Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Zwei-Punkt-Injektion von Lysophosphatidylcholin über einen stereotaktischen Rahmen, um ein stabiles und reproduzierbares Demyelinmodell in Mäusen zu erzeugen.
Abstract
Die rezeptorvermittelte Lysophospholipid-Signalgebung trägt zur Pathophysiologie verschiedener neurologischer Erkrankungen, insbesondere der Multiplen Sklerose (MS), bei. Lysophosphatidylcholin (LPC) ist ein endogenes Lysophospholipid, das mit Entzündungen assoziiert ist, und es könnte eine schnelle Schädigung mit Toxizität für Myelinlipide induzieren, was zu einer fokalen Demyelinisierung führt. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die stereotaktische Zwei-Punkt-LPC-Injektion vorgestellt, die eine schwere Demyelinisierung direkt verursachen und die experimentelle Demyelinisierungsverletzung bei Mäusen durch chirurgische Eingriffe schnell und stabil replizieren könnte. Somit ist dieses Modell für Demyelinisierungserkrankungen, insbesondere MS, von hoher Relevanz und kann dazu beitragen, die damit verbundene klinisch relevante Forschung voranzutreiben. Auch Immunfluoreszenz- und Luxol-Schnellblaufärbungsmethoden wurden verwendet, um den zeitlichen Verlauf der Demyelinisierung im Corpus callosum von Mäusen, denen LPC injiziert wurde, darzustellen. Darüber hinaus wurde die Verhaltensmethode verwendet, um die kognitive Funktion von Mäusen nach der Modellierung zu bewerten. Insgesamt ist die Zwei-Punkt-Injektion von Lysophosphatidylcholin über einen stereotaktischen Rahmen eine stabile und reproduzierbare Methode, um ein Demyelinisierungsmodell in Mäusen für weitere Studien zu generieren.
Introduction
Die rezeptorvermittelte Lysophospholipid-Signalgebung umfasst verschiedene physiologische Prozesse fast aller Organsysteme1. Im zentralen Nervensystem (ZNS) spielt diese Signalübertragung eine entscheidende Rolle bei den Erregern autoimmuner neurologischer Erkrankungen wie der Multiplen Sklerose (MS). Multiple Sklerose ist eine chronische immunvermittelte Erkrankung, die durch pathologische Demyelinisierung und Entzündungsreaktion gekennzeichnet ist und neurologische Dysfunktion und kognitive Beeinträchtigung verursacht 2,3. Nach kontinuierlichem Rezidiv und Remittieren während der frühen Erkrankung gelangen die meisten Patienten schließlich in das sekundär-progressive Stadium, das irreversible Schäden am Gehirn und eine daraus resultierende Behinderung verursachen kann4. Es wird angenommen, dass das pathologische Kennzeichen des sekundär-progressiven Verlaufs demyelinisierende Plaques sind, die durch entzündliche Läsionen verursacht werden5. Bestehende Behandlungen für MS können das Risiko eines Rückfalls signifikant reduzieren. Es gibt jedoch immer noch keine wirksame Therapie für langfristige demyelinisierende Schäden, die durch progressive MS6 verursacht werden. Daher ist ein stabil etabliertes und leicht reproduzierbares Modell erforderlich, um präklinische Therapeutika zu untersuchen, die sich auf die Degeneration der weißen Substanz konzentrieren.
Demyelinisierung und Remyelinisierung sind zwei wichtige pathologische Prozesse bei der Entwicklung von Multipler Sklerose. Demyelinisierung ist der Verlust von Myelinscheide um Axone, die durch Mikroglia mit proinflammatorischen Phänotypen7 induziert werden, und es führt zu einer langsamen Leitung von Nervenimpulsen und führt zum Verlust von Neuronen und neurologischen Störungen. Remyelinisierung ist eine endogene Reparaturreaktion, die durch Oligodendrozyten vermittelt wird, wo Störungen zu Neurodegeneration und kognitiven Beeinträchtigungen führen können8. Die Entzündungsreaktion ist entscheidend für den gesamten Prozess und beeinflusst sowohl den Grad der Myelinschädigung als auch die Reparatur.
