מיקרו-בדיקה רדיומטרית תוך-רקמתית למדידת קרינה באתרה ברקמה חיה

Summary

במאמר זה מתוארת שיטה למדידת קרינה באתרה ברקמה חיה. עבודה זו כוללת פירוט של בניית גשושיות בקנה מידה מיקרו למדידות שונות של קרינה וקרינה, מספקת הדרכה להרכבת רקמה לאפיון קרינה, ומתווה שיטות חישוביות לניתוח הנתונים המתקבלים.

Abstract

אורגניזמים נראים אטומים בעיקר משום ששכבות הרקמה החיצוניות שלהם מתפזרות בחוזקה לאור מאורע; פיגמנטים בעלי ספיגה חזקה, כגון דם, הם בדרך כלל בעלי ספיגה צרה, כך שהנתיב החופשי הממוצע של אור מחוץ לפסגות הספיגה יכול להיות ארוך למדי. מאחר שאנשים אינם יכולים לראות דרך רקמות, הם בדרך כלל מדמיינים שרקמות כמו המוח, השומן והעצם מכילות מעט אור או כלל לא. עם זאת, חלבוני אופסין מגיבים לאור באים לידי ביטוי בתוך רבות מהרקמות הללו, ותפקידיהם אינם מובנים היטב. קרינה פנימית לרקמה חשובה גם להבנת הפוטוסינתזה. לדוגמה, צדפות ענק סופגות חזק אך שומרות על אוכלוסייה צפופה של אצות עמוק ברקמה. התפשטות אור דרך מערכות כמו משקעים וביופילמים יכולה להיות מורכבת, והקהילות האלה יכולות להיות תורמות משמעותיות לפרודוקטיביות של מערכות אקולוגיות. לכן, פותחה שיטה לבניית מיקרו-גשושיות אופטיות למדידת קרינה סקלרית (שטף פוטונים החוצה נקודה) וקרינה יורדת (שטף פוטונים החוצה מישור בניצב) כדי להבין טוב יותר תופעות אלה בתוך רקמה חיה. טכניקה זו ניתנת לטיפול גם במעבדות שדה. מיקרו-גשושיות אלה עשויות מסיבים אופטיים שנמשכים בחום ומאובטחים בפיפטות זכוכית משוכות. כדי לשנות את הקבלה הזוויתית של הבדיקה, כדור בגודל 10-100 מיקרומטר של אפוקסי הניתן לריפוי UV מעורבב עם דו תחמוצת טיטניום מאובטח לאחר מכן לקצה של סיב משוך וגזוז. הבדיקה מוחדרת לרקמה חיה, ומיקומה נשלט באמצעות מיקרומניפולטור. בדיקות אלה מסוגלות למדוד את זוהר הרקמה באתרה ברזולוציות מרחביות של 10-100 מיקרומטר או בקנה מידה של תאים בודדים. גשושיות אלה שימשו לאפיון האור המגיע לתאי השומן והמוח הנמצאים 4 מ"מ מתחת לעורו של עכבר חי ולאפיון האור המגיע לעומקים דומים בתוך רקמת צדפות ענק עשירות באצות חיות.

Introduction

באופן מפתיע, לחיות יבשה ולשוכני אוקיינוס רדודים יש מספיק אור בתוך גופם לפיזיולוגיה חזותית ואפילו פוטוסינתזה. לדוגמה, רמות האור במרכז ראשו של עכבר (מחוץ לרצועות ספיגת ההמוגלובין החזקות) מוחלשות בשלושה או ארבעה סדרי גודל ביחס לעולם החיצון. זה בערך ההבדל בין רמות האור בתוך הבית ובחוץ. לכן, האטימות של רקמה או חומר עקב פיזור חזק אינה זהה לאטימות עקב בליעת אור חזקה. אור יכול להמשיך להתפשט למרחקים ארוכים במערכת פיזור חזק קדימה, בדומה לאור המתפשט דרך מערכות ימיות עם ריכוזים גבוהים של תאים וחלקיקים¹. תצפית זו בולטת במיוחד לאור העובדה שחלבוני אופסין באים לידי ביטוי כמעט בכל הרקמות של כל בעלי החיים. לכן, חשוב להבין כיצד והיכן האור נחלש ומפוזר בתוך רקמה חיה. עם זאת, בניגוד למערכות ימיות, עם רקמה חיה, אי אפשר לטבול מכשיר בעמודת המים ולקבל מדידות זוהר וקרינה, ויש צורך בטכניקה חדשה.

