Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल चूहों में एक स्थिर और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डिमाइलिनेशन मॉडल उत्पन्न करने के लिए एक स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम के माध्यम से लाइसोफॉस्फेटिडिलकोलाइन के दो-बिंदु इंजेक्शन का वर्णन करता है।
Abstract
रिसेप्टर-मध्यस्थता लाइसोफॉस्फोलिपिड सिग्नलिंग विभिन्न न्यूरोलॉजिकल बीमारियों, विशेष रूप से मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस) के पैथोफिजियोलॉजी में योगदान देता है। लाइसोफॉस्फेटिडिलकोलाइन (एलपीसी) सूजन से जुड़ा एक अंतर्जात लाइसोफॉस्फोलिपिड है, और यह माइलिन लिपिड को विषाक्तता के साथ तेजी से नुकसान पहुंचा सकता है, जिससे फोकल डिमाइलिनेशन हो सकता है। यहां, स्टीरियोटैक्टिक दो-बिंदु एलपीसी इंजेक्शन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है जो सीधे गंभीर डिमाइलिनेशन का कारण बन सकता है और सर्जिकल प्रक्रिया द्वारा चूहों में प्रयोगात्मक डिमाइलिनेशन चोट को जल्दी और स्थिर रूप से दोहरा सकता है। इस प्रकार, यह मॉडल डिमाइलिनेशन रोगों, विशेष रूप से एमएस के लिए अत्यधिक प्रासंगिक है, और यह संबंधित अग्रिम नैदानिक रूप से प्रासंगिक अनुसंधान में योगदान दे सकता है। इसके अलावा, एलपीसी के साथ इंजेक्शन चूहों के कॉर्पस कॉलोसम में डिमाइलिनेशन के समय पाठ्यक्रम को चित्रित करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस और लक्सोल फास्ट ब्लू धुंधला तरीकों का उपयोग किया गया था। इसके अलावा, मॉडलिंग के बाद चूहों के संज्ञानात्मक कार्य का मूल्यांकन करने के लिए व्यवहार विधि का उपयोग किया गया था। कुल मिलाकर, स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम के माध्यम से लाइसोफॉस्फेटिडिलकोलाइन का दो-बिंदु इंजेक्शन आगे के अध्ययन के लिए चूहों में एक डिमाइलिनेशन मॉडल उत्पन्न करने के लिए एक स्थिर और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीका है।
Introduction
रिसेप्टर-मध्यस्थता वाले लाइसोफॉस्फोलिपिड सिग्नलिंग में लगभग सभी अंग प्रणालियों की विविध शारीरिक प्रक्रियाएं शामिलहैं 1. केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में, यह सिग्नलिंग मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस) जैसे ऑटोइम्यून न्यूरोलॉजिकल रोगों के रोगजनकों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। मल्टीपल स्केलेरोसिस एक पुरानी प्रतिरक्षा-मध्यस्थता विकार है जो पैथोलॉजिकल डिमाइलिनेशन और भड़काऊ प्रतिक्रिया की विशेषता है, जिससे न्यूरोलॉजिकल डिसफंक्शन और संज्ञानात्मक हानि 2,3 होती है। प्रारंभिक बीमारी के दौरान निरंतर रिलैप्सिंग और प्रेषण के बाद, अधिकांश रोगी अंततः माध्यमिक-प्रगतिशील चरण में प्रगति करते हैं, जो मस्तिष्क को अपरिवर्तनीय क्षति पहुंचा सकता है और परिणामस्वरूप विकलांगता4. यह माना जाता है कि माध्यमिक-प्रगतिशील पाठ्यक्रम की पैथोलॉजिकल हॉलमार्क भड़काऊ घावों के कारण सजीले टुकड़े को कम करना है5. एमएस के लिए मौजूदा उपचार रिलैप्स के जोखिम को काफी कम कर सकते हैं। हालांकि, प्रगतिशील एमएस6 के कारण दीर्घकालिक डिमाइलिनेटिंग क्षति के लिए अभी भी कोई प्रभावी चिकित्सा नहीं है। इस प्रकार, सफेद पदार्थ अध: पतन पर ध्यान केंद्रित करने वाले प्रीक्लिनिकल चिकित्सीय का अध्ययन करने के लिए एक स्थिर रूप से स्थापित और आसानी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मॉडल की आवश्यकता होती है।
मल्टीपल स्केलेरोसिस विकसित करने में डिमाइलिनेशन और रिमाइलिनेशन दो प्रमुख रोग प्रक्रियाएं हैं। डिमाइलिनेशन प्रो-भड़काऊ फेनोटाइप7 के साथ माइक्रोग्लिया द्वारा प्रेरित अक्षतंतु के चारों ओर माइलिन म्यान का नुकसान है, और यह तंत्रिका आवेगों के धीमे चालन की ओर जाता है और इसके परिणामस्वरूप न्यूरॉन्स और न्यूरोलॉजिकल विकारों का नुकसान होता है। रिमाइलिनेशन ओलिगोडेंड्रोसाइट्स द्वारा मध्यस्थता की गई एक अंतर्जात मरम्मत प्रतिक्रिया है, जहां विकार न्यूरोडीजेनेरेशन और संज्ञानात्मक हानि का कारण बन सकते हैं8. भड़काऊ प्रतिक्रिया पूरी प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है, माइलिन क्षति और मरम्मत दोनों की डिग्री को प्रभावित करती है।
