Microsonde de radiométrie intratissulaire pour mesurer la radiance in situ dans un tissu vivant

Summary

Dans cet article, une méthode de mesure de la radiance in situ dans les tissus vivants est décrite. Ce travail comprend des détails sur la construction de sondes à micro-échelle pour différentes mesures de radiance et d’irradiance, fournit des conseils pour le montage de tissus pour la caractérisation de la radiance et décrit les méthodes de calcul pour analyser les données résultantes.

Abstract

Les organismes semblent opaques en grande partie parce que leurs couches tissulaires externes se dispersent fortement à la lumière incidente; Les pigments fortement absorbants, tels que le sang, ont généralement des absorbances étroites, de sorte que le libre trajet moyen de la lumière à l’extérieur des pics d’absorbance peut être assez long. Comme les gens ne peuvent pas voir à travers les tissus, ils imaginent généralement que les tissus comme le cerveau, la graisse et les os contiennent peu ou pas de lumière. Cependant, les protéines d’opsine photosensibles sont exprimées dans bon nombre de ces tissus et leurs fonctions sont mal comprises. L’éclat interne aux tissus est également important pour comprendre la photosynthèse. Par exemple, les palourdes géantes absorbent fortement tout en maintenant une population dense d’algues profondément dans les tissus. La propagation de la lumière à travers des systèmes comme les sédiments et les biofilms peut être complexe, et ces communautés peuvent contribuer grandement à la productivité des écosystèmes. Par conséquent, une méthode de construction de microsondes optiques pour mesurer l’irradiance scalaire (flux de photons coupant un point) et l’irradiance descendante (flux de photons traversant un plan perpendiculairement) pour mieux comprendre ces phénomènes à l’intérieur des tissus vivants a été développée. Cette technique est également traitable dans les laboratoires de terrain. Ces micro-sondes sont fabriquées à partir de fibres optiques tirées thermiquement qui sont ensuite fixées dans des pipettes en verre tiré. Pour modifier l’acceptation angulaire de la sonde, une sphère de 10 à 100 μm d’époxy durcissable aux UV mélangée à du dioxyde de titane est ensuite fixée à l’extrémité d’une fibre tirée et coupée. La sonde est insérée dans un tissu vivant et sa position est contrôlée à l’aide d’un micromanipulateur. Ces sondes sont capables de mesurer in situ la radiance tissulaire à des résolutions spatiales de 10 à 100 μm ou à l’échelle de cellules individuelles. Ces sondes ont été utilisées pour caractériser la lumière atteignant les cellules adipeuses et cérébrales à 4 mm sous la peau d’une souris vivante et pour caractériser la lumière atteignant des profondeurs similaires dans le tissu de palourdes géantes riche en algues vivantes.

Introduction

Étonnamment, les animaux terrestres et les habitants des océans peu profonds ont suffisamment de lumière dans leur corps pour la physiologie visuelle et même la photosynthèse. Par exemple, les niveaux de lumière au centre de la tête d’une souris (en dehors des fortes bandes d’absorbance de l’hémoglobine) sont atténués de trois ou quatre ordres de grandeur par rapport au monde extérieur. C’est à peu près la différence entre les niveaux de lumière à l’intérieur et à l’extérieur. Ainsi, l’opacité d’un tissu ou d’un matériau due à une forte diffusion n’est pas la même que l’opacité due à une forte absorption de la lumière. La lumière peut continuer à se propager sur de longues distances dans un système fortement diffusant vers l’avant, semblable à la lumière qui se propage à travers les systèmes aquatiques avec de fortes concentrations de cellules et de particules¹. Cette observation est particulièrement importante à la lumière du fait que les protéines d’opsine sont presque omniprésentes dans tous les tissus de tous les animaux. Ainsi, il est important de comprendre comment et où la lumière est atténuée et dispersée dans les tissus vivants. Cependant, contrairement aux systèmes aquatiques, avec des tissus vivants, il est impossible d’immerger un instrument dans la colonne d’eau et d’obtenir des mesures de radiance et d’irradiance, et une nouvelle technique est nécessaire.

D’autres méthodes précédemment utilisées pour caractériser les propriétés d’absorption et de diffusion des tissus vivants comprennent la mesure des sondes de réflectance tissulaire et/ou des sphères intégratrices^2,3, les méthodes microscopiques telles que la microscopie confocale à balayage⁴, la mesure de la diffusion de la lumière laser sur la surface^5, et les techniques de modélisation telles que le transfert radiatif de Monte Carlo⁶. Les méthodes expérimentales mentionnées nécessitent souvent un équipement spécifique, volumineux et coûteux ou des connaissances détaillées sur la structure tissulaire et sont généralement limitées dans leur capacité à caractériser la structure spatiale de la lumière profondément dans le tissu.

Il existe également des méthodes similaires basées sur des sondes qui utilisent une aiguille hypodermique pour insérer une fibre optique à travers le tissu ^7,8,9. D’après notre expérience, les aiguilles modifiées sont efficaces pour percer les tissus, mais nécessitent une force considérable et déchirent généralement les tissus délicats lorsqu’elles passent à travers des cellules densément tassées. Par conséquent, ces aiguilles nécessitent généralement une intervention chirurgicale pour insérer plus d’un millimètre environ dans une couche de tissu. La méthode décrite ici, à l’aide d’un support en verre tiré lubrifié, est capable de glisser entre les cellules avec une blessure minimale du tissu et sans intervention chirurgicale supplémentaire.

