Una microsonda de radiometría intratisular para medir la radiación in situ en tejido vivo

Summary

En este artículo, se describe un método para medir la radiación in situ en tejido vivo. Este trabajo incluye detalles de la construcción de sondas a microescala para diferentes mediciones de radiancia e irradiancia, proporciona orientación para el montaje de tejido para la caracterización de la radiación y describe métodos computacionales para analizar los datos resultantes.

Abstract

Los organismos parecen opacos en gran parte porque sus capas externas de tejido se dispersan fuertemente a la luz incidente; Los pigmentos fuertemente absorbentes, como la sangre, suelen tener absorbancias estrechas, de modo que el camino libre medio de la luz fuera de los picos de absorbancia puede ser bastante largo. Como las personas no pueden ver a través del tejido, generalmente imaginan que los tejidos como el cerebro, la grasa y el hueso contienen poca o ninguna luz. Sin embargo, las proteínas opsina fotosensibles se expresan dentro de muchos de estos tejidos, y sus funciones son poco conocidas. La luminosidad interna al tejido también es importante para comprender la fotosíntesis. Por ejemplo, las almejas gigantes son fuertemente absorbentes pero mantienen una densa población de algas en lo profundo del tejido. La propagación de la luz a través de sistemas como sedimentos y biopelículas puede ser compleja, y estas comunidades pueden ser importantes contribuyentes a la productividad del ecosistema. Por lo tanto, se ha desarrollado un método para construir microsondas ópticas para medir la irradiancia escalar (flujo de fotones que interseca un punto) y la irradiancia descendente (flujo de fotones que cruza un plano perpendicularmente) para comprender mejor estos fenómenos dentro del tejido vivo. Esta técnica también es manejable en laboratorios de campo. Estas microsondas están hechas de fibras ópticas tiradas por calor que luego se aseguran en pipetas de vidrio tiradas. Para cambiar la aceptación angular de la sonda, una esfera de 10-100 μm de epoxi curable UV mezclada con dióxido de titanio se asegura al extremo de una fibra tirada y recortada. La sonda se inserta en el tejido vivo y su posición se controla mediante un micromanipulador. Estas sondas son capaces de medir in situ la radiación tisular a resoluciones espaciales de 10-100 μm o en la escala de células individuales. Estas sondas se utilizaron para caracterizar la luz que llega a las células adiposas y cerebrales a 4 mm por debajo de la piel de un ratón vivo y para caracterizar la luz que alcanza profundidades similares dentro del tejido de almeja gigante rico en algas vivas.

Introduction

Sorprendentemente, los animales terrestres y los habitantes poco profundos del océano tienen suficiente luz dentro de su cuerpo para la fisiología visual e incluso la fotosíntesis. Por ejemplo, los niveles de luz en el centro de la cabeza de un ratón (fuera de las fuertes bandas de absorbancia de hemoglobina) se atenúan en tres o cuatro órdenes de magnitud en relación con el mundo exterior. Esta es aproximadamente la diferencia entre los niveles de luz en interiores y exteriores. Por lo tanto, la opacidad de un tejido o material debido a una fuerte dispersión no es lo mismo que la opacidad debido a la fuerte absorción de luz. La luz puede seguir propagándose a largas distancias en un sistema de fuerte dispersión hacia adelante, similar a la luz que se propaga a través de sistemas acuáticos con altas concentraciones de células y partículas¹. Esta observación es particularmente notable a la luz del hecho de que las proteínas opsinas se expresan casi ubicuamente en todos los tejidos de todos los animales. Por lo tanto, es importante entender cómo y dónde la luz se atenúa y se dispersa dentro del tejido vivo. Sin embargo, a diferencia de los sistemas acuáticos, con tejido vivo, es imposible sumergir un instrumento en la columna de agua y obtener mediciones de luminosidad e irradiancia, y es necesaria una nueva técnica.

Otros métodos utilizados anteriormente para caracterizar las propiedades de absorción y dispersión del tejido vivo incluyen la medición de sondas de reflectancia tisular y / o esferas integradoras^2,3, métodos microscópicos como la microscopía confocal de barrido 4^, la medición de la difusión de la luz láser en la superficie⁵ y técnicas^de modelado como la transferencia radiativa de Monte Carlo⁶. Los métodos experimentales mencionados a menudo requieren equipos específicos, grandes y costosos o conocimientos detallados sobre la estructura del tejido y generalmente están limitados en su capacidad para caracterizar la estructura espacial de la luz en las profundidades del tejido.

También existen métodos similares basados en sondas que utilizan una aguja hipodérmica para insertar una fibra óptica a través del tejido ^7,8,9. En nuestra experiencia, las agujas modificadas son efectivas para perforar tejido, pero requieren una fuerza considerable y generalmente desgarran tejidos delicados cuando pasan a través de células densamente empaquetadas. Por lo tanto, estas agujas generalmente requieren un procedimiento quirúrgico para insertar más de un milímetro más o menos en una capa de tejido. El método descrito aquí, utilizando un soporte de vidrio lubricado y tirado, es capaz de deslizarse entre las células con una herida mínima del tejido y sin cirugía adicional.

