Summary
Mevcut protokol, farelerde stabil ve tekrarlanabilir bir demiyelinasyon modeli oluşturmak için stereotaksik bir çerçeve yoluyla iki noktalı bir lizofosfatidilkolin enjeksiyonunu tanımlamaktadır.
Abstract
Reseptör aracılı lizofosfolipid sinyalizasyonu, başta multipl skleroz (MS) olmak üzere çeşitli nörolojik hastalıkların patofizyolojisine katkıda bulunur. Lizofosfatidilkolin (LPC), inflamasyonla ilişkili endojen bir lizofosfolipiddir ve miyelin lipitlerine toksisite ile hızlı hasara neden olarak fokal demiyelinizasyona yol açabilir. Burada, stereotaktik iki noktalı LPC enjeksiyonu için doğrudan ciddi demiyelinasyona neden olabilecek ve deneysel demiyelinasyon hasarını cerrahi prosedürle farelerde hızlı ve istikrarlı bir şekilde çoğaltabilecek ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Bu nedenle, bu model demiyelinasyon hastalıkları, özellikle MS ile oldukça ilgilidir ve klinik olarak ilgili araştırmaların ilerlemesine katkıda bulunabilir. Ayrıca, LPC enjekte edilen farelerin korpus kallozumunda demiyelinizasyonun zaman seyrini göstermek için immünofloresan ve Luxol hızlı mavi boyama yöntemleri kullanılmıştır. Ek olarak, modelleme sonrası farelerin bilişsel işlevlerini değerlendirmek için davranışsal yöntem kullanılmıştır. Genel olarak, stereotaksik bir çerçeve yoluyla lizofosfatidilkolinin iki noktalı enjeksiyonu, daha fazla çalışma için farelerde bir demiyelinasyon modeli oluşturmak için kararlı ve tekrarlanabilir bir yöntemdir.
Introduction
Reseptör aracılı lizofosfolipid sinyalizasyonu, hemen hemen tüm organ sistemlerinin çeşitli fizyolojik süreçlerini içerir1. Merkezi sinir sisteminde (MSS), bu sinyal multipl skleroz (MS) gibi otoimmün nörolojik hastalıkların patojenitelerinde kritik bir rol oynar. Multipl skleroz, patolojik demiyelinasyon ve inflamatuar yanıt ile karakterize, nörolojik disfonksiyon ve kognitif bozukluğa neden olan kronik immün aracılı bir hastalıktır 2,3. Erken hastalık sırasında sürekli nüks ve remitting sonrasında, çoğu hasta sonunda beyinde geri dönüşü olmayan hasara ve sonuçta sakatlığa neden olabilecek ikincil-ilerleyici aşamaya ilerler4. İkincil-ilerleyici seyrin patolojik özelliğinin, enflamatuar lezyonların neden olduğu demiyelinizan plaklar olduğuna inanılmaktadır5. MS için mevcut tedaviler nüks riskini önemli ölçüde azaltabilir. Bununla birlikte, ilerleyici MS6'nın neden olduğu uzun süreli demiyelinizan hasar için hala etkili bir tedavi yoktur. Bu nedenle, beyaz cevher dejenerasyonuna odaklanan preklinik terapötikleri incelemek için istikrarlı bir şekilde kurulmuş ve kolayca çoğaltılabilir bir model gereklidir.
Demiyelinasyon ve remiyelinasyon, multipl skleroz gelişiminde iki önemli patolojik süreçtir. Demiyelinasyon, proinflamatuar fenotipler7 ile mikroglia tarafından indüklenen aksonların etrafındaki miyelin kılıfının kaybıdır ve sinir uyarılarının yavaş iletilmesine yol açarak nöron kaybına ve nörolojik bozukluklara neden olur. Remiyelinasyon, oligodendrositlerin aracılık ettiği, bozuklukların nörodejenerasyona ve bilişsel bozulmaya yol açabileceği endojen bir onarım yanıtıdır8. Enflamatuar yanıt, hem miyelin hasarının derecesini hem de onarımını etkileyen tüm süreç için çok önemlidir.
