En intra-vævs radiometrimikroprobe til måling af udstråling in situ i levende væv

Summary

I denne artikel beskrives en metode til måling af udstråling in situ i levende væv. Dette arbejde omfatter detaljer om konstruktionen af mikroskalasonder til forskellige målinger af udstråling og bestråling, giver vejledning til montering af væv til karakterisering af udstråling og skitserer beregningsmetoder til analyse af de resulterende data.

Abstract

Organismer virker uigennemsigtige, hovedsageligt fordi deres ydre vævslag spredes stærkt til indfaldende lys; Stærkt absorberende pigmenter, såsom blod, har typisk smalle absorbanser, således at den gennemsnitlige frie vej af lys uden for absorbanstoppene kan være ret lang. Da folk ikke kan se gennem væv, forestiller de sig generelt, at væv som hjerne, fedt og knogle indeholder lidt eller intet lys. Imidlertid udtrykkes fotoresponsive opsinproteiner i mange af disse væv, og deres funktioner forstås dårligt. Udstråling internt i vævet er også vigtigt for forståelsen af fotosyntese. For eksempel absorberer gigantiske muslinger stærkt, men opretholder alligevel en tæt population af alger dybt i vævet. Lysudbredelse gennem systemer som sedimenter og biofilm kan være kompleks, og disse samfund kan være store bidragydere til økosystemets produktivitet. Derfor er der udviklet en metode til konstruktion af optiske mikrosonder til måling af skalar bestråling (fotonflux, der skærer et punkt) og downwelling bestråling (fotonflux, der krydser et plan vinkelret) for bedre at forstå disse fænomener inde i levende væv. Denne teknik kan også trækkes i feltlaboratorier. Disse mikrosonder er fremstillet af varmetrukne optiske fibre, der derefter fastgøres i trukne glaspipetter. For at ændre sondens vinkelaccept fastgøres derefter en 10-100 μm stor kugle af UV-hærdelig epoxy blandet med titandioxid til enden af en trukket, trimmet fiber. Sonden indsættes i levende væv, og dens position styres ved hjælp af en mikromanipulator. Disse sonder er i stand til at måle in situ vævsudstråling ved rumlige opløsninger på 10-100 μm eller på skalaen af enkeltceller. Disse sonder blev brugt til at karakterisere lyset, der nåede fedt- og hjernecellerne 4 mm under huden på en levende mus og til at karakterisere lyset, der nåede lignende dybder i levende algerige kæmpemuslingevæv.

Introduction

Overraskende nok har landdyr og lavvandede havboere nok lys i deres krop til visuel fysiologi og endda fotosyntese. For eksempel dæmpes lysniveauerne i midten af musens hoved (uden for de stærke hæmoglobinabsorbansbånd) med tre eller fire størrelsesordener i forhold til omverdenen. Dette er omtrent forskellen mellem lysniveauerne indendørs og udendørs. Så opaciteten af et væv eller materiale på grund af stærk spredning er ikke det samme som opacitet på grund af stærk lysabsorption. Lys kan blive ved med at forplante sig over lange afstande i et stærkt fremadrettet spredningssystem, svarende til lys, der formerer sig gennem akvatiske systemer med høje koncentrationer af celler og partikler¹. Denne observation er særlig fremtrædende i lyset af det faktum, at opsinproteiner næsten allestedsnærværende udtrykkes i alle væv fra alle dyr. Det er således vigtigt at forstå, hvordan og hvor lys dæmpes og spredes i levende væv. I modsætning til akvatiske systemer med levende væv er det imidlertid umuligt at nedsænke et instrument i vandsøjlen og opnå udstrålings- og bestrålingsmålinger, og en ny teknik er nødvendig.

Andre metoder, der tidligere blev brugt til at karakterisere levende vævs absorptions- og spredningsegenskaber, omfatter måling af vævsreflektionssonder og / eller integrerende kugler^2,3, mikroskopiske metoder såsom scanning konfokal mikroskopi^4, måling af diffusion af laserlys på overfladen⁵ og modelleringsteknikker såsom Monte Carlo strålingsoverførsel⁶. De nævnte eksperimentelle metoder kræver ofte specifikt, stort og dyrt udstyr eller detaljeret viden om vævsstruktur og er generelt begrænset i deres evne til at karakterisere lysets rumlige struktur dybt inde i vævet.

Der er også lignende sondebaserede metoder, der bruger en hypodermisk nål til at indsætte en optisk fiber gennem væv ^7,8,9. Det er vores erfaring, at modificerede nåle er effektive til at punktere væv, men kræver betydelig kraft og generelt river sarte væv i stykker, når de passerer gennem tætpakkede celler. Derfor kræver disse nåle generelt en kirurgisk procedure for at indsætte mere end en millimeter eller deromkring i et vævslag. Metoden beskrevet her, ved hjælp af en smurt, trukket glasstøtte, er i stand til at glide mellem celler med minimal såring af vævet og uden yderligere kirurgi.