שיטות נוספות ששימשו בעבר לאפיון תכונות הבליעה והפיזור של רקמה חיה כוללות מדידת בדיקות החזרת רקמות ו/או שילוב כדורים^2,3, שיטות מיקרוסקופיות כגון סריקת מיקרוסקופ קונפוקלי⁴, מדידת דיפוזיה של אור לייזר על פני השטח^5, וטכניקות מידול כגון העברת קרינת מונטה קרלו⁶. שיטות הניסוי שהוזכרו דורשות לעיתים קרובות ציוד ספציפי, גדול ויקר או ידע מפורט על מבנה הרקמה ובדרך כלל מוגבלות ביכולתן לאפיין את המבנה המרחבי של האור בעומק הרקמה.

ישנן גם שיטות דומות מבוססות בדיקה המשתמשות במחט היפודרמית כדי להחדיר סיב אופטי דרך רקמה ^7,8,9. מניסיוננו, מחטים מהונדסות יעילות בניקור רקמות אך דורשות כוח רב ובדרך כלל קורעות רקמות עדינות כאשר הן עוברות דרך תאים צפופים. לכן, מחטים אלה דורשות בדרך כלל הליך כירורגי להחדיר יותר ממילימטר בערך לתוך שכבת רקמה. השיטה המתוארת כאן, באמצעות תמיכת זכוכית משומנת ומשוכה, מסוגלת להחליק בין תאים עם פגיעה מינימלית של הרקמה וללא ניתוח נוסף.

כתב יד זה מציג שיטה בהשראת עבודתם של יורגנסון ועמיתיו על מדידת אור בתוך מחצלות אצות^10,11, באמצעות מיקרו-גשושיות אופטיות נתמכות זכוכית ואלקטרוניקה ניידת המתאימות לחיטוט עמוק לתוך רקמות צפופות ולבנייה ושימוש בשטח. ניתן לבנות גשושיות אלה כדי לאפיין קרינה סקלרית (אור הפוגע בנקודה מכל הכיוונים) וקרינה יורדת (אור החוצה מישור אופקי) בתוך רקמה חיה ברזולוציות מרחביות גבוהות. גשושיות אלה פותחו במקור כדי למדוד מעבר קרינה בתוך הרקמה של צדפות ענק פוטוסימביוטיות¹². מדידות סטנדרטיות של ספיגה והעברה של הרקמה הכוללת לא הספיקו כדי לאפיין את הביצועים הפוטוסינתטיים של הרקמה, שכן זה משנה מאוד אם כל אור האירוע נבלע על ידי תאים בודדים החווים עוצמה גבוהה על פני השטח של הרקמה או תאים רבים החווים עוצמות נמוכות לאורך נפח הרקמה. בפרויקט שני, גשושיות אלה שימשו למדידת קרינה in vivo בתוך מוחו של עכבר^13,14, ובכך אפיינו את סביבת האור של אופסינים המתבטאים עמוק בתוך המוח. מיקרו-גשושיות אלה הן קטנות ורגישות מספיק כדי למדוד קרינה בתוך רקמת המוח של עכבר כאשר כל הפרווה, העור והעצם שלמים, ולהראות כי רמות האור הפיזיולוגי גבוהות מספיק בקלות כדי לעורר אופסינים בעומק המוח.

בדיקה מיקרו-אופטית זו ומערך מדידה זה יכולים להיות שימושיים לחוקרים הזקוקים לכמת ולאפיין את האור הפנימי לרקמה ביולוגית, במיוחד להבנה דקדקנית יותר של פוטוסינתזה או תפקודים של פיגמנטים חזותיים המתבטאים מחוץ לעיניים. ניתן להשתמש בשיטה זו לבד או בשילוב עם טכניקות אחרות כדי לאפיין באופן מלא את התכונות האופטיות והתפשטות האור בתוך רקמה חיה בעלות נמוכה, עם ציוד נייד קטן מובנה בתוך הבית ועם פרמטרים מתכווננים תלויי משימה.