Daher ist ein stabiles Tiermodell der persistierenden entzündlichen Demyelinisierung für die weitere Erforschung therapeutischer Strategien für MS von Bedeutung. Aufgrund der Komplexität von MS wurden verschiedene Arten von Tiermodellen etabliert, um demyelinisierende Läsionen in vivo nachzuahmen, einschließlich experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis (EAE), toxisch-demyelinisierender Modelle, Cuprizon (CPZ) und Lysophosphatidylcholin (LPC)9 . LPC ist ein endogenes Lysophospholipid, das mit Entzündungen assoziiert ist, und es könnte schnelle Schäden mit Toxizität für Myelinlipide induzieren, was zu einer fokalen Demyelinisierung führt. Basierend auf früheren Berichten und Forschungsergebnissen10,11 wird ein detailliertes Protokoll der Zweipunktinjektion mit einigen Modifikationen bereitgestellt. Im Allgemeinen erzeugt das klassische Einpunkt-LPC-Injektionsmodell nur eine lokale Demyelinisierung an der Injektionsstelle und wird oft von einer spontanen Remyelinisierungbegleitet 12,13. Das Zwei-Punkt-Injektions-LPC-Modell kann jedoch zeigen, dass der LPC eine Demyelinisierung im Mouse Corpus callosum direkt induzieren und eine dauerhaftere Demyelinisierung mit geringer Myelinregeneration verursachen kann.
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Protocol
Alle Tierverfahren wurden vom Institute of Animal Care Committee des Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, China, genehmigt. Für die vorliegende Studie wurden erwachsene männliche und weibliche C57BL/6-Mäuse (Wildtyp, WT; 20-25 g; 8-10 Wochen alt) verwendet. Die Mäuse wurden aus kommerziellen Quellen gewonnen (siehe Materialtabelle). Die Mäuse wurden in einer speziellen pathogenfreien (SPF) Tieranlage untergebracht, in der Wasser und Nahrung ad libitum geliefert wurden. Sie wurden in einer abwechselnden 12-stündigen Periode von Hell-Dunkel-Zyklus unter den Standardbedingungen von 22 ° C Temperatur und relativer Luftfeuchtigkeit von 55% -60% gehalten.
1. LPC-Lösungsvorbereitung
- 25 mg LPC-Pulver (siehe Materialtabelle) werden mit 250 μL Chloroform- und Methanolmischlösung (1:1) gelöst, um eine 10%ige LPC-Lösung herzustellen, und sie in ein 500-μL-Zentrifugenröhrchen überführen.
HINWEIS: Wenn der LPC nicht vollständig gelöst ist, legen Sie das Zentrifugenröhrchen in einen Ultraschallreiniger und Ultraschall bei 40 kHz für ~ 1 h, um eine gleichmäßige Lösung zu erhalten. - Teilen Sie die Lösung in 3 μL/Röhrchen und lagern Sie sie bei −80 °C.
HINWEIS: Die Lösung kann für ~ 2 Jahre gelagert werden. - Vor der Operation wird die Lösung (Schritt 1.2.) mit 27 μL 0,9%iger NaCl-Lösung verdünnt und in einem Wasserbad mit konstanter Temperatur bei 37 °C aufbewahrt.
HINWEIS: Bereiten Sie die Lösung kurz vor Beginn der Injektion vor.
2. Chirurgische Vorbereitung
- Verwenden Sie eine 32 G, 2 in Nadel, um eine 5 μL Spritze anzuschließen (siehe Tabelle der Materialien). Stellen Sie sicher, dass die Mikroliterspritze ungehindert ist. Zur Vorbereitung der Injektion werden 5 μL LPC-Lösung entnommen.