Bu nedenle, MS'in karmaşıklığı nedeniyle, deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), toksik-demiyelinizan modeller, cuprizon (CPZ) ve lizofosfatidilkolin (LPC)9 dahil olmak üzere in vivo demiyelinizan lezyonları taklit etmek için çeşitli hayvan modelleri oluşturulmuştur. . LPC, inflamasyonla ilişkili endojen bir lizofosfolipiddir ve miyelin lipitlerine toksisite ile hızlı hasara neden olabilir ve fokal demiyelinizasyona yol açabilir. Önceki raporlara ve araştırmalara dayanarak10,11, bazı modifikasyonlarla birlikte iki noktalı enjeksiyonun ayrıntılı bir protokolü sağlanmıştır. Genel olarak, klasik tek noktalı LPC enjeksiyon modeli sadece enjeksiyon bölgesinde lokal demiyelinasyon üretir ve sıklıkla spontan remiyelinasyon12,13 eşlik eder. Bununla birlikte, iki noktalı enjeksiyon LPC modeli, LPC'nin fare korpus kallozumunda doğrudan demiyelinasyonu indükleyebileceğini ve az miktarda miyelin rejenerasyonu ile daha dayanıklı demiyelinizasyona neden olabileceğini gösterebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri, Çin'deki Huazhong Bilim ve Teknoloji Üniversitesi, Tongji Tıp Koleji Hayvan Bakım Komitesi Enstitüsü tarafından onaylandı. Bu çalışmada yetişkin C57BL/6 erkek ve dişi fareler (vahşi tip, WT; 20-25 g; 8-10 haftalık) kullanılmıştır. Fareler ticari kaynaklardan elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu). Fareler, su ve gıda ile sağlanan ad libitum ile spesifik bir patojen içermeyen (SPF) hayvan tesisinde barındırıldı. 22 °C sıcaklık ve %55-%60 bağıl nem standart koşullarında alternatif 12 saatlik aydınlık ve karanlık döngü periyodunda tutuldular.
1. LPC çözeltisi hazırlama
- % 10'luk bir LPC çözeltisi oluşturmak ve 500 μL'lik bir santrifüj tüpüne aktarmak için 25 mg LPC tozunu (Malzeme Tablosuna bakınız) 250 μL kloroform ve metanol karışık çözelti (1: 1) ile çözün.
NOT: LPC tamamen çözülmemişse, santrifüj tüpünü ultrasonik bir temizleyiciye yerleştirin ve düzgün bir çözelti elde etmek için ~ 1 saat boyunca 40 kHz'de ultrasonikte yapın. - Çözeltiyi 3 μL / tüpe bölün ve -80 ° C'de saklayın.
NOT: Çözelti ~ 2 yıl saklanabilir. - Ameliyattan önce, çözeltiyi (adım 1.2.) 27 μL% 0.9 NaCl çözeltisi ile seyreltin ve çözeltiyi 37 ° C'de sabit sıcaklıkta bir su banyosunda tutun.
NOT: Enjeksiyona başlamadan hemen önce çözeltiyi hazırlayın.
2. Cerrahi hazırlık
- 5 μL'lik bir şırıngaya bağlanmak için 32 G, 2 iğne içinde bir iğne kullanın (bkz. Mikrolitre şırınganın engelsiz olduğundan emin olun. Enjeksiyonun hazırlanması için 5 μL LPC çözeltisi çekin.
- Fareyi, yaklaşık 0.3 L / dak hızında% 100 oksijen ile karıştırılmış% 3 izofluran buharlaştırıcısına bağlı bir indüksiyon odasında anestezi yapın.
- Solunum pürüzsüzken ayak parmağını sıkıştırma refleksinin eksikliği ile anestezi derinliğini onaylayın.
- Elektrikli tıraş makinesi kullanarak farenin başını kulaklar arasında tıraş edin. İşlem sırasında kornea kuruluğunu önlemek için yağlayıcı göz damlası uygulayın.
- Ardından, fareyi sırt tarafı yukarı bakacak şekilde stereotaksik bir çerçeveye yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu) ve kafayı bir burun konisi ve diş kelepçesi ile sabitleyin. Anesteziyi burnundan %1.2-%1.6 izofluran ile sürdürün.
NOT: İzofluran konsantrasyonu, farelerin solunum durumuna göre ayarlanabilir.
3. Cerrahi prosedür
NOT: Hayvanlar tüm prosedürler sırasında bir ısıtma yastığı üzerine yerleştirilir.
- Fareyi iki taraflı kulak çubuklarıyla stereotaksik aparata sabitleyin. Kulak çubuklarının düz olduğundan ve başın yatay ve sabit olduğundan emin olun.