Protocol

מחקר זה תואם את כל התקנות האתיות הרלוונטיות של אוניברסיטת ייל בנוגע למחקר בעלי חוליות וחסרי חוליות בבעלי חיים.

1. בניית המיקרו-בדיקה האופטית

1. בניית שרוול זכוכית, חומר: פיפטה פסטר, 5.75 אינץ' (ראה טבלת חומרים)
   1. בעזרת תפס תנין הניתן להרכבה (טבלת חומרים), הרכיבו את פיפטת הזכוכית בקצה הרחב כך שהקצה המחודד פונה כלפי מטה לכיוון הרצפה וכיוון הפיפטה מאונך לרצפה.
   2. תלו ידית אחיזה מפלסטיק של 50 גרם (טבלת חומרים) מהקצה המחודד של הפיפטה. הניחו כרית של סרט חשמלי בין פיפטה לבין ידית האחיזה כדי לסייע במניעת החלקה.
   3. מחממים את הקצה המחודד של הפיפטה בעזרת לפיד בוטאן קטן (טבלת חומרים). יש להפעיל את הלהבה 1 ס"מ מעל ידית האחיזה. החזיקו את הפנס כך שהחלק הבהיר ביותר של הלהבה יהיה במרחק של 3 ס"מ מהזכוכית והזכוכית נמצאת בקצה הלהבה. כאשר אורך הפיפטה גדל בכ-15 ס"מ, הסירו מיד את הלהבה.
   4. השתמש במספריים קטנים או בחותך זכוכית כדי לחתוך את הקצה הנמשך של פיפטה בנקודה שבה קוטר המשיכה החדש כפול בערך מזה של הסיב האופטי המשמש בסעיף הבא (ראה שלב 1.2). תייק את כל האזורים החדים בקצה החתוך באמצעות נייר קרבורונדום (Table of Materials). יש לשטוף את כל שברי הזכוכית או האבק הקטנים שנוצרו באמצעות בקבוק איזופרופיל אלכוהול ולאחר מכן אוויר דחוס.
2. משיכת הסיב האופטי (איור 1D)
   1. השתמש בסכין גילוח כדי לנתק את הסיב האופטי, והסר מחבר SMA אחד של סיב אופטי SMA בקוטר 200 מיקרומטר (תוכן חומרים). חתכו קרוב לאחת מסיומות ה-SMA. לאחר מכן, השתמש בסכין הגילוח כדי להסיר את 5 הס"מ הבאים של פלסטיק וציפוי פיברגלס, כך שהסיב האופטי החשוף ייחשף ויבלוט משאר המכלול השלם.
   2. השתמשו בלפיד הבוטאן כדי לשרוף את ציפוי פולימר הפולימיד מסיבי הזכוכית. יש לשטוף עם איזופרופנול. נגבו את סיבי הזכוכית החשופים באמצעות מגבון ללא סיבים.
   3. השלב הבא הוא להרכיב את הסיב החשוף כך שניתן יהיה למשוך אותו גם עם להבה. הרכיבו את הקצה החשוף של הסיב האופטי ישירות במהדק צבת (Table of Materials) על שולחן או קצה מדף, ואפשרו לקצה המסתיים SMA של הסיב להיתלות לכיוון הרצפה. הוסף את המשקולות למשיכה בצורה של שני מלחציים קטנים (משקל כולל: 10 גרם) על קצה הז'קט של הסיב כ -12 אינץ 'למטה מהמקום שבו מוחזק הסיב האופטי החשוף במהדק הצבת.
   4. כדי למשוך את הסיבים, התחילו עם להבת לפיד הבוטאן דולקת. כשהלהבה דולקת, החזיקו את לפיד הבוטאן במרחק של 1 ס"מ מהסיב החשוף כך שהלהבה תהיה בניצב לסיב האופטי ו-3 ס"מ למטה אנכית מהמקום שבו מהדק הצבת מחזיק את הסיב החשוף. אפשרו לסיב להימתח, למשוך, להפריד וליפול לרצפה.