Dette manuskript præsenterer en metode inspireret af Jorgenson og kollegers arbejde med at måle lys i algemåtter^10,11 ved hjælp af glasunderstøttede optiske mikroprober og bærbar elektronik, der er egnet til at sondere dybt ind i tæt væv og til konstruktion og brug i marken. Disse sonder kan konstrueres til at karakterisere skalar indstråling (lys, der rammer et punkt fra alle retninger) og downwelling udstråling (lys, der skærer et vandret plan) inde i levende væv ved høje rumlige opløsninger. Disse sonder blev oprindeligt udviklet til at måle strålingsoverførsel i vævet af fotosymbiotiske kæmpemuslinger¹². Standardmålinger af absorption og transmission af det samlede væv var ikke nok til at karakterisere vævets fotosyntetiske ydeevne, da det gør en stor forskel, om alt det indfaldende lys absorberes af nogle få celler, der oplever høj intensitet på overfladen af vævet, eller mange celler, der oplever lave intensiteter i hele vævets volumen. I et andet projekt blev disse sonder brugt til at måle in vivo bestråling i en mus' hjerne^13,14 og derved karakterisere lysmiljøet af opsiner udtrykt dybt inde i hjernen. Disse mikrosonder er både små og følsomme nok til at måle bestråling i musehjernevæv med al pels, hud og knogler intakte og demonstrere, at fysiologiske lysniveauer let er høje nok til at stimulere dybe hjerneopsiner.

Denne mikrooptiske sonde og måleopsætning kan være nyttig for forskere, der har brug for at kvantificere og karakterisere lyset internt i biologisk væv, især for en mere nuanceret forståelse af fotosyntese eller funktionerne af visuelle pigmenter udtrykt uden for øjnene. Denne metode kan bruges alene eller sammen med andre teknikker til fuldt ud at karakterisere de optiske egenskaber og lysudbredelse i levende væv til en lav pris, med lille bærbart udstyr indbygget internt og med opgaveafhængige justerbare parametre.

Protocol

Denne undersøgelse er i overensstemmelse med alle de relevante etiske regler fra Yale University vedrørende forskning i hvirveldyr og hvirvelløse dyr.

