜干燥。
- 然后，将鼠标置于立体定位框架（参见 材料表），背侧朝上，并用鼻锥和齿夹固定头部。通过鼻子用1.2%-1.6%的异氟醚维持麻醉。
注意：异氟醚浓度可以根据小鼠的呼吸状态进行调整。
3. 外科手术
注意：在所有过程中，动物都被放在加热垫上。
- 将鼠标固定在带有双侧耳条的立体定位装置上。确保耳杆水平，头部水平稳定。
- 用碘伏擦拭几次，然后以圆周运动的方式擦拭酒精，对头部皮肤进行消毒。然后用手术刀沿着头皮中线切开一个约1.5厘米的小切口，露出头骨。
- 用蘸有1%过氧化氢的棉签擦拭头骨，直到囟、锉和后囟门暴露出来。将注射器放在立体定位装置上。
注意：请小心使用过氧化氢，避免接触周围组织。 - 确保动物头部的水平位置（前后、左右）。
- 调整立体定位框架的Z轴旋钮，使针尖和颅骨只需接触而不弯曲，然后测量Z轴坐标。检查囟门和后囟门的Z坐标。
- 调整耳条，使囟门和后囟门的Z坐标之差不超过0.02毫米。然后，按照相同的方法测量中线左侧和右侧相应位置的 Z 坐标。调整耳条以确保左右两侧处于同一水平。
- 找到胼胝体。将 XYZ 原点设置为“短整型”。
注意：第一个注射部位位于前圃外侧1.0 mm，深2.4 mm，前部1.1 mm。第二个注射部位为前坩外侧1.0 mm，深2.1 mm，前部0.6 mm。例如，角坨的坐标为 （0，0，0）。测量标记为 （-1， 1.1， X） 和 （-1， 0.6， Y） 的相应位置的 Z 坐标。可以确定胼胝体的第一个注射位点坐标是（-1， 1.1， −[X + 2.4]），第二个注射位点是（-1， 0.6， −[Y + 2.1]）。 - 一旦确定了注射部位，在颅骨上用无菌标记标记并记录坐标。
- 用颅骨钻轻轻钻出标记的部位（参见 材料表）。注意避免任何出血。
- 慢慢地将针头移动到给定的坐标并开始注射。为了诱导胼胝脱髓鞘，在每个注射部位（步骤3.5）以0.4μL / min的速率注入2μL LPC溶液（步骤1.）。
- 注射后，将针头在每个部位再保持10分钟。
注意：确保两次注射的间隔不超过20分钟。 - 用4-0缝合线缝合皮肤，等待动物在10分钟内醒来。术后按照机构动物护理规定给予镇痛药。
注意：建议安乐死的时间可以根据实验的目的来确定。
4. 用于局灶性脱髓鞘的样品提取
注意：有关此步骤的详细信息，请参阅以前发布的报告14。
- 将中性红色染料（见 材料表）溶解在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的1%溶液中。
- 在牺牲小鼠之前几个小时（有关详细信息，请参阅先前的参考文献10），通过腹膜内注射为每只小鼠在PBS中注射500μL1%中性红色染料。
- 用30 mL 0.1%PBS在4°C下预冷进行心脏灌注12 。
- 用脑模将大脑切成1毫米（见 材料表）。
- 在显微镜下观察染有中性红色的病变并解离病变。
注意：尽可能多地去除周围的正常组织，以提高后续分析的准确性。病变组织可通过 RT-PCR、电子显微镜检查和免疫印迹分析进行检查。
5. 组织学染色和免疫荧光
- 对于组织学染色和免疫荧光12，在心脏灌注（步骤4.3.）后，取出大脑10，固定在4%PFA中过夜（在4°C），并在30%蔗糖中完全脱水。
- 在恒定温度（-20°C）下使用冷冻切片机10切成20 毫米的冠状脑切片。
- 将切片用于卢克索快速蓝 （LFB） 染色、免疫荧光和蛋白质印迹10。
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Representative Results
LPC的两点注射导致更持久的脱髓鞘
LPC主要导致快速损伤，对髓鞘有毒性，轴突完整性15断裂。注射当天被视为第0天。将小鼠保存10-28天（10 dpi和28 dpi）。使用卢克索快速蓝（LFB）染色10来评估这些时间点小鼠脱髓鞘的区域。在两点注射模型中，与假组相比，10 dpi上存在显着的脱髓鞘，表明局部注射LPC可以成功地脱髓胼胝体。在28 dpi处仍然存在相对较高的脱髓鞘，表明由于两点LPC注射导致持久和稳定的脱髓鞘（图1D-E）。
为了进一步评估髓鞘的缺失，选择10天作为脱髓鞘相对明显的关键时间点。通过免疫荧光染色降解的髓鞘碱性蛋白（dMBP），在LPC注射组中观察到10 dpi的dMBP显着增加（图1F），这代表了胼胝体中的髓鞘损失。此外，将获得的病变组织的蛋白质（步骤4）用于通过蛋白质印迹分析MBP的表达。根据协议建模后，MBP显示出显着的损失（图1G）。这些结果与LFB和免疫荧光染色一致。
用电子显微镜观察LPC注射后10天胼胝体中的髓鞘形态（根据步骤4提取病变组织）。明显的脱髓鞘验证了建模的成功（图2）。
两点LPC注射影响髓鞘再生
少突胶质细胞（OLGs）的分化和成熟在MS中修复髓鞘中起着至关重要的作用，髓鞘再生主要通过将少突胶质细胞前体细胞（OPCs）分化为髓鞘化少突胶质细胞而发生。因此，一旦OPCs分化为OLG被阻止，髓鞘修复过程将受到影响。Gst-π是OPC分化成熟16的标志。LPC注射10天后，通过免疫荧光可以看出，与假组相比，Gst-π降低（图3A）。同时，少突胶质细胞的增殖能力可以通过Ki67（少突胶质细胞增殖）和Olig2（总少突胶质细胞谱系细胞）的比例17，18来反映。较高的Ki67 / Olig2 +共定位比表示10dpi后少突胶质细胞的增殖更多（图3B）。这些图像表明，病变区域试图通过LPC注射后OPC的成熟和增殖进行修复。
