Een intra-tissue radiometrie microprobe voor het meten van straling in situ in levend weefsel

Summary

In dit artikel wordt een methode beschreven voor het meten van straling in situ in levend weefsel. Dit werk omvat details van de constructie van sondes op microschaal voor verschillende metingen van straling en bestraling, biedt richtlijnen voor het monteren van weefsel voor de karakterisering van straling en schetst computationele methoden voor het analyseren van de resulterende gegevens.

Abstract

Organismen lijken ondoorzichtig, grotendeels omdat hun buitenste weefsellagen sterk verstrooien naar invallend licht; Sterk absorberende pigmenten, zoals bloed, hebben meestal een smalle absorptie, zodat de gemiddelde vrije weg van licht buiten de absorptiepieken vrij lang kan zijn. Omdat mensen niet door weefsel kunnen kijken, stellen ze zich over het algemeen voor dat weefsels zoals de hersenen, vet en bot weinig of geen licht bevatten. Fotoresponsieve opsine-eiwitten komen echter tot expressie in veel van deze weefsels en hun functies zijn slecht begrepen. Uitstraling intern in weefsel is ook belangrijk voor het begrijpen van fotosynthese. Reuzenschelpen absorberen bijvoorbeeld sterk, maar behouden een dichte populatie algen diep in het weefsel. Lichtvoortplanting door systemen zoals sedimenten en biofilms kan complex zijn en deze gemeenschappen kunnen een belangrijke bijdrage leveren aan de productiviteit van ecosystemen. Daarom is een methode ontwikkeld voor het construeren van optische microsondes voor het meten van scalaire straling (fotonflux die een punt snijdt) en downwelling-bestraling (fotonflux die een vlak loodrecht kruist) om deze verschijnselen in levend weefsel beter te begrijpen. Deze techniek is ook in veldlaboratoria hanteerbaar. Deze micro-sondes zijn gemaakt van warmte-getrokken optische vezels die vervolgens worden vastgezet in getrokken glazen pipetten. Om de hoekige acceptatie van de sonde te veranderen, wordt een 10-100 μm grote bol UV-uithardende epoxy gemengd met titaniumdioxide vervolgens bevestigd aan het einde van een getrokken, bijgesneden vezel. De sonde wordt ingebracht in levend weefsel en de positie ervan wordt geregeld met behulp van een micromanipulator. Deze sondes zijn in staat om in situ weefselstraling te meten bij ruimtelijke resoluties van 10-100 μm of op de schaal van afzonderlijke cellen. Deze sondes werden gebruikt om het licht te karakteriseren dat de vet- en hersencellen 4 mm onder de huid van een levende muis bereikt en om het licht te karakteriseren dat vergelijkbare diepten bereikt in levend algenrijk reuzenschelpweefsel.

Introduction

Verrassend genoeg hebben landdieren en ondiepe oceaanbewoners genoeg licht in hun lichaam voor visuele fysiologie en zelfs fotosynthese. De lichtniveaus in het midden van het hoofd van een muis (buiten de sterke hemoglobineabsorptiebanden) worden bijvoorbeeld verzwakt door drie of vier ordes van grootte ten opzichte van de buitenwereld. Dit is ongeveer het verschil tussen de lichtniveaus binnen en buiten. De opaciteit van een weefsel of materiaal als gevolg van sterke verstrooiing is dus niet hetzelfde als opaciteit als gevolg van sterke lichtabsorptie. Licht kan zich over lange afstanden blijven voortplanten in een sterk voorwaarts verstrooiend systeem, vergelijkbaar met licht dat zich voortplant door aquatische systemen met hoge concentraties cellen en deeltjes¹. Deze observatie is vooral saillant in het licht van het feit dat opsine-eiwitten bijna alomtegenwoordig tot expressie komen in alle weefsels van alle dieren. Het is dus belangrijk om te begrijpen hoe en waar licht wordt verzwakt en verstrooid in levend weefsel. In tegenstelling tot aquatische systemen, met levend weefsel, is het echter onmogelijk om een instrument in de waterkolom onder te dompelen en stralings- en bestralingsmetingen te verkrijgen, en een nieuwe techniek is noodzakelijk.

Andere methoden die eerder werden gebruikt om de absorptie- en verstrooiingseigenschappen van levend weefsel te karakteriseren, zijn het meten van weefselreflectiesondes en / of het integreren van bollen^2,3, microscopische methoden zoals het scannen van confocale microscopie⁴, het meten van de diffusie van laserlicht op het oppervlak^5, en modelleringstechnieken zoals Monte Carlo stralingsoverdracht⁶. De genoemde experimentele methoden vereisen vaak specifieke, grote en dure apparatuur of gedetailleerde kennis over weefselstructuur en zijn over het algemeen beperkt in hun vermogen om de ruimtelijke structuur van licht diep in het weefsel te karakteriseren.

Er zijn ook vergelijkbare op sondes gebaseerde methoden die een hypodermische naald gebruiken om een optische vezel door weefsel ^7,8,9 in te brengen. In onze ervaring zijn gemodificeerde naalden effectief in het doorboren van weefsel, maar vereisen ze aanzienlijke kracht en scheuren ze over het algemeen delicate weefsels wanneer ze door dicht opeengepakte cellen gaan. Daarom vereisen deze naalden over het algemeen een chirurgische ingreep om meer dan een millimeter of zo in een weefsellaag in te brengen. De hier beschreven methode, met behulp van een gesmeerde, getrokken glazen steun, is in staat om tussen cellen te glijden met minimale verwonding van het weefsel en zonder aanvullende chirurgie.