1. Opbygning af den optiske mikrosonde

1. Opbygning af glashylster, materiale: Pasteurpipette, 5,75 tommer (se materialetabel)
   1. Brug en monterbar alligatorclips (materialetabel) til at montere glaspipetten i den brede ende, så den koniske ende vender nedad mod gulvet, og pipettens retning er vinkelret på gulvet.
   2. Hæng et 50 g plastikskruestik (materialebord) fra pipettens koniske ende. Anbring en pude med elektrisk tape mellem pipetten og skruestikgrebet for at forhindre glidning.
   3. Opvarm den koniske ende af pipetten ved hjælp af en lille butanbrænder (materialetabel). Påfør flammen 1 cm over skruestikgrebet. Hold brænderen, så den klareste del af flammen er 3 cm fra glasset, og glasset er ved spidsen af flammen. Når pipettens længde er øget med ca. 5 tommer, fjernes flammen straks.
   4. Brug en lille saks eller en glasskærer til at trimme pipettens aftrukne ende på det sted, hvor den nye trækdiameter er omtrent dobbelt så stor som den optiske fiber, der bruges i næste afsnit (se trin 1.2). Arkiver eventuelle skarpe områder af den trimmede ende ved hjælp af carborundumpapir (materialetabel). Skyl eventuelle resulterende små glasskår eller støv væk med en sprøjteflaske isopropylalkohol efterfulgt af trykluft.
2. Træk i den optiske fiber (figur 1D)
   1. Brug et barberblad til at adskille den optiske fiber, fjern et SMA-stik med en SMA-termineret optisk fiber med en diameter på 200 μm (materialetabel). Klip tæt på en af SMA-afslutningerne. Brug derefter barberbladet til at fjerne de næste 5 cm plast- og glasfiberkappe, så den blotte optiske fiber udsættes og stikker ud fra resten af den intakte samling.
   2. Brug butanbrænderen til at brænde polyimidpolymerbelægningen fra glasfiberen. Skyl med isopropanol. Tør den bare glasfiber ren med en fnugfri serviet.
   3. Det næste skridt er at montere den bare fiber, så den også kan trækkes med en flamme. Monter den bare ende af den optiske fiber direkte i en tangklemme (Table of Materials) på et bord eller en hyldekant, så den SMA-terminerede ende af fiberen hænger mod gulvet. Tilføj vægtene til træk i form af to små klemmer (samlet vægt: 10 g) på den kappede ende af fiberen ca. 12 ned fra, hvor den blotte optiske fiber holdes i tangklemmen.
   4. For at trække fiberen skal du starte med butanbrænderflammen tændt. Når flammen er tændt, skal du holde butanbrænderen 1 cm fra den bare fiber, så flammen er vinkelret på den optiske fiber og 3 cm lodret ned, hvorfra tangklemmen holder den bare fiber. Lad fiberen strække sig, trække, adskille og falde til gulvet.
   5. Undersøg den resulterende trukne optiske fiberende. Slib forsigtigt ujævnheder væk med carborundumpapir, rengør med isopropylalkohol og en fnugfri serviet, og tør med trykluft.
      BEMÆRK: På dette tidspunkt kan man bruge et mikroskop til at karakterisere og dokumentere størrelsen og formen af den trukne fiber.
   6. Brug en filmopaquing pen til at mørkere siderne af fiberen og forhindre indtrængen af omstrejfende lys (Tabel over materialer). Træk forsigtigt fiberen hen over spidsen af pennen, så kun et lille område ved spidsen er udækket.
3. Montering af den trukne fiber inde i glaspipettebøsningen (figur 1A)
   1. Under et stereomikroskop indsættes forsigtigt den koniske optiske fiber fra trin 1.2 i den brede ende af den ændrede glaspipette fra trin 1.1 og skubbes fiberen igennem, indtil ~1 mm bar fiber stikker ud af pipettens koniske ende.
   2. Brug elektrisk tape til at fastgøre den kappede ende af den optiske fiber til pipettens brede ende.
   3. Sæt en dråbe cyanoacrylatklæbemiddel på en lille nål (materialetabel). Rør forsigtigt klæbedråben til den afskårne kant af den trukne pipette, undgå den blotte ende af den trukne fiber.
   4. Lad kapillær virkning transportere klæbemidlet ind i pipetten og fugte området mellem pipettens væg og den optiske fiber. Lad klæbemidlet hærde i mindst 15 minutter, før sondeenheden flyttes.
4. Ændring af fiberspidsen med en spredningskugle (figur 1C)
   1. Opret råmaterialet til spredningskuglespidsen ved at blande en dråbe UV-hærdeligt klæbemiddel med titandioxidpulver (materialetabel) ved ~ 1: 1 v / v.
   2. Fastgør sonden til en mikromanipulator med en monteringsstangholder (materialetabel), således at sonden er i vandret retning. Der fremstilles en arbejdsbeholder af spredningsmaterialet ved at dyppe spidsen af en tråd eller nål i den ovenfor fremstillede klæbemiddel/_{TiO2-blanding} , således at der dannes en dråbe klæbemiddel. Monter ledningen eller nålen med dråben nær spidsen af den vandrette sonde. Det er praktisk at gøre dette ved hjælp af et alligatorklip monteret på bænken.
   3. Deponer en spredningskugle på spidsen af sonden. Brug mikromanipulatoren til langsomt og forsigtigt at skubbe spidsen af sondens optiske fiber ind i dråben af klæbemiddel/TiO₂. Træk derefter hurtigt spidsen ud af limen. Gentag to til tre gange, indtil en sfærisk dråbe klæbemiddel af den ønskede størrelse er deponeret på spidsen af den optiske fiber.
      BEMÆRK: Spredningskuglen vil være stabil ved diametre fra to til otte gange større end diameteren af den koniske optiske fiber. Den endelige optimale størrelse afhænger af den endelige ønskede anvendelse.
   4. Hærd kuglen ved at forbinde den SMA-terminerede ende af den optiske fiber til en fiberkoblet UV-lyskilde (materialetabel).
      BEMÆRK: Lyskilden, der blev brugt i denne undersøgelse, havde en effekt på 5,3 mW. Ved denne effekt er den anbefalede hærdetid mindst 12 timer eller natten over. Efter hærdning er det et godt tidspunkt at karakterisere og måle størrelsen af den endelige optiske sondespids.