Este manuscrito presenta un método inspirado en el trabajo de Jorgenson y sus colegas sobre la medición de la luz dentro de esteras de algas^10,11, utilizando microsondas ópticas soportadas por vidrio y electrónica portátil que son susceptibles de sondear profundamente en el tejido denso y de la construcción y el uso en el campo. Estas sondas se pueden construir para caracterizar la irradiancia escalar (luz que golpea un punto desde todas las direcciones) y la radiación descendente (luz que interseca un plano horizontal) dentro del tejido vivo a altas resoluciones espaciales. Estas sondas fueron desarrolladas originalmente para medir la transferencia radiativa dentro del tejido de almejas gigantes fotosimbióticas¹². Las mediciones estándar de absorción y transmisión del tejido total no fueron suficientes para caracterizar el rendimiento fotosintético del tejido, ya que hace una gran diferencia si toda la luz incidente es absorbida por unas pocas células que experimentan alta intensidad en la superficie del tejido o muchas células que experimentan bajas intensidades en todo el volumen del tejido. En un segundo proyecto, estas sondas se utilizaron para medir la irradiancia in vivo dentro del cerebro de un ratón^13,14, caracterizando así el entorno de luz de las opsinas expresadas profundamente dentro del cerebro. Estas microsondas son lo suficientemente pequeñas y sensibles como para medir la irradiancia dentro del tejido cerebral del ratón con todo el pelaje, la piel y el hueso intactos y demostrar que los niveles de luz fisiológica son lo suficientemente altos como para estimular las opsinas cerebrales profundas.

Esta sonda microóptica y la configuración de medición podrían ser útiles para los investigadores que necesitan cuantificar y caracterizar la luz interna del tejido biológico, particularmente para una comprensión más matizada de la fotosíntesis o las funciones de los pigmentos visuales expresados fuera de los ojos. Este método se puede utilizar solo o junto con otras técnicas para caracterizar completamente las propiedades ópticas y la propagación de la luz dentro del tejido vivo a bajo costo, con pequeños equipos portátiles construidos internamente y con parámetros ajustables dependientes de la tarea.

Protocol

Este estudio cumple con todas las regulaciones éticas relevantes de la Universidad de Yale con respecto a la investigación de animales vertebrados e invertebrados.