   5. בדוק את קצה הסיב האופטי שנמשך כתוצאה מכך. יש לסלק בעדינות כל חריגה עם נייר קרבורונדום, לנקות עם אלכוהול איזופרופיל ומגבון ללא סיבים, ולייבש עם אוויר דחוס.
      הערה: בשלב זה, ניתן להשתמש במיקרוסקופ כדי לאפיין ולתעד את גודל וצורת הסיב המושך.
   6. השתמשו בעט אטום כדי להכהות את צידי הסיב ולמנוע כניסת אור תועה (Table of Materials). משכו בעדינות את הסיב לאורך קצה העט, והשאירו רק אזור קטן בקצה חשוף.
3. הרכבת הסיב המשוך בתוך שרוול פיפטת הזכוכית (איור 1A)
   1. עבודה תחת סטריאומיקרוסקופ, הכנס בזהירות את הסיב האופטי המחודד משלב 1.2 לקצה הרחב של פיפטת הזכוכית שהשתנתה משלב 1.1, ודחוף את הסיב דרך עד ~ 1 מ"מ של סיבים חשופים בולט מהקצה המחודד של הפיפטה.
   2. באמצעות סרט חשמלי, מחברים את קצה הסיב האופטי לקצה הרחב של הפיפטה.
   3. שים טיפה של דבק ציאנואקרילט על מחט קטנה (טבלה של חומרים). בזהירות לגעת טיפה של דבק בקצה לחתוך של פיפטה משוך, הימנעות הקצה החשוף של הסיב משוך.
   4. אפשר לפעולה נימית לפתל את הדבק לתוך הפיפטה, להרטיב את האזור שבין דופן פיפטה לבין הסיב האופטי. הניחו לדבק להירפא למשך 15 דקות לפחות לפני הזזת מכלול הבדיקה.
4. שינוי קצה הסיב בעזרת כדור פיזור (איור 1C)
   1. צור את חומר הגלם עבור קצה כדור הפיזור על ידי ערבוב טיפה של דבק הניתן לריפוי UV עם אבקת טיטניום דו חמצני (טבלה של חומרים) ב ~ 1: 1 v/v.
   2. חבר את הגשושית למיקרומניפולטור עם מחזיק מוטות הרכבה (טבלה של חומרים) כך שהגשושית תהיה בכיוון אופקי. מכינים מיכל עבודה של חומר הפיזור על ידי טבילת קצה חוט או מחט בתערובת הדבק/TiO₂ שהוכנה לעיל כך שתיווצר טיפת דבק. הר את החוט או המחט עם הטיפה ליד קצה הבדיקה האופקית. נוח לעשות זאת באמצעות קליפס תנין המותקן על הספסל.
   3. הפקד כדור פיזור על קצה הגשוש. השתמש במיקרומניפולטור כדי לדחוף לאט ובזהירות את קצה הסיב האופטי של הגשושית לתוך טיפת הדבק/TiO₂. לאחר מכן, למשוך במהירות את קצה מן הדבק. חזור על הפעולה פעמיים עד שלוש עד שטיפה כדורית של דבק בגודל הרצוי מונחת על קצה הסיב האופטי.
      הערה: כדור הפיזור יהיה יציב בקטרים הגדולים פי שניים עד פי שמונה מקוטר הסיב האופטי המחודד. הגודל האופטימלי הסופי תלוי ביישום הרצוי הסופי.
   4. רפא את הכדור על ידי חיבור הקצה המסתיים SMA של הסיב האופטי למקור אור UV מצומד סיבים (טבלה של חומרים).
      הערה: מקור האור ששימש במחקר זה היה בהספק של 5.3 mW. בשלב זה, זמן הריפוי המומלץ הוא לפחות 12 שעות או לילה. לאחר הריפוי הוא זמן טוב לאפיין ולמדוד את גודל קצה הבדיקה האופטית הסופי.