इसलिए, एमएस के लिए चिकित्सीय रणनीतियों के आगे अन्वेषण के लिए लगातार भड़काऊ डिमाइलिनेशन का एक स्थिर पशु मॉडल सार्थक है एमएस की जटिलता के कारण, प्रायोगिक ऑटोइम्यून एन्सेफलोमाइलाइटिस (ईएई), विषाक्त-डिमाइलिनेटिंग मॉडल, क्यूप्रीज़ोन (सीपीजेड), और लाइसोफॉस्फेटिडिलकोलाइन (एलपीसी) सहित विवो में डिमाइलिनेटिंग घावों की नकल करने के लिए विभिन्न प्रकार के पशु मॉडल स्थापित किए गए हैं। . एलपीसी सूजन से जुड़ा एक अंतर्जात लाइसोफॉस्फोलिपिड है, और यह माइलिन लिपिड को विषाक्तता के साथ तेजी से नुकसान पहुंचा सकता है, जिससे फोकल डिमाइलिनेशन हो सकता है। पिछली रिपोर्टों और अनुसंधान10,11 के आधार पर, कुछ संशोधनों के साथ दो-बिंदु इंजेक्शन का एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है। आम तौर पर, क्लासिक एक-बिंदु एलपीसी इंजेक्शन मॉडल केवल इंजेक्शन साइट पर स्थानीय डिमाइलिनेशन का उत्पादन करता है और अक्सर सहज पुनर्मिलन12,13 के साथ होता है। हालांकि, दो-बिंदु इंजेक्शन एलपीसी मॉडल यह प्रदर्शित कर सकता है कि एलपीसी सीधे माउस कॉर्पस कॉलोसम में डिमाइलिनेशन को प्रेरित कर सकता है और थोड़ा माइलिन पुनर्जनन के साथ अधिक टिकाऊ डिमाइलिनेशन का कारण बन सकता है।
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Protocol
सभी पशु प्रक्रियाओं को टोंगजी मेडिकल कॉलेज, हुआझोंग यूनिवर्सिटी ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी, चीन की पशु देखभाल समिति संस्थान द्वारा अनुमोदित किया गया था। वर्तमान अध्ययन के लिए वयस्क सी 57 बीएल / 6 नर और मादा चूहों (जंगली प्रकार, डब्ल्यूटी; 20-25 ग्राम; 8-10 सप्ताह पुराना) का उपयोग किया गया था। चूहों को वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। चूहों को एक विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त (एसपीएफ़) पशु सुविधा में रखा गया था जिसमें पानी और भोजन की आपूर्ति की गई विज्ञापन लिबिटम थी। उन्हें 22 डिग्री सेल्सियस तापमान और 55% -60% की सापेक्ष आर्द्रता की मानक स्थितियों में प्रकाश और अंधेरे चक्र की बारी-बारी से 12 घंटे की अवधि में रखा गया था।
1. एलपीसी समाधान तैयारी
- 10% एलपीसी समाधान बनाने और इसे 500 μL अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल मिश्रित समाधान (1: 1) के 250 μL के साथ एलपीसी पाउडर के 25 मिलीग्राम ( सामग्री की तालिका देखें) को भंग करें।
नोट: यदि एलपीसी पूरी तरह से भंग नहीं है, तो एक समान समाधान प्राप्त करने के लिए ~ 1 घंटे के लिए 40 किलोहर्ट्ज पर अल्ट्रासोनिक क्लीनर और अल्ट्रासोनिकेट में अपकेंद्रित्र ट्यूब रखें। - ट्यूब में समाधान को विभाजित करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
नोट: समाधान ~ 2 साल के लिए संग्रहीत किया जा सकता है। - सर्जरी से पहले, 0.9% एनएसीएल समाधान के 27 μL के साथ समाधान (चरण 1.2.) को पतला करें, और समाधान को 37 डिग्री सेल्सियस पर निरंतर तापमान पानी के स्नान में रखें।
नोट: इंजेक्शन शुरू करने से ठीक पहले समाधान तैयार करें।
2. सर्जिकल तैयारी
- 5 μL सिरिंज से कनेक्ट करने के लिए सुई में 32 जी, 2 का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें)। सुनिश्चित करें कि माइक्रोलीटर सिरिंज अबाधित है। इंजेक्शन की तैयारी के लिए एलपीसी समाधान के 5 μL वापस ले लें।
- मिनट की दर से 100% ऑक्सीजन के साथ मिश्रित 3% आइसोफ्लूरेन के साथ आइसोफ्लूरेन वाष्पीकरण से जुड़े एक प्रेरण कक्ष में माउस को संवेदनाहारी करें।
- पैर की अंगुली-चुटकी पलटा की कमी से संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें जबकि श्वास चिकनी है।
- एक इलेक्ट्रिक शेवर का उपयोग करके कानों के बीच माउस के सिर को दाढ़ी दें। प्रक्रिया के दौरान कॉर्नियल सूखापन को रोकने के लिए चिकनाई आंखों की बूंदें लागू करें।
- फिर, माउस को पृष्ठीय पक्ष के साथ एक स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम ( सामग्री की तालिका देखें) में रखें, और नाक शंकु और दांत क्लैंप के साथ सिर को सुरक्षित करें। अपनी नाक के माध्यम से 1.2% -1.6% आइसोफ्लूरेन के साथ संज्ञाहरण बनाए रखें।
नोट: आइसोफ्लूरेन एकाग्रता को चूहों की श्वसन स्थिति के अनुसार समायोजित किया जा सकता है।
3. सर्जिकल प्रक्रिया