- Betäuben Sie die Maus in einer Induktionskammer, die mit einem Isofluran-Verdampfer verbunden ist, mit 3% Isofluran, gemischt mit 100% Sauerstoff mit einer Rate von etwa 0,3 l / min.
- Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch das Fehlen eines Zehenkneifreflexes, während die Atmung glatt ist.
- Rasieren Sie den Kopf der Maus mit einem elektrischen Rasierer zwischen den Ohren. Tragen Sie schmierende Augentropfen auf, um Hornhauttrockenheit während des Eingriffs zu verhindern.
- Positionieren Sie dann die Maus in einem stereotaktischen Rahmen (siehe Materialtabelle) mit der dorsalen Seite nach oben und sichern Sie den Kopf mit Nasenkonus und Zahnklemme. Halten Sie die Anästhesie mit 1,2% -1,6% Isofluran durch die Nase aufrecht.
HINWEIS: Die Isoflurankonzentration kann entsprechend dem Atmungsstatus der Mäuse eingestellt werden.
3. Chirurgischer Eingriff
HINWEIS: Die Tiere werden während aller Eingriffe auf ein Heizkissen gelegt.
- Befestigen Sie die Maus mit bilateralen Ohrstangen am stereotaktischen Gerät. Stellen Sie sicher, dass die Ohrstangen eben und der Kopf horizontal und stabil ist.
- Desinfizieren Sie die Haut auf dem Kopf, indem Sie mehrmals mit Jodophor abwischen, gefolgt von Alkohol in kreisförmiger Bewegung. Verwenden Sie dann ein Skalpell, um einen kleinen Schnitt von etwa 1,5 cm entlang der Mittellinie der Kopfhaut zu schneiden, um den Schädel freizulegen.
- Wischen Sie den Schädel mit einem Wattestäbchen ab, das in 1% Wasserstoffperoxid getaucht ist, bis die Bregma, Lambda und die hintere Fontanelle freigelegt sind. Legen Sie die Spritze auf das stereotaktische Gerät.
HINWEIS: Verwenden Sie Wasserstoffperoxid mit Vorsicht und vermeiden Sie es, das umgebende Gewebe zu berühren. - Stellen Sie sicher, dass der Kopf des Tieres horizontal positioniert wird (sowohl vorne als auch hinten und links und rechts).
- Stellen Sie den Z-Achsenknopf des stereotaktischen Rahmens so ein, dass sich die Nadelspitze und der Schädel einfach berühren, ohne sich zu biegen, und messen Sie dann die Z-Achsenkoordinate. Überprüfen Sie die Z-Koordinaten von bregma und posterior fontanelle.
- Stellen Sie die Ohrstange so ein, dass die Differenz zwischen den Z-Koordinaten von bregma und hinterer Fontanelle nicht mehr als 0,02 mm beträgt. Befolgen Sie dann die gleiche Methode, um die Z-Koordinaten der entsprechenden Positionen auf der linken und rechten Seite der Mittellinie zu messen. Passen Sie die Ohrstange an, um sicherzustellen, dass sich die linke und rechte Seite auf der gleichen Höhe befinden.
- Suchen Sie das Corpus callosum. Setzen Sie den XYZ-Ursprung auf bregma.
HINWEIS: Die erste Injektionsstelle ist 1,0 mm lateral zum Bregma entfernt, 2,4 mm tief und 1,1 mm vorne. Die zweite Injektionsstelle ist 1,0 mm seitlich zum Bregma entfernt, 2,1 mm tief und 0,6 mm vorne. Zum Beispiel ist die Koordinate des Bregmas (0,0,0). Messen Sie die Z-Koordinate der entsprechenden Position, die als (-1, 1,1, X) und (-1, 0,6, Y) gekennzeichnet ist. Es kann bestimmt werden, dass die erste Injektionsstellenkoordinate des Corpus callosum (-1, 1,1, −[X + 2,4]) und die zweite Injektionsstelle (-1, 0,6, −[Y + 2,1]) ist. - Sobald die Injektionsstelle bestimmt ist, machen Sie eine Markierung mit einem sterilen Marker auf dem Schädel und notieren Sie die Koordinaten.