2. הכנה והרכבה של הרקמה למדידות אופטיות (איור 2 ואיור 3)

1. הכינו את הכלים כדי להרכיב את הדגימות לניסוי. מחממים את הקצה הגדול של פיפטת פסטר באמצעות לפיד בוטאן כדי ליצור אגרוף להמסת חור בקוטר 0.5 ס"מ בתחתית צלחת פטרי מפלסטיק בגודל 35 מ"מ x 10 מ"מ. אטמו את החור בצד התחתון של הצלחת בעזרת סרט חשמלי או סרט מעבדה. בצע כמה בכל פעם ליעילות.
2. הכינו ג'לטין נוזלי (טבלת חומרים) בהתאם להוראות שעל האריזה.
   הערה: ג'לטין מסחרי ללא טעם באיכות מזון מהמכולת עדיף למטרה זו מאשר ג'לטין באיכות כימית מספקים כימיים מכיוון שהג'לטין ברמה כימית פחות ברור אופטית ופחות אמין מכנית ממוצר המזון.
3. בצע את הדיסקציה וההכנה של הרקמה שתשמש.
   הערה: מניסיון, כל רקמה שטוחה בעובי של עד 1 ס"מ ניתנת למדידה מוצלחת בניסוי זה באמצעות כל טכניקת דיסקציה המתאימה למערכת העניין. עבור רקמת צדפה ענקית, נעשה שימוש בניקוב ביופסיה של 8 מ"מ כדי ליצור עיגול שטוח וסדיר של רקמת צדפה לשימוש בניסוי¹². עבור מערכת זו, רק דגימה אחת יכולה להיות מוכנה ביעילות בכל פעם בהתחשב במשך הזמן הדרוש להשלמת מדידה כדי להבטיח שהדגימה עדיין הייתה במצב דמוי חיים בסוף הניסוי.
4. מלאו שתי צלחות פטרי משלב 2.1 רבע מהדרך בג'לטין הנוזלי, ותנו להתקרר לטמפרטורת החדר (RT) רק לפני הג'לציה. בצלחת אחת, מניחים את הביופסיה בכרית של ג'לטין צמיג שנוצר בחור בתחתית המנה. השתמשו בפיפטה של פסטר כדי להוסיף בעדינות ג'לטין RT סביב הביופסיה עד שצלחת הפטרי מלאה (איור 3). ממלאים את המנה השנייה בג'לטין כדי ליצור מדגם ריק.
5. הכניסו את הכלים לדוגמה למקרר למשך כ-10-30 דקות עד שהג'לטין נרפא לחלוטין ואלסטי מעט למגע.
   הערה: בחדר קריר, ייתכן שלא יהיה צורך בכך; כאשר עובדים באזורים הטרופיים, שלב זה נדרש כדי לרפא באופן מלא את הג'לטין.
6. יצירת תושבת עבור צלחת הפטרי על המיקרומניפולטור (איור 2)
   1. חותכים ריבוע בגודל 6X6 ס"מ של 1/4 בפרספקס עבה (טבלת חומרים).
   2. לקדוח או להמיס חור בריבוע הפלסטיק באותו קוטר כמו צלחת פטרי (~ 35 מ"מ). ודאו שצלחת הפטרי מתאימה היטב לחור הזה ומוחזקת במקומה עם חיכוך. מוסיפים סרט הדבקה לקצוות המנה כדי להגדיל מעט את הגודל ואת מגע החיכוך.
   3. קודחים או ממיסים חור בקוטר 1/4 בפינת ריבוע הפלסטיק. השתמש בחור זה כדי לחבר את הריבוע למיקרומניפולטור באמצעות 1/4 בורג ובריח.
   4. כסו את ריבוע הפלסטיק בסרט חשמלי שחור כדי להפחית את האור התועה המגיע לבדיקה. באופן דומה, השתמשו בסרט הדבקה כדי ליצור חצאית סביב צידי הריבוע הנמשכת מתחת לתחתית התבנית המוחדרת (>10 מ"מ) כדי להפחית את האור התועה (איור 2B).
   5. השתמש בבורג ובחומרה מתאימה כדי לחבר את מחזיק צלחת הפטרי למיקרומניפולטור המאפשר התאמות תלת ממדיות ותנועה אנכית פתורה היטב על פני היקף גדול מעובי הדגימות (חלק 1 וחלק 2 של המניפולטור המוזכרים בטבלת החומרים הם דוגמאות טובות). הצמד מיקרומניפולטור זה ללוח לחם אופטי.