नोट: जानवरों को सभी प्रक्रियाओं के दौरान हीटिंग पैड पर रखा जाता है।
- द्विपक्षीय कान सलाखों के साथ स्टीरियोटैक्सिक उपकरण के लिए माउस को ठीक करें। सुनिश्चित करें कि कान सलाखों स्तर रहे हैं और सिर क्षैतिज और स्थिर है।
- सर्कुलर मोशन में अल्कोहल के बाद आयोडोफोर से कई बार पोंछकर सिर की त्वचा को कीटाणुरहित करें। फिर खोपड़ी को उजागर करने के लिए खोपड़ी की मध्य रेखा के साथ लगभग 1.5 सेमी के एक छोटे चीरे को काटने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें।
- खोपड़ी को 1% हाइड्रोजन पेरोक्साइड में डूबे हुए कपास झाड़ू के साथ पोंछें जब तक कि ब्रेग्मा, लैम्ब्डा और पीछे के फोंटानेल उजागर न हों। स्टीरियोटैक्सिक उपकरण पर सिरिंज रखें।
नोट: देखभाल के साथ हाइड्रोजन पेरोक्साइड का उपयोग करें और आसपास के ऊतकों को छूने से बचें। - जानवर के सिर की क्षैतिज स्थिति सुनिश्चित करें (सामने और पीछे दोनों और बाएं और दाएं)।
- स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम के जेड-अक्ष घुंडी को समायोजित करें ताकि सुई टिप और खोपड़ी झुकने के बिना स्पर्श करें, फिर जेड-अक्ष समन्वय को मापें। ब्रेग्मा और पीछे के फोंटानेल के जेड निर्देशांक की जांच करें।
- कान बार को समायोजित करें ताकि ब्रेग्मा और पीछे के फोंटानेल के जेड निर्देशांक के बीच का अंतर 0.02 मिमी से अधिक न हो। फिर, मिडलाइन के बाईं और दाईं ओर संबंधित पदों के जेड निर्देशांक को मापने के लिए एक ही विधि का पालन करें। यह सुनिश्चित करने के लिए कान बार को समायोजित करें कि बाएं और दाएं एक ही स्तर पर हैं।
- कॉर्पस कॉलोसम का पता लगाएं। एक्सवाईजेड मूल को ब्रेग्मा पर सेट करें।
नोट: पहला इंजेक्शन साइट ब्रेग्मा के लिए 1.0 मिमी पार्श्व, 2.4 मिमी गहरा और 1.1 मिमी पूर्वकाल है। दूसरा इंजेक्शन साइट ब्रेग्मा के लिए 1.0 मिमी पार्श्व, 2.1 मिमी गहरा और 0.6 मिमी पूर्वकाल है। उदाहरण के लिए, ब्रेग्मा का समन्वय (0,0,0) है। (-1, 1.1, एक्स) और (-1, 0.6, वाई) के रूप में चिह्नित संबंधित स्थान के जेड समन्वय को मापें। यह निर्धारित किया जा सकता है कि कॉर्पस कॉलोसम का पहला इंजेक्शन साइट समन्वय (-1, 1.1, −[एक्स + 2.4]) है, और दूसरा इंजेक्शन साइट (-1, 0.6, −[वाई + 2.1]) है। - एक बार इंजेक्शन साइट निर्धारित हो जाने के बाद, खोपड़ी पर एक बाँझ मार्कर के साथ एक निशान बनाएं और निर्देशांक रिकॉर्ड करें।
- धीरे-धीरे एक खोपड़ी ड्रिल के साथ चिह्नित साइट ड्रिल करें ( सामग्री की तालिका देखें)। किसी भी रक्तस्राव से बचने के लिए ध्यान रखें।
- धीरे-धीरे सुई को दिए गए निर्देशांक में ले जाएं और इंजेक्शन शुरू करें। कॉर्पस कॉलोसम डिमाइलिनेशन को प्रेरित करने के लिए, प्रत्येक इंजेक्शन साइट (चरण 3.5.) पर एलपीसी समाधान (चरण 1.) के 2 μL को 0.4 μL / मिनट की दर से इंजेक्ट करें।
- इंजेक्शन के बाद, एक अतिरिक्त 10 मिनट के लिए प्रत्येक साइट में सुई रखें।
नोट: सुनिश्चित करें कि दो इंजेक्शन का अंतराल 20 मिनट से अधिक नहीं है। - एक 4-0 सिवनी के साथ त्वचा सीवन और 10 मिनट के भीतर जानवर जागने के लिए प्रतीक्षा करें। संस्थागत पशु देखभाल नियमों के अनुसार एनाल्जेसिक का प्रशासन करें।
नोट: इच्छामृत्यु के लिए अनुशंसित समय प्रयोग के उद्देश्य के अनुसार निर्धारित किया जा सकता है।
4. फोकल डिमाइलिनेशन के लिए नमूना निष्कर्षण
नोट: इस चरण के बारे में विवरण के लिए, कृपया पहले प्रकाशित रिपोर्ट14 देखें।
- फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में 1% समाधान में तटस्थ लाल डाई ( सामग्री की तालिका देखें) को भंग करें।
- चूहों का बलिदान करने से पहले घंटे (विवरण के लिए, पिछले संदर्भ10 देखें), प्रत्येक माउस के लिए इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा पीबीएस में 1% तटस्थ लाल डाई के 500 μL इंजेक्ट करें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.1% पीबीएस के 30 एमएल के साथ कार्डियक छिड़काव12 करें।
- मस्तिष्क को मस्तिष्क मोल्ड के साथ 1 मिमी में स्लाइस करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- माइक्रोस्कोप के नीचे तटस्थ लाल रंग के साथ दाग घाव की कल्पना करें और घाव को अलग करें।
नोट: बाद के विश्लेषण की सटीकता में सुधार करने के लिए जितना संभव हो उतना सामान्य ऊतक निकालें। घाव ऊतक आरटी-पीसीआर, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के साथ जांच की जा सकती है।