1. Construcción de la microsonda óptica

1. Construcción de la manga de vidrio, material: pipeta Pasteur, 5.75 in (ver Tabla de materiales)
   1. Usando un clip de cocodrilo montable (Tabla de materiales), monte la pipeta de vidrio por el extremo ancho de modo que el extremo cónico quede hacia abajo hacia el piso y la orientación de la pipeta sea perpendicular al piso.
   2. Cuelgue una empuñadura de plástico de 50 g (Tabla de materiales) del extremo cónico de la pipeta. Coloque una almohadilla con cinta aislante entre la pipeta y la empuñadura para ayudar a evitar el deslizamiento.
   3. Caliente el extremo cónico de la pipeta con una pequeña antorcha de butano (Tabla de materiales). Aplicar la llama 1 cm por encima de la empuñadura de vicio. Sostenga la antorcha de tal manera que la parte más brillante de la llama esté a 3 cm del vidrio y el vidrio esté en la punta de la llama. Cuando la longitud de la pipeta haya aumentado en aproximadamente 5 pulgadas, retire inmediatamente la llama.
   4. Utilice tijeras pequeñas o un cortador de vidrio para recortar el extremo tirado de la pipeta en el punto donde el nuevo diámetro tirado es aproximadamente el doble que el de la fibra óptica utilizada en la siguiente sección (consulte el paso 1.2). Lima cualquier área afilada del extremo recortado con papel de carborundo (Tabla de materiales). Enjuague cualquier fragmento de vidrio pequeño resultante o polvo con una botella de alcohol isopropílico seguido de aire comprimido.
2. Tirando de la fibra óptica (Figura 1D)
   1. Utilice una cuchilla de afeitar para cortar la fibra óptica, eliminando un conector SMA de una fibra óptica terminada en SMA de 200 μm de diámetro (Tabla de materiales). Corte cerca de una de las terminaciones SMA. Luego, use la hoja de afeitar para quitar los siguientes 5 cm de revestimiento de plástico y fibra de vidrio para que la fibra óptica desnuda quede expuesta y sobresalga del resto del conjunto intacto.
   2. Use la antorcha de butano para quemar el recubrimiento de polímero de poliimida de la fibra de vidrio. Enjuagar con isopropanol. Limpie la fibra de vidrio desnuda con una toallita sin pelusa.
   3. El siguiente paso es montar la fibra desnuda para que también se pueda tirar con una llama. Monte el extremo desnudo de la fibra óptica directamente en una abrazadera de alicates (Tabla de materiales) en el borde de una mesa o estante, dejando que el extremo de la fibra con terminación SMA cuelgue hacia el piso. Agregue los pesos para tirar en forma de dos abrazaderas pequeñas (peso total: 10 g) en el extremo encamisado de la fibra aproximadamente 12 pulgadas hacia abajo desde donde se sostiene la fibra óptica desnuda en la abrazadera del alicate.
   4. Para tirar de la fibra, comience con la llama de la antorcha de butano encendida. Con la llama encendida, sostenga la antorcha de butano a 1 cm de la fibra desnuda para que la llama quede perpendicular a la fibra óptica y 3 cm hacia abajo verticalmente desde donde la abrazadera del alicate sostiene la fibra desnuda. Permita que la fibra se estire, tire, se separe y caiga al suelo.
   5. Examine el extremo de fibra óptica tirado resultante. Lije suavemente cualquier irregularidad con papel de carborundo, limpie con alcohol isopropílico y una toallita sin pelusa, y seque con aire comprimido.
      NOTA: En este punto, se puede usar un microscopio para caracterizar y documentar el tamaño y la forma de la fibra extraída.
   6. Utilice un bolígrafo de película para oscurecer los lados de la fibra y evitar la entrada de luz parásita (Tabla de materiales). Tire suavemente de la fibra a través de la punta de la pluma, dejando solo una pequeña área en la punta descubierta.
3. Montaje de la fibra tirada dentro del manguito de pipeta de vidrio (Figura 1A)
   1. Trabajando bajo un microscopio estereoscópico, inserte cuidadosamente la fibra óptica cónica del paso 1.2 en el extremo ancho de la pipeta de vidrio alterada del paso 1.1, y empuje la fibra hasta que sobresalga ~ 1 mm de fibra desnuda del extremo cónico de la pipeta.
   2. Con cinta aislante, fije el extremo encamisado de la fibra óptica al extremo ancho de la pipeta.
   3. Coloque una gota de adhesivo de cianoacrilato en una aguja de calibre pequeño (Tabla de materiales). Toque con cuidado la gota de adhesivo en el borde cortado de la pipeta tirada, evitando el extremo desnudo de la fibra tirada.
   4. Permita que la acción capilar absorba el adhesivo en la pipeta, humedeciendo el área entre la pared de la pipeta y la fibra óptica. Deje que el adhesivo se cure durante al menos 15 minutos antes de mover el conjunto de la sonda.
4. Modificación de la punta de la fibra con una esfera de dispersión (Figura 1C)
   1. Cree la materia prima para la punta de la bola de dispersión mezclando una gota de adhesivo curable UV con polvo de dióxido de titanio (Tabla de materiales) a ~ 1: 1 v / v.
   2. Fije la sonda a un micromanipulador con un soporte de varilla de montaje (Tabla de materiales) de modo que la sonda esté en orientación horizontal. Prepare un depósito funcional del material de dispersión sumergiendo la punta de un alambre o aguja en la mezcla adhesiva/TiO₂ preparada anteriormente de tal manera que se forme una gota de adhesivo. Monte el alambre o la aguja con la gota cerca de la punta de la sonda horizontal. Es conveniente hacer esto usando un clip de cocodrilo montado en el banco.
   3. Deposite una esfera de dispersión en la punta de la sonda. Utilice el micromanipulador para empujar lenta y cuidadosamente la punta de la fibra óptica de la sonda en la gota de adhesivo/TiO₂. Luego, retire rápidamente la punta del pegamento. Repita dos o tres veces hasta que se deposite una gota esférica de adhesivo del tamaño deseado en la punta de la fibra óptica.
      NOTA: La esfera de dispersión será estable en diámetros de dos a ocho veces mayores que el diámetro de la fibra óptica cónica. El tamaño óptimo final depende de la aplicación final deseada.
   4. Cure la esfera conectando el extremo de la fibra óptica con terminación SMA a una fuente de luz UV acoplada a fibra (Tabla de materiales).
      NOTA: La fuente de luz utilizada en este estudio tenía una potencia de 5,3 mW. A esta potencia, el tiempo de curación recomendado es de al menos 12 h o durante la noche. Después del curado es un buen momento para caracterizar y medir el tamaño de la punta final de la sonda óptica.