3. מערך מדידה לביופסיות רקמה

1. הרכיבו מקור אור מעל האזור שבו מתבצעת המדידה, כך שהאור יתנגש כאשר הוא יגיע למישור שבו תמוקם הדגימה (איור 2A). לדוגמה, חברו עדשה מתנגשת בקוטר 5 ס"מ (Table of Materials) למדריך אור נוזלי בקוטר 5 מ"מ (Table of Materials), והגביהו מעל הדגימה ב-0.6 מ' > באמצעות סגן ומסגרת המחוברים ללוח לחם אופטי (Table of Materials). לאחר מכן, חבר את מדריך האור למקור אור בפס רחב, כגון מקור אור הפלזמה המופיע בטבלת החומרים.
2. חבר את הגשושית לתושבת בכיוון אנכי כך שתצביע לעבר מקור האור. אבטח את הבדיקה באמצעות מלחציים, מהדקי צינור או סרט דבק לעמוד שולחן אופטי.
   הערה: בניסוי צדפות ענק, נעשה שימוש במחזיק מוט שעוצב במיוחד, כגון המיקרומניפולטור המופיע בטבלת החומרים. בעבודה זו הוא אובטח באמצעות מגנטים ללוח לחם אופטי (Table of Materials). דרגות החופש הנוספות ליישור המתקבלות על ידי הימצאות הן של הגשושית והן של הדגימה על מניפולטורים הן נוחות אך אינן נדרשות. היזהר לא להיצמד יתר על המידה לפוסט, מכיוון שזה יכול לשבור את בית הפיפטה.
3. מקם את מניפולטור הדגימה ליד הגשושית המותקנת אנכית. השתמש במניפולטור הדגימה כדי להתאים את מיקום שלב הדגימה כך שהבדיקה ממורכזת בפתח של 0.5 ס"מ בתחתית צלחת הפטרי. יש לנקוט משנה זהירות כדי להימנע מלגעת או להיתקל בקצה הגשושית המותקנת.
   הערה: סטריאומיקרוסקופ רכוב על בום הממוקם מעל אזור הדגימה יכול להיות שימושי. בדרך זו ניתן לראות את היישור מלמעלה למטה של קצה הגשושית, השלב והדגימה לפני תחילת ניסוי (איור 2A).
4. חבר את הקצה המסתיים ב-SMA של הסיב האופטי של הגשושית לספקטרומטר סיב אופטי USB (Table of Materials), וחבר את הספקטרומטר למחשב באמצעות כבל USB.