Ce manuscrit présente une méthode inspirée des travaux de Jorgenson et de ses collègues sur la mesure de la lumière dans les tapis d’algues^10,11, en utilisant des microsondes optiques à support de verre et une électronique portable qui se prêtent à sonder profondément dans les tissus denses et à la construction et à l’utilisation sur le terrain. Ces sondes peuvent être construites pour caractériser l’irradiance scalaire (la lumière frappant un point de toutes les directions) et la radiance descendante (lumière recoupant un plan horizontal) à l’intérieur des tissus vivants à des résolutions spatiales élevées. Ces sondes ont été développées à l’origine pour mesurer le transfert radiatif dans les tissus des palourdes géantes photosymbiotiques¹². Les mesures standard de l’absorption et de la transmission du tissu total n’étaient pas suffisantes pour caractériser la performance photosynthétique du tissu, car il fait une grande différence si toute la lumière incidente est absorbée par quelques cellules subissant une intensité élevée à la surface du tissu ou de nombreuses cellules de faible intensité dans tout le volume du tissu. Dans un second projet, ces sondes ont été utilisées pour mesurer l’irradiance in vivo dans le cerveau d’une souris^13,14, caractérisant ainsi l’environnement lumineux des opsines exprimées profondément dans le cerveau. Ces micro-sondes sont à la fois petites et suffisamment sensibles pour mesurer l’irradiance dans le tissu cérébral de souris avec toute la fourrure, la peau et les os intacts et démontrer que les niveaux de lumière physiologique sont facilement assez élevés pour stimuler les opsines cérébrales profondes.

Cette sonde micro-optique et cette installation de mesure pourraient être utiles aux chercheurs qui ont besoin de quantifier et de caractériser la lumière interne aux tissus biologiques, en particulier pour une compréhension plus nuancée de la photosynthèse ou des fonctions des pigments visuels exprimés à l’extérieur des yeux. Cette méthode peut être utilisée seule ou en conjonction avec d’autres techniques pour caractériser pleinement les propriétés optiques et la propagation de la lumière dans les tissus vivants à faible coût, avec de petits équipements portables construits en interne et avec des paramètres réglables en fonction de la tâche.

Protocol

Cette étude est conforme à toutes les réglementations éthiques pertinentes de l’Université de Yale concernant la recherche sur les animaux vertébrés et invertébrés.