- İyodofor ve ardından dairesel harekette alkol ile birkaç kez silerek kafadaki cildi dezenfekte edin. Ardından, kafatasını ortaya çıkarmak için kafa derisinin orta çizgisi boyunca yaklaşık 1,5 cm'lik küçük bir kesiyi kesmek için bir neşter kullanın.
- Kafatasını bregma, lambda ve posterior fontanelle açığa çıkana kadar% 1 hidrojen peroksit içine batırılmış bir pamuklu çubukla silin. Şırıngayı stereotaksik aparata yerleştirin.
NOT: Hidrojen peroksiti dikkatli kullanın ve çevre dokulara dokunmaktan kaçının. - Hayvanın başının yatay olarak konumlandırılmasını sağlayın (hem ön hem de arka ve sol ve sağ).
- Stereotaksik çerçevenin Z ekseni düğmesini, iğne ucu ve kafatası bükülmeden sadece temas edecek şekilde ayarlayın, ardından Z ekseni koordinatını ölçün. Bregma ve posterior fontanelle'nin Z koordinatlarını kontrol edin.
- Kulak çubuğunu, bregma ve posterior fontanelle'nin Z koordinatları arasındaki fark 0,02 mm'den fazla olmayacak şekilde ayarlayın. Ardından, orta hattın sol ve sağ taraflarındaki karşılık gelen konumların Z koordinatlarını ölçmek için aynı yöntemi izleyin. Sol ve sağın aynı seviyede olduğundan emin olmak için kulak çubuğunu ayarlayın.
- Korpus kallozumu bulun. XYZ kaynağını bregma olarak ayarlayın.
NOT: İlk enjeksiyon bölgesi bregmaya 1,0 mm yanal, 2,4 mm derinlikte ve 1,1 mm öndür. İkinci enjeksiyon bölgesi bregmaya 1.0 mm yanal, 2.1 mm derinlikte ve 0.6 mm öndür. Örneğin, bregmanın koordinatı (0,0,0) şeklindedir. (-1, 1.1, X) ve (-1, 0.6, Y) olarak işaretlenmiş karşılık gelen konumun Z koordinatını ölçün. Korpus kallozumun ilk enjeksiyon bölgesi koordinatının (-1, 1.1, -[X + 2.4]) ve ikinci enjeksiyon bölgesinin (-1, 0.6, -[Y + 2.1]) olduğu belirlenebilir. - Enjeksiyon bölgesi belirlendikten sonra, kafatası üzerinde steril bir işaretleyici ile bir işaret yapın ve koordinatları kaydedin.
- İşaretli bölgeyi kafatası matkabıyla nazikçe delin (bkz. Herhangi bir kanamayı önlemeye özen gösterin.
- İğneyi yavaşça verilen koordinatlara hareket ettirin ve enjeksiyona başlayın. Korpus kallozum demiyelinizasyonunu indüklemek için, her enjeksiyon bölgesine (adım 3.5.) 0.4 μL / dak hızında 2 μL LPC çözeltisi (adım 1.) enjekte edin.
- Enjeksiyondan sonra, iğneyi her bölgede 10 dakika daha tutun.
NOT: İki enjeksiyon aralığının 20 dakikadan fazla olmadığından emin olun. - Cildi 4-0 dikişle dikin ve hayvanın 10 dakika içinde uyanmasını bekleyin. Analjezikleri postoperatif olarak kurumsal hayvan bakım yönetmeliklerine uygun olarak uygular.
NOT: Ötanazi için önerilen süre, deneyin amacına göre belirlenebilir.
4. Fokal demiyelinizasyon için numune ekstraksiyonu
NOT: Bu adımla ilgili ayrıntılar için lütfen daha önce yayınlanmış olan14 numaralı rapora bakın.
- Nötr kırmızı boyayı (bakınız Malzeme Tablosu) fosfat tamponlu salin (PBS) içinde %1'lik bir çözelti içinde çözün.
- fareleri feda etmeden saatler önce (ayrıntılar için önceki referans 10'a bakın), her fare için intraperitoneal enjeksiyonla PBS'ye500 μL% 1 nötr kırmızı boya enjekte edin.
- Kardiyak perfüzyon12'yi, 4 °C'de önceden soğutulmuş 30 mL% 0.1 PBS ile gerçekleştirin.
- Beyni bir beyin kalıbı ile 1 mm'ye dilimleyin (bkz.