Dit manuscript presenteert een methode geïnspireerd op het werk van Jorgenson en collega's over het meten van licht in algenmatten^10,11, met behulp van door glas ondersteunde optische microprobes en draagbare elektronica die geschikt zijn om diep in dicht weefsel te tasten en om te bouwen en te gebruiken in het veld. Deze sondes kunnen worden geconstrueerd om scalaire bestraling (licht dat vanuit alle richtingen een punt raakt) en downwelling radiance (licht dat een horizontaal vlak snijdt) in levend weefsel met hoge ruimtelijke resoluties te karakteriseren. Deze sondes werden oorspronkelijk ontwikkeld om stralingsoverdracht te meten in het weefsel van fotosymbiotische reuzenschelpen¹². Standaardmetingen van absorptie en transmissie van het totale weefsel waren niet voldoende om de fotosynthetische prestaties van het weefsel te karakteriseren, omdat het een groot verschil maakt of al het invallende licht wordt geabsorbeerd door een paar cellen die een hoge intensiteit ervaren aan het oppervlak van het weefsel of veel cellen die lage intensiteiten ervaren gedurende het volume van het weefsel. In een tweede project werden deze sondes gebruikt om in vivo straling in de hersenen van een muis^{te meten 13,14}, waardoor de lichtomgeving van opsins diep in de hersenen tot expressie kwam^, werd gekarakteriseerd. Deze micro-sondes zijn zowel klein als gevoelig genoeg om de bestraling in het hersenweefsel van muizen te meten met alle vacht, huid en bot intact en tonen aan dat fysiologische lichtniveaus gemakkelijk hoog genoeg zijn om diepe hersenopsins te stimuleren.

Deze micro-optische sonde en meetopstelling kunnen nuttig zijn voor onderzoekers die het licht in biologisch weefsel moeten kwantificeren en karakteriseren, met name voor een genuanceerder begrip van fotosynthese of de functies van visuele pigmenten die buiten de ogen tot expressie komen. Deze methode kan alleen of in combinatie met andere technieken worden gebruikt om de optische eigenschappen en lichtvoortplanting in levend weefsel tegen lage kosten volledig te karakteriseren, met kleine draagbare apparatuur die in eigen huis is gebouwd en met taakafhankelijke instelbare parameters.

Protocol

Deze studie voldoet aan alle relevante ethische voorschriften van Yale University met betrekking tot gewervelde en ongewervelde dierproeven.