2. Klargøring og montering af vævet til optiske målinger (figur 2 og figur 3)

1. Forbered opvasken til at montere prøverne til et eksperiment. Opvarm den store ende af en Pasteur-pipette ved hjælp af en butanbrænder for at lave et slag for at smelte et hul på 0,5 cm i diameter i bunden af en 35 mm x 10 mm plast petriskål. Forsegl hullet på undersiden af skålen med elektrisk tape eller laboratorietape. Lav flere ad gangen for effektivitet.
2. Forbered flydende gelatine (materialetabel) i henhold til instruktionerne på pakken.
   BEMÆRK: Kommerciel smagsfri gelatine af fødevarekvalitet fra købmanden er bedre til dette formål end gelatine af kemisk kvalitet fra kemiske leverandører, fordi gelatinen af kemisk kvalitet er mindre optisk klar og mindre mekanisk pålidelig end fødevareproduktet.
3. Udfør dissektion og forberedelse af vævet, der skal bruges.
   BEMÆRK: Erfaringsmæssigt kan ethvert fladt væv op til 1 cm tykt måles med succes i dette eksperiment ved hjælp af enhver dissektionsteknik, der passer til det pågældende system. For kæmpe muslingevæv blev en 8 mm biopsistans brugt til at lave en flad, regelmæssig cirkel af muslingevæv til brug i eksperimentet¹². For dette system kunne kun én prøve effektivt forberedes ad gangen i betragtning af den tid, det tager at gennemføre en måling for at sikre, at prøven stadig var i naturtro tilstand ved forsøgets afslutning.
4. Fyld to petriskåle fra trin 2.1 en fjerdedel af vejen med den flydende gelatine, og lad afkøle til stuetemperatur (RT) lige før gelering. I en skål placeres biopsien i puden af tyktflydende gelatine, der dannes i hullet i bunden af skålen. Brug en Pasteur-pipette til forsigtigt at tilføje RT-gelatine omkring biopsi, indtil petriskålen er fuld (figur 3). Fyld den anden skål med gelatine for at lave en tom prøve.
5. Sæt prøveskålene i køleskab i ca. 10-30 minutter, indtil gelatinen er helt hærdet og let elastisk at røre ved.
   BEMÆRK: I et køligt rum er dette muligvis ikke nødvendigt; Når du arbejder i troperne, er dette trin nødvendigt for fuldt ud at helbrede gelatinen.
6. Lav en montering til petriskålen på mikromanipulatoren (figur 2)
   1. Skær en 6 cm x 6 cm firkant på 1/4 i tykt plexiglas (Materialetabel).
   2. Bor eller smelt et hul i plastfirkanten med samme diameter som petriskålen (~35 mm). Sørg for, at petriskålen sidder tæt i dette hul og holdes på plads med friktion. Tilsæt tape til skålens kanter for lidt at øge størrelsen og friktionskontakten.
   3. Bor eller smelt et hul på 1/4 i diameter i hjørnet af plastfirkanten. Brug dette hul til at fastgøre firkanten til mikromanipulatoren ved hjælp af en 1/4 tommer skrue og bolt.
   4. Dæk plastfirkanten med sort elektrisk tape for at reducere det omstrejfende lys, der når sonden. På samme måde skal du bruge tape til at skabe et nederdel rundt om siderne af firkanten, der strækker sig under bunden af den indsatte skål (>10 mm) for at reducere vildfarende lys (figur 2B).
   5. Brug en bolt og passende hardware til at fastgøre petriskålholderen til en mikromanipulator, der giver mulighed for tredimensionelle justeringer og velopløst lodret bevægelse over et omfang, der er større end tykkelsen af prøverne (del 1 og del 2 af manipulatoren nævnt i materialetabellen er gode eksempler). Fastgør denne mikromanipulator til et optisk brødbræt.

3. Måleopsætning for vævsbiopsier

1. Over måleområdet anbringes en lyskilde således, at lyset kolliderer, når det når det plan, hvor prøveemnet skal placeres (figur 2A). Fastgør f.eks. en 5 cm kollimerende linse (materialetabel) til en 5 mm flydende lysguide (materialetabel), og løft over prøven med >0,6 m ved hjælp af en skruestik og ramme, der er fastgjort til et optisk brødbræt (materialetabel). Tilslut derefter lysstyret til en bredbåndslyskilde, såsom plasmalyskilden, der er angivet i materialetabellen.
2. Fastgør sonden til en lodret orienteret holder, så den peger mod lyskilden. Fastgør sonden med klemmer, slangeklemmer eller tape til en optisk bordstolpe.
   BEMÆRK: I det gigantiske muslingeeksperiment anvendes en specielt designet stangholder, såsom mikromanipulatoren, der er anført i materialetabellen. I dette arbejde blev det fastgjort med magneter til et optisk brødbræt (materialebord). De ekstra frihedsgrader til justering, der opnås ved at have både sonden og prøven på manipulatorer, er praktiske, men ikke påkrævet. Pas på ikke at klemme for meget fast på stolpen, da dette kan ødelægge pipettehuset.
3. Prøvemanipulatoren placeres i nærheden af den lodret monterede sonde. Brug prøvemanipulatoren til at justere prøvetrinnets position, så sonden er centreret i 0,5 cm åbningen i bunden af petriskålen. Vær yderst forsigtig for at undgå at røre ved eller støde spidsen af den monterede sonde.
   BEMÆRK: Et boommonteret stereomikroskop placeret over prøveområdet kan være nyttigt. På denne måde kan top-down-justeringen af sondespidsen, stadiet og prøven ses, før et eksperiment startes (figur 2A).
4. Tilslut den SMA-terminerede ende af sondens optiske fiber til et USB-fiberoptisk spektrometer (materialetabel), og tilslut spektrometeret til computeren ved hjælp af et USB-kabel.