- Mikroskop altında nötr kırmızı ile boyanmış lezyonu görselleştirin ve lezyonu ayırın.
NOT: Sonraki analizlerin doğruluğunu artırmak için çevredeki normal dokuyu mümkün olduğunca çıkarın. Lezyon dokusu RT-PCR, elektron mikroskobu ve western blot analizleri ile incelenebilir.
5. Histolojik boyama ve immünofloresan
- Histolojik boyama ve immünofloresan12 için, kardiyak perfüzyondan sonra (adım 4.3.), beyin 10'unu çıkarın, gece boyunca% 4 PFA'da (4 ° C'de) sabitleyin ve%30 sakarozda tamamen dehidratasyon.
- Sabit sıcaklıkta (-20 ° C) dondurulmuş bir dilimleyici10 kullanarak 20 mm koronal beyin bölümlerine kesin.
- Luxol hızlı mavi (LFB) boyama, immünofloresan ve batı lekesi10 için dilimleri kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LPC'nin iki noktalı enjeksiyonu daha dayanıklı bir demiyelinizasyon ile sonuçlandı
LPC esas olarak miyelin toksisitesi ve akson bütünlüğünün bölünmesi ile hızlı hasara yol açar15. Enjeksiyon günü 0. gün olarak kabul edildi. Fareler 10-28 günlük bir süre boyunca tutuldu (10 dpi ve 28 dpi). Luxol hızlı mavi (LFB) boyama10, bu zaman noktalarında farelerde demiyelinizasyon alanını değerlendirmek için kullanıldı. İki noktalı enjeksiyon modelinde, sahte gruba kıyasla 10 dpi üzerinde anlamlı demiyelinizasyon vardı, bu da lokalize LPC enjeksiyonunun korpus kallozumu başarılı bir şekilde demiyelinizan edebileceğini gösterdi. 28 dpi'de nispeten yüksek bir demiyelinasyon derecesi hala mevcuttur, bu da iki noktalı LPC enjeksiyonu nedeniyle kalıcı ve kararlı demiyelinizasyonu gösterir (Şekil 1D-E).
Miyelin kılıfının kaybını daha fazla değerlendirmek için, demiyelinasyonun nispeten belirgin olduğu kilit bir zaman noktası olarak 10 gün seçildi. İmmünofloresan boyama ile bozulmuş miyelin bazik proteini (dMBP) sayesinde, LPC enjekte edilen grupta 10 dpi'de (Şekil 1F) kayda değer bir dMBP artışı gözlenmiştir ve bu da korpus kallozumda miyelin kaybını temsil etmektedir. Ayrıca, elde edilen lezyon dokusunun proteini (adım 4.) MBP'nin western blot ile ekspresyonunu analiz etmek için kullanıldı. Protokole göre modelleme yaptıktan sonra, MBP önemli bir kayıp gösterdi (Şekil 1G). Bu sonuçlar LFB ve immünofloresan boyama ile tutarlıydı.
LPC enjeksiyonundan 10 gün sonra korpus kallozumdaki miyelin morfolojisi elektron mikroskobu ile gözlendi (lezyon dokusu adım 4'e göre çıkarıldı). Bariz demiyelinasyon, modellemenin başarısını doğrular (Şekil 2).
İki noktalı LPC enjeksiyonu miyelin rejenerasyonunu etkiledi
Miyelin rejenerasyonu, öncelikle oligodendrosit öncü hücrelerinin (OPC'ler) miyelinli oligodendrositlere farklılaştırılmasıyla gerçekleşir. Böylece, OPC'lerin OLG'lere farklılaşması engellendikten sonra miyelin onarım süreci etkilenecektir. Gst-π, OPC farklılaşma olgunlaşması16'nın belirtecidir. LPC enjeksiyonundan 10 gün sonra, immünofloresan ile Gst-π sahte gruba göre azaldığı görülebilir (Şekil 3A). Aynı zamanda, oligodendrositlerin proliferasyon kabiliyeti, Ki67 (oligodendrositlerin çoğalması) ve Olig2 (toplam oligodendrosit soy hücreleri) 17,18 oranı ile yansıtılabilir. Daha yüksek Ki67 / Olig2 + ko-lokalizasyon oranı, 10dpi'den sonra oligodendrositlerin daha fazla çoğalmasını temsil eder (Şekil 3B). Bu görüntüler, lezyon alanının LPC enjeksiyonundan sonra OPC'lerin olgunlaşması ve çoğalması yoluyla onarılmaya çalışıldığını göstermektedir.