5. हिस्टोलॉजिकल धुंधला और इम्यूनोफ्लोरेसेंस
- हिस्टोलॉजिकल धुंधला और इम्यूनोफ्लोरेसेंस12 के लिए, कार्डियक छिड़काव (चरण 4.3) के बाद, मस्तिष्क10 को हटा दें, रात भर (4 डिग्री सेल्सियस पर) 4% पीएफए में ठीक करें, और 30% सुक्रोज में पूरी तरह से निर्जलित करें।
- स्थिर तापमान (−20 डिग्री सेल्सियस) पर जमे हुए स्लाइसर10 का उपयोग करके 20 मिमी कोरोनल मस्तिष्क वर्गों में कटौती करें।
- लक्सोल फास्ट ब्लू (एलएफबी) धुंधला, इम्यूनोफ्लोरेसेंस और पश्चिमी धब्बा10 के लिए स्लाइस का उपयोग करें।
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Representative Results
एलपीसी के दो-बिंदु इंजेक्शन के परिणामस्वरूप अधिक टिकाऊ विघटन हुआ
एलपीसी मुख्य रूप से माइलिन और अक्षतंतु अखंडता के दरार के लिए विषाक्तता के साथ तेजी से नुकसान की ओर जाताहै 15. इंजेक्शन के दिन को दिन 0 माना जाता था। चूहों को 10-28 दिनों (10 डीपीआई और 28 डीपीआई) की अवधि के लिए रखा गया था। लक्सोल फास्ट ब्लू (एलएफबी) धुंधला10 का उपयोग इन समय बिंदुओं पर चूहों में विघटन के क्षेत्र का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। दो-बिंदु इंजेक्शन मॉडल में, शम समूह की तुलना में 10 डीपीआई पर महत्वपूर्ण डिमाइलिनेशन था, यह दर्शाता है कि एलपीसी का स्थानीयकृत इंजेक्शन कॉर्पस कॉलोसम को सफलतापूर्वक डिमाइलिनेट कर सकता है। डिमाइलिनेशन की एक अपेक्षाकृत उच्च डिग्री अभी भी 28 डीपीआई पर मौजूद है, जो दो-बिंदु एलपीसी इंजेक्शन (चित्रा 1 डी-ई) के कारण लगातार और स्थिर डिमाइलिनेशन का संकेत देती है।
माइलिन म्यान के नुकसान का मूल्यांकन करने के लिए, 10 दिनों को एक महत्वपूर्ण समय बिंदु के रूप में चुना गया था जब डिमाइलिनेशन अपेक्षाकृत स्पष्ट होता है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला नीचा माइलिन मूल प्रोटीन (डीएमबीपी) के माध्यम से, 10 डीपीआई (चित्रा 1 एफ) पर एलपीसी-इंजेक्शन समूह में डीएमबीपी की उल्लेखनीय वृद्धि देखी गई, जो कॉर्पस कॉलोसम में माइलिन हानि का प्रतिनिधित्व करती है। इसके अलावा, पश्चिमी धब्बा द्वारा एमबीपी की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए प्राप्त घाव ऊतक (चरण 4.) के प्रोटीन का उपयोग किया गया था। प्रोटोकॉल के अनुसार मॉडलिंग के बाद, एमबीपी ने एक महत्वपूर्ण नुकसान (चित्रा 1 जी) दिखाया। ये परिणाम एलएफबी और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के अनुरूप थे।
एलपीसी इंजेक्शन के 10 दिनों बाद कॉर्पस कॉलोसम में माइलिन आकृति विज्ञान इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ मनाया गया था (घाव ऊतक चरण 4 के अनुसार निकाला गया था। स्पष्ट डिमाइलिनेशन मॉडलिंग (चित्रा 2) की सफलता की पुष्टि करता है।
दो-बिंदु एलपीसी इंजेक्शन ने माइलिन पुनर्जनन को प्रभावित किया
ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स (ओएलजी) का भेदभाव और परिपक्वता एमएस में माइलिन म्यान की मरम्मत में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है माइलिन पुनर्जनन मुख्य रूप से ऑलिगोडेंड्रोसाइट अग्रदूत कोशिकाओं (ओपीसी) को माइलिनेटिंग ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स में अलग करके होता है। इस प्रकार, ओएलजी में ओपीसी के भेदभाव को अवरुद्ध करने के बाद माइलिन मरम्मत प्रक्रिया प्रभावित होगी। जीएसटी-π ओपीसी भेदभाव परिपक्वता16 का मार्कर है। एलपीसी इंजेक्शन के 10 दिनों के बाद, यह इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा देखा जा सकता है कि शम समूह (चित्रा 3 ए) की तुलना में जीएसटी -π में कमी आई है। इसी समय, ओलिगोडेंड्रोसाइट्स की प्रसार क्षमता को केआई 67 (ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स प्रसार) और ओलिग 2 (कुल ऑलिगोडेंड्रोसाइट वंश कोशिकाओं) 17,18 के अनुपात से परिलक्षित किया जा सकता है। ओलिग 2 + सह-स्थानीयकरण अनुपात 10 डीपीआई (चित्रा 3 बी) के बाद ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स के अधिक प्रसार का प्रतिनिधित्व करता है। इन छवियों से पता चलता है कि घाव क्षेत्र एलपीसी इंजेक्शन के बाद ओपीसी की परिपक्वता और प्रसार के माध्यम से मरम्मत करने का प्रयास करता है।