4. Dataindsamling

1. Eksperimentel opsætning
   1. Hav sonden og manipulatorerne i den nøjagtige position, hvor dataene indsamles, som i trin 3.4.
   2. Brug en vatpind eller finmålernål til forsigtigt at påføre en lille mængde silikonesmøremiddel (materialetabel) på den del af sonden, der indsættes i vævet for at sænke friktionen mellem sondens sider og vævsprøven. Påfør silikonesmøremidlet igen før hver baseline- eller vævsmåling.
   3. Fjern tapen, der dækker hullet i den blinde petriskål, og anbring den i prøveholderen (trin 2.7), og sørg for, at den holdes sikkert på plads ved friktion.
   4. Brug mikromanipulatoren til at sænke prøven ned på sonden. Lad sonden trænge ind i gelatinen via hullet på undersiden af petriskålen. Fortsæt, indtil sonden er ca. 5 mm fra bunden af gelatinelaget.
   5. Tænd for lyskilden. Brug spektrometersoftwaren til at justere spektrometerintegrationstiden, indtil signalet er så højt som muligt, men ikke mættet. Indstil antallet af gennemsnitlige scanninger mellem to og fem og udjævningspixelværdien til seks. Brugbare integrationstider på dette trin kan variere mellem 1-50 ms for denne baseline.
2. Indsamling af referencespektre
   1. Saml en mørk måling.
      1. Når spektrometerparametrene er indstillet med blindprøven, skal du løsne sondefiberen fra spektrometeret og dække porten med det uigennemsigtige metaldæksel, der fulgte med spektrometeret.
      2. Få en mørk måling fra spektrometeret (ofte ved hjælp af det mørke lyspæreikon i GUI) for at karakterisere spektrometerets støj uden indgangslys. Gem denne måling i henhold til dataindsamlingsstrategien.
   2. Saml en lampemåling. Tilslut sondefiberen til spektrometeret igen, vent på, at signalet stabiliseres, og få et andet spektrum. Denne måling karakteriserer lyset, der når sonden gennem gelatinen i fravær af væv.
3. Indsamling af vævsspektre
   1. Fjern tapen i bunden af petriskålen, og læg den i prøveholderen.
   2. Juster prøveskålen med sonden ved hjælp af tredimensionel manipulation, så vævsbiopsien er centreret over spidsen af sonden.
   3. Der påføres silikonegel på sonden (se 4.1.2), og prøven sænkes langsomt ned på sonden, indtil sondespidsen har passeret gennem gelatinen, der understøtter vævsprøven, og netop er kommet ind i vævsprøven.
      BEMÆRK: Nogle spektrometre og computerprogrammer tillader realtidsovervågning af det detekterede lys. Brug dette til at bestemme, hvornår sonden kommer ind i vævet. Spektrumintensiteten vil brat falde, så snart sondespidsen er i direkte kontakt med vævet.
   4. Kontroller, at integrationstiden er passende for målingen ved at sikre, at det målte spektrum hverken er for støjende eller mættet. Skift integrationstiden, hvis det er nødvendigt.
      1. Hver gang integrationstiden justeres, skal du udføre og gemme en ny mørk måling (trin 4.2.1). Du må ikke ændre antallet af gennemsnitlige scanninger eller antallet af udjævnede pixel.
      2. Når du har fundet passende måleparametre, skal du foretage målingerne og gemme spektret.
   5. Flyt prøven ned i en bestemt afstand ved hjælp af mikromanipulatoren. For manipulatoren, der blev brugt til denne undersøgelse, var hvert lille flueben 0,001 in eller 25,4 μm. Prøven blev flyttet ned gennem fem flueben eller 127 μm for hver måling. Gentag trin 4.3.4.
   6. Fortsæt med at gemme spektrene i hver lodret position i vævet.
      BEMÆRK: For det her beskrevne system varierede de krævede integrationstider mellem 1 ms og 5 s for målingerne i en enkelt vævsprøve. Til sidst vil sondespidsen forlade toppen af vævet og være synlig der (figur 4A). Dette er den endelige måling og karakteriserer lyshændelsen øverst i vævet.
4. Indlæsning og behandling af data
   1. Brug spektrometerets software til at konvertere alle de indsamlede spektre (mørke spektre, lampespektre og vævsmålinger) til afgrænsede tekstfiler.
   2. Brug Matlab eller et valgt kodesprog til at indlæse alle målefilerne til en prøve. For hvert vævsmålespektrum trækkes det mørke spektrum fra med den matchende integrationstid, og divideres det derefter med integrationstiden.
      BEMÆRK: I denne undersøgelse blev der brugt et Matlab-script til indlæsning og behandling af dataene (supplerende fil 1).
   3. Beregn procentdelen af indfaldende lys, der når hver position i vævet, ved at dividere spektrene opnået med sonden inde i vævet med baselinespektret opnået i tom gelatine.
      BEMÆRK: Målingen øverst i vævet (trin 4.3.6) skal være meget lig baselinemålingen i gelatine (trin 4.1) og bør, når den opdeles, være tæt på 100%. Afhængigt af den eksperimentelle kontekst kan enten lampespektrum (spektret fra tom gelatine eller det fra toppen af vævet) bruges som reference. Det er dog stadig vigtigt at indsamle et lampespektrum, inden eksperimentet påbegyndes. Dette skyldes, at hvis sonden går i stykker, eller eksperimentet på anden måde mislykkes, før det når toppen af vævet, er de data, der er opnået før fejlen, stadig brugbare, hvilket ikke er tilfældet, hvis der ikke er noget tilsvarende indledende lampereferencespektrum.
   4. Visualiser dataene; konturplots kan være nyttige (figur 4B).

Representative Results

Denne protokol beskriver proceduren for konstruktion af en mikrooptisk sonde, der kan bruges til at måle downwelling-bestrålingen (lyset når et punkt fra en retning) eller, med tilføjelse af en lysspredende sfærisk spids, til at måle skalarbestrålingen (lyset når et punkt fra alle retninger). Disse sonder kan måle bestråling ved rumlige opløsninger, der nærmer sig længdeskalaerne for enkeltceller inde i levende væv. Denne protokol beskriver også en repræsentativ metode til forberedelse af en vævsprøve til bestrålingsmålinger ved hjælp af den beskrevne sonde og en repræsentativ metode til datavisning og analyse.