两点LPC注射损害小鼠的空间记忆
为了分析LPC注射在小鼠中的空间记忆能力，使用了莫里斯水迷宫（WMM）19 ，发现假小鼠和LPC注射小鼠的游泳速度没有差异。然而，当在Morris水迷宫中移除平台时，找到隐藏平台的延迟减少了（空间学习受损），并且在目标象限中花费的时间增加了（记忆保留受损）（图4）。结果表明，在两点LPC注射模型中，脱髓鞘小鼠的空间记忆明显受损。不同实验中使用的动物数量列于 表1中。 每只小鼠从第2天或第20天开始接受训练。
图1：LPC诱导的脱髓鞘的两点 注射（A）注射部位的表示（1.0毫米外侧，2.4毫米深和前1.1毫米）。（B）注射部位的表示（横向1.0毫米，深2.1毫米，前方0.6毫米）。（C） 检测时间点示意图。（D） 通过 LFB染色检测白质病变。注射后10天（dpi）和28 dpi的LFB染色，显示胼胝体的持续脱髓鞘（比例尺= 200μm）。（E）量化不同时间点的脱髓鞘面积。数据表示为均值±SD，单因子方差分析，然后是邦费罗尼的多重比较检验。****p < 0.0001，n = 每组 6 个。（F）胼胝体中dMBP免疫染色的代表性图像（比例尺= 100μm）。与几乎没有dMBP的假象相比，LPC注射后可以看到明显的dMBP。（G）MBP表达的蛋白质印迹分析。注射LPC后MBP显示出显着的损失。β肌动蛋白用作测量基线表达的负荷对照。 请点击此处查看此图的大图。
图2：电子显微镜图像证实了假胼胝体中髓鞘化的超微结构与LPC注射小鼠中的脱髓鞘超微结构（比例尺= 1μm）相比。
图3：两点注射影响了OPC的成熟和增殖 （A）假小鼠和LPC注射小鼠胼胝体中GST-π的代表性图像（比例尺= 20μm）。红色表示商品及服务税π。（B）Olig2和Ki67共定位的代表性图像（比例尺= 20μm）。红色表示 Ki67，绿色表示 Olig2。使用具有488 nm和594 nm激光线的共聚焦显微镜系统捕获图像。 请点击此处查看此图的大图。
图4：LPC注射引起的空间记忆障碍。（A）在平台存在（学习阶段）中每组中小鼠游泳路径的代表性图像。（B）去除平台后每组中小鼠游泳路径的代表性图像（记忆阶段）。所用动物的数量列于 表1中。 请点击此处查看此图的大图。
| 群 | 假 | 乐峰集团 |
| 低频染色 | 6 | 12 （10 dpi， 6; 28 dpi， 6） |
| 电子显微镜 | 4 | 4 |
| 如果 | 6 | 6 |
| 蛋白质印迹 | 4 | 4 |
| 莫里斯水迷宫 | 12 | 12 |
表1：用于不同测试的动物数量。
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Discussion
MS是中枢神经系统的慢性脱髓鞘疾病，是年轻人神经系统功能障碍的最常见原因之一20.临床上，大约60%-80%的MS患者在发展为继发性进行性MS21，22之前经历复发和缓解的周期，并且最终导致累积的运动障碍和认知缺陷23。目前，没有一个单一的实验模型涵盖了该疾病24的各种临床、病理或免疫学特征。为了模拟MS在不同阶段的病理过程和发病机制，有三种常见的脱髓鞘动物模型及其优点和局限性，包括EAE模型，喂养动物CPZ和LPC诱导的脱髓鞘模型。
在小鼠中，EAE由注射髓鞘抗原后的免疫反应诱导，导致小胶质细胞活化和血管周围T和B淋巴细胞的浸润，伴随的髓鞘损伤通常与疾病的复发20，25有关。它更好地模拟了MS复发 - 缓解期的特征。但是，它也有几个限制。例如，EAE主要是一种影响脊髓白质的疾病，而MS主要引起大脑皮层的脱髓鞘，病变的位置和时间是随机的，因此很难准确获得病变19。
CPZ和LPC是诱导毒性脱髓鞘模型的最常用物质。它们都能够在给药后引起中枢神经系统脱髓鞘。在CPZ模型中，向年轻小鼠喂食铜螯合剂铜芫酮导致少突胶质细胞死亡和随后的可逆脱髓鞘。铜绿素戒断后，在4天内触发自发性髓鞘再生过程26，27。CPZ主要导致广泛的脱髓鞘，而LPC注射倾向于局灶性脱髓鞘。由于毒素和炎症反应，经典的单点注射LPC会触发快速且高度可重复的脱髓鞘形式28。
然而，上述模型都不能正确模拟以持续性脱髓鞘为特征的进行性MS的病理过程。因此，本方案提出了一种将LPC直接两点注射到胼胝体中以诱导长期脱髓鞘的模型。协议中的关键步骤包括水平调整动物的头部和定位注射坐标。在步骤3.5.中，必须确保首先调整囟门和后囟门水平，然后调整左右水平。同时需要注意的是，在调整左右水平后，在后续操作之前必须重新定位零点。此步骤至关重要，因为它与定位的精度直接相关。在步骤3.6.中，在确定Z轴的坐标时，必须确保针的末端和颅骨保持精确接触，并且研究人员可以观察针是否弯曲。在步骤3.10.中，针头保持在原位10分钟以防止药物从针头通道流出。
本协议有一些局限性。像其他毒性诱导的脱髓鞘模型一样，它缺乏免疫过程的建模。其次，虽然两点注射模式可以维持脱髓鞘相对较长的时间，但随着疾病进展到后期，它仍然不可避免地伴随着轻微程度的髓鞘再生。它可能不是比粒蛋白少突胶质细胞糖蛋白（MOG）诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎29，30更适合模拟继发性进行性多发性硬化症的模型。经典的单点 LPC 注射模型仅产生局部炎性脱髓鞘，伴有自发性髓鞘再生。先前的研究表明，LPC注射后T细胞、B细胞和巨噬细胞的浸润是髓鞘修复15的关键因素。然而，与经典注射模型相比，两点注射LPC模型诱导胼胝体快速局灶性脱髓鞘，并保持脱髓鞘程度较长，几乎没有髓鞘再生。