1. Construction de la micro-sonde optique

1. Bâtiment du manchon en verre, matériau: pipette Pasteur, 5,75 po (voir le tableau des matériaux)
   1. À l’aide d’une pince crocodile montable (table des matériaux), montez la pipette en verre par l’extrémité large de telle sorte que l’extrémité conique soit orientée vers le sol et que l’orientation de la pipette soit perpendiculaire au sol.
   2. Suspendez une poignée d’étau en plastique de 50 g (table des matériaux) à l’extrémité conique de la pipette. Placez un tampon de ruban électrique entre la pipette et la poignée de l’étau pour éviter le glissement.
   3. Chauffer l’extrémité effilée de la pipette à l’aide d’une petite torche au butane (Table des matériaux). Appliquez la flamme à 1 cm au-dessus de la poignée de l’étau. Tenez la torche de telle sorte que la partie la plus brillante de la flamme se trouve à 3 cm du verre et que le verre soit à l’extrémité de la flamme. Lorsque la longueur de la pipette a augmenté d’environ 5 po, retirez immédiatement la flamme.
   4. Utilisez de petits ciseaux ou un coupe-verre pour couper l’extrémité tirée de la pipette au point où le nouveau diamètre tiré est environ le double de celui de la fibre optique utilisée dans la section suivante (voir étape 1.2). Limer toutes les zones nettes de l’extrémité coupée à l’aide de papier carborundum (Table des matériaux). Rincez tous les petits éclats de verre ou la poussière qui en résultent à l’aide d’un flacon d’alcool isopropylique suivi d’air comprimé.
2. Traction de la fibre optique (Figure 1D)
   1. Utilisez une lame de rasoir pour couper la fibre optique, en retirant un connecteur SMA d’une fibre optique SMA de 200 μm de diamètre (Table des matériaux). Couper près de l’une des terminaisons SMA. Ensuite, utilisez la lame de rasoir pour retirer les 5 cm suivants de gaine en plastique et en fibre de verre afin que la fibre optique nue soit exposée et dépasse du reste de l’assemblage intact.
   2. Utilisez la torche au butane pour brûler le revêtement polymère polyimide de la fibre de verre. Rincer à l’isopropanol. Essuyez la fibre de verre nue à l’aide d’une lingette non pelucheuse.
   3. L’étape suivante consiste à monter la fibre nue afin qu’elle puisse également être tirée avec une flamme. Montez l’extrémité nue de la fibre optique directement dans une pince à pince (Table of Materials) sur un bord de table ou d’étagère, en laissant l’extrémité SMA de la fibre pendre vers le sol. Ajouter les poids pour tirer sous la forme de deux petites pinces (poids total: 10 g) sur l’extrémité gainée de la fibre à environ 12 pouces de l’endroit où la fibre optique nue est maintenue dans la pince.
   4. Pour tirer la fibre, commencez avec la flamme de la torche au butane. Avec la flamme allumée, tenez la torche au butane à 1 cm de la fibre nue de sorte que la flamme soit perpendiculaire à la fibre optique et à 3 cm verticalement de l’endroit où la pince à pince maintient la fibre nue. Laissez la fibre s’étirer, tirer, se séparer et tomber au sol.
   5. Examinez l’extrémité de la fibre optique tirée résultante. Poncez délicatement toute irrégularité avec du papier carborundum, nettoyez avec de l’alcool isopropylique et une lingette non pelucheuse, et séchez à l’air comprimé.
      REMARQUE: À ce stade, on peut utiliser un microscope pour caractériser et documenter la taille et la forme de la fibre tirée.
   6. Utilisez un stylo opaque pour assombrir les côtés de la fibre et empêcher l’entrée de lumière parasite (Tableau des matériaux). Tirez doucement la fibre sur la pointe du stylo, en ne laissant qu’une petite zone à l’extrémité découverte.
3. Montage de la fibre tirée à l’intérieur du manchon de la pipette en verre (Figure 1A)
   1. En travaillant sous un stéréomicroscope, insérez soigneusement la fibre optique conique de l’étape 1.2 dans l’extrémité large de la pipette en verre modifié à partir de l’étape 1.1, et poussez la fibre jusqu’à ce que ~1 mm de fibre nue dépasse de l’extrémité conique de la pipette.
   2. À l’aide de ruban électrique, fixez l’extrémité gainée de la fibre optique à l’extrémité large de la pipette.
   3. Mettez une goutte d’adhésif cyanoacrylate sur une aiguille de petit calibre (Table des matériaux). Touchez délicatement la goutte d’adhésif sur le bord coupé de la pipette tirée, en évitant l’extrémité nue de la fibre tirée.
   4. Laisser l’action capillaire évacuer l’adhésif dans la pipette, mouillant la zone située entre la paroi de la pipette et la fibre optique. Laissez durcir l’adhésif pendant au moins 15 minutes avant de déplacer l’ensemble de la sonde.
4. Modification de la pointe de la fibre à l’aide d’une sphère de diffusion (Figure 1C)
   1. Créez la matière première pour la pointe de la bille de diffusion en mélangeant une goutte d’adhésif durcissable aux UV avec de la poudre de dioxyde de titane (Tableau des matériaux) à ~1:1 v/v.
   2. Fixez la sonde à un micromanipulateur muni d’un support de tige de montage (table des matériaux) de telle sorte que la sonde soit orientée horizontalement. Préparer un réservoir fonctionnel du matériau de diffusion en trempant la pointe d’un fil ou d’une aiguille dans le mélange adhésif/TiO₂ préparé au-dessus de telle sorte qu’une gouttelette d’adhésif se forme. Montez le fil ou l’aiguille avec la gouttelette près de la pointe de la sonde horizontale. Il est pratique de le faire à l’aide d’un clip crocodile monté sur le banc.
   3. Déposez une sphère de diffusion sur la pointe de la sonde. Utilisez le micromanipulateur pour pousser lentement et soigneusement la pointe de la fibre optique de la sonde dans la gouttelette d’adhésif/TiO₂. Ensuite, retirez rapidement la pointe de la colle. Répétez deux à trois fois jusqu’à ce qu’une gouttelette sphérique d’adhésif de la taille souhaitée soit déposée sur la pointe de la fibre optique.
      REMARQUE: La sphère de diffusion sera stable à des diamètres de deux à huit fois supérieurs au diamètre de la fibre optique conique. La taille optimale finale dépend de l’application finale souhaitée.
   4. Durcissez la sphère en connectant l’extrémité SMA de la fibre optique à une source de lumière UV couplée à une fibre (Table of Materials).
      NOTE: La source lumineuse utilisée dans cette étude avait une puissance de 5,3 mW. À cette puissance, le temps de durcissement recommandé est d’au moins 12 h ou pendant la nuit. Après le durcissement, c’est un bon moment pour caractériser et mesurer la taille de la pointe finale de la sonde optique.