İki noktalı LPC enjeksiyonu, farelerin uzamsal hafızasını bozdu
Farelerde LPC enjeksiyonunun uzamsal hafıza yeteneğini analiz etmek için, Morris su labirenti (WMM)19 kullanıldı ve sahte ve LPC enjekte edilen fareler arasında yüzme hızında bir fark göstermedi. Bununla birlikte, platform Morris su labirentinde kaldırıldığında, gizli platformu bulma gecikmesi azaldı (uzamsal öğrenmenin bozulması) ve hedef kadranda harcanan zaman arttı (bozulmuş hafıza tutma) (Şekil 4). Sonuçlar, iki noktalı LPC enjeksiyon modelinde demiyelinli farelerin uzamsal hafızasının önemli ölçüde bozulduğunu göstermektedir. Farklı deneylerde kullanılan hayvan sayısı Tablo 1'de listelenmiştir. Her fare 2. günden veya 20. günden itibaren eğitim aldı.
Şekil 1: LPC kaynaklı demiyelinizasyonun iki noktalı enjeksiyonu. (A) Enjeksiyon bölgelerinin gösterimi (1.0 mm yanal, 2.4 mm derinlikte ve 1.1 mm ön). (B) Enjeksiyon bölgelerinin gösterimi (1,0 mm yanal, 2,1 mm derinlikte ve 0,6 mm ön). (C) Algılama zaman noktalarının gösterimi. (D) LFB boyama yoluyla beyaz cevher lezyonlarının saptanması. Enjeksiyondan 10 gün sonra (dpi) ve 28 dpi'de LFB boyaması, korpus kallozumun kalıcı demiyelinasyonunu gösterir (ölçek çubuğu = 200 μm). (E) Demiyelinasyon alanının farklı zaman noktalarında ölçülmesi. Veriler ortalama ± SD, tek yönlü ANOVA ve ardından Bonferroni'nin çoklu karşılaştırma testleri olarak temsil edilmektedir. ****p < 0,0001, n = grup başına 6. (F) Korpus kallozumda dMBP immün boyamasının temsili görüntüleri (ölçek çubuğu = 100 μm). Neredeyse hiç dMBP'si olmayan sahte ile karşılaştırıldığında, LPC enjeksiyonundan sonra belirgin dMBP görülebilir. (G) MBP ifadesinin Batı leke analizi. MBP, LPC enjeksiyonundan sonra önemli bir kayıp gösterdi. β-aktin, taban çizgisi ifadesini ölçmek için yükleme kontrolü olarak kullanılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Elektron mikroskobu görüntüleri, LPC enjekte edilen farelerdeki demiyelinize olana kıyasla sahte korpus kallozumdaki miyelinli ultrayapıyı doğrulamaktadır (ölçek çubuğu = 1 μm). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İki noktalı enjeksiyon, OPC'lerin olgunlaşmasını ve çoğalmasını etkiledi. (A) Sahte ve LPC enjekte edilen farelerin korpus kallozumunda GST π temsili görüntüleri (ölçek çubuğu = 20 μm). Kırmızı, GST-π belirtir. (B) Olig2 ve Ki67 birlikte lokalizasyonunun temsili görüntüleri (ölçek çubuğu = 20 μm). Kırmızı Ki67'yi, yeşil ise Olig2'yi ifade eder. Görüntüler, 488 nm ve 594 nm lazer çizgilerine sahip bir konfokal mikroskopi sistemi kullanılarak yakalandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: LPC enjeksiyonu ile indüklenen uzamsal hafıza bozukluğu. (A) Platformun varlığında (öğrenme aşaması) her grupta farelerin yüzme yolunun temsili görüntüleri. (B) Platformu çıkardıktan sonra her gruptaki farelerin yüzme yollarının temsili görüntüleri (hafıza aşaması). Kullanılan hayvanların sayısı Tablo 1'de listelenmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Grup | Şam | LPC-Grubu |
| LFB boyama | 6 | 12 (10 dpi, 6; 28 dpi, 6) |
| Elektron mikroskobu | 4 | 4 |
| Eğer | 6 | 6 |
| Batı Lekesi | 4 | 4 |
| Morrris Su Labirenti | 12 | 12 |
Tablo 1: Farklı testler için kullanılan hayvan sayısı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MSS'nin kronik demiyelinizan bir hastalığı olan MS, genç erişkinlerde nörolojik disfonksiyonun en yaygın nedenlerinden biridir20. Klinik olarak, MS hastalarının yaklaşık% 60-80'i, sekonder-ilerleyici bir MS 21,22 gelişmeden önce nüks ve remisyon döngüsünü yaşar ve sonunda kümülatif hareket bozukluklarına ve zamanla bilişsel eksikliklere yol açar23. Şu anda, tek bir deneysel model, hastalığın klinik, patolojik veya immünolojik özelliklerinin tüm çeşitliliğini kapsamamaktadır24. MS'in patolojik sürecini ve patogenezini farklı evrelerde simüle etmek için, EAE modeli, beslenen hayvanlar CPZ ve LPC kaynaklı demiyelinasyon modelleri dahil olmak üzere avantajları ve sınırlamaları ile üç yaygın demiyelinizan hayvan modeli vardır.