1. De optische microsonde bouwen

1. Bouw van de glazen huls, materiaal: Pasteur pipet, 5.75 in (zie tabel van materialen)
   1. Monteer met behulp van een monteerbare krokodillenklem (Table of Materials) de glazen pipet aan het brede uiteinde, zodat het taps toelopende uiteinde naar beneden is gericht naar de vloer en de oriëntatie van de pipet loodrecht op de vloer staat.
   2. Hang een plastic bankschroefgreep van 50 g (Table of Materials) aan het taps toelopende uiteinde van de pipet. Plaats een pad van elektrische tape tussen de pipet en de bankschroefgreep om slippen te voorkomen.
   3. Verwarm het taps toelopende uiteinde van de pipet met een kleine butaanbrander (Materiaaltabel). Breng de vlam 1 cm boven de bankschroefgreep aan. Houd de zaklamp zo vast dat het helderste deel van de vlam zich op 3 cm van het glas bevindt en het glas zich aan de punt van de vlam bevindt. Wanneer de lengte van de pipet met ongeveer 5 inch is toegenomen, verwijdert u onmiddellijk de vlam.
   4. Gebruik een kleine schaar of een glassnijder om het getrokken uiteinde van de pipet bij te snijden op het punt waar de nieuwe getrokken diameter ongeveer tweemaal zo groot is als die van de optische vezel die in de volgende sectie wordt gebruikt (zie stap 1.2). Vijl alle scherpe delen van het bijgesneden uiteinde af met carborundumpapier (materiaaltabel). Spoel eventuele resulterende kleine glasscherven of stof weg met behulp van een spuitfles isopropylalcohol gevolgd door perslucht.
2. Trekken aan de optische vezel (Figuur 1D)
   1. Gebruik een scheermesje om de optische vezel te verbreken en verwijder één SMA-connector van een SMA-geëindigde optische vezel met een diameter van 200 μm (Materiaaltabel). Knip dicht bij een van de SMA-beëindigingen. Gebruik vervolgens het scheermesje om de volgende 5 cm plastic en glasvezelmantel te verwijderen, zodat de kale optische vezel bloot komt te liggen en uitsteekt uit de rest van de intacte assemblage.
   2. Gebruik de butaanbrander om de polyimidepolymeercoating van de glasvezel af te branden. Afspoelen met isopropanol. Veeg de kale glasvezel schoon met een pluisvrij doekje.
   3. De volgende stap is om de kale vezel te monteren zodat deze ook met een vlam getrokken kan worden. Monteer het kale uiteinde van de optische vezel direct in een tangklem (Table of Materials) op een tafel of plankrand, waardoor het SMA-uiteinde van de vezel naar de vloer hangt. Voeg de gewichten voor het trekken in de vorm van twee kleine klemmen (totaalgewicht: 10 g) toe aan het ommantelde uiteinde van de vezel ongeveer 12 inch naar beneden van waar de kale optische vezel in de tangklem wordt gehouden.
   4. Om de vezel te trekken, begin je met de butaanbrandervlam aan. Houd met de vlam aan de butaanbrander 1 cm van de kale vezel zodat de vlam loodrecht op de optische vezel staat en 3 cm verticaal naar beneden van waar de tangklem de kale vezel vasthoudt. Laat de vezel uitrekken, trekken, scheiden en op de grond vallen.
   5. Onderzoek het resulterende getrokken optische vezeluiteinde. Schuur eventuele onregelmatigheden voorzichtig weg met carborundumpapier, reinig met isopropylalcohol en een pluisvrij doekje en droog af met perslucht.
      OPMERKING: Op dit punt kan men een microscoop gebruiken om de grootte en vorm van de getrokken vezel te karakteriseren en te documenteren.
   6. Gebruik een film-opaquing pen om de zijkanten van de vezel donkerder te maken en het binnendringen van strooilicht te voorkomen (Table of Materials). Trek de vezel voorzichtig over de punt van de pen en laat slechts een klein gebied aan de punt onbedekt.
3. Montage van de getrokken vezel in de glazen pipethuls (figuur 1A)
   1. Werk onder een stereomicroscoop, steek de taps toelopende optische vezel van stap 1.2 voorzichtig in het brede uiteinde van de gewijzigde glazen pipet van stap 1.1 en duw de vezel door totdat ~ 1 mm kale vezel uit het taps toelopende uiteinde van de pipet steekt.
   2. Bevestig met behulp van elektrische tape het ommantelde uiteinde van de optische vezel aan het brede uiteinde van de pipet.
   3. Breng een druppel cyanoacrylaatlijm aan op een naald met een kleine dikte (Materiaaltabel). Raak de druppel lijm voorzichtig aan op de snijrand van de getrokken pipet en vermijd het kale uiteinde van de getrokken vezel.
   4. Laat de capillaire werking de lijm in de pipet afvoeren, waardoor het gebied tussen de wand van de pipet en de optische vezel wordt bevochtigd. Laat de lijm minstens 15 minuten uitharden voordat u de sonde verplaatst.
4. De vezelpunt wijzigen met een verstrooiingsbol (figuur 1C)
   1. Maak de grondstof voor de strooikogelpunt door een druppel UV-uithardende lijm te mengen met titaniumdioxidepoeder (materiaaltabel) bij ~ 1: 1 v / v.
   2. Bevestig de sonde aan een micromanipulator met een montagestaafhouder (materiaaltabel), zodat de sonde zich in een horizontale oriëntatie bevindt. Bereid een werkend reservoir van het strooimateriaal door de punt van een draad of naald in het hierboven bereide kleefstof/TiO_2-mengsel te dopen, zodat zich een druppel kleefstof vormt. Monteer de draad of naald met de druppel in de buurt van de punt van de horizontale sonde. Het is handig om dit te doen met behulp van een krokodillenclip die op de bank is gemonteerd.
   3. Plaats een verstrooiingsbol op de punt van de sonde. Gebruik de micromanipulator om de punt van de optische vezel van de sonde langzaam en voorzichtig in de druppel lijm/TiO₂ te duwen. Trek vervolgens snel de punt uit de lijm. Herhaal dit twee tot drie keer totdat een bolvormige druppel lijm van de gewenste grootte op de punt van de optische vezel is afgezet.
      OPMERKING: De verstrooiingsbol zal stabiel zijn bij diameters van twee tot acht keer groter dan de diameter van de taps toelopende optische vezel. De uiteindelijke optimale grootte is afhankelijk van de uiteindelijke gewenste toepassing.
   4. Hardt de bol uit door het SMA-uiteinde van de optische vezel aan te sluiten op een vezelgekoppelde UV-lichtbron (Materiaaltabel).
      OPMERKING: De lichtbron die in deze studie werd gebruikt, had een vermogen van 5,3 mW. Bij dit vermogen is de aanbevolen uithardingstijd ten minste 12 uur of 's nachts. Na het uitharden is een goed moment om de grootte van de uiteindelijke optische sondepunt te karakteriseren en te meten.