2. Preparación y montaje del tejido para mediciones ópticas (Figura 2 y Figura 3)

1. Prepare los platos para montar las muestras para un experimento. Caliente el extremo grande de una pipeta Pasteur con una antorcha de butano para hacer un punzón para fundir un orificio de 0,5 cm de diámetro en el fondo de una placa de Petri de plástico de 35 mm x 10 mm. Selle el agujero en la parte inferior del plato con cinta aislante o cinta de laboratorio. Haga varios a la vez para la eficiencia.
2. Prepare gelatina líquida (Tabla de materiales) de acuerdo con las instrucciones del paquete.
   NOTA: La gelatina comercial sin sabor de grado alimenticio de la tienda de comestibles es mejor para este propósito que la gelatina de grado químico de proveedores químicos porque la gelatina de grado químico es menos ópticamente clara y menos confiable mecánicamente que el producto alimenticio.
3. Realizar la disección y preparación del tejido que se utilizará.
   NOTA: Por experiencia, cualquier tejido plano de hasta 1 cm de espesor se puede medir con éxito en este experimento utilizando cualquier técnica de disección apropiada para el sistema de interés. Para el tejido de almeja gigante, se utilizó un punzón de biopsia de 8 mm para hacer un círculo plano y regular de tejido de almeja para su uso en el experimento¹². Para este sistema, solo se podía preparar efectivamente una muestra a la vez, dado el tiempo requerido para completar una medición para garantizar que la muestra todavía estuviera en condiciones realistas al final del experimento.
4. Llene dos placas de Petri del paso 2.1 un cuarto del camino con la gelatina líquida y deje enfriar a temperatura ambiente (RT) justo antes de la gelificación. En un plato, coloque la biopsia en el cojín de gelatina viscosa que se forma en el orificio en el fondo del plato. Utilice una pipeta Pasteur para añadir suavemente gelatina RT alrededor de la biopsia hasta que la placa de Petri esté llena (figura 3). Llene el segundo plato con gelatina para hacer una muestra en blanco.
5. Coloque los platos de muestra en un refrigerador durante unos 10-30 minutos hasta que la gelatina esté completamente curada y ligeramente elástica al tacto.
   NOTA: En una habitación fresca, esto puede no ser necesario; Cuando se trabaja en los trópicos, este paso es necesario para curar completamente la gelatina.
6. Haciendo un montaje para la placa de Petri en el micromanipulador (Figura 2)
   1. Corte un cuadrado de 6 cm x 6 cm de 1/4 en plexiglás grueso (Tabla de materiales).
   2. Perfore o derrita un agujero en el cuadrado de plástico del mismo diámetro que la placa de Petri (~ 35 mm). Asegúrese de que la placa de Petri encaje perfectamente en este orificio y se mantenga en su lugar con fricción. Agregue cinta adhesiva a los bordes del plato para aumentar ligeramente el tamaño y el contacto de fricción.
   3. Perfore o derrita un agujero de 1/4 de diámetro en la esquina del cuadrado de plástico. Utilice este orificio para fijar el cuadrado al micromanipulador con un tornillo y un perno de 1/4 de pulgada.
   4. Cubra el cuadrado de plástico con cinta aislante negra para reducir la luz parásita que llega a la sonda. Del mismo modo, use cinta adhesiva para crear una falda alrededor de los lados del cuadrado que se extienda por debajo de la parte inferior del plato insertado (>10 mm) para reducir la luz parásita (Figura 2B).
   5. Use un perno y un hardware apropiado para unir el soporte de la placa de Petri a un micromanipulador que permita ajustes tridimensionales y movimientos verticales bien resueltos en una extensión mayor que el grosor de las muestras (la parte 1 y la parte 2 del manipulador mencionado en la Tabla de materiales son buenos ejemplos). Fije este micromanipulador a una placa de pruebas óptica.

3. Configuración de medición para biopsias de tejido

1. Monte una fuente de luz sobre el área donde se realiza la medición de modo que la luz se colime cuando llegue al plano donde se colocará la muestra (Figura 2A). Por ejemplo, conecte una lente colimadora de 5 cm (Tabla de materiales) a una guía de luz líquida de 5 mm (Tabla de materiales) y elévela por encima de la muestra en >0,6 m utilizando un vicio y un marco unidos a una placa de pruebas óptica (Tabla de materiales). A continuación, conecte la guía de luz a una fuente de luz de banda ancha, como la fuente de luz de plasma que aparece en la Tabla de materiales.
2. Fije la sonda a un soporte orientado verticalmente de modo que apunte hacia la fuente de luz. Asegure la sonda con abrazaderas, abrazaderas de manguera o cinta adhesiva a un poste de mesa óptico.
   NOTA: En el experimento de la almeja gigante, se utiliza un soporte de varilla diseñado específicamente, como el micromanipulador que figura en la Tabla de materiales. En este trabajo, se aseguró mediante imanes a una placa óptica (Tabla de materiales). Los grados adicionales de libertad para la alineación obtenidos al tener tanto la sonda como la muestra en manipuladores son convenientes pero no necesarios. Tenga cuidado de no sujetar demasiado al poste, ya que esto puede romper la carcasa de la pipeta.
3. Coloque el manipulador de muestras cerca de la sonda montada verticalmente. Utilice el manipulador de muestras para ajustar la posición de la etapa de muestra de modo que la sonda esté centrada en la abertura de 0,5 cm en la parte inferior de la placa de Petri. Tenga mucho cuidado para evitar tocar o golpear la punta de la sonda montada.
   NOTA: Un microscopio estereoscópico montado en la pluma colocado sobre el área de muestra puede ser útil. De esta manera, la alineación de arriba hacia abajo de la punta de la sonda, la etapa y la muestra se pueden ver antes de comenzar un experimento (Figura 2A).
4. Conecte el extremo terminado en SMA de la fibra óptica de la sonda a un espectrómetro de fibra óptica USB (Tabla de materiales) y conecte el espectrómetro a la computadora con un cable USB.