Figur 1 viser outputtet fra mikrosondeproduktion. Når den trækkes, skal den optiske fiber tilspidses i ca. 3 cm og ikke have ridser langs konusen. Det skal også være fladt i slutningen og have en diameter på 15-30 μm (figur 1D). Spidsens fladhed kan forbedres ved at slibe enden med karborundumpapir eller score og bryde igen. På samme måde bør den trukne glaspipette, der anvendes som fiberens hus, ikke have skarpe eller ødelagte kanter. Når spredningskuglen dannes på enden af fiberens flade, afskårne spids, skal den være sfærisk (figur 1C). Før hærdning kan misdannede fjernes ved en anden runde med at indsætte kuglen i moderklæbedråben og hurtigt trække fiberen ud. En hurtig bevægelseshastighed trækker limkuglen fra enden af fiberen. Langsommere bevægelser resulterer i yderligere klæbende bygning på fiberen. At se processen ved hjælp af et dissekerende mikroskop, mens fiberen er fastgjort til en lyskilde, er nyttigt til at visualisere arbejdet og afgøre, om processen fungerer. Det er vigtigt at fastgøre fiberen inde i glaspipetten med lim og elektrisk tape, inden spredningslimet påføres; Ellers kan fiberen gå i stykker, eller klæbemidlet kan smøre med den skiftende fiber (figur 1).

Figur 2 viser måleapparatet. I dette eksempel har holderne til både vævsprøven og sonden justeringsmuligheder i tre dimensioner (figur 2). Fastgørelse af både prøven og sonden til manipulatorer hjælper med justeringen, men er ikke afgørende; Sonden kunne fastgøres til en stationær stolpe. Manipulatorernes mest opløste bevægelser skal orienteres i lodret z-retning, således at positionen i vævet og/eller den mængde, sonderne bevæger sig, kan bestemmes nøjagtigt (figur 2A). Et boommonteret stereomikroskop kan være nyttigt, når det placeres således, at man kan se scenen, sonden og prøven gennem okularet for at kontrollere sondens justering med scenen, skålen og prøven (figur 2B). Det er nyttigt at se spektrene i realtid, mens prøven sænkes ned på sonden, fordi hvis spektret målt af sonden pludselig ændres, tyder dette på, at prøven med succes er placeret inde i det stærkt spredte eller absorberende væv, eller at sonden bøjer eller bryder. Abrupte skift i form og intensitet af spektret indikerer sandsynligvis vævsindtræden, mens pludselige intensitetsændringer uden en ændring i form tyder på, at sonden bøjer eller går i stykker. På toppen af muslingevævet er der en tynd klar membran, som sonden ikke kan trænge igennem uden at bryde. I et tilfælde som dette skal toppen af vævet overvåges for at se, hvornår sonden er ved at komme ud, og målingerne skal stoppes på det tidspunkt, så sonden ikke går i stykker.

Figur 3 viser vævsbiopsiprøven indlejret i en petriskål med gelatine, som beskrevet i punkt 2. Der er et hul i bunden af petriskålen for at tillade den optiske sondes indsættelse i vævet nedenunder. Biopsien er 8 mm i diameter og centreret over hullet i petriskålen (figur 3A). Der er en lille mængde gelatine under vævsprøven, og gelatinen fyldes til toppen af skålen over vævet (figur 3B).

Figur 4A viser sonden, når den begynder at forlade toppen af vævet, og figur 4B viser de repræsentative data. Et Matlab-script (supplerende fil 2) blev brugt til at generere sporingerne i figur 4B. X-aksen er bølgelængden, og y-aksen er procentdelen af lys i en vævsdybde i forhold til basislinjespektret. Individuelle målinger for vævsdybde er angivet med linjerne med gråskalafarve. Målinger taget dybere i vævet er repræsenteret af en mørkere linje. Baselinespektret er målingen i en prøve kun med gelatine og bruges til at karakterisere lampen og sondens reaktion på lampen. Gelatine har let absorption og spredning, hvilket betyder, at signalet for gelatineabsorption mod bølgelængde ikke er helt fladt. Derfor divideres spektrene i hele vævet enten med sondens spektrum i gelatine eller med sondens spektrum øverst i vævet, således at spektraldataene vist i figur 4B kun repræsenterer procentdelen af lys for vævsprøven og således er uafhængige af lyskilden. gelatinen og specifikationerne for hver enkelt sonde.