2. Voorbereiding en montage van het weefsel voor optische metingen (figuur 2 en figuur 3)

1. Bereid de gerechten voor om de monsters te monteren voor een experiment. Verwarm het grote uiteinde van een Pasteur-pipet met behulp van een butaanbrander om een pons te maken om een gat met een diameter van 0,5 cm in de bodem van een plastic petrischaal van 35 mm x 10 mm te smelten. Sluit het gat aan de onderkant van de schaal af met elektrische tape of laboratoriumtape. Maak er meerdere tegelijk voor efficiëntie.
2. Bereid vloeibare gelatine (materiaaltabel) volgens de instructies op de verpakking.
   OPMERKING: Commerciële smaakloze gelatine van voedingskwaliteit uit de supermarkt is beter voor dit doel dan gelatine van chemische kwaliteit van chemische leveranciers, omdat de gelatine van chemische kwaliteit minder optisch helder en minder mechanisch betrouwbaar is dan het voedingsproduct.
3. Voer de dissectie en voorbereiding uit van het weefsel dat zal worden gebruikt.
   OPMERKING: Uit ervaring kan elk plat weefsel tot 1 cm dik in dit experiment met succes worden gemeten met behulp van elke dissectietechniek die geschikt is voor het systeem van belang. Voor gigantisch schelpweefsel werd een 8 mm biopsiepons gebruikt om een platte, regelmatige cirkel van schelpweefsel te maken voor gebruik in het experiment¹². Voor dit systeem kon slechts één monster tegelijk worden voorbereid, gezien de tijd die nodig was om een meting te voltooien om ervoor te zorgen dat het monster aan het einde van het experiment nog steeds in levensechte toestand was.
4. Vul twee petrischaaltjes uit stap 2.1 een kwart van de weg met de vloeibare gelatine en laat afkoelen tot kamertemperatuur (RT) net onder de gelatatie. Plaats in één schaal de biopsie in het kussen van viskeuze gelatine dat zich vormt in het gat in de bodem van de schaal. Gebruik een Pasteur-pipet om voorzichtig RT-gelatine rond de biopsie toe te voegen totdat de petrischaal vol is (figuur 3). Vul de tweede schaal met gelatine om een blanco monster te maken.
5. Plaats de monsterschalen ongeveer 10-30 minuten in de koelkast totdat de gelatine volledig is uitgehard en enigszins elastisch aanvoelt.
   LET OP: In een koele ruimte is dit misschien niet nodig; Bij het werken in de tropen is deze stap nodig om de gelatine volledig uit te harden.
6. Het maken van een houder voor de petrischaal op de micromanipulator (figuur 2)
   1. Snijd een vierkant van 6 cm x 6 cm van 1/4 in dik plexiglas (Table of Materials).
   2. Boor of smelt een gat in het plastic vierkant met dezelfde diameter als de petrischaal (~35 mm). Zorg ervoor dat de petrischaal goed in dit gat past en met wrijving op zijn plaats wordt gehouden. Voeg tape toe aan de randen van de schotel om de grootte en het wrijvingscontact iets te vergroten.
   3. Boor of smelt een gat met een diameter van 1/4 in de hoek van het plastic vierkant. Gebruik dit gat om het vierkant aan de micromanipulator te bevestigen met behulp van een 1/4 in schroef en bout.
   4. Bedek het plastic vierkant met zwarte elektrische tape om het strooilicht dat de sonde bereikt te verminderen. Gebruik ook tape om een rok rond de zijkanten van het vierkant te maken die zich uitstrekt onder de onderkant van de ingebrachte schaal (>10 mm) om strooilicht te verminderen (figuur 2B).
   5. Gebruik een bout en de juiste hardware om de petrischaalhouder aan een micromanipulator te bevestigen die driedimensionale aanpassingen en goed opgeloste verticale beweging mogelijk maakt over een mate die groter is dan de dikte van de monsters (deel 1 en deel 2 van de manipulator die in de materiaaltabel worden genoemd, zijn goede voorbeelden). Bevestig deze micromanipulator op een optisch breadboard.

3. Meetopstelling voor weefselbiopten

1. Monteer een lichtbron boven het gebied waar de meting plaatsvindt, zodat het licht wordt gecollimeerd wanneer het het vlak bereikt waar het monster zal worden geplaatst (figuur 2A). Bevestig bijvoorbeeld een collimaterende lens van 5 cm (Materiaalopgave) aan een vloeistoflichtgeleider van 5 mm (Materiaaltabel) en verhef deze met >0,6 m boven het monster met behulp van een bankschroef en frame die zijn bevestigd aan een optisch breadboard (Materiaalopgave). Sluit vervolgens de lichtgeleider aan op een breedbandlichtbron, zoals de plasmalichtbron die wordt vermeld in de materiaaltabel.
2. Bevestig de sonde aan een verticaal georiënteerde houder, zodat deze naar de lichtbron wijst. Bevestig de sonde met klemmen, slangklemmen of tape aan een optische tafelpost.
   OPMERKING: In het giant clam-experiment wordt een speciaal ontworpen staafhouder gebruikt, zoals de micromanipulator die in de materiaaltabel wordt vermeld. In dit werk werd het met magneten vastgezet aan een optisch breadboard (Table of Materials). De extra vrijheidsgraden voor uitlijning die worden verkregen door zowel de sonde als het monster op manipulatoren te hebben, zijn handig, maar niet vereist. Zorg ervoor dat u niet te veel aan de paal klemt, omdat dit de pipetbehuizing kan breken.
3. Plaats de monstermanipulator in de buurt van de verticaal gemonteerde sonde. Gebruik de monstermanipulator om de positie van de monsterfase zodanig aan te passen dat de sonde gecentreerd is in de opening van 0,5 cm aan de onderkant van de petrischaal. Wees uiterst voorzichtig om te voorkomen dat u de punt van de gemonteerde sonde aanraakt of stoot.
   OPMERKING: Een op de boom gemonteerde stereomicroscoop die boven het monstergebied is geplaatst, kan nuttig zijn. Op deze manier kan de top-down uitlijning van de sondepunt, het stadium en het monster worden bekeken voordat een experiment wordt gestart (figuur 2A).
4. Sluit het SMA-geëindigde uiteinde van de optische vezel van de sonde aan op een USB-glasvezelspectrometer (Table of Materials) en sluit de spectrometer aan op de computer met behulp van een USB-kabel.