2. Préparation et montage du tissu pour les mesures optiques (Figure 2 et Figure 3)

1. Préparez les plats pour monter les échantillons pour une expérience. Chauffer la grande extrémité d’une pipette Pasteur à l’aide d’une torche au butane pour faire un poinçon afin de faire fondre un trou de 0,5 cm de diamètre dans le fond d’une boîte de Petri en plastique de 35 mm x 10 mm. Scellez le trou sur le côté inférieur de la capsule avec du ruban électrique ou du ruban de laboratoire. Faites-en plusieurs à la fois pour plus d’efficacité.
2. Préparer la gélatine liquide (table des matières) conformément aux instructions sur l’emballage.
   REMARQUE: La gélatine sans saveur de qualité alimentaire commerciale de l’épicerie est meilleure à cette fin que la gélatine de qualité chimique provenant de fournisseurs de produits chimiques, car la gélatine de qualité chimique est moins transparente optiquement et moins fiable mécaniquement que le produit alimentaire.
3. Effectuer la dissection et la préparation du tissu qui sera utilisé.
   NOTE: D’après l’expérience, tout tissu plat jusqu’à 1 cm d’épaisseur peut être mesuré avec succès dans cette expérience en utilisant n’importe quelle technique de dissection appropriée pour le système d’intérêt. Pour le tissu de palourde géante, un poinçon de biopsie de 8 mm a été utilisé pour fabriquer un cercle plat et régulier de tissu de palourdes à utiliser dans l’expérience¹². Pour ce système, un seul échantillon pouvait être préparé efficacement à la fois étant donné le temps nécessaire pour effectuer une mesure afin de s’assurer que l’échantillon était toujours dans un état réaliste à la fin de l’expérience.
4. Remplissez deux boîtes de Petri de l’étape 2.1 au quart du chemin avec la gélatine liquide et laissez refroidir à température ambiante (RT) juste avant la gélification. Dans un plat, placez la biopsie dans le coussin de gélatine visqueuse qui se forme dans le trou au fond du plat. Utilisez une pipette Pasteur pour ajouter doucement de la gélatine RT autour de la biopsie jusqu’à ce que la boîte de Petri soit pleine (Figure 3). Remplissez le deuxième plat avec de la gélatine pour faire un échantillon blanc.
5. Placez les échantillons de plats dans un réfrigérateur pendant environ 10-30 minutes jusqu’à ce que la gélatine soit complètement durcie et légèrement élastique au toucher.
   REMARQUE: Dans une pièce fraîche, cela peut ne pas être nécessaire; Lorsque vous travaillez sous les tropiques, cette étape est nécessaire pour guérir complètement la gélatine.
6. Fabrication d’un support pour l’antenne de Petri sur le micromanipulateur (Figure 2)
   1. Couper un carré de 6 cm x 6 cm de 1/4 dans du plexiglas épais (Table des matériaux).
   2. Percez ou faites fondre un trou dans le carré en plastique du même diamètre que la boîte de Petri (~35 mm). Assurez-vous que la boîte de Petri s’adapte parfaitement à ce trou et qu’elle est maintenue en place avec friction. Ajoutez du ruban adhésif sur les bords du plat pour augmenter légèrement la taille et le contact de friction.
   3. Percez ou faites fondre un trou de 1/4 de diamètre dans le coin du carré en plastique. Utilisez ce trou pour fixer le carré au micromanipulateur à l’aide d’une vis et d’un boulon de 1/4 de po.
   4. Couvrez le carré en plastique avec du ruban électrique noir pour réduire la lumière parasite atteignant la sonde. De même, utilisez du ruban adhésif pour créer une jupe autour des côtés du carré s’étendant au-dessous du bas du plat inséré (>10 mm) afin de réduire la lumière parasite (figure 2B).
   5. Utilisez un boulon et du matériel approprié pour fixer le porte-boîte de Petri à un micromanipulateur qui permet des ajustements tridimensionnels et un mouvement vertical bien résolu sur une étendue supérieure à l’épaisseur des échantillons (les parties 1 et 2 du manipulateur mentionnées dans le tableau des matériaux en sont de bons exemples). Fixez ce micromanipulateur sur une planche à pain optique.

3. Configuration de mesure pour les biopsies tissulaires

1. Montez une source lumineuse au-dessus de la zone où la mesure a lieu de telle sorte que la lumière soit collimatée lorsqu’elle atteint le plan où l’échantillon sera placé (Figure 2A). Par exemple, fixez une lentille collimatrice de 5 cm (Table des matériaux) à un guide de lumière liquide de 5 mm (Table des matériaux) et élevez-la au-dessus de l’échantillon de >0,6 m à l’aide d’un étau et d’un cadre fixés à une breadboard optique (Table des matériaux). Ensuite, connectez le guide lumineux à une source lumineuse à large bande, telle que la source lumineuse à plasma répertoriée dans le tableau des matériaux.
2. Fixez la sonde à un support orienté verticalement de telle sorte qu’elle pointe vers la source lumineuse. Fixez la sonde à l’aide de pinces, de colliers de serrage ou de ruban adhésif à un poteau de table optique.
   REMARQUE : Dans l’expérience sur la palourde géante, un porte-tige spécialement conçu, tel que le micromanipulateur répertorié dans le tableau des matériaux, est utilisé. Dans ce travail, il a été fixé par des aimants à une planche à pain optique (Table of Materials). Les degrés supplémentaires de liberté d’alignement obtenus en ayant à la fois la sonde et l’échantillon sur des manipulateurs sont pratiques mais pas obligatoires. Veillez à ne pas trop serrer le poteau, car cela pourrait casser le boîtier de la pipette.
3. Placez le manipulateur d’échantillon près de la sonde montée verticalement. Utilisez le manipulateur d’échantillon pour ajuster la position de l’étage de l’échantillon de sorte que la sonde soit centrée dans l’ouverture de 0,5 cm au fond de la boîte de Pétri. Faites preuve d’une extrême prudence pour éviter de toucher ou de heurter l’extrémité de la sonde montée.
   REMARQUE: Un stéréomicroscope monté sur perche positionné sur la zone d’échantillonnage peut être utile. De cette façon, l’alignement descendant de la pointe, de l’étage et de l’échantillon de la sonde peut être visualisé avant de commencer une expérience (Figure 2A).
4. Connectez l’extrémité SMA de la fibre optique de la sonde à un spectromètre à fibre optique USB (Table of Materials) et connectez le spectromètre à l’ordinateur à l’aide d’un câble USB.