Figur 1: Stadier af fremstilling af den mikrooptiske intravævssonde . (A) Et skema over den optiske sonde. B) Afbildning af den færdige optiske sonde. (C) Et nærbillede af spredningskuglen, der er fastgjort til den udtrukne optiske fiber inde i glaspipetstøtten. (D) Den trukne og rensede optiske fiber. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Billeder og diagrammer af forsøgsopstillingen til måling af skalar bestråling inde i vævet. (A) Et overordnet skema og billede af forsøgsopstillingen. (B) Et nærbillede af prøven af petriskålholderen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Muslingevævsbiopsi . (A) Øverste og (B) sidebillede af en biopsi af muslingevæv, der er klar til at blive målt i den ændrede petriskål fyldt med gelatine. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Repræsentative data . (A) Mikroskopbillede af, hvordan sonden ser ud, når den kommer op gennem vævet. B) Repræsentative data opnået med intravævssonden. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende fil 1: Matlab-script, der bruges til indlæsning og behandling af dataene. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: Matlab-script, der bruges til at generere sporingerne i figur 4B. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Denne protokol beskriver en teknik til systematisk karakterisering af det optiske miljø gennem et stort volumen levende væv med en rumlig opløsning omtrent på skalaen af enkeltceller. Denne billige, fleksible og feltanvendelige metode kan være nyttig for enhver forsker, der studerer udbredelsen af lys inden for levende systemer. Fra erfaring, sammenlignet med eksisterende metoder⁷, kræver disse sonder lidt mere øvelse og dygtighed at opbygge, men resulterer i mindre vævsskade og evnen til mere omfattende at karakterisere større mængder tæt væv.

Denne metode består af fire dele. Den første del, bygningen af sonden, var inspireret af tidligere enhedsdesign^10,11. Den nuværende tilgang blev udviklet til systematiske, mindre destruktive scanninger af hele tykt væv, da den trukne glasnål forsigtigt kan glide mellem celler. Det kan også bruges i et feltlaboratorium^12,13,14. Denne protokol resulterer i sonder med ~20 μm diameter spidser til måling af downwelling udstråling og en valgfri 50-100 μm diameter spredningskugle til måling af skalar bestråling. Større eller mindre skalarbestrålingskugler kan udvikles ved at ændre de anvendte materialer, for eksempel et UV-hærdeligt klæbemiddel med en anden indledende viskositet. Vægten i både pipettetrækningen og fiberprocessen kan justeres, så den resulterer i mere eller mindre tilspidsning. Opvarmningshastigheden kan også ændres gennem afstanden fra fakkelflammen for at justere trækprocessen og den resulterende konus.

Sondekonstruktionsteknikken kræver nogle manuelle færdigheder og forsøg og fejl for at perfektionere, men kan blive pålidelig og hurtig med øvelse. Her præsenteres nogle fejlfindingsnuancer udviklet over tid. At trække den optiske fiber ned fra den kappede ende resulterer i mere ensartede tilspidsninger. Det er vigtigt at påføre den uigennemsigtige pen, før du tilføjer den sfæriske spredningsspids, da befugtningsegenskaberne for det uigennemsigtige blæk positivt påvirker dannelsen af en ryddelig klæbekugle ved fiberspidsen. Hvis den resulterende klæbekugle er forkert formet, er det muligt at trække den af og prøve igen. For at gøre dette kan mikromanipulatoren bruges til at skubbe hele kuglen ind i klæbemiddelbeholderen og derefter trækkes meget langsomt tilbage. Dette trækker normalt det første, misdannede forsøg af, efterlader det i klæbemiddelbeholderen og gør det muligt at prøve igen.

Behandlet med omhu kan disse sonder bruges gentagne gange til forskellige prøver. Den største fare er ved et uheld at banke sondespidsen ind i noget, mens du flytter den. Mellem målingerne skal de rengøres for cellulært affald ved hjælp af isopropylalkohol og trykluft. Sonderne kan også opbevares i uger, så længe sondespidsen ikke rører ved noget, og der er ingen kræfter på den fiberoptiske samling, der kan trække båndet og limen, der holder sonden inde i glasbøsningen, fra hinanden. Dette kan opnås ved at fastspænde fiber- og glaspipetten flere steder til kanten af en høj hylde.

Den anden og tredje del af denne metode involverer de mekano-optiske aspekter af eksperimentet og sikring af vævet til måling. Denne del af metoden blev udviklet specielt til måling af skalarbestråling inden for væv inde i kæmpemuslingevæv¹². Her præsenteres detaljer om fejlfinding af disse aspekter af metoden. For det første bør biopsien være stor i forhold til sonden. Dette forhindrer sonden i at bevæge vævet, når det transiterer. Derudover skal vævet sidde på bunden af petriskålen, så gelatinens elasticitet og vægt kombineres for at holde vævet på plads under målingen. Det er også vigtigt, at rummet er køligt nok til at opretholde gelatinen i en elastisk, fast tilstand under den eksperimentelle lyskilde. Tilsvarende, det hjælper at bruge en LED eller anden kilde med forholdsvis lidt varmeudvikling i forhold til synligt lys.

Metodens geometriske og optomekaniske parametre er meget fleksible. For eksempel blev den skalære bestrålingssonde brugt til at måle bestråling inde i en intakt mus' hjerne og fedtvæv^13,14. For at gøre dette blev sonden monteret på manipulatorerne på en standard gnaverstereotaktisk ramme, og lyskilden blev monteret pegende mod musens talerstol. I enhver geometri er nøglen til en vellykket anvendelse af denne metode altid at indsamle passende lampe- og mørkereferencespektre ved starten af en given måling. Hvis en sonde går i stykker under en vævsmåling, og der ikke er nogen indledende karakterisering uden vævet på plads, vil dataene være vanskelige eller umulige at fortolke, og det vil være nødvendigt at starte forfra med en frisk sonde. I modsætning hertil er delvise målinger brugbare data med passende referencer på plads i starten.