दो-बिंदु एलपीसी इंजेक्शन ने चूहों की स्थानिक स्मृति को बिगड़ा दिया
चूहों में एलपीसी इंजेक्शन की स्थानिक स्मृति क्षमता का विश्लेषण करने के लिए, मॉरिस वॉटर भूलभुलैया (डब्ल्यूएमएम) 19 का उपयोग किया गया था और शम और एलपीसी-इंजेक्शन चूहों के बीच तैराकी की गति में कोई अंतर नहीं दिखाया गया था। हालांकि, जब मंच मॉरिस पानी भूलभुलैया में हटा दिया गया था, तो छिपे हुए मंच को खोजने के लिए विलंबता कम हो गई थी (बिगड़ा हुआ स्थानिक सीखने), और लक्ष्य चतुर्थांश में बिताए गए समय में वृद्धि हुई (बिगड़ा हुआ स्मृति प्रतिधारण) (चित्रा 4)। परिणाम बताते हैं कि दो-बिंदु एलपीसी इंजेक्शन मॉडल में डिमाइलिनेटेड चूहों की स्थानिक स्मृति काफी बिगड़ा हुआ है। विभिन्न प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले जानवरों की संख्या तालिका 1 में सूचीबद्ध है। प्रत्येक माउस ने दिन 2 या दिन 20 से शुरू होने वाला प्रशिक्षण प्राप्त किया।
चित्रा 1: एलपीसी-प्रेरित डिमाइलिनेशन का दो-बिंदु इंजेक्शन (ए) इंजेक्शन साइटों का प्रतिनिधित्व (1.0 मिमी पार्श्व, 2.4 मिमी गहरा, और 1.1 मिमी पूर्वकाल)। (बी) इंजेक्शन साइटों का प्रतिनिधित्व (1.0 मिमी पार्श्व, 2.1 मिमी गहरा, और 0.6 मिमी पूर्वकाल)। (सी) पता लगाने के समय बिंदुओं का चित्रण। (डी) एलएफबी धुंधला के माध्यम से सफेद पदार्थ के घावों का पता लगाना। 10 दिनों के बाद इंजेक्शन (डीपीआई) और 28 डीपीआई पर एलएफबी धुंधला हो जाना, कॉर्पस कॉलोसम (स्केल बार = 200 μm) के लगातार विघटन को दर्शाता है। (ई) विभिन्न समय बिंदुओं पर डिमाइलिनेशन क्षेत्र का परिमाणीकरण। डेटा को एसडी, वन-वे एनोवा के ± मतलब के रूप में दर्शाया जाता है, जिसके बाद बोनफेरोनी के कई तुलना परीक्षण होते हैं। पी < 0.0001, एन = 6 प्रति समूह। (एफ) कॉर्पस कॉलोसम (स्केल बार = 100 μm) में डीएमबीपी इम्यूनोस्टेनिंग की प्रतिनिधि छवियां। शम की तुलना में, जिसमें लगभग कोई डीएमबीपी नहीं था, एलपीसी इंजेक्शन के बाद स्पष्ट डीएमबीपी देखा जा सकता था। (जी) एमबीपी अभिव्यक्ति का पश्चिमी धब्बा विश्लेषण। एलपीसी के इंजेक्शन के बाद एमबीपी ने एक महत्वपूर्ण नुकसान दिखाया। बेसलाइन अभिव्यक्ति को मापने के लिए लोडिंग नियंत्रण के रूप में β-एक्टिन का उपयोग किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियां एलपीसी-इंजेक्शन चूहों (स्केल बार = 1 μm) में डिमाइलिनेटेड की तुलना में शम के कॉर्पस कॉलोसम में माइलिनेटेड अल्ट्रास्ट्रक्चर की पुष्टि करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: दो-बिंदु इंजेक्शन ने ओपीसी की परिपक्वता और प्रसार को प्रभावित किया (ए) शम और एलपीसी-इंजेक्शन चूहों (स्केल बार = 20 μm) के कॉर्पस कॉलोसम में जीएसटी-π की प्रतिनिधि छवियां। लाल रंग जीएसटी-π को दर्शाता है। (बी) ओलिग 2 और केआई 67 सह-स्थानीयकरण की प्रतिनिधि छवियां (स्केल बार = 20 μm)। लाल की 67 को दर्शाता है, और हरा ओलिग 2 को दर्शाता है। छवियों को 488 एनएम और 594 एनएम लेजर लाइनों के साथ एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी सिस्टम का उपयोग करके कैप्चर किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: एलपीसी इंजेक्शन द्वारा प्रेरित स्थानिक स्मृति हानि। (ए) मंच की उपस्थिति (सीखने के चरण) में प्रत्येक समूह में चूहों के तैराकी पथ की प्रतिनिधि छवियां। (बी) मंच (स्मृति चरण) को हटाने के बाद प्रत्येक समूह में चूहों के तैराकी पथ की प्रतिनिधि छवियां। उपयोग किए गए जानवरों की संख्या तालिका 1 में सूचीबद्ध है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| समूह | धोखा | एलपीसी-समूह |
| एलएफबी धुंधला हो जाना | 6 | 12 (10 डीपीआई, 6; 28 डीपीआई, 6) |
| इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी | 4 | 4 |
| अगर | 6 | 6 |
| पश्चिमी धब्बा | 4 | 4 |
| मोरिस पानी भूलभुलैया | 12 | 12 |
तालिका 1: विभिन्न परीक्षणों के लिए उपयोग किए जाने वाले जानवरों की संख्या।
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Discussion