4. Collecte des données

1. Configuration expérimentale
   1. Placez la sonde et les manipulateurs dans la position exacte alignée dans laquelle les données seront collectées, comme à l’étape 3.4.
   2. Utilisez un coton-tige ou une aiguille de calibre fin pour appliquer soigneusement une petite quantité de lubrifiant à base de silicone (tableau des matériaux) sur la partie de la sonde qui sera insérée dans le tissu afin de réduire la friction entre les côtés de la sonde et l’échantillon de tissu. Réappliquez le lubrifiant silicone avant chaque mesure de base ou de tissu.
   3. Retirez le ruban adhésif qui recouvre le trou dans la boîte de Petri d’échantillon vierge et placez-le dans le porte-échantillon (étape 2.7), en vous assurant qu’il est maintenu solidement en place par frottement.
   4. Utilisez le micromanipulateur pour abaisser l’échantillon sur la sonde. Laissez la sonde pénétrer dans la gélatine par le trou situé sous la boîte de Pétri. Continuez jusqu’à ce que la sonde soit à environ 5 mm du bas de la couche de gélatine.
   5. Allumez la source lumineuse. À l’aide du logiciel du spectromètre, réglez le temps d’intégration du spectromètre jusqu’à ce que le signal soit aussi élevé que possible mais pas saturé. Définissez le nombre de balayages moyennés entre deux et cinq et la valeur des pixels de lissage sur six. Les temps d’intégration utilisables à ce stade peuvent varier entre 1 et 50 ms pour cette ligne de base.
2. Collecte des spectres de référence
   1. Collectez une mesure sombre.
      1. Une fois que les paramètres du spectromètre ont été réglés avec l’échantillon blanc, détachez la fibre de sonde du spectromètre et couvrez l’orifice avec le couvercle métallique opaque fourni avec le spectromètre.
      2. Obtenez une mesure de l’obscurité du spectromètre (souvent en utilisant l’icône de l’ampoule sombre dans l’interface graphique) pour caractériser le bruit du spectromètre sans lumière d’entrée. Enregistrez cette mesure en fonction de la stratégie d’acquisition de données.
   2. Collectez une mesure de lampe. Reconnectez la fibre de la sonde au spectromètre, attendez que le signal se stabilise et acquérez un autre spectre. Cette mesure caractérise la lumière atteignant la sonde à travers la gélatine en l’absence de tissu.
3. Collecte des spectres tissulaires
   1. Retirez le ruban au fond de la boîte de Petri de l’échantillon et placez-le dans le porte-échantillon.
   2. Aligner le plat d’échantillon avec la sonde en utilisant une manipulation tridimensionnelle afin que la biopsie tissulaire soit centrée au-dessus de l’extrémité de la sonde.
   3. Appliquer du gel de silicone sur la sonde (voir 4.1.2) et descendre lentement l’échantillon sur la sonde jusqu’à ce que l’extrémité de la sonde ait traversé la gélatine supportant l’échantillon de tissu et vienne d’entrer dans l’échantillon de tissu.
      REMARQUE: Certains spectromètres et programmes informatiques permettent de surveiller en temps réel la lumière détectée. Utilisez-le pour déterminer quand la sonde pénètre dans le tissu. L’intensité du spectre diminue brusquement dès que la pointe de la sonde est en contact direct avec le tissu.
   4. Vérifier que le temps d’intégration est approprié pour la mesure en s’assurant que le spectre mesuré n’est ni trop bruyant ni saturé. Modifiez le temps d’intégration si nécessaire.
      1. Chaque fois que le temps d’intégration est ajusté, effectuez et stockez une nouvelle mesure de l’obscurité (étape 4.2.1). Ne modifiez pas le nombre de balayages moyennés ou le nombre de pixels lissés.
      2. Après avoir trouvé les paramètres de mesure appropriés, prenez les mesures et enregistrez le spectre.
   5. Déplacez l’échantillon sur une distance spécifiée à l’aide du micromanipulateur. Pour le manipulateur utilisé pour cette étude, chaque petite marque de tique était de 0,001 po ou 25,4 μm. L’échantillon a été déplacé vers le bas à travers cinq graduations, ou 127 μm, pour chaque mesure. Répétez l’étape 4.3.4.
   6. Continuez à sauvegarder les spectres à chaque position verticale dans le tissu.
      NOTE: Pour le système décrit ici, les temps d’intégration requis variaient entre 1 ms et 5 s pour les mesures dans un seul échantillon de tissu. Finalement, la pointe de la sonde sortira du haut du tissu et y sera visible (Figure 4A). Il s’agit de la mesure finale et caractérise la lumière incidente au sommet du tissu.
4. Chargement et traitement des données
   1. Utilisez le logiciel du spectromètre pour convertir tous les spectres collectés (spectres sombres, spectres de lampe et mesures de tissus) en fichiers texte délimités.
   2. À l’aide de Matlab ou d’un langage de codage de votre choix, chargez tous les fichiers de mesure d’un échantillon. Pour chaque spectre de mesure tissulaire, soustrayez le spectre sombre avec le temps d’intégration correspondant, puis divisez-le par le temps d’intégration.
      REMARQUE : Dans cette étude, un script Matlab a été utilisé pour charger et traiter les données (Fichier supplémentaire 1).
   3. Calculer le pourcentage de lumière incidente atteignant chaque position dans le tissu en divisant les spectres obtenus avec la sonde à l’intérieur du tissu par le spectre de base obtenu dans la gélatine vide.
      NOTE: La mesure au sommet du tissu (étape 4.3.6) doit être très similaire à la mesure de base dans la gélatine (étape 4.1) et, lorsqu’elle est divisée, doit être proche de 100%. Selon le contexte expérimental, l’un ou l’autre spectre de la lampe (le spectre de la gélatine vide ou celui du sommet du tissu) peut être utilisé comme référence. Cependant, il est toujours important de collecter un spectre de lampe avant de commencer l’expérience. En effet, si la sonde se brise ou si l’expérience échoue avant d’atteindre le sommet du tissu, les données obtenues avant la défaillance sont encore utilisables, ce qui n’est pas le cas s’il n’y a pas de spectre de référence initial correspondant à la lampe.
   4. Visualiser les données; Les courbes de niveau peuvent être utiles (figure 4B).