由于MS的复杂性，不同的疾病阶段需要不同的模型来更好地描述。 通过 立体定位框架对LPC进行两点注入是一种稳定，高效且可重复的实验小鼠模型。这种模式可导致长期脱髓鞘，并伴有随着时间的推移较少的髓鞘修复。这意味着两点注射模型不仅可以用于研究脱髓鞘疾病，还可以用于研究髓鞘修复干预措施。此外，该模型可以通过免疫荧光和组织学方法轻松快速地评估干预后的脱髓鞘，MS的认知功能障碍可以通过行为测试中脱髓鞘小鼠的空间记忆受损来反映。总之，这种稳定的脱髓鞘模型可以促进MS继发性进展和复发缓解MS的病理学和临床前研究。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本研究由国家自然科学基金（基金资助：82071380、81873743）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk | Sigma-Aldrich | L4129-25MG | |
| 32 gauge Needle | HAMILTON | 7762-05 | |
| 10 μl syringe | HAMILTON | 80014 | |
| high speed skull drill | strong,korea | strong204 | |
| drill | Hager & Meisinger, Germany | REF 500 104 001 001 005 | |
| Matrx Animal Aneathesia Ventilator | MIDMARK | VMR | |
| Portable Stereotaxic Instrument for Mouse | Reward | 68507 | |
| Micro syringe | Reward | KDS LEGATO 130 | |
| Isoflurane | VETEASY | ||
| Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | |
| Phosphate buffer | BOSTER | PYG0021 | |
| LuxoL fast bLue | Servicebio | G1030-100ML | |
| Suture | FUSUNPHARMA | 20152021225 | |
| Brain mold | Reward | 68707 | |
| Electron microscope fixative | Servicebio | G1102-100ML | |
| Neutral red (C.I. 50040), for microscopy Certistain | Sigma-Aldrich | 1.01376 | |
| Anti-Myelin Basic Protein Antibody | Millipore | #AB5864 | |
| Anti-GST-P pAb | MBL | #311 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15) | Thermo Fisher Scientific | 14-5698-95 | |
| Beta Actin Monoclonal Antibody | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| Myelin Basic Protein Polyclonal Antibody | Proteintech | 10458-1-AP | |
| OLIG2 Polyclonal Antibody | Proteintech | 13999-1-AP | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34206ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | YEASEN | 34412ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34212ES60 | |
| HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | abclonal | AS014 | |
| HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | abclonal | AS003 | |
| Adult C57BL/6 male and female mice | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd |
References
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