4. איסוף נתונים

1. מערך ניסיוני
   1. יש את הבדיקה ואת מניפולטורים במצב מיושר בדיוק שבו הנתונים ייאספו, כמו בשלב 3.4.
   2. השתמש במקלון צמר גפן או מחט מדידה עדינה כדי למרוח בזהירות כמות קטנה של חומר סיכה סיליקון (טבלה של חומרים) על החלק של הבדיקה שיוכנס לתוך הרקמה כדי להפחית את החיכוך בין הצדדים של הבדיקה לבין דגימת הרקמה. מרחו מחדש את חומר הסיכה מסיליקון לפני כל מדידה בסיסית או רקמה.
   3. הסר את סרט הדבק המכסה את החור בצלחת פטרי הדגימה הריקה, והנח אותו במחזיק הדגימה (שלב 2.7), וודא שהוא מוחזק היטב במקומו על ידי חיכוך.
   4. השתמש במיקרומניפולטור כדי להוריד את הדגימה אל הבדיקה. אפשרו לגשושית להיכנס לג'לטין דרך החור בחלק התחתון של צלחת הפטרי. ממשיכים עד שהבדיקה נמצאת במרחק של כ-5 מ"מ מתחתית שכבת הג'לטין.
   5. הפעל את מקור האור. באמצעות תוכנת הספקטרומטר, התאם את זמן שילוב הספקטרומטר עד שהאות גבוה ככל האפשר אך לא רווי. הגדר את מספר הסריקות הממוצע בין שתיים לחמש ואת ערך הפיקסלים המחליקים על שש. זמני שילוב שמישים בשלב זה עשויים לנוע בין 1-50 אלפיות השנייה עבור תוכנית בסיסית זו.
2. איסוף ספקטרום הייחוס
   1. אספו מדידה כהה.
      1. לאחר הגדרת פרמטרי הספקטרומטר עם הדגימה הריקה, נתקו את סיב הגשושית מהספקטרומטר, וכסו את היציאה בכיסוי המתכת האטום שהגיע עם הספקטרומטר.
      2. קבל מדידה כהה מהספקטרומטר (לעתים קרובות באמצעות סמל הנורה הכהה בממשק המשתמש הגרפי) כדי לאפיין את רעש הספקטרומטר ללא אור קלט. שמור מדידה זו בהתאם לאסטרטגיית איסוף הנתונים.
   2. אספו מדידת מנורה. חברו מחדש את סיב הגשושית לספקטרומטר, המתינו עד שהאות יתייצב ורכשו ספקטרום נוסף. מדידה זו מאפיינת את האור המגיע לגשושית דרך הג'לטין בהיעדר רקמה.
3. איסוף ספקטרום הרקמה
   1. הסר את הסרט בתחתית צלחת פטרי הדגימה, והניחו אותו במחזיק הדגימה.
   2. יישרו את צלחת הדגימה עם הבדיקה באמצעות מניפולציה תלת ממדית כך שביופסיה הרקמה ממורכזת מעל קצה הבדיקה.
   3. מרחו ג'ל סיליקון על הבדיקה (ראו 4.1.2), והורידו את הדגימה לאט לאט אל הבדיקה עד שקצה הבדיקה עבר דרך הג'לטין התומך בדגימת הרקמה ונכנס זה עתה לדגימת הרקמה.
      הערה: ספקטרומטרים ותוכנות מחשב מסוימים מאפשרים ניטור בזמן אמת של האור שזוהה. השתמש באפשרות זו כדי לקבוע מתי הבדיקה נכנסת לרקמה. עוצמת הספקטרום תרד בפתאומיות ברגע שקצה הבדיקה נמצא במגע ישיר עם הרקמה.
   4. ודא שזמן האינטגרציה מתאים למדידה על ידי הבטחה שהספקטרום הנמדד אינו רועש מדי או רווי. שנה את זמן השילוב במידת הצורך.
      1. בכל פעם שזמן האינטגרציה מותאם, בצע ואחסן מדידה כהה חדשה (שלב 4.2.1). אין לשנות את מספר הסריקות הממוצע או את מספר הפיקסלים המוחלקים.
      2. לאחר מציאת פרמטרי מדידה מתאימים, קחו את המדידות ושמרו את הספקטרום.
   5. הזז את הדגימה למרחק מסוים באמצעות המיקרומניפולטור. עבור המניפולטור ששימש למחקר זה, כל סימן שנתות קטן היה 0.001 אינץ 'או 25.4 מיקרומטר. הדגימה הועברה למטה דרך חמישה סימני שנת, או 127 מיקרומטר, עבור כל מדידה. חזור על שלב 4.3.4.
   6. המשך לשמור את הספקטרום בכל מיקום אנכי בתוך הרקמה.
      הערה: עבור המערכת המתוארת כאן, זמני האינטגרציה הנדרשים נעו בין 1ms ל- 5 s עבור המדידות בתוך דגימת רקמה אחת. בסופו של דבר, קצה הבדיקה ייצא מהחלק העליון של הרקמה וייראה שם (איור 4A). זוהי המדידה הסופית ומאפיינת את אירוע האור בחלק העליון של הרקמה.
4. טעינה ועיבוד של הנתונים
   1. השתמש בתוכנת הספקטרומטר כדי להמיר את כל הספקטרום שנאסף (ספקטרום כהה, ספקטרום מנורות ומדידות רקמות) לקבצי טקסט מופרדים.
   2. באמצעות Matlab או שפת קידוד לפי בחירה, טענו את כל קובצי המדידה לדגימה. עבור כל ספקטרום מדידת רקמות, החסר את הספקטרום הכהה עם זמן האינטגרציה התואם, ולאחר מכן חלק אותו בזמן האינטגרציה.
      הערה: במחקר זה, נעשה שימוש בסקריפט Matlab לטעינה ולעיבוד של הנתונים (קובץ משלים 1).
   3. חשב את אחוז האור המקרי המגיע לכל מיקום ברקמה על ידי חלוקת הספקטרום המתקבל עם הגשושית בתוך הרקמה בספקטרום קו הבסיס המתקבל בג'לטין ריק.
      הערה: המדידה בחלק העליון של הרקמה (שלב 4.3.6) צריכה להיות דומה מאוד למדידת קו הבסיס בג'לטין (שלב 4.1), וכאשר היא מחולקת, צריכה להיות קרובה ל-100%. בהתאם להקשר הניסויי, ספקטרום המנורה (הספקטרום מג'לטין ריק או זה מהחלק העליון של הרקמה) יכול לשמש כנקודת התייחסות. עם זאת, עדיין חשוב לאסוף ספקטרום מנורה לפני תחילת הניסוי. הסיבה לכך היא שאם הגשושית נשברת או שהניסוי נכשל בדרך אחרת לפני שהגיע לחלק העליון של הרקמה, הנתונים שהתקבלו לפני הכישלון עדיין שמישים, וזה לא המקרה אם אין ספקטרום ייחוס ראשוני מתאים של המנורה.
   4. הצג את הנתונים באופן חזותי; חלקות מתאר יכולות להיות מועילות (איור 4B).