Farelerde, EAE, miyelin antijenlerinin enjeksiyonunu takiben bir immün yanıt ile indüklenir, bu da perivasküler T ve B lenfositlerinin mikroglial aktivasyonu ve infiltrasyonu ile sonuçlanır ve eşlik eden miyelin hasarı genellikle hastalığın nüksetmesi ile ilişkilidir20,25. MS relapsing-remitting periyodunun özelliklerini daha iyi simüle eder. Bununla birlikte, aynı zamanda birkaç sınırlaması vardır. Örneğin, EAE öncelikle omuriliğin beyaz maddesini etkileyen bir hastalıktır, oysa MS esas olarak serebral korteksin demiyelinizasyonuna neden olur ve lezyonların yeri ve zamanlaması rastgeledir, bu da lezyonların doğru bir şekilde elde edilmesini zorlaştırır19.
CPZ ve LPC, toksik-demiyelinizan modelleri indüklemek için en yaygın kullanılan maddelerdir. Hepsi uygulamadan sonra CNS demiyelinasyonuna neden olabilir. CPZ modelinde, genç farelerin bakır şelatör cuprizone ile beslenmesi, oligodendrosit ölümü ve ardından geri dönüşümlü demiyelinizasyon ile sonuçlandı. Kubrizon'un geri çekilmesinden sonra, 4 gün içinde spontan bir remiyelinasyon süreci tetiklendi26,27. CPZ esas olarak yaygın demiyelinizasyon ile sonuçlanırken, LPC enjeksiyonu fokal demiyelinizasyona doğru eğilimlidir. Toksin ve enflamatuar yanıt nedeniyle, klasik tek noktalı LPC enjeksiyonu, hızlı ve yüksek oranda tekrarlanabilir bir demiyelinizasyon formunu tetikler28.
Bununla birlikte, yukarıdaki modellerin hiçbiri, kalıcı demiyelinizasyon ile karakterize ilerleyici MS'in patolojik sürecini düzgün bir şekilde taklit edemez. Bu nedenle, mevcut protokol, uzun süreli demiyelinizasyonu indüklemek için LPC'nin doğrudan korpus kallozuma iki noktalı enjeksiyonu için bir model önermektedir. Protokoldeki kritik adımlar, hayvanın başının yatay olarak ayarlanmasını ve enjeksiyon koordinatlarının bulunmasını içerir. Adım 3.5.'te, önce bregma ve arka fontanelle seviyesinin ayarlandığından emin olunmalı ve ardından sol ve sağ seviyeler ayarlanmalıdır. Aynı zamanda, sol ve sağ seviyeleri ayarladıktan sonra, sonraki işlemlerden önce sıfır noktasının yeniden konumlandırılması gerektiğine dikkat edilmelidir. Bu adım çok önemlidir, çünkü konumlandırmanın doğruluğu ile doğrudan ilgilidir. Adım 3.6.'da, Z ekseninin koordinatlarını belirlerken, iğnenin ucunun ve kafatasının tam temas halinde kalmasını sağlamalıdır ve araştırmacı iğnenin bükülmüş olup olmadığını gözlemleyebilir. Adım 3.10.'da, ilacın iğne geçişinden dışarı akmasını önlemek için iğne 10 dakika boyunca yerinde kalır.