- Bohren Sie die markierte Stelle vorsichtig mit einem Schädelbohrer (siehe Materialtabelle). Achten Sie darauf, Blutungen zu vermeiden.
- Bewegen Sie die Nadel langsam zu den angegebenen Koordinaten und starten Sie die Injektion. Um eine Demyelinisierung des Corpus callosum zu induzieren, werden an jeder Injektionsstelle (Schritt 3.5.) 2 μL LPC-Lösung (Schritt 1.) mit einer Rate von 0,4 μL/min injiziert.
- Nach der Injektion die Nadel an jeder Stelle für weitere 10 Minuten aufbewahren.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Intervall von zwei Injektionen nicht mehr als 20 Minuten beträgt. - Nähen Sie die Haut mit einer 4-0-Naht und warten Sie, bis das Tier innerhalb von 10 Minuten aufwacht. Verabreichen Sie Analgetika postoperativ in Übereinstimmung mit den institutionellen Tierpflegevorschriften.
HINWEIS: Die empfohlene Zeit für die Euthanasie kann entsprechend dem Zweck des Experiments bestimmt werden.
4. Probenextraktion zur fokalen Demyelinisierung
HINWEIS: Einzelheiten zu diesem Schritt finden Sie im zuvor veröffentlichten Bericht14.
- Neutraler roter Farbstoff (siehe Materialtabelle) in einer 1%igen Lösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auflösen.
- Stunden vor dem Opfern der Mäuse (Einzelheiten siehe vorherige Referenz10) injizieren Sie 500 μL 1% neutralen roten Farbstoff in PBS durch intraperitoneale Injektion für jede Maus.
- Führen Sie eine Herzperfusion12 mit 30 ml 0,1% PBS vorgekühlt bei 4 °C durch.
- Schneiden Sie das Gehirn mit einer Gehirnform in 1 mm (siehe Tabelle der Materialien).
- Visualisieren Sie die mit neutralem Rot gefärbte Läsion unter dem Mikroskop und dissoziieren Sie die Läsion.
HINWEIS: Entfernen Sie so viel umgebendes normales Gewebe wie möglich, um die Genauigkeit der nachfolgenden Analyse zu verbessern. Das Läsionsgewebe kann mit RT-PCR, Elektronenmikroskopie und Western-Blot-Analysen untersucht werden.
5. Histologische Färbung und Immunfluoreszenz
- Für histologische Färbung und Immunfluoreszenz 12 entfernen Sie nach der Herzperfusion (Schritt 4.3.) das Gehirn10, fixieren Sie 4% PFA über Nacht (bei 4 ° C) und dehydrieren Sie vollständig in30% Saccharose.
- Mit einemgefrorenen Slicer 10 bei konstanter Temperatur (−20 °C) in 20 mm koronale Hirnschnitte schneiden.
- Verwenden Sie die Scheiben für Luxol Fast Blue (LFB) Färbung, Immunfluoreszenz und Western Blot10.
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Representative Results
Die Zwei-Punkt-Injektion des LPC führte zu einer dauerhafteren Demyelinisierung
LPC führt hauptsächlich zu schnellen Schäden mit Toxizität für Myelin und Spaltung der Axonintegrität15. Der Tag der Injektion wurde als Tag 0 angesehen. Die Mäuse wurden über einen Zeitraum von 10-28 Tagen (10 dpi und 28 dpi) gehalten. Luxol Fast Blue (LFB) Färbung10 wurde verwendet, um den Bereich der Demyelinisierung bei Mäusen zu diesen Zeitpunkten zu bewerten. Im Zwei-Punkt-Injektionsmodell gab es eine signifikante Demyelinisierung der 10 dpi im Vergleich zur Scheingruppe, was zeigt, dass die lokalisierte Injektion von LPC das Corpus callosum erfolgreich demyelinieren kann. Bei 28 dpi besteht nach wie vor ein relativ hoher Grad an Demyelinisierung, was auf eine anhaltende und stabile Demyelinisierung aufgrund der Zwei-Punkt-LPC-Injektion hinweist (Abbildung 1D-E).