Representative Results

פרוטוקול זה מתאר את ההליך לבניית גשושית מיקרו-אופטית שניתן להשתמש בה כדי למדוד את הקרינה היורדת (האור המגיע לנקודה מכיוון אחד) או, בתוספת קצה כדורי מפזר אור, למדוד את הקרינה הסקלרית (האור המגיע לנקודה מכל הכיוונים). בדיקות אלה יכולות למדוד קרינה ברזולוציות מרחביות המתקרבות לסקאלות האורך של תאים בודדים בתוך רקמה חיה. פרוטוקול זה מתאר גם שיטה מייצגת להכנת דגימת רקמה למדידות קרינה באמצעות הגשושית המתוארת ושיטה מייצגת לצפייה וניתוח נתונים.

איור 1 מראה את התפוקה של ייצור מיקרו-גשושיות. בעת משיכה, הסיב האופטי צריך להתחדד במשך כ -3 ס"מ ולא יהיו שריטות לאורך הטייפר. הוא גם צריך להיות שטוח בקצה ולהיות בקוטר של 15-30 מיקרומטר (איור 1D). ניתן לשפר את השטיחות של הקצה על ידי שיוף הקצה עם נייר קרבורונדום או ניקוד ושבירה שוב. באופן דומה, פיפטת הזכוכית הנמשכת המשמשת כבית הסיב לא צריכה להיות בעלת קצוות חדים או שבורים. כאשר כדור הפיזור נוצר בקצה השטוח והחתוך של הסיב, הוא צריך להיות כדורי (איור 1C). לפני הריפוי, ניתן להסיר מעוותים על ידי סיבוב נוסף של החדרת הכדור לטיפת הדבק האב ומשיכה מהירה של הסיב החוצה. מהירות תנועה מהירה תמשוך את כדור הדבק מקצה הסיב. תנועות איטיות יותר גורמות לבניית דבק נוסף על הסיב. צפייה בתהליך באמצעות מיקרוסקופ מנתח בזמן שהסיב מחובר למקור אור מועילה להמחשת העבודה ולקביעה אם התהליך עובד. חשוב לאבטח את הסיב בתוך פיפטת הזכוכית באמצעות דבק וסרט חשמלי לפני