Den sidste del af denne metode vedrører dataindsamlingen. Anvendelsen af et fiberoptisk spektrometer til overvågning af signaler fra sonden er beskrevet, hvilket sikrer let SMA-kobling og giver fuldt spektral bølgelængdeinformation. For systemer med lavere fotonflux er det imidlertid også muligt at koble disse sonder til fotomultiplikatorrør eller lavinefotodioder. Under alle omstændigheder kræver alle detektorer referencemålinger for hver ny måling. Derfor kan alle forskellige typer optiske parametre karakteriseres med kun små justeringer af de beskrevne dataindsamlingsmetoder.

Fremtidige interessante anvendelser af denne metode kunne være kvantificering af lys dybt inde i kroppen af større pattedyr og i planter med komplekse strålingsoverførselsegenskaber, såsom sukkulenter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1" travel ball bearing center+D11+A2:D31+A2:A2:D31	Edmond Optics	37-935	Part 2 of manipulator for lowering sample
1/4" thick acrylic sheet	McMaster-Carr	8505K754	For making Petri dish holder
3/4" mini spring clamp	Anvil	99693	Use as weight for pulling optical fiber
8 mm biopsy punch	Fisher Scientific	NC9324386	For tissue sample
Butane Torch	McMaster-Carr	MT-51	Heat source for pulling fiber and pipette
Collimating lens	Thorlabs	LLG5A1-A	To collimate light source through liquid light guide
Compressed air	McMaster-Carr	7437K35	For drying pulled fiber and pipette
Cyanoacrylate glue - liquid	McMaster-Carr	66635A31	For securing tapered fiber end at top of pulled pipette
Electrical tape	McMaster-Carr	76455A21	For securing fiber in pipette and for adding grip to clamps
Fine grade carborundum paper	McMaster-Carr	4649A24	Small triangle on exacto knife holder works well
Gelatin	Knox	10043000048679	For securing the tissue biopsy in the petri dish
Glass Pasteur Pipete	Fisher Scientific	13-678-20B	Disposable glass pipette 5.75" in length
Insulin syringes, 31G needle	BD	320440	For applying glue
Isopropanol	McMaster-Carr	54845T42	For cleaning pulled fiber and pipette
Kimwipe	Cole-Parmer	SKU 33670-04	For wiping optical fiber and glass pipette clean
LED driver	Thorlabs	LEDD1B	For powering the UV LEDs
Light source for measurements	Cole-Parmer	UX-78905-05	Low heat white light source for measurements
Linear metric X-Y-Z axis rack and pinion stage	Edmond Optics	55-023	Part 1 of manipulator for lowering sample
Liquid light guide	Thorlabs	LLG5-4T	For light source in measurements
Magnetic feet	Siskiyou	MGB 8-32	For use with magnetic strips
Magnetic strips	Siskiyou	MS-6.0	For mounting magnetically to breadboard
Manipulator #1	Siskiyou	MX10R	4-axis manipulator with pipette holder
Opaquer pen, small	WindowTint	TOP01	For opaquing side of optical fiber to prevent stray light from enter probe
Optical breadboard	Edmond Optics	03-640	For stable affixation of probe holder, sample, microscope and light source
Optical fibers	Ocean Optics	P-100-2-UV-VIS	About 4 fibers are good to have
Plasma light source	Thorlabs	HPLS345	For tissue radiometry measurements
Plastic plier clamp	McMaster-Carr	5070A11	Plier clamp used for weight in pulling pipette
Polystyrene Petri dishes	Thomas scientific	3488N10	Sample holders, enough volume to hold sample thickness plus ~10 mm of gelatin on top
Razor blades	McMaster-Carr	3962A3	For stripping jacketing from optical fiber
Silicone oil lubricant	Thomas scientific	1232E30	For reducing friction between probe and tissue
Software for analyzing data	Matlab		Chosen software for data analysis
Spectrometer + spectrometer software	Avantes	AvaSpec-2048L	Spectrometer can be any brand, this one is compatible with sma-terminated optical fibers and comes with its own software for running the spectrometer
Titanium dioxide powder	Sigma Aldrich	718467-100G	For making scattering sphere
Toolour tabletop clip	Toolour	Toolour0004	For holding pipette while pulling and for holding finished probes
Trigger-action bar clamps	mcMaster-Carr	51755A2	Good for holding optical fibers while pulling or curing
UV curable adhesive	Delo Photobond	GB368	For making scattering sphere
UV light source	Thorlabs	M365FP1	Light source for curing adhesive in scattering ball, this one is sma-fiber compatible, higher intensity = less cure time
White LED light source	Thorlabs	MCWHF2	For characterizing pulled fiber and scattering sphere