Mevcut protokolün bazı sınırlamaları vardır. Diğer toksisiteye bağlı demiyelinizan modeller gibi, immünolojik süreçlerin modellenmesinden yoksundur. İkincisi, iki noktalı enjeksiyon modeli nispeten uzun bir süre demiyelinasyonu koruyabilse de, hastalık daha sonraki bir aşamaya ilerledikçe kaçınılmaz olarak hafif bir miyelin rejenerasyonu eşlik eder. Sekonder progresif multipl sklerozu simüle etmek için miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG) ile indüklenen deneysel otoimmün ensefalomiyelit 29,30'dan daha uygun bir model olmayabilir. Klasik tek noktalı LPC enjeksiyon modeli, spontan remiyelinasyonun eşlik ettiği sadece lokalize inflamatuar demiyelinasyon üretir. Önceki araştırmalar, LPC enjeksiyonundan sonra T hücrelerinin, B hücrelerinin ve makrofajların infiltrasyonunun miyelin onarımında önemli bir faktör olduğunu göstermiştir15. Bununla birlikte, klasik enjeksiyon modeli ile karşılaştırıldığında, iki noktalı enjeksiyon LPC modeli, korpus kallozumun hızlı fokal demiyelinasyonunu indükler ve demiyelinasyon derecesini az miktarda remiyelinasyon ile daha uzun bir süre korur.
MS'in karmaşıklığı nedeniyle, farklı hastalık evreleri farklı modellerin daha iyi tanımlanmasını gerektirir. LPC'nin stereotaksik bir çerçeve aracılığıyla iki noktalı enjeksiyonu, kararlı, verimli ve tekrarlanabilir bir deneysel fare modelidir. Bu model, zamanla daha az miyelin onarımı ile birlikte uzun süreli demiyelinizasyona yol açabilir. Bu, iki noktalı enjeksiyon modelinin sadece demiyelinasyon hastalıklarını incelemek için değil, aynı zamanda miyelin onarım müdahalelerini incelemek için de kullanılabileceği anlamına gelir. Ayrıca bu model, immünofloresan ve histolojik yöntemlerle müdahale sonrası demiyelinasyonu kolay ve hızlı bir şekilde değerlendirebilmekte ve MS'in bilişsel işlev bozukluğu, davranış testinde demiyelinli farelerin bozulmuş uzamsal hafızası ile yansıtılabilmektedir. Sonuç olarak, bu stabil demiyelinizasyon modeli, hem MS'in sekonder progresyonu hem de relapsing-remitting MS üzerine patolojik ve preklinik çalışmaları kolaylaştırabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı tarafından desteklenmiştir (Hibeler: 82071380, 81873743).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk | Sigma-Aldrich | L4129-25MG | |
| 32 gauge Needle | HAMILTON | 7762-05 | |
| 10 μl syringe | HAMILTON | 80014 | |
| high speed skull drill | strong,korea | strong204 | |
| drill | Hager & Meisinger, Germany | REF 500 104 001 001 005 | |
| Matrx Animal Aneathesia Ventilator | MIDMARK | VMR | |
| Portable Stereotaxic Instrument for Mouse | Reward | 68507 | |
| Micro syringe | Reward | KDS LEGATO 130 | |
| Isoflurane | VETEASY | ||
| Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | |
| Phosphate buffer | BOSTER | PYG0021 | |
| LuxoL fast bLue | Servicebio | G1030-100ML | |
| Suture | FUSUNPHARMA | 20152021225 | |
| Brain mold | Reward | 68707 | |
| Electron microscope fixative | Servicebio | G1102-100ML | |
| Neutral red (C.I. 50040), for microscopy Certistain | Sigma-Aldrich | 1.01376 | |
| Anti-Myelin Basic Protein Antibody | Millipore | #AB5864 | |
| Anti-GST-P pAb | MBL | #311 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15) | Thermo Fisher Scientific | 14-5698-95 | |
| Beta Actin Monoclonal Antibody | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| Myelin Basic Protein Polyclonal Antibody | Proteintech | 10458-1-AP | |
| OLIG2 Polyclonal Antibody | Proteintech | 13999-1-AP | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34206ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | YEASEN | 34412ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34212ES60 | |
| HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | abclonal | AS014 | |
| HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | abclonal | AS003 | |
| Adult C57BL/6 male and female mice | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd |
References
- Gaire, B. P., Choi, J. W. Critical roles of lysophospholipid receptors in activation of neuroglia and their neuroinflammatory responses. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7864 (2021).