4. Gegevensverzameling

1. Experimentele opstelling
   1. Zorg ervoor dat de sonde en manipulatoren precies zijn uitgelijnd waarin de gegevens worden verzameld, zoals in stap 3.4.
   2. Gebruik een wattenstaafje of fijnmazige naald om voorzichtig een kleine hoeveelheid siliconensmeermiddel (materiaaltabel) aan te brengen op het deel van de sonde dat in het weefsel wordt ingebracht om de wrijving tussen de zijkanten van de sonde en het weefselmonster te verminderen. Breng het siliconensmeermiddel opnieuw aan vóór elke basislijn- of weefselmeting.
   3. Verwijder de tape die het gat in de lege petrischaal van het monster bedekt en plaats deze in de monsterhouder (stap 2.7), zodat deze door wrijving stevig op zijn plaats wordt gehouden.
   4. Gebruik de micromanipulator om het monster op de sonde te laten zakken. Laat de sonde de gelatine binnendringen via het gat aan de onderkant van de petrischaal. Ga door totdat de sonde zich op ongeveer 5 mm van de onderkant van de gelatinelaag bevindt.
   5. Schakel de lichtbron in. Pas met behulp van de spectrometersoftware de integratietijd van de spectrometer aan totdat het signaal zo hoog mogelijk is, maar niet verzadigd. Stel het aantal gemiddelde scans in tussen twee en vijf en de waarde van de vloeiende pixels op zes. Bruikbare integratietijden in dit stadium kunnen variëren tussen 1-50 ms voor deze basislijn.
2. Verzamelen van de referentiespectra
   1. Verzamel een donkere meting.
      1. Zodra de spectrometerparameters zijn ingesteld met het blanco monster, maakt u de sondevezel los van de spectrometer en bedekt u de poort met de ondoorzichtige metalen afdekking die bij de spectrometer is geleverd.
      2. Verkrijg een donkere meting van de spectrometer (vaak met behulp van het donkere gloeilamppictogram in de GUI) om de ruis van de spectrometer zonder ingangslicht te karakteriseren. Sla deze meting op volgens de data-acquisitiestrategie.
   2. Verzamel een lampmeting. Sluit de sondevezel opnieuw aan op de spectrometer, wacht tot het signaal is gestabiliseerd en verkrijg een ander spectrum. Deze meting karakteriseert het licht dat de sonde bereikt via de gelatine in afwezigheid van weefsel.
3. Verzamelen van de weefselspectra
   1. Verwijder de tape op de bodem van de petrischaal en plaats deze in de monsterhouder.
   2. Lijn de monsterschaal uit met de sonde met behulp van driedimensionale manipulatie, zodat de weefselbiopsie boven de punt van de sonde wordt gecentreerd.
   3. Breng siliconengel aan op de sonde (zie 4.1.2) en laat het monster langzaam op de sonde zakken totdat de punt van de sonde door de gelatine is gegaan die het weefselmonster ondersteunt en net in het weefselmonster is gekomen.
      OPMERKING: Sommige spectrometers en computerprogramma's maken real-time monitoring van het gedetecteerde licht mogelijk. Gebruik dit om te bepalen wanneer de sonde het weefsel binnendringt. De spectrumintensiteit zal abrupt afnemen zodra de sondepunt in direct contact staat met het weefsel.
   4. Controleer of de integratietijd geschikt is voor de meting door ervoor te zorgen dat het gemeten spectrum niet te luidruchtig of verzadigd is. Wijzig indien nodig de integratietijd.
      1. Telkens wanneer de integratietijd wordt aangepast, voert u een nieuwe donkere meting uit en slaat u deze op (stap 4.2.1). Wijzig het aantal gemiddelde scans of het aantal afgevlakte pixels niet.
      2. Na het vinden van geschikte meetparameters, neemt u de metingen en slaat u het spectrum op.
   5. Verplaats het monster over een bepaalde afstand met behulp van de micromanipulator. Voor de manipulator die voor dit onderzoek werd gebruikt, was elk klein vinkje 0,001 in of 25,4 μm. Het monster werd door vijf vinkjes, of 127 μm, voor elke meting naar beneden verplaatst. Herhaal stap 4.3.4.
   6. Blijf de spectra opslaan op elke verticale positie in het weefsel.
      OPMERKING: Voor het hier beschreven systeem varieerden de vereiste integratietijden van 1 ms tot 5 s voor de metingen binnen een enkel weefselmonster. Uiteindelijk zal de sondepunt de bovenkant van het weefsel verlaten en daar zichtbaar zijn (figuur 4A). Dit is de laatste meting en karakteriseert de lichtinval aan de bovenkant van het weefsel.
4. Laden en verwerken van de gegevens
   1. Gebruik de software van de spectrometer om alle verzamelde spectra (donkere spectra, lampspectra en weefselmetingen) om te zetten in tekstbestanden met scheidingstekens.
   2. Gebruik Matlab of een codeertaal naar keuze om alle meetbestanden voor een monster te laden. Trek voor elk weefselmeetspectrum het donkere spectrum af met de bijbehorende integratietijd en deel het vervolgens door de integratietijd.
      OPMERKING: In deze studie werd een Matlab-script gebruikt voor het laden en verwerken van de gegevens (aanvullend bestand 1).
   3. Bereken het percentage invallend licht dat elke positie in het weefsel bereikt door de spectra verkregen met de sonde in het weefsel te delen door het basislijnspectrum verkregen in lege gelatine.
      OPMERKING: De meting aan de bovenkant van het weefsel (stap 4.3.6) moet sterk lijken op de nulmeting in gelatine (stap 4.1) en, wanneer verdeeld, dicht bij 100% liggen. Afhankelijk van de experimentele context kan het lampspectrum (het spectrum van lege gelatine of dat van de bovenkant van het weefsel) als referentie worden gebruikt. Het is echter nog steeds belangrijk om een lampspectrum te verzamelen voordat u met het experiment begint. Dit komt omdat, als de sonde breekt of het experiment anderszins faalt voordat de bovenkant van het weefsel is bereikt, de gegevens die vóór de storing zijn verkregen, nog steeds bruikbaar zijn, wat niet het geval is als er geen overeenkomstig initieel lampreferentiespectrum is.
   4. Visualiseer de data; contourplots kunnen nuttig zijn (figuur 4B).

Representative Results

Dit protocol beschrijft de procedure voor het construeren van een micro-optische sonde die kan worden gebruikt om de neerwaartse inwelling te meten (het licht dat een punt uit één richting bereikt) of, met de toevoeging van een lichtverstrooiende bolvormige punt, om de scalaire straling te meten (het licht dat een punt uit alle richtingen bereikt). Deze sondes kunnen straling meten met ruimtelijke resoluties die de lengteschalen van afzonderlijke cellen in levend weefsel benaderen. Dit protocol beschrijft ook een representatieve methode voor het voorbereiden van een weefselmonster voor bestralingsmetingen met behulp van de beschreven sonde en een representatieve methode voor het bekijken en analyseren van gegevens.