Representative Results

Ce protocole décrit la procédure de construction d’une sonde micro-optique qui peut être utilisée pour mesurer l’irradiance descendante (la lumière atteignant un point d’une direction) ou, avec l’ajout d’une pointe sphérique diffusant la lumière, pour mesurer l’irradiance scalaire (la lumière atteignant un point de toutes les directions). Ces sondes peuvent mesurer l’irradiance à des résolutions spatiales proches des échelles de longueur des cellules individuelles à l’intérieur des tissus vivants. Ce protocole décrit également une méthode représentative pour la préparation d’un échantillon de tissu pour les mesures d’irradiance à l’aide de la sonde décrite et une méthode représentative pour la visualisation et l’analyse des données.

La figure 1 montre le résultat de la production de micro-sondes. Lorsqu’elle est tirée, la fibre optique doit se rétrécir sur environ 3 cm et ne pas avoir de rayures le long de la conicité. Il doit également être plat à l’extrémité et avoir un diamètre de 15 à 30 μm (Figure 1D). La planéité de la pointe peut être améliorée en ponçant l’extrémité avec du papier carborundum ou en marquant et en cassant à nouveau. De même, la pipette en verre tiré utilisée comme boîtier de la fibre ne doit pas avoir d’arêtes vives ou cassées. Lorsque la boule de diffusion se forme à l’extrémité de l’extrémité plate coupée de la fibre, elle doit être sphérique (Figure 1C). Avant le durcissement, les difformes peuvent être éliminées en insérant la bille dans la gouttelette adhésive mère et en retirant rapidement la fibre. Une vitesse de mouvement rapide tirera la boule de colle de l’extrémité de la fibre. Des mouvements plus lents entraînent une accumulation d’adhésif supplémentaire sur la fibre. Observer le processus à l’aide d’un microscope à dissection pendant que la fibre est attachée à une source lumineuse est utile pour visualiser le travail et déterminer si le processus fonctionne. Il est important de fixer la fibre à l’intérieur de la pipette en verre avec de la colle et du ruban électrique avant d’appliquer l’adhésif diffuseur; sinon, la fibre peut se briser ou l’adhésif peut s’enduire de la fibre en mouvement (Figure 1).

La figure 2 montre l’appareil de mesure. Dans cet exemple, les supports de l’échantillon de tissu et de la sonde ont des capacités de réglage en trois dimensions (Figure 2). La fixation de l’échantillon et de la sonde à des manipulateurs facilite l’alignement, mais n’est pas essentielle; La sonde pourrait être fixée à un poteau fixe. Les mouvements les plus résolus des manipulateurs doivent être orientés dans la direction verticale en z afin que la position dans le tissu et/ou la quantité de mouvements des sondes puissent être déterminées avec précision (Figure 2A). Un stéréomicroscope monté sur perche peut être utile lorsqu’il est placé de manière à ce que l’on puisse voir la scène, la sonde et l’échantillon à travers l’oculaire pour vérifier l’alignement de la sonde avec la scène, l’antenne parabolique et l’échantillon (Figure 2B). Il est utile d’observer les spectres en temps réel tout en abaissant l’échantillon sur la sonde, car si le spectre mesuré par la sonde change soudainement, cela suggère que l’échantillon est situé avec succès à l’intérieur du tissu hautement diffusant ou absorbant ou que la sonde se plie ou se brise. Des changements brusques dans la forme et l’intensité du spectre indiquent très probablement l’entrée du tissu, tandis que les changements brusques d’intensité sans changement de forme suggèrent que la sonde se plie ou se brise. Au sommet du tissu de palourde, il y a une fine membrane transparente que la sonde ne peut pas pénétrer sans se briser. Dans un cas comme celui-ci, le haut du tissu doit être surveillé pour voir quand la sonde est sur le point de sortir, et les mesures doivent être arrêtées à ce moment-là afin que la sonde ne se casse pas.

La figure 3 montre l’échantillon de biopsie tissulaire incorporé dans une boîte de Pétri de gélatine, comme décrit à la section 2. Il y a un trou dans le fond de la boîte de Petri pour permettre l’insertion de la sonde optique dans le tissu par le dessous. La biopsie mesure 8 mm de diamètre et est centrée sur le trou de la boîte de Petri (figure 3A). Il y a une petite quantité de gélatine sous l’échantillon de tissu, et la gélatine est remplie jusqu’au sommet de la capsule au-dessus du tissu (Figure 3B).

La figure 4A montre la sonde lorsqu’elle commence à sortir du haut du tissu, et la figure 4B montre les données représentatives. Un script Matlab (fichier supplémentaire 2) a été utilisé pour générer les traces de la figure 4B. L’axe des x est la longueur d’onde et l’axe des y est le pourcentage de lumière à une profondeur de tissu par rapport au spectre de base. Les mesures individuelles de la profondeur des tissus sont indiquées par les lignes de coloration en échelle de gris. Les mesures prises plus profondément dans le tissu sont représentées par une ligne plus foncée. Le spectre de base est la mesure dans un échantillon de gélatine seule et est utilisé pour caractériser la lampe et la réponse de la sonde à la lampe. La gélatine a une légère absorption et diffusion, ce qui signifie que le signal d’absorption de la gélatine contre la longueur d’onde n’est pas complètement plat. Par conséquent, les spectres prélevés dans tout le tissu sont soit divisés par le spectre de la sonde en gélatine, soit par le spectre de la sonde au sommet du tissu, de sorte que les données spectrales présentées à la figure 4B représentent le pourcentage de lumière uniquement pour l’échantillon de tissu et sont donc indépendantes de la source lumineuse, la gélatine et les spécificités de chaque sonde.