Um den Verlust der Myelinscheide weiter zu bewerten, wurden 10 Tage als Schlüsselzeitpunkt ausgewählt, an dem die Demyelinisierung relativ offensichtlich ist. Durch Immunfluoreszenzfärbung des abgebauten Myelin-Basisproteins (dMBP) wurde in der LPC-injizierten Gruppe ein bemerkenswerter Anstieg von dMBP bei 10 dpi beobachtet (Abbildung 1F), was den Myelinverlust im Corpus callosum darstellt. Auch das Protein des erhaltenen Läsionsgewebes (Schritt 4.) wurde verwendet, um die Expression von MBP durch Western Blot zu analysieren. Nach der Modellierung nach dem Protokoll zeigte MBP einen signifikanten Verlust (Abbildung 1G). Diese Ergebnisse stimmten mit der LFB und der Immunfluoreszenzfärbung überein.
Die Myelinmorphologie im Corpus callosum 10 Tage nach der LPC-Injektion wurde mit dem Elektronenmikroskop beobachtet (das Läsionsgewebe wurde gemäß Schritt 4 extrahiert). Die offensichtliche Demyelinisierung bestätigt den Erfolg der Modellierung (Abbildung 2).
Zwei-Punkt-LPC-Injektion beeinflusste die Myelin-Regeneration
Die Differenzierung und Reifung von Oligodendrozyten (OLGs) spielt eine entscheidende Rolle bei der Reparatur der Myelinscheide bei MS. Die Myelinregeneration erfolgt in erster Linie durch Differenzierung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) in myelinisierende Oligodendrozyten. Somit wird der Myelinreparaturprozess beeinflusst, sobald die Differenzierung von OPCs in OLGs blockiert ist. Gst-π ist der Marker der OPC-Differenzierungsreifung16. Nach 10 Tagen LPC-Injektion kann durch Immunfluoreszenz gesehen werden, dass die Gst-π im Vergleich zur Scheingruppe abnahm (Abbildung 3A). Gleichzeitig kann die Proliferationsfähigkeit von Oligodendrozyten durch das Verhältnis von Ki67 (Oligodendrozyten vermehren sich) und Olig2 (Gesamtzellen der Oligodendrozytenlinie)17,18 widergespiegelt werden. Das höhere Kolokalisierungsverhältnis von Ki67/Olig2+ stellt eine stärkere Proliferation von Oligodendrozyten nach 10dpi dar (Abbildung 3B). Diese Bilder deuten darauf hin, dass der Läsionsbereich versucht, sich durch die Reifung und Proliferation von OPCs nach LPC-Injektion zu reparieren.
Zwei-Punkt-LPC-Injektion beeinträchtigte das räumliche Gedächtnis von Mäusen
Um die räumliche Gedächtnisfähigkeit der LPC-Injektion bei Mäusen zu analysieren, wurde das Morris Water Maze (WMM)19 verwendet, das keinen Unterschied in der Schwimmgeschwindigkeit zwischen Schein- und LPC-injizierten Mäusen zeigte. Als die Plattform jedoch im Morris-Wasserlabyrinth entfernt wurde, verringerte sich die Latenz, um die versteckte Plattform zu finden (beeinträchtigtes räumliches Lernen), und die im Zielquadranten verbrachte Zeit nahm zu (beeinträchtigte Gedächtnisspeicherung) (Abbildung 4). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass das räumliche Gedächtnis von demyelinisierten Mäusen im Zwei-Punkt-LPC-Injektionsmodell signifikant beeinträchtigt ist. Die Anzahl der Tiere, die in verschiedenen Versuchen verwendet wurden, ist in Tabelle 1 aufgeführt. Jede Maus wurde ab Tag 2 oder Tag 20 trainiert.