Figuur 1 toont de output van de productie van micro-probes. Wanneer eraan wordt getrokken, moet de optische vezel ongeveer 3 cm taps toelopen en geen krassen langs de taper hebben. Het moet ook plat zijn aan het einde en een diameter hebben van 15-30 μm (figuur 1D). De vlakheid van de punt kan worden verbeterd door het uiteinde te schuren met carborundumpapier of door te scoren en opnieuw te breken. Evenzo mag de getrokken glazen pipet die wordt gebruikt als de behuizing van de vezel geen scherpe of gebroken randen hebben. Wanneer de verstrooiingsbal wordt gevormd aan het uiteinde van de platte, gesneden punt van de vezel, moet deze bolvormig zijn (figuur 1C). Voor het uitharden kunnen misvormde exemplaren worden verwijderd door de bal nog een ronde in de bovenliggende lijmdruppel te steken en de vezel er snel uit te trekken. Een hoge bewegingssnelheid trekt de bal lijm van het uiteinde van de vezel. Langzamere bewegingen resulteren in extra lijmopbouw op de vezel. Het bekijken van het proces met behulp van een ontleedmicroscoop terwijl de vezel aan een lichtbron is bevestigd, is nuttig om het werk te visualiseren en te bepalen of het proces werkt. Het is belangrijk om de vezel in de glazen pipet vast te zetten met lijm en elektrische tape voordat u de strooilijm aanbrengt; anders kan de vezel breken of kan de lijm zich uitsmeren met de verschuivende vezel (figuur 1).

Figuur 2 toont het meetapparaat. In dit voorbeeld hebben de houders voor zowel het weefselmonster als de sonde aanpassingsmogelijkheden in drie dimensies (figuur 2). Het bevestigen van zowel het monster als de sonde aan manipulatoren helpt bij de uitlijning, maar is niet essentieel; De sonde kon aan een stilstaande paal worden bevestigd. De meest opgeloste bewegingen van de manipulatoren moeten in de verticale z-richting worden gericht, zodat de positie in het weefsel en/of de hoeveelheid die de sondes bewegen nauwkeurig kan worden bepaald (figuur 2A). Een op de boom gemonteerde stereomicroscoop kan nuttig zijn wanneer deze zo wordt geplaatst dat men het podium, de sonde en het monster door het oculair kan bekijken om de uitlijning van de sonde met het podium, de schotel en het monster te controleren (figuur 2B). Het is nuttig om de spectra in realtime te bekijken terwijl het monster op de sonde wordt neergelaten, want als het spectrum dat door de sonde wordt gemeten plotseling verandert, suggereert dit dat het monster zich met succes in het sterk verstrooiende of absorberende weefsel bevindt of dat de sonde buigt of breekt. Abrupte verschuivingen in de vorm en intensiteit van het spectrum wijzen hoogstwaarschijnlijk op weefselingang, terwijl abrupte intensiteitsveranderingen zonder een verandering in vorm suggereren dat de sonde buigt of breekt. Aan de bovenkant van het schelpweefsel bevindt zich een dun helder membraan dat de sonde niet kan binnendringen zonder te breken. In een dergelijk geval moet de bovenkant van het weefsel worden gecontroleerd om te zien wanneer de sonde op het punt staat te verlaten en moeten de metingen op dat punt worden gestopt, zodat de sonde niet breekt.

Figuur 3 toont het weefselbiopsiemonster ingebed in een petrischaal met gelatine, zoals beschreven in rubriek 2. Er is een gat in de bodem van de petrischaal om de optische sonde van onderaf in het weefsel te kunnen inbrengen. De biopsie heeft een diameter van 8 mm en is gecentreerd over het gat in de petrischaal (figuur 3A). Er is een kleine hoeveelheid gelatine onder het weefselmonster en de gelatine wordt gevuld tot de bovenkant van de schaal boven het weefsel (figuur 3B).

Figuur 4A toont de sonde wanneer deze de bovenkant van het weefsel begint te verlaten en figuur 4B toont de representatieve gegevens. Een Matlab-script (Aanvullend Bestand 2) werd gebruikt om de sporen in Figuur 4B te genereren. De x-as is de golflengte en de y-as is het percentage licht op weefseldiepte ten opzichte van het basislijnspectrum. Individuele metingen voor weefseldiepte worden aangegeven door de lijnen met grijsschaalkleuring. Metingen die dieper in het weefsel worden uitgevoerd, worden weergegeven door een donkerdere lijn. Het basisspectrum is de meting in een monster met alleen gelatine en wordt gebruikt om de lamp en de reactie van de sonde op de lamp te karakteriseren. Gelatine heeft een lichte absorptie en verstrooiing, wat betekent dat het signaal voor gelatineabsorptie tegen golflengte niet volledig vlak is. Daarom worden de spectra die door het hele weefsel worden genomen, gedeeld door het spectrum van de sonde in gelatine of door het spectrum van de sonde aan de bovenkant van het weefsel, zodat de spectrale gegevens in figuur 4B alleen het lichtpercentage voor het weefselmonster vertegenwoordigen en dus onafhankelijk zijn van de lichtbron; de gelatine en de specifieke kenmerken van elke individuele sonde.