Figure 1 : Étapes de fabrication de la sonde micro-optique de radiométrie intratissulaire. (A) Schéma de la sonde optique. (B) Une vue de la sonde optique finie. (C) Un gros plan de la sphère de diffusion fixée à la fibre optique tirée à l’intérieur du support de pipette en verre. (D) La fibre optique tirée et nettoyée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Images et diagrammes de l’installation expérimentale pour mesurer l’irradiance scalaire à l’intérieur du tissu. (A) Un schéma général et une image de la configuration expérimentale. (B) Gros plan du porte-boîte de Pétri de l’échantillon. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Biopsie du tissu de palourdes. (A) Vue supérieure et (B) vue latérale d’une biopsie de tissu de palourde prête à être mesurée dans la boîte de Petri modifiée remplie de gélatine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Données représentatives. (A) Image au microscope de l’apparence de la sonde lorsqu’elle traverse le tissu. (B) Données représentatives obtenues avec la sonde de radiométrie intratissulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire 1 : script Matlab utilisé pour le chargement et le traitement des données. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : script Matlab utilisé pour générer les traces de la figure 4B. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Ce protocole décrit une technique de caractérisation systématique de l’environnement optique à travers un grand volume de tissu vivant avec une résolution spatiale approximativement à l’échelle de cellules individuelles. Cette méthode peu coûteuse, flexible et traitable sur le terrain pourrait être utile à tous les chercheurs qui étudient la propagation de la lumière dans les systèmes vivants. D’après l’expérience, par rapport aux méthodes existantes⁷, ces sondes nécessitent un peu plus de pratique et de compétences pour être construites, mais entraînent moins de dommages tissulaires et la capacité de caractériser de manière plus complète de plus grands volumes de tissus denses.

Cette méthode comprend quatre parties. La première partie, la construction de la sonde, a été inspirée par les conceptions précédentes de l’appareil^10,11. L’approche actuelle a été développée pour des scans systématiques et moins destructeurs de l’ensemble des tissus épais, car l’aiguille de verre tirée peut glisser doucement entre les cellules. Il peut également être utilisé dans un laboratoire de terrain^12,13,14. Ce protocole aboutit à des sondes avec des pointes de ~20 μm de diamètre pour mesurer la radiance descendante et une sphère de diffusion optionnelle de 50-100 μm de diamètre pour mesurer l’irradiance scalaire. Des sphères d’irradiance scalaire plus grandes ou plus petites pourraient être développées en modifiant les matériaux utilisés, par exemple, un adhésif durcissable aux UV avec une viscosité initiale différente. Le poids dans la traction de la pipette et le processus de fibre peut être ajusté pour obtenir plus ou moins de conicité. La vitesse de chauffage peut également être modifiée en fonction de la distance de la flamme de la torche pour ajuster le processus de traction et la conicité qui en résulte.

La technique de construction de sonde nécessite une certaine habileté manuelle et des essais et erreurs pour se perfectionner, mais peut devenir fiable et rapide avec la pratique. Ici, quelques nuances de dépannage développées au fil du temps sont présentées. Tirer la fibre optique vers le bas de l’extrémité gainée permet d’obtenir des conicités plus cohérentes. Il est important d’appliquer le stylo opaque avant d’ajouter la pointe de diffusion sphérique, car les propriétés mouillantes de l’encre opaque influencent favorablement la formation d’une boule d’adhésif ordonnée à l’extrémité de la fibre. Si la bille adhésive résultante est déformée, il est possible de la retirer et de réessayer. Pour ce faire, le micromanipulateur peut être utilisé pour glisser toute la bille dans le réservoir adhésif, puis retiré très lentement. Cela retire généralement la première tentative difforme, la laissant dans le réservoir adhésif et permettant de réessayer.

Traitées avec soin, ces sondes peuvent être utilisées à plusieurs reprises pour différents échantillons. Le plus grand danger est de frapper accidentellement la pointe de la sonde dans quelque chose tout en la déplaçant. Entre les mesures, ils doivent être nettoyés des débris cellulaires à l’aide d’alcool isopropylique et d’air comprimé. Les sondes peuvent également être stockées pendant des semaines tant que la pointe de la sonde ne touche rien et qu’il n’y a pas de forces sur l’assemblage de fibre optique qui peuvent séparer le ruban et la colle maintenant la sonde à l’intérieur du manchon en verre. Cela peut être accompli en serrant la pipette en fibre et en verre à plusieurs endroits jusqu’au bord d’une étagère haute.

Les deuxième et troisième parties de cette méthode impliquent les aspects mécano-optiques de l’expérience et la sécurisation du tissu pour la mesure. Cette partie de la méthode a été développée spécifiquement pour mesurer l’irradiance scalaire intra-tissulaire à l’intérieur du tissu de palourdes^{géantes 12}. Ici, les détails pour le dépannage de ces aspects de la méthode sont présentés. Tout d’abord, la biopsie doit être importante par rapport à la sonde. Cela empêche la sonde de déplacer le tissu pendant son transit. De plus, le tissu doit reposer sur le fond de la boîte de Petri afin que l’élasticité et le poids de la gélatine se combinent pour maintenir le tissu en place pendant la mesure. Il est également important que la pièce soit suffisamment froide pour maintenir la gélatine dans un état élastique et solide sous la source lumineuse expérimentale. De même, il est utile d’utiliser une LED ou une autre source avec relativement peu de production de chaleur par rapport à la lumière visible.