4. Recopilación de datos

1. Configuración experimental
   1. Tenga la sonda y los manipuladores en la posición alineada exacta en la que se recopilarán los datos, como en el paso 3.4.
   2. Use un hisopo de algodón o una aguja de calibre fino para aplicar cuidadosamente una pequeña cantidad de lubricante de silicona (Tabla de materiales) a la parte de la sonda que se insertará en el tejido para reducir la fricción entre los lados de la sonda y la muestra de tejido. Vuelva a aplicar el lubricante de silicona antes de cada línea de base o medición de tejido.
   3. Retire la cinta que cubre el orificio de la placa de Petri de muestra en blanco y colóquela en el portamuestras (paso 2.7), asegurándose de que se mantiene firmemente en su lugar por fricción.
   4. Utilice el micromanipulador para bajar la muestra a la sonda. Permita que la sonda entre en la gelatina a través del orificio en la parte inferior de la placa de Petri. Continuar hasta que la sonda esté aproximadamente a 5 mm de la parte inferior de la capa de gelatina.
   5. Encienda la fuente de luz. Usando el software del espectrómetro, ajuste el tiempo de integración del espectrómetro hasta que la señal sea lo más alta posible pero no saturada. Establezca el número de escaneos promediados entre dos y cinco y el valor de suavizado de píxeles en seis. Los tiempos de integración utilizables en esta etapa pueden variar entre 1 y 50 ms para esta línea base.
2. Recopilación de los espectros de referencia
   1. Recopile una medida oscura.
      1. Una vez que los parámetros del espectrómetro se hayan establecido con la muestra en blanco, separe la fibra de la sonda del espectrómetro y cubra el puerto con la cubierta metálica opaca que venía con el espectrómetro.
      2. Obtenga una medición oscura del espectrómetro (a menudo usando el icono de bombilla oscura en la GUI) para caracterizar el ruido del espectrómetro sin luz de entrada. Guarde esta medición de acuerdo con la estrategia de adquisición de datos.
   2. Recopile una medida de lámpara. Vuelva a conectar la fibra de la sonda al espectrómetro, espere a que la señal se estabilice y adquiera otro espectro. Esta medición caracteriza la luz que llega a la sonda a través de la gelatina en ausencia de tejido.
3. Recolección de los espectros tisulares
   1. Retire la cinta en la parte inferior de la placa de Petri de muestra y colóquela en el soporte de muestra.
   2. Alinee el plato de muestra con la sonda mediante manipulación tridimensional para que la biopsia de tejido se centre por encima de la punta de la sonda.
   3. Aplicar gel de silicona a la sonda (véase 4.1.2) y bajar lentamente la muestra sobre la sonda hasta que la punta de la sonda haya pasado a través de la gelatina que soporta la muestra de tejido y haya entrado en la muestra de tejido.
      NOTA: Algunos espectrómetros y programas informáticos permiten el monitoreo en tiempo real de la luz detectada. Use esto para determinar cuándo la sonda ingresa al tejido. La intensidad del espectro disminuirá abruptamente tan pronto como la punta de la sonda esté en contacto directo con el tejido.
   4. Verifique que el tiempo de integración sea apropiado para la medición asegurándose de que el espectro medido no sea demasiado ruidoso ni saturado. Cambie el tiempo de integración si es necesario.
      1. Cada vez que se ajuste el tiempo de integración, realice y almacene una nueva medición oscura (paso 4.2.1). No cambie el número de escaneos promediados ni el número de píxeles suavizados.
      2. Después de encontrar los parámetros de medición adecuados, tome las medidas y guarde el espectro.
   5. Mueva la muestra hacia abajo una distancia especificada utilizando el micromanipulador. Para el manipulador utilizado para este estudio, cada pequeña marca de verificación fue de 0.001 in o 25.4 μm. La muestra se movió hacia abajo a través de cinco marcas de verificación, o 127 μm, para cada medición. Repita el paso 4.3.4.
   6. Continúe guardando los espectros en cada posición vertical dentro del tejido.
      NOTA: Para el sistema descrito aquí, los tiempos de integración requeridos variaron entre 1 ms y 5 s para las mediciones dentro de una sola muestra de tejido. Eventualmente, la punta de la sonda saldrá de la parte superior del tejido y será visible allí (Figura 4A). Esta es la medición final y caracteriza la luz incidente en la parte superior del tejido.
4. Carga y procesamiento de los datos
   1. Utilice el software del espectrómetro para convertir todos los espectros recopilados (espectros oscuros, espectros de lámparas y mediciones de tejido) en archivos de texto delimitados.
   2. Utilizando Matlab o un lenguaje de codificación de su elección, cargue todos los archivos de medición para una muestra. Para cada espectro de medición de tejido, reste el espectro oscuro con el tiempo de integración correspondiente y luego divídalo por el tiempo de integración.
      NOTA: En este estudio, se utilizó un script Matlab para cargar y procesar los datos (Archivo Suplementario 1).
   3. Calcule el porcentaje de luz incidente que alcanza cada posición en el tejido dividiendo los espectros obtenidos con la sonda dentro del tejido por el espectro basal obtenido en gelatina vacía.
      NOTA: La medición en la parte superior del tejido (paso 4.3.6) debe ser muy similar a la medición de referencia en gelatina (paso 4.1) y, cuando se divide, debe ser cercana al 100%. Dependiendo del contexto experimental, se puede usar como referencia el espectro de la lámpara (el espectro de la gelatina vacía o el de la parte superior del tejido). Sin embargo, sigue siendo importante recopilar un espectro de lámpara antes de comenzar el experimento. Esto se debe a que, si la sonda se rompe o el experimento falla antes de llegar a la parte superior del tejido, los datos obtenidos antes de la falla aún son utilizables, lo que no es el caso si no hay un espectro de referencia de lámpara inicial correspondiente.
   4. Visualizar los datos; Los diagramas de contorno pueden ser útiles (Figura 4B).