Abbildung 1: Zwei-Punkt-Injektion der LPC-induzierten Demyelinisierung. (A) Darstellung der Injektionsstellen (1,0 mm lateral, 2,4 mm tief und 1,1 mm vorne). (B) Darstellung der Injektionsstellen (1,0 mm lateral, 2,1 mm tief und 0,6 mm vorne). (C) Darstellung der Erfassungszeitpunkte. (D) Nachweis der Läsionen der weißen Substanz durch LFB-Färbung. LFB-Färbung bei 10 Tagen nach der Injektion (dpi) und 28 dpi, zeigt eine anhaltende Demyelinisierung des Corpus callosum (Skalenbalken = 200 μm). (E) Quantifizierung des Demyelinisierungsbereichs zu verschiedenen Zeitpunkten. Die Daten werden als Mittelwert ± SD, Einweg-ANOVA gefolgt von den mehreren Vergleichstests von Bonferroni dargestellt. ****p < 0,0001, n = 6 pro Gruppe. (F) Repräsentative Bilder der dMBP-Immunfärbung im Corpus callosum (Skalenbalken = 100 μm). Im Vergleich zu der Täuschung, die fast kein dMBP hatte, konnte nach der LPC-Injektion offensichtlich dMBP gesehen werden. (G) Western Blot-Analyse des MBP-Ausdrucks. MBP zeigte einen signifikanten Verlust nach der Injektion von LPC. β-Aktin wurde als Ladekontrolle verwendet, um den Baseline-Ausdruck zu messen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Elektronenmikroskopische Aufnahmen bestätigen die myelinisierte Ultrastruktur im Corpus callosum von Schein im Vergleich zu der demyelinierten in den LPC-injizierten Mäusen (Skalenbalken = 1 μm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Die Zwei-Punkt-Injektion beeinflusste die Reifung und Proliferation von OPCs. (A) Repräsentative Bilder von GST-π im Corpus callosum von Schein- und LPC-injizierten Mäusen (Skalenbalken = 20 μm). Das Rot bedeutet GST-π. (B) Repräsentative Bilder der Kolokalisierung von Olig2 und Ki67 (Maßstabsleiste = 20 μm). Das Rot steht für Ki67 und das Grün für Olig2. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskopiesystem mit 488 nm und 594 nm Laserlinien aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Beeinträchtigung des räumlichen Gedächtnisses durch LPC-Injektion. (A) Repräsentative Bilder des Schwimmweges der Mäuse in jeder Gruppe in Anwesenheit der Plattform (Lernphase). (B) Repräsentative Bilder der Schwimmwege der Mäuse in jeder Gruppe nach dem Entfernen der Plattform (Gedächtnisphase). Die Anzahl der verwendeten Tiere ist in Tabelle 1 aufgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Gruppe | Schein | LPC-Gruppe |
| LFB-Färbung | 6 | 12 (10 dpi, 6; 28 dpi, 6) |
| Elektronenmikroskopie | 4 | 4 |
| Wenn | 6 | 6 |
| Westlicher Schandfleck | 4 | 4 |
| Morrris Wasserlabyrinth | 12 | 12 |
Tabelle 1: Anzahl der Tiere, die für die verschiedenen Tests verwendet wurden.
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Discussion
MS, eine chronisch demyelinisierende Erkrankung des ZNS, ist eine der häufigsten Ursachen für neurologische Funktionsstörungen bei jungen Erwachsenen20 Jahren. Klinisch erleben etwa 60%-80% der MS-Patienten den Zyklus von Rückfällen und Remissionen, bevor sie eine sekundär-progrediente MS 21,22 entwickeln, und es führt schließlich zu kumulativen Bewegungsstörungen und kognitiven Defiziten im Laufe der Zeit23. Derzeit deckt kein einzelnes experimentelles Modell die gesamte Vielfalt klinischer, pathologischer oder immunologischer Merkmale der Erkrankungab 24. Um den pathologischen Prozess und die Pathogenese von MS in verschiedenen Stadien zu simulieren, gibt es drei gemeinsame demyelinisierende Tiermodelle mit ihren Vorteilen und Einschränkungen, darunter das EAE-Modell, die Fütterung von Tieren CPZ und LPC-induzierte Demyelinisierungsmodelle.