Les paramètres géométriques et optomécaniques de la méthode sont très flexibles. Par exemple, la sonde d’irradiance scalaire a été utilisée pour mesurer l’irradiance à l’intérieur du cerveau et du tissu adipeux intacts^{d’une souris 13,14}. Pour ce faire, la sonde a été montée sur les manipulateurs sur un cadre stéréotaxique standard pour rongeurs, et la source lumineuse a été montée pointant vers le rostre de la souris. Dans n’importe quelle géométrie, la clé du succès de l’utilisation de cette méthode est de toujours collecter les spectres de référence appropriés de la lampe et de l’obscurité au début d’une mesure donnée. Si une sonde se brise lors d’une mesure tissulaire et qu’il n’y a pas de caractérisation initiale sans le tissu en place, les données seront difficiles ou impossibles à interpréter, et il faudra recommencer avec une nouvelle sonde. En revanche, avec des références appropriées en place au départ, les mesures partielles sont des données utilisables.

La dernière partie de cette méthode concerne l’acquisition des données. L’utilisation d’un spectromètre à fibre optique pour surveiller les signaux de la sonde est décrite, ce qui garantit la facilité de couplage SMA et fournit des informations de longueur d’onde entièrement spectrales. Cependant, pour les systèmes avec un flux de photons plus faible, il est également possible de coupler ces sondes à des tubes photomultiplicateurs ou à des photodiodes à avalanche. Dans tous les cas, tous les détecteurs nécessitent des mesures de référence pour chaque nouvelle mesure. Par conséquent, avec seulement de légers ajustements aux méthodes de collecte de données décrites, tous les différents types de paramètres optiques peuvent être caractérisés.

Les utilisations futures intéressantes de cette méthode pourraient être la quantification de la lumière profonde dans le corps des grands mammifères et dans les plantes ayant des propriétés de transfert radiatif complexes, telles que les plantes succulentes.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1" travel ball bearing center+D11+A2:D31+A2:A2:D31	Edmond Optics	37-935	Part 2 of manipulator for lowering sample
1/4" thick acrylic sheet	McMaster-Carr	8505K754	For making Petri dish holder
3/4" mini spring clamp	Anvil	99693	Use as weight for pulling optical fiber
8 mm biopsy punch	Fisher Scientific	NC9324386	For tissue sample
Butane Torch	McMaster-Carr	MT-51	Heat source for pulling fiber and pipette
Collimating lens	Thorlabs	LLG5A1-A	To collimate light source through liquid light guide
Compressed air	McMaster-Carr	7437K35	For drying pulled fiber and pipette
Cyanoacrylate glue - liquid	McMaster-Carr	66635A31	For securing tapered fiber end at top of pulled pipette
Electrical tape	McMaster-Carr	76455A21	For securing fiber in pipette and for adding grip to clamps
Fine grade carborundum paper	McMaster-Carr	4649A24	Small triangle on exacto knife holder works well
Gelatin	Knox	10043000048679	For securing the tissue biopsy in the petri dish
Glass Pasteur Pipete	Fisher Scientific	13-678-20B	Disposable glass pipette 5.75" in length
Insulin syringes, 31G needle	BD	320440	For applying glue
Isopropanol	McMaster-Carr	54845T42	For cleaning pulled fiber and pipette
Kimwipe	Cole-Parmer	SKU 33670-04	For wiping optical fiber and glass pipette clean
LED driver	Thorlabs	LEDD1B	For powering the UV LEDs
Light source for measurements	Cole-Parmer	UX-78905-05	Low heat white light source for measurements
Linear metric X-Y-Z axis rack and pinion stage	Edmond Optics	55-023	Part 1 of manipulator for lowering sample
Liquid light guide	Thorlabs	LLG5-4T	For light source in measurements
Magnetic feet	Siskiyou	MGB 8-32	For use with magnetic strips
Magnetic strips	Siskiyou	MS-6.0	For mounting magnetically to breadboard
Manipulator #1	Siskiyou	MX10R	4-axis manipulator with pipette holder
Opaquer pen, small	WindowTint	TOP01	For opaquing side of optical fiber to prevent stray light from enter probe
Optical breadboard	Edmond Optics	03-640	For stable affixation of probe holder, sample, microscope and light source
Optical fibers	Ocean Optics	P-100-2-UV-VIS	About 4 fibers are good to have
Plasma light source	Thorlabs	HPLS345	For tissue radiometry measurements
Plastic plier clamp	McMaster-Carr	5070A11	Plier clamp used for weight in pulling pipette
Polystyrene Petri dishes	Thomas scientific	3488N10	Sample holders, enough volume to hold sample thickness plus ~10 mm of gelatin on top
Razor blades	McMaster-Carr	3962A3	For stripping jacketing from optical fiber
Silicone oil lubricant	Thomas scientific	1232E30	For reducing friction between probe and tissue
Software for analyzing data	Matlab		Chosen software for data analysis
Spectrometer + spectrometer software	Avantes	AvaSpec-2048L	Spectrometer can be any brand, this one is compatible with sma-terminated optical fibers and comes with its own software for running the spectrometer
Titanium dioxide powder	Sigma Aldrich	718467-100G	For making scattering sphere
Toolour tabletop clip	Toolour	Toolour0004	For holding pipette while pulling and for holding finished probes
Trigger-action bar clamps	mcMaster-Carr	51755A2	Good for holding optical fibers while pulling or curing
UV curable adhesive	Delo Photobond	GB368	For making scattering sphere
UV light source	Thorlabs	M365FP1	Light source for curing adhesive in scattering ball, this one is sma-fiber compatible, higher intensity = less cure time
White LED light source	Thorlabs	MCWHF2	For characterizing pulled fiber and scattering sphere