Representative Results

Este protocolo describe el procedimiento para construir una sonda microóptica que se puede utilizar para medir la irradiancia descendente (la luz que llega a un punto desde una dirección) o, con la adición de una punta esférica de dispersión de luz, para medir la irradiancia escalar (la luz que llega a un punto desde todas las direcciones). Estas sondas pueden medir la irradiancia a resoluciones espaciales que se acercan a las escalas de longitud de las células individuales dentro del tejido vivo. Este protocolo también describe un método representativo para preparar una muestra de tejido para mediciones de irradiancia utilizando la sonda descrita y un método representativo para la visualización y el análisis de datos.

La Figura 1 muestra la salida de la producción de microsondas. Cuando se tira, la fibra óptica debe estrecharse durante unos 3 cm y no tener rasguños a lo largo de la conicidad. También debe ser plano al final y tener un diámetro de 15-30 μm (Figura 1D). La planitud de la punta se puede mejorar lijando el extremo con papel de carborundo o marcando y rompiendo de nuevo. Del mismo modo, la pipeta de vidrio tirado utilizada como carcasa de la fibra no debe tener bordes afilados o rotos. Cuando la bola de dispersión se forma en el extremo de la punta plana y cortada de la fibra, debe ser esférica (Figura 1C). Antes de curar, los deformes se pueden eliminar mediante otra ronda de inserción de la bola en la gota adhesiva madre y tirando rápidamente de la fibra. Una velocidad rápida de movimiento tirará de la bola de pegamento desde el extremo de la fibra. Los movimientos más lentos dan como resultado una acumulación de adhesivo adicional en la fibra. Observar el proceso con un microscopio de disección mientras la fibra está unida a una fuente de luz es útil para visualizar el trabajo y determinar si el proceso está funcionando. Es importante asegurar la fibra dentro de la pipeta de vidrio con pegamento y cinta aislante antes de aplicar el adhesivo de dispersión; de lo contrario, la fibra puede romperse o el adhesivo puede mancharse con la fibra cambiante (Figura 1).

La figura 2 muestra el aparato de medición. En este ejemplo, los soportes tanto para la muestra de tejido como para la sonda tienen capacidades de ajuste en tres dimensiones (Figura 2). Conectar tanto la muestra como la sonda a los manipuladores ayuda con la alineación, pero no es esencial; La sonda podría estar conectada a un poste estacionario. Los movimientos más resueltos de los manipuladores deben orientarse en la dirección z vertical para que la posición en el tejido y/o la cantidad de movimientos de las sondas se puedan determinar con precisión (Figura 2A). Un microscopio estereoscópico montado en la pluma puede ser útil cuando se coloca de tal manera que se pueda ver la etapa, la sonda y la muestra a través del ocular para verificar la alineación de la sonda con la etapa, el plato y la muestra (Figura 2B). Observar los espectros en tiempo real mientras se baja la muestra sobre la sonda es útil porque si el espectro medido por la sonda cambia repentinamente, esto sugiere que la muestra se encuentra con éxito dentro del tejido altamente disperso o absorbente o que la sonda se está doblando o rompiendo. Los cambios abruptos en la forma e intensidad del espectro probablemente indican la entrada de tejido, mientras que los cambios bruscos de intensidad sin un cambio en la forma sugieren que la sonda se está doblando o rompiendo. En la parte superior del tejido de la almeja, hay una membrana delgada y transparente que la sonda no puede penetrar sin romperse. En un caso como este, la parte superior del tejido debe ser monitoreada para ver cuándo la sonda está a punto de salir, y las mediciones deben detenerse en ese punto para que la sonda no se rompa.

La figura 3 muestra la muestra de biopsia de tejido incrustada en una placa de Petri de gelatina, como se describe en la sección 2. Hay un agujero en el fondo de la placa de Petri para permitir la inserción de la sonda óptica en el tejido desde abajo. La biopsia tiene 8 mm de diámetro y está centrada sobre el orificio de la placa de Petri (Figura 3A). Hay una pequeña cantidad de gelatina debajo de la muestra de tejido, y la gelatina se llena hasta la parte superior del plato por encima del tejido (Figura 3B).

La Figura 4A muestra la sonda a medida que comienza a salir de la parte superior del tejido, y la Figura 4B muestra los datos representativos. Se utilizó un script de Matlab (archivo complementario 2) para generar los seguimientos de la figura 4B. El eje x es la longitud de onda, y el eje y es el porcentaje de luz a una profundidad de tejido en relación con el espectro de referencia. Las mediciones individuales para la profundidad del tejido se indican mediante las líneas con coloración en escala de grises. Las mediciones tomadas más profundamente en el tejido están representadas por una línea más oscura. El espectro de referencia es la medición en una muestra de gelatina solamente y se utiliza para caracterizar la lámpara y la respuesta de la sonda a la lámpara. La gelatina tiene una ligera absorción y dispersión, lo que significa que la señal para la absorción de gelatina contra la longitud de onda no es completamente plana. Por lo tanto, los espectros tomados en todo el tejido se dividen por el espectro de la sonda en gelatina o por el espectro de la sonda en la parte superior del tejido, de modo que los datos espectrales que se muestran en la Figura 4B representan el porcentaje de luz solo para la muestra de tejido y, por lo tanto, son independientes de la fuente de luz. la gelatina y los detalles de cada sonda individual.