- Compston, A., Coles, A.
- Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis - a review. European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
- Mahad, D. H., Trapp, B. D., Lassmann, H. Pathological mechanisms in progressive multiple sclerosis. The Lancet Neurology. 14 (2), 183-193 (2015).
- Filippi, M., et al.
- Villoslada, P., Steinman, L. New targets and therapeutics for neuroprotection, remyelination and repair in multiple sclerosis. Expert Opinion on Investigational Drugs. 29 (5), 443-459 (2020).
- Lassmann, H.
- Franklin, R. J., Ffrench-Constant, C. Remyelination in the CNS: From biology to therapy. Nature Reviews Neuroscience. 9 (11), 839-855 (2008).
- Gentile, A., et al. Immunomodulatory effects of exercise in experimental multiple sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 2197 (2019).
- Chen, M., et al. Deficiency of microglial Hv1 channel is associated with activation of autophagic pathway and ROS production in LPC-induced demyelination mouse model. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 333 (2020).
- Luo, Q., et al. A stable and easily reproducible model of focal white matter demyelination. Journal of Neuroscience Methods. 307, 230-239 (2018).
- Blakemore, W. F., Franklin, R. J. Remyelination in experimental models of toxin-induced demyelination. Current Topics in Microbiology and Immunology. 318, 193-212 (2008).
- Degaonkar, M. N., Raghunathan, P., Jayasundar, R., Jagannathan, N. R. Determination of relaxation characteristics during preacute stage of lysophosphatidyl choline-induced demyelinating lesion in rat brain: An animal model of multiple sclerosis. Magnetic Resonance Imaging. 23 (1), 69-73 (2005).
- Baydyuk, M., et al. Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).
- Plemel, J. R., et al. Mechanisms of lysophosphatidylcholine-induced demyelination: A primary lipid disrupting myelinopathy. Glia. 66 (2), 327-347 (2018).
- Nave, K. A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).
- Liu, Z., et al. Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms. Developmental Biology. 302 (2), 683-693 (2007).
- Kassis, H., et al. Histone deacetylase expression in white matter oligodendrocytes after stroke. Neurochemistry International. 77, 17-23 (2014).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Morris water maze: Procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nature Protocols. 1 (2), 848-858 (2006).
- Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination. Brain. 129, Pt 8 1972-1983 (2006).
- Karussis, D. The diagnosis of multiple sclerosis and the various related demyelinating syndromes: A critical review. Journal of Autoimmunity. 48-49, 134-142 (2014).
- Kamma, E., Lasisi, W., Libner, C., Ng, H. S., Plemel, J. R. Central nervous system macrophages in progressive multiple sclerosis: Relationship to neurodegeneration and therapeutics. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 45 (2022).
- Kutzelnigg, A., et al. Cortical demyelination and diffuse white matter injury in multiple sclerosis. Brain. 128, Pt 11 2705-2712 (2005).
- Lassmann, H., Bradl, M. Multiple sclerosis: Experimental models and reality). Acta Neuropathologica. 133 (2), 223-244 (2017).
- Lamport, A. C., Chedrawe, M., Nichols, M., Robertson, G. S. Experimental autoimmune encephalomyelitis accelerates remyelination after lysophosphatidylcholine-induced demyelination in the corpus callosum. Journal of Neuroimmunology. 334, 576995 (2019).
- Torkildsen, O., Brunborg, L. A., Myhr, K. M., Bo, L. The cuprizone model for demyelination. Acta Neurologica Scandinavica. Supplementum. 188, 72-76 (2008).
- Zhan, J., et al. The cuprizone model: Dos and do nots. Cells. 9 (4), 843 (2020).
- Torre-Fuentes, L., et al. Experimental models of demyelination and remyelination. Neurologia (Barcelona, Spain). 35 (1), 32-39 (2020).
- Merkler, D., et al. Myelin oligodendrocyte glycoprotein-induced experimental autoimmune encephalomyelitis in the common marmoset reflects the immunopathology of pattern II multiple sclerosis lesions. Multiple Sclerosis Journal. 12 (4), 369-374 (2006).
- Ucal, M., et al. Widespread cortical demyelination of both hemispheres can be induced by injection of pro-inflammatory cytokines via an implanted catheter in the cortex of MOG-immunized rats. Experimental Neurology. 294, 32-44 (2017).