Figuur 1: Fabricagestadia van de micro-optische intraweefselradiometriesonde . (A) Een schema van de optische sonde. (B) Een weergave van de voltooide optische sonde. (C) Een close-up van de verstrooiingsbol die is bevestigd aan de getrokken optische vezel in de glazen pipetsteun. (D) De getrokken en gereinigde optische vezel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Afbeeldingen en diagrammen van de experimentele opstelling voor het meten van scalaire straling in het weefsel . (A) Een algemeen schema en beeld van de experimentele opzet. B) Een close-up van de petrischaalhouder van het monster. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Clam tissue biopsie . (A) Boven- en (B) zijaanzichten van een biopsie van schelpweefsel klaar om te worden gemeten in de gewijzigde petrischaal gevuld met gelatine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Representatieve gegevens . (A) Microscoopbeeld van hoe de sonde eruit ziet wanneer hij door het weefsel naar boven komt. B) Representatieve gegevens verkregen met de intra-tissue radiometriesonde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand 1: Matlab-script dat wordt gebruikt voor het laden en verwerken van de gegevens. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Matlab-script dat wordt gebruikt om de sporen in figuur 4B te genereren. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Dit protocol beschrijft een techniek voor het systematisch karakteriseren van de optische omgeving door middel van een groot volume levend weefsel met een ruimtelijke resolutie ongeveer op de schaal van afzonderlijke cellen. Deze goedkope, flexibele en in het veld behandelbare methode kan nuttig zijn voor onderzoekers die de voortplanting van licht in levende systemen bestuderen. Uit ervaring, in vergelijking met bestaande methoden⁷, vereisen deze sondes iets meer oefening en vaardigheid om te bouwen, maar resulteren in minder weefselschade en het vermogen om grotere volumes dicht weefsel uitgebreider te karakteriseren.

Deze methode bestaat uit vier delen. Het eerste deel, het bouwen van de sonde, was geïnspireerd op eerdere apparaatontwerpen^10,11. De huidige aanpak is ontwikkeld voor systematische, minder destructieve scans van het geheel van dik weefsel, omdat de getrokken glazen naald voorzichtig tussen cellen kan schuiven. Het is ook geschikt voor gebruik in een veldlaboratorium^12,13,14. Dit protocol resulteert in sondes met ~20 μm diameter tips voor het meten van de downwelling radiance en een optionele 50-100 μm diameter verstrooiingsbol voor het meten van de scalaire bestraling. Grotere of kleinere scalaire bestralingsbollen kunnen worden ontwikkeld door de gebruikte materialen aan te passen, bijvoorbeeld een UV-uithardende lijm met een andere initiële viscositeit. Het gewicht in zowel het pipettrekken als het vezelproces kan worden aangepast om te resulteren in meer of minder taps toelopen. De verwarmingssnelheid kan ook worden gewijzigd door de afstand tot de fakkelvlam om het trekproces en de resulterende taps toelopende aan te passen.

De sondeconstructietechniek vereist enige handmatige vaardigheid en vallen en opstaan om te perfectioneren, maar kan betrouwbaar en snel worden met oefening. Hier worden enkele nuances voor probleemoplossing gepresenteerd die in de loop van de tijd zijn ontwikkeld. Het naar beneden trekken van de optische vezel van het ommantelde uiteinde resulteert in consistentere taps toelopende. Het is belangrijk om de opaquing-pen aan te brengen voordat u de bolvormige verstrooiingspunt toevoegt, omdat de bevochtigingseigenschappen van de ondoorzichtige inkt de vorming van een nette bal lijm aan de vezelpunt gunstig beïnvloeden. Als de resulterende kleefbal misvormd is, is het mogelijk om deze eraf te trekken en het opnieuw te proberen. Om dit te doen, kan de micromanipulator worden gebruikt om de hele bal in het lijmreservoir te schuiven en vervolgens heel langzaam terug te trekken. Dit trekt meestal de eerste, misvormde poging af, laat het in het lijmreservoir achter en maakt het mogelijk om het opnieuw te proberen.

Met zorg behandeld, kunnen deze sondes herhaaldelijk worden gebruikt voor verschillende monsters. Het grootste gevaar is het per ongeluk ergens tegenaan slaan van de sondepunt tijdens het verplaatsen. Tussen de metingen door moeten ze worden gereinigd van cellulair afval met behulp van isopropylalcohol en perslucht. De sondes kunnen ook wekenlang worden bewaard zolang de sondepunt niets aanraakt en er geen krachten op de glasvezelassemblage zijn die de tape en lijm die de sonde in de glazen huls houden, uit elkaar kunnen trekken. Dit kan worden bereikt door de vezel- en glaspipet op verschillende plaatsen aan de rand van een hoge plank te klemmen.

Het tweede en derde deel van deze methode hebben betrekking op de mechano-optische aspecten van het experiment en het beveiligen van het weefsel voor meting. Dit deel van de methode is speciaal ontwikkeld voor het meten van intra-weefsel scalaire bestraling in gigantisch schelpweefsel¹². Hier worden details gepresenteerd voor het oplossen van deze aspecten van de methode. Ten eerste moet de biopsie groot zijn ten opzichte van de sonde. Dit voorkomt dat de sonde het weefsel beweegt terwijl het passeert. Bovendien moet het weefsel op de bodem van de petrischaal zitten, zodat de elasticiteit en het gewicht van de gelatine samen het weefsel op zijn plaats houden tijdens de meting. Het is ook belangrijk dat de kamer koel genoeg is om de gelatine in een elastische, vaste toestand onder de experimentele lichtbron te houden. Evenzo helpt het om een LED of andere bron te gebruiken met relatief weinig warmteontwikkeling ten opzichte van zichtbaar licht.