Figura 1: Etapas de fabricación de la sonda de radiometría intratisular microóptica. (A) Un esquema de la sonda óptica. (B) Una vista de la sonda óptica terminada. (C) Un primer plano de la esfera de dispersión unida a la fibra óptica tirada dentro del soporte de la pipeta de vidrio. (D) La fibra óptica tirada y limpiada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Imágenes y diagramas de la configuración experimental para medir la irradiancia escalar dentro del tejido. (A) Un esquema general y una imagen de la configuración experimental. (B) Un primer plano del soporte de la placa de Petri de muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Biopsia de tejido de almeja. (A) Vistas superiores y (B) laterales de una biopsia de tejido de almeja listo para ser medido en la placa de Petri alterada llena de gelatina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Datos representativos . (A) Imagen de microscopio de cómo se ve la sonda cuando sube a través del tejido. (B) Datos representativos obtenidos con la sonda de radiometría intratisular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo complementario 1: script de Matlab utilizado para cargar y procesar los datos. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: script de Matlab utilizado para generar los seguimientos de la figura 4B. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Este protocolo describe una técnica para caracterizar sistemáticamente el entorno óptico a través de un gran volumen de tejido vivo con una resolución espacial aproximadamente en la escala de células individuales. Este método económico, flexible y manejable en campo podría ser útil para cualquier investigador que estudie la propagación de la luz dentro de los sistemas vivos. Por experiencia, en comparación con los métodos existentes⁷, estas sondas requieren un poco más de práctica y habilidad para construir, pero resultan en menos daño tisular y la capacidad de caracterizar de manera más completa grandes volúmenes de tejido denso.

Este método consta de cuatro partes. La primera parte, la construcción de la sonda, se inspiró en diseños de dispositivos anteriores^10,11. El enfoque actual se desarrolló para escaneos sistemáticos y menos destructivos de la totalidad del tejido grueso, ya que la aguja de vidrio tirada puede deslizarse suavemente entre las células. También es susceptible de uso en un laboratorio de campo^12,13,14. Este protocolo da como resultado sondas con puntas de ~ 20 μm de diámetro para medir la radiación descendente y una esfera de dispersión opcional de 50-100 μm de diámetro para medir la irradiancia escalar. Se podrían desarrollar esferas de irradiancia escalar más grandes o más pequeñas modificando los materiales utilizados, por ejemplo, un adhesivo curable por UV con una viscosidad inicial diferente. El peso tanto en la extracción de pipetas como en el proceso de fibra se puede ajustar para dar como resultado una mayor o menor conicidad. La velocidad de calentamiento también se puede modificar a través de la distancia desde la llama de la antorcha para ajustar el proceso de tracción y el cono resultante.

La técnica de construcción de la sonda requiere cierta habilidad manual y prueba y error para perfeccionarse, pero puede llegar a ser confiable y rápida con la práctica. Aquí, se presentan algunos matices de solución de problemas desarrollados a lo largo del tiempo. Tirar de la fibra óptica hacia abajo desde el extremo encamisado da como resultado estrechas más consistentes. Es importante aplicar la pluma opaquing antes de agregar la punta de dispersión esférica, ya que las propiedades humectantes de la tinta opaca influyen favorablemente en la formación de una bola ordenada de adhesivo en la punta de la fibra. Si la bola adhesiva resultante está deformada, es posible sacarla y volver a intentarlo. Para hacer esto, el micromanipulador se puede usar para deslizar toda la bola en el depósito de adhesivo y luego retirarse muy lentamente. Esto generalmente tira del primer intento deforme, dejándolo en el depósito de adhesivo y haciendo posible volver a intentarlo.

Tratadas con cuidado, estas sondas se pueden usar repetidamente para diferentes muestras. El mayor peligro es golpear accidentalmente la punta de la sonda en algo mientras la mueve. Entre mediciones, deben limpiarse de restos celulares utilizando alcohol isopropílico y aire comprimido. Las sondas también se pueden almacenar durante semanas, siempre y cuando la punta de la sonda no toque nada y no haya fuerzas en el conjunto de fibra óptica que puedan separar la cinta y el pegamento que sostienen la sonda dentro del manguito de vidrio. Esto se puede lograr sujetando la pipeta de fibra y vidrio en varios lugares hasta el borde de un estante alto.

La segunda y tercera parte de este método involucran los aspectos mecano-ópticos del experimento y la seguridad del tejido para la medición. Esta parte del método fue desarrollada específicamente para medir la irradiancia escalar intratisular dentro del tejido de almeja gigante¹². Aquí, se presentan detalles para solucionar estos aspectos del método. Primero, la biopsia debe ser grande en relación con la sonda. Esto evita que la sonda mueva el tejido a medida que transita. Además, el tejido debe colocarse en el fondo de la placa de Petri para que la elasticidad y el peso de la gelatina se combinen para mantener el tejido en su lugar durante la medición. También es importante que la habitación esté lo suficientemente fría como para mantener la gelatina en un estado elástico y sólido bajo la fuente de luz experimental. Del mismo modo, ayuda usar un LED u otra fuente con comparativamente poca generación de calor en relación con la luz visible.