एमएस, सीएनएस की एक पुरानी डिमाइलिनेटिंग बीमारी, युवा वयस्कों में न्यूरोलॉजिकल शिथिलता के सबसे आम कारणों में से एक है20. नैदानिक रूप से, लगभग 60% -80% एमएस रोगी माध्यमिक-प्रगतिशील एमएस21,22 विकसित करने से पहले रिलैप्स और छूट के चक्र का अनुभव करते हैं, और यह अंततः समय23 के साथ संचयी आंदोलन हानि और संज्ञानात्मक घाटे की ओर जाता है। वर्तमान में, कोई भी एकल प्रयोगात्मक मॉडल रोग की नैदानिक, रोग, या प्रतिरक्षाविज्ञानी विशेषताओं की पूरी विविधता को कवर नहीं करताहै 24. विभिन्न चरणों में एमएस की रोग प्रक्रिया और रोगजनन का अनुकरण करने के लिए, ईएई मॉडल, जानवरों को सीपीजेड खिलाने और एलपीसी-प्रेरित डिमाइलिनेशन मॉडल सहित उनके फायदे और सीमाओं के साथ तीन सामान्य डिमाइलिनेटिंग पशु मॉडल हैं।
चूहों में, ईएई माइलिन एंटीजन के इंजेक्शन के बाद एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से प्रेरित होता है, जिसके परिणामस्वरूप माइक्रोग्लियल सक्रियण और पेरिवास्कुलर टी और बी लिम्फोसाइटों की घुसपैठ होती है, और साथ में माइलिन क्षति अक्सर रोग20,25 की पुनरावृत्ति से जुड़ी होती है। यह एमएस रिलैप्सिंग-प्रेषण अवधि की विशेषताओं का बेहतर अनुकरण करता है। हालांकि इसकी कई सीमाएं भी हैं। उदाहरण के लिए, ईएई मुख्य रूप से रीढ़ की हड्डी के सफेद पदार्थ को प्रभावित करने वाली बीमारी है, जबकि एमएस मुख्य रूप से सेरेब्रल कॉर्टेक्स के विघटन का कारण बनता है, और घावों का स्थान और समय यादृच्छिक होता है, जिससे घावों को सही ढंग से प्राप्त करना मुश्किल हो जाता है19.
सीपीजेड और एलपीसी विषाक्त-डिमाइलिनेटिंग मॉडल को प्रेरित करने के लिए सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले पदार्थ हैं। वे सभी प्रशासन के बाद सीएनएस डिमाइलिनेशन पैदा करने में सक्षम हैं। सीपीजेड मॉडल में, युवा चूहों को तांबा चेलेटर क्यूप्रिज़ोन खिलाने के परिणामस्वरूप ओलिगोडेंड्रोसाइट की मृत्यु हो गई और बाद में प्रतिवर्ती विघटन हुआ। क्यूप्रिज़ोन की वापसी के बाद, 4 दिनों26,27 के भीतर एक सहज पुनर्मिलन प्रक्रिया शुरू की गई थी। सीपीजेड के परिणामस्वरूप मुख्य रूप से व्यापक विघटन होता है, जबकि एलपीसी इंजेक्शन फोकल डिमाइलिनेशन की ओर झुकता है। विष और भड़काऊ प्रतिक्रिया के कारण, एलपीसी का क्लासिक एक-बिंदु इंजेक्शन डिमाइलिनेशन28 के तेजी से और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रूप को ट्रिगर करता है।
हालांकि, उपरोक्त मॉडलों में से कोई भी प्रगतिशील एमएस की रोग प्रक्रिया की ठीक से नकल नहीं कर सकता है जो लगातार विघटन की विशेषता है। इसलिए, वर्तमान प्रोटोकॉल दीर्घकालिक विघटन को प्रेरित करने के लिए कॉर्पस कॉलोसम में सीधे एलपीसी के दो-बिंदु इंजेक्शन के लिए एक मॉडल का प्रस्ताव करता है। प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम जानवर के सिर के क्षैतिज समायोजन और इंजेक्शन निर्देशांक का पता लगाने शामिल हैं। चरण 3.5 में, किसी को पहले ब्रेग्मा और पीछे के फोंटानेल स्तर को समायोजित करना सुनिश्चित करना चाहिए और फिर बाएं और दाएं स्तरों को समायोजित करना चाहिए। इसी समय, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि, बाएं और दाएं स्तरों को समायोजित करने के बाद, शून्य बिंदु को बाद के संचालन से पहले पुनर्स्थापित किया जाना चाहिए। यह कदम महत्वपूर्ण है क्योंकि यह सीधे स्थिति की सटीकता से संबंधित है। चरण 3.6 में, जेड-अक्ष के निर्देशांक का निर्धारण करते समय, किसी को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि सुई और खोपड़ी का अंत सटीक संपर्क में रहे, और शोधकर्ता यह देख सकता है कि सुई मुड़ी हुई है या नहीं। चरण 3.10 में, सुई सुई मार्ग से बाहर बहने से दवा को रोकने के लिए 10 मिनट के लिए जगह में रहती है।
वर्तमान प्रोटोकॉल की कुछ सीमाएं हैं। अन्य विषाक्तता-प्रेरित डिमाइलिनेटिंग मॉडल की तरह, इसमें इम्यूनोलॉजिकल प्रक्रियाओं के मॉडलिंग का अभाव है। दूसरे, हालांकि दो-बिंदु इंजेक्शन मॉडल अपेक्षाकृत लंबे समय तक डिमाइलिनेशन को बनाए रख सकता है, फिर भी यह अनिवार्य रूप से माइलिन पुनर्जनन की थोड़ी डिग्री के साथ होता है क्योंकि रोग बाद के चरण में आगे बढ़ता है। यह माइलिन ओलिगोडेंड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन (एमओजी) प्रेरित प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून एन्सेफलोमाइलाइटिस29,30 की तुलना में माध्यमिक प्रगतिशील मल्टीपल स्केलेरोसिस