De geometrische en optomechanische parameters van de methode zijn zeer flexibel. De scalaire bestralingssonde werd bijvoorbeeld gebruikt om de bestraling in de hersenen en het vetweefsel van een intacte muis te meten^13,14. Om dit te doen, werd de sonde op de manipulatoren op een standaard stereotactisch frame voor knaagdieren gemonteerd en werd de lichtbron naar het rostrum van de muis gericht. In elke geometrie is de sleutel tot het succesvolle gebruik van deze methode het verzamelen van de juiste lamp- en donkere referentiespectra aan het begin van een bepaalde meting. Als een sonde breekt tijdens een weefselmeting en er is geen initiële karakterisering zonder het weefsel op zijn plaats, zullen de gegevens moeilijk of onmogelijk te interpreteren zijn en zal het nodig zijn om opnieuw te beginnen met een nieuwe sonde. Daarentegen zijn deelmetingen, met de juiste referenties aan het begin, bruikbare gegevens.

Het laatste deel van deze methode betreft de data-acquisitie. Het gebruik van een glasvezelspectrometer voor het monitoren van signalen van de sonde wordt beschreven, wat het gemak van SMA-koppeling garandeert en volledig spectrale golflengte-informatie biedt. Voor systemen met een lagere fotonenflux is het echter ook mogelijk om deze sondes te koppelen aan fotomultiplicatorbuizen of lawinefotodiodes. In ieder geval vereisen alle detectoren referentiemetingen voor elke nieuwe meting. Daarom kunnen, met slechts kleine aanpassingen aan de beschreven methoden voor gegevensverzameling, alle verschillende soorten optische parameters worden gekarakteriseerd.

Toekomstige interessante toepassingen van deze methode kunnen de kwantificering van licht diep in de lichamen van grotere zoogdieren en in planten met complexe stralingsoverdrachtseigenschappen, zoals vetplanten, zijn.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1" travel ball bearing center+D11+A2:D31+A2:A2:D31	Edmond Optics	37-935	Part 2 of manipulator for lowering sample
1/4" thick acrylic sheet	McMaster-Carr	8505K754	For making Petri dish holder
3/4" mini spring clamp	Anvil	99693	Use as weight for pulling optical fiber
8 mm biopsy punch	Fisher Scientific	NC9324386	For tissue sample
Butane Torch	McMaster-Carr	MT-51	Heat source for pulling fiber and pipette
Collimating lens	Thorlabs	LLG5A1-A	To collimate light source through liquid light guide
Compressed air	McMaster-Carr	7437K35	For drying pulled fiber and pipette
Cyanoacrylate glue - liquid	McMaster-Carr	66635A31	For securing tapered fiber end at top of pulled pipette
Electrical tape	McMaster-Carr	76455A21	For securing fiber in pipette and for adding grip to clamps
Fine grade carborundum paper	McMaster-Carr	4649A24	Small triangle on exacto knife holder works well
Gelatin	Knox	10043000048679	For securing the tissue biopsy in the petri dish
Glass Pasteur Pipete	Fisher Scientific	13-678-20B	Disposable glass pipette 5.75" in length
Insulin syringes, 31G needle	BD	320440	For applying glue
Isopropanol	McMaster-Carr	54845T42	For cleaning pulled fiber and pipette
Kimwipe	Cole-Parmer	SKU 33670-04	For wiping optical fiber and glass pipette clean
LED driver	Thorlabs	LEDD1B	For powering the UV LEDs
Light source for measurements	Cole-Parmer	UX-78905-05	Low heat white light source for measurements
Linear metric X-Y-Z axis rack and pinion stage	Edmond Optics	55-023	Part 1 of manipulator for lowering sample
Liquid light guide	Thorlabs	LLG5-4T	For light source in measurements
Magnetic feet	Siskiyou	MGB 8-32	For use with magnetic strips
Magnetic strips	Siskiyou	MS-6.0	For mounting magnetically to breadboard
Manipulator #1	Siskiyou	MX10R	4-axis manipulator with pipette holder
Opaquer pen, small	WindowTint	TOP01	For opaquing side of optical fiber to prevent stray light from enter probe
Optical breadboard	Edmond Optics	03-640	For stable affixation of probe holder, sample, microscope and light source
Optical fibers	Ocean Optics	P-100-2-UV-VIS	About 4 fibers are good to have
Plasma light source	Thorlabs	HPLS345	For tissue radiometry measurements
Plastic plier clamp	McMaster-Carr	5070A11	Plier clamp used for weight in pulling pipette
Polystyrene Petri dishes	Thomas scientific	3488N10	Sample holders, enough volume to hold sample thickness plus ~10 mm of gelatin on top
Razor blades	McMaster-Carr	3962A3	For stripping jacketing from optical fiber
Silicone oil lubricant	Thomas scientific	1232E30	For reducing friction between probe and tissue
Software for analyzing data	Matlab		Chosen software for data analysis
Spectrometer + spectrometer software	Avantes	AvaSpec-2048L	Spectrometer can be any brand, this one is compatible with sma-terminated optical fibers and comes with its own software for running the spectrometer
Titanium dioxide powder	Sigma Aldrich	718467-100G	For making scattering sphere
Toolour tabletop clip	Toolour	Toolour0004	For holding pipette while pulling and for holding finished probes
Trigger-action bar clamps	mcMaster-Carr	51755A2	Good for holding optical fibers while pulling or curing
UV curable adhesive	Delo Photobond	GB368	For making scattering sphere
UV light source	Thorlabs	M365FP1	Light source for curing adhesive in scattering ball, this one is sma-fiber compatible, higher intensity = less cure time
White LED light source	Thorlabs	MCWHF2	For characterizing pulled fiber and scattering sphere