Bei Mäusen wird EAE durch eine Immunantwort nach der Injektion von Myelin-Antigenen induziert, was zu einer mikroglialen Aktivierung und Infiltration von perivaskulären T- und B-Lymphozyten führt, und die begleitende Myelinschädigung ist oft mit dem Wiederauftreten der Krankheitverbunden 20,25. Es simuliert besser die Eigenschaften der MS-Rückfall-Remitting-Periode. Es hat jedoch auch mehrere Einschränkungen. Zum Beispiel ist EAE in erster Linie eine Krankheit, die die weiße Substanz des Rückenmarks betrifft, während MS hauptsächlich eine Demyelinisierung der Großhirnrinde verursacht, und der Ort und der Zeitpunkt der Läsionen sind zufällig, was es schwierig macht, Läsionen genauzu erhalten 19.
CPZ und LPC sind die am häufigsten verwendeten Substanzen zur Induktion toxisch-demyelinisierender Modelle. Sie alle sind in der Lage, ZNS-Demyelinisierung nach der Verabreichung zu verursachen. Im CPZ-Modell führte die Fütterung junger Mäuse mit dem Kupferchelator Cuprizon zum Tod von Oligodendrozyten und anschließender reversibler Demyelinisierung. Nach dem Entzug von Cuprizone wurde innerhalb von 4 Tagen ein spontaner Remyelinisierungsprozess ausgelöst26,27. CPZ führt hauptsächlich zu einer ausgedehnten Demyelinisierung, während die LPC-Injektion zur fokalen Demyelinisierung tendiert. Aufgrund des Toxins und der Entzündungsreaktion löst die klassische Ein-Punkt-Injektion von LPC eine schnelle und hochreproduzierbare Form der Demyelinisierungaus 28.
Keines der oben genannten Modelle kann jedoch den pathologischen Prozess der progressiven MS, der durch eine anhaltende Demyelinisierung gekennzeichnet ist, richtig nachahmen. Daher schlägt das vorliegende Protokoll ein Modell für eine Zwei-Punkt-Injektion von LPC direkt in das Corpus callosum vor, um eine langfristige Demyelinisierung zu induzieren. Zu den kritischen Schritten im Protokoll gehören die horizontale Einstellung des Kopfes des Tieres und die Lokalisierung der Injektionskoordinaten. In Schritt 3.5. muss sichergestellt werden, dass zuerst die Bregma- und hintere Fontanellenebene und dann die linke und rechte Ebene angepasst werden. Gleichzeitig ist zu beachten, dass nach der Anpassung des linken und rechten Niveaus der Nullpunkt vor nachfolgenden Operationen neu positioniert werden muss. Dieser Schritt ist entscheidend, da er in direktem Zusammenhang mit der Genauigkeit der Positionierung steht. In Schritt 3.6. muss bei der Bestimmung der Koordinaten der Z-Achse sichergestellt werden, dass das Ende der Nadel und der Schädel in exaktem Kontakt bleiben und der Forscher beobachten kann, ob die Nadel gebogen ist. In Schritt 3.10. bleibt die Nadel 10 Minuten an Ort und Stelle, um zu verhindern, dass das Medikament aus der Nadelpassage fließt.