का अनुकरण करने के लिए अधिक उपयुक्त मॉडल नहीं हो सकता है। क्लासिक एक-बिंदु एलपीसी इंजेक्शन मॉडल केवल सहज पुनर्मिलन के साथ स्थानीयकृत भड़काऊ डिमाइलिनेशन का उत्पादन करता है। पिछले शोध से पता चला है कि एलपीसी इंजेक्शन के बाद टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं और मैक्रोफेज की घुसपैठ माइलिन मरम्मत15 में एक महत्वपूर्ण कारक है। हालांकि, क्लासिक इंजेक्शन मॉडल की तुलना में, दो-बिंदु इंजेक्शन एलपीसी मॉडल कॉर्पस कॉलोसम के तेजी से फोकल डिमाइलिनेशन को प्रेरित करता है और थोड़ा रिमाइलिनेशन के साथ लंबी अवधि के लिए डिमाइलिनेशन की डिग्री को बनाए रखता है।
एमएस की जटिलता के कारण, विभिन्न रोग चरणों को बेहतर ढंग से वर्णित करने के लिए विभिन्न मॉडलों की आवश्यकता होती है। स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम के माध्यम से एलपीसी का दो-बिंदु इंजेक्शन एक स्थिर, कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रयोगात्मक माउस मॉडल है। यह मॉडल समय के साथ कम माइलिन मरम्मत के साथ दीर्घकालिक विघटन का कारण बन सकता है। इसका मतलब है कि दो-बिंदु इंजेक्शन मॉडल का उपयोग न केवल डिमाइलिनेशन रोगों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, बल्कि माइलिन मरम्मत हस्तक्षेपों का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है। इसके अलावा, यह मॉडल इम्यूनोफ्लोरेसेंस और हिस्टोलॉजिकल विधियों के माध्यम से हस्तक्षेप के बाद आसानी से और जल्दी से डिमाइलिनेशन का मूल्यांकन कर सकता है, और एमएस की संज्ञानात्मक शिथिलता व्यवहार परीक्षण में डिमाइलिनेटेड चूहों की बिगड़ा हुआ स्थानिक स्मृति द्वारा परिलक्षित हो सकती है। अंत में, स्थिर डिमाइलिनेशन का यह मॉडल एमएस की माध्यमिक प्रगति और रिलैप्सिंग-प्रेषण एमएस दोनों पर पैथोलॉजिकल और प्रीक्लिनिकल अध्ययन की सुविधा प्रदान कर सकता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान: 82071380, 81873743) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk | Sigma-Aldrich | L4129-25MG | |
| 32 gauge Needle | HAMILTON | 7762-05 | |
| 10 μl syringe | HAMILTON | 80014 | |
| high speed skull drill | strong,korea | strong204 | |
| drill | Hager & Meisinger, Germany | REF 500 104 001 001 005 | |
| Matrx Animal Aneathesia Ventilator | MIDMARK | VMR | |
| Portable Stereotaxic Instrument for Mouse | Reward | 68507 | |
| Micro syringe | Reward | KDS LEGATO 130 | |
| Isoflurane | VETEASY | ||
| Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | |
| Phosphate buffer | BOSTER | PYG0021 | |
| LuxoL fast bLue | Servicebio | G1030-100ML | |
| Suture | FUSUNPHARMA | 20152021225 | |
| Brain mold | Reward | 68707 | |
| Electron microscope fixative | Servicebio | G1102-100ML | |
| Neutral red (C.I. 50040), for microscopy Certistain | Sigma-Aldrich | 1.01376 | |
| Anti-Myelin Basic Protein Antibody | Millipore | #AB5864 | |
| Anti-GST-P pAb | MBL | #311 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15) | Thermo Fisher Scientific | 14-5698-95 | |
| Beta Actin Monoclonal Antibody | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| Myelin Basic Protein Polyclonal Antibody | Proteintech | 10458-1-AP | |
| OLIG2 Polyclonal Antibody | Proteintech | 13999-1-AP | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34206ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | YEASEN | 34412ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34212ES60 | |
| HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | abclonal | AS014 | |
| HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | abclonal | AS003 | |
| Adult C57BL/6 male and female mice | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd |
References
- Gaire, B. P., Choi, J. W. Critical roles of lysophospholipid receptors in activation of neuroglia and their neuroinflammatory responses. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7864 (2021).