Los parámetros geométricos y optomecánicos del método son muy flexibles. Por ejemplo, la sonda de irradiancia escalar se utilizó para medir la irradiancia dentro del cerebro y el tejido adiposo de un ratón intacto^13,14. Para hacer esto, la sonda se montó en los manipuladores en un marco estereotáctico estándar de roedores, y la fuente de luz se montó apuntando hacia la tribuna del ratón. En cualquier geometría, la clave para el uso exitoso de este método es recopilar siempre los espectros de referencia de lámpara y oscuridad apropiados al comienzo de cualquier medición dada. Si una sonda se rompe durante una medición de tejido y no hay una caracterización inicial sin el tejido en su lugar, los datos serán difíciles o imposibles de interpretar, y será necesario comenzar de nuevo con una nueva sonda. Por el contrario, con las referencias apropiadas al principio, las mediciones parciales son datos utilizables.

La última parte de este método se refiere a la adquisición de datos. Se describe el uso de un espectrómetro de fibra óptica para monitorear las señales de la sonda, lo que garantiza la facilidad del acoplamiento SMA y proporciona información completa de la longitud de onda espectral. Sin embargo, para sistemas con menor flujo de fotones, también es posible acoplar estas sondas a tubos fotomultiplicadores o fotodiodos de avalancha. En cualquier caso, todos los detectores requieren mediciones de referencia para cada nueva medición. Por lo tanto, con solo ligeros ajustes en los métodos de recopilación de datos descritos, se pueden caracterizar todos los diferentes tipos de parámetros ópticos.

Los usos interesantes futuros de este método podrían ser la cuantificación de la luz en las profundidades de los cuerpos de mamíferos más grandes y dentro de plantas con propiedades complejas de transferencia radiativa, como las suculentas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1" travel ball bearing center+D11+A2:D31+A2:A2:D31	Edmond Optics	37-935	Part 2 of manipulator for lowering sample
1/4" thick acrylic sheet	McMaster-Carr	8505K754	For making Petri dish holder
3/4" mini spring clamp	Anvil	99693	Use as weight for pulling optical fiber
8 mm biopsy punch	Fisher Scientific	NC9324386	For tissue sample
Butane Torch	McMaster-Carr	MT-51	Heat source for pulling fiber and pipette
Collimating lens	Thorlabs	LLG5A1-A	To collimate light source through liquid light guide
Compressed air	McMaster-Carr	7437K35	For drying pulled fiber and pipette
Cyanoacrylate glue - liquid	McMaster-Carr	66635A31	For securing tapered fiber end at top of pulled pipette
Electrical tape	McMaster-Carr	76455A21	For securing fiber in pipette and for adding grip to clamps
Fine grade carborundum paper	McMaster-Carr	4649A24	Small triangle on exacto knife holder works well
Gelatin	Knox	10043000048679	For securing the tissue biopsy in the petri dish
Glass Pasteur Pipete	Fisher Scientific	13-678-20B	Disposable glass pipette 5.75" in length
Insulin syringes, 31G needle	BD	320440	For applying glue
Isopropanol	McMaster-Carr	54845T42	For cleaning pulled fiber and pipette
Kimwipe	Cole-Parmer	SKU 33670-04	For wiping optical fiber and glass pipette clean
LED driver	Thorlabs	LEDD1B	For powering the UV LEDs
Light source for measurements	Cole-Parmer	UX-78905-05	Low heat white light source for measurements
Linear metric X-Y-Z axis rack and pinion stage	Edmond Optics	55-023	Part 1 of manipulator for lowering sample
Liquid light guide	Thorlabs	LLG5-4T	For light source in measurements
Magnetic feet	Siskiyou	MGB 8-32	For use with magnetic strips
Magnetic strips	Siskiyou	MS-6.0	For mounting magnetically to breadboard
Manipulator #1	Siskiyou	MX10R	4-axis manipulator with pipette holder
Opaquer pen, small	WindowTint	TOP01	For opaquing side of optical fiber to prevent stray light from enter probe
Optical breadboard	Edmond Optics	03-640	For stable affixation of probe holder, sample, microscope and light source
Optical fibers	Ocean Optics	P-100-2-UV-VIS	About 4 fibers are good to have
Plasma light source	Thorlabs	HPLS345	For tissue radiometry measurements
Plastic plier clamp	McMaster-Carr	5070A11	Plier clamp used for weight in pulling pipette
Polystyrene Petri dishes	Thomas scientific	3488N10	Sample holders, enough volume to hold sample thickness plus ~10 mm of gelatin on top
Razor blades	McMaster-Carr	3962A3	For stripping jacketing from optical fiber
Silicone oil lubricant	Thomas scientific	1232E30	For reducing friction between probe and tissue
Software for analyzing data	Matlab		Chosen software for data analysis
Spectrometer + spectrometer software	Avantes	AvaSpec-2048L	Spectrometer can be any brand, this one is compatible with sma-terminated optical fibers and comes with its own software for running the spectrometer
Titanium dioxide powder	Sigma Aldrich	718467-100G	For making scattering sphere
Toolour tabletop clip	Toolour	Toolour0004	For holding pipette while pulling and for holding finished probes
Trigger-action bar clamps	mcMaster-Carr	51755A2	Good for holding optical fibers while pulling or curing
UV curable adhesive	Delo Photobond	GB368	For making scattering sphere
UV light source	Thorlabs	M365FP1	Light source for curing adhesive in scattering ball, this one is sma-fiber compatible, higher intensity = less cure time
White LED light source	Thorlabs	MCWHF2	For characterizing pulled fiber and scattering sphere