Das vorliegende Protokoll weist einige Einschränkungen auf. Wie anderen toxizitätsinduzierten Demyelinismodellen fehlt ihm die Modellierung immunologischer Prozesse. Zweitens, obwohl das Zwei-Punkt-Injektionsmodell die Demyelinisierung für eine relativ lange Zeit aufrechterhalten kann, wird es immer noch unweigerlich von einem leichten Grad an Myelinregeneration begleitet, wenn die Krankheit in ein späteres Stadium fortschreitet. Es ist möglicherweise kein geeigneteres Modell zur Simulation der sekundären progressiven Multiplen Sklerose als die durch Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) induzierte experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis29,30. Das klassische Einpunkt-LPC-Injektionsmodell erzeugt nur eine lokalisierte entzündliche Demyelinisierung, die von einer spontanen Remyelinisierung begleitet wird. Frühere Forschungen haben gezeigt, dass die Infiltration von T-Zellen, B-Zellen und Makrophagen nach LPC-Injektion ein Schlüsselfaktor bei der Myelinreparaturist 15. Im Vergleich zum klassischen Injektionsmodell induziert das Zwei-Punkt-Injektions-LPC-Modell jedoch eine schnelle fokale Demyelinisierung des Corpus callosum und hält den Grad der Demyelinisierung für einen längeren Zeitraum mit wenig Remyelinisierung aufrecht.
Aufgrund der Komplexität der MS erfordern verschiedene Krankheitsstadien, dass unterschiedliche Modelle besser beschrieben werden können. Die Zwei-Punkt-Injektion von LPC über einen stereotaktischen Rahmen ist ein stabiles, effizientes und reproduzierbares experimentelles Mausmodell. Dieses Modell kann zu einer langfristigen Demyelinisierung führen, begleitet von einer geringeren Myelinreparatur im Laufe der Zeit. Das bedeutet, dass das Zwei-Punkt-Injektionsmodell nicht nur zur Untersuchung von Demyelinisierungskrankheiten, sondern auch zur Untersuchung von Myelinreparaturinterventionen verwendet werden kann. Außerdem kann dieses Modell die Demyelinisierung nach dem Eingriff durch Immunfluoreszenz und histologische Methoden einfach und schnell bewerten, und die kognitive Dysfunktion der MS kann durch das beeinträchtigte räumliche Gedächtnis von demyelinisierten Mäusen im Verhaltenstest reflektiert werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Modell der stabilen Demyelinisierung pathologische und präklinische Studien sowohl zum sekundären Fortschreiten der MS als auch zur schubförmig-remittierenden MS erleichtern könnte.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grants: 82071380, 81873743) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk | Sigma-Aldrich | L4129-25MG | |
| 32 gauge Needle | HAMILTON | 7762-05 | |
| 10 μl syringe | HAMILTON | 80014 | |
| high speed skull drill | strong,korea | strong204 | |
| drill | Hager & Meisinger, Germany | REF 500 104 001 001 005 | |
| Matrx Animal Aneathesia Ventilator | MIDMARK | VMR | |
| Portable Stereotaxic Instrument for Mouse | Reward | 68507 | |
| Micro syringe | Reward | KDS LEGATO 130 | |
| Isoflurane | VETEASY | ||
| Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | |
| Phosphate buffer | BOSTER | PYG0021 | |
| LuxoL fast bLue | Servicebio | G1030-100ML | |
| Suture | FUSUNPHARMA | 20152021225 | |
| Brain mold | Reward | 68707 | |
| Electron microscope fixative | Servicebio | G1102-100ML | |
| Neutral red (C.I. 50040), for microscopy Certistain | Sigma-Aldrich | 1.01376 | |
| Anti-Myelin Basic Protein Antibody | Millipore | #AB5864 | |
| Anti-GST-P pAb | MBL | #311 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15) | Thermo Fisher Scientific | 14-5698-95 | |
| Beta Actin Monoclonal Antibody | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| Myelin Basic Protein Polyclonal Antibody | Proteintech | 10458-1-AP | |
| OLIG2 Polyclonal Antibody | Proteintech | 13999-1-AP | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34206ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | YEASEN | 34412ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34212ES60 | |
| HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | abclonal | AS014 | |
| HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | abclonal | AS003 | |
| Adult C57BL/6 male and female mice | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd |
References
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