- Compston, A., Coles, A.
- Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis - a review. European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
- Mahad, D. H., Trapp, B. D., Lassmann, H. Pathological mechanisms in progressive multiple sclerosis. The Lancet Neurology. 14 (2), 183-193 (2015).
- Filippi, M., et al.
- Villoslada, P., Steinman, L. New targets and therapeutics for neuroprotection, remyelination and repair in multiple sclerosis. Expert Opinion on Investigational Drugs. 29 (5), 443-459 (2020).
- Lassmann, H.
- Franklin, R. J., Ffrench-Constant, C. Remyelination in the CNS: From biology to therapy. Nature Reviews Neuroscience. 9 (11), 839-855 (2008).
- Gentile, A., et al. Immunomodulatory effects of exercise in experimental multiple sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 2197 (2019).
- Chen, M., et al. Deficiency of microglial Hv1 channel is associated with activation of autophagic pathway and ROS production in LPC-induced demyelination mouse model. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 333 (2020).
- Luo, Q., et al. A stable and easily reproducible model of focal white matter demyelination. Journal of Neuroscience Methods. 307, 230-239 (2018).
- Blakemore, W. F., Franklin, R. J. Remyelination in experimental models of toxin-induced demyelination. Current Topics in Microbiology and Immunology. 318, 193-212 (2008).
- Degaonkar, M. N., Raghunathan, P., Jayasundar, R., Jagannathan, N. R. Determination of relaxation characteristics during preacute stage of lysophosphatidyl choline-induced demyelinating lesion in rat brain: An animal model of multiple sclerosis. Magnetic Resonance Imaging. 23 (1), 69-73 (2005).
- Baydyuk, M., et al. Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).
- Plemel, J. R., et al. Mechanisms of lysophosphatidylcholine-induced demyelination: A primary lipid disrupting myelinopathy. Glia. 66 (2), 327-347 (2018).
- Nave, K. A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).
- Liu, Z., et al. Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms. Developmental Biology. 302 (2), 683-693 (2007).
- Kassis, H., et al. Histone deacetylase expression in white matter oligodendrocytes after stroke. Neurochemistry International. 77, 17-23 (2014).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Morris water maze: Procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nature Protocols. 1 (2), 848-858 (2006).
- Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination. Brain. 129, Pt 8 1972-1983 (2006).
- Karussis, D. The diagnosis of multiple sclerosis and the various related demyelinating syndromes: A critical review. Journal of Autoimmunity. 48-49, 134-142 (2014).
- Kamma, E., Lasisi, W., Libner, C., Ng, H. S., Plemel, J. R. Central nervous system macrophages in progressive multiple sclerosis: Relationship to neurodegeneration and therapeutics. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 45 (2022).
- Kutzelnigg, A., et al. Cortical demyelination and diffuse white matter injury in multiple sclerosis. Brain. 128, Pt 11 2705-2712 (2005).
- Lassmann, H., Bradl, M. Multiple sclerosis: Experimental models and reality). Acta Neuropathologica. 133 (2), 223-244 (2017).
- Lamport, A. C., Chedrawe, M., Nichols, M., Robertson, G. S. Experimental autoimmune encephalomyelitis accelerates remyelination after lysophosphatidylcholine-induced demyelination in the corpus callosum. Journal of Neuroimmunology. 334, 576995 (2019).
- Torkildsen, O., Brunborg, L. A., Myhr, K. M., Bo, L. The cuprizone model for demyelination. Acta Neurologica Scandinavica. Supplementum. 188, 72-76 (2008).
- Zhan, J., et al. The cuprizone model: Dos and do nots. Cells. 9 (4), 843 (2020).
- Torre-Fuentes, L., et al. Experimental models of demyelination and remyelination. Neurologia (Barcelona, Spain). 35 (1), 32-39 (2020).
- Merkler, D., et al. Myelin oligodendrocyte glycoprotein-induced experimental autoimmune encephalomyelitis in the common marmoset reflects the immunopathology of pattern II multiple sclerosis lesions. Multiple Sclerosis Journal. 12 (4), 369-374 (2006).
- Ucal, M., et al. Widespread cortical demyelination of both hemispheres can be induced by injection of pro-inflammatory cytokines via an implanted catheter in the cortex of MOG-immunized rats. Experimental Neurology. 294, 32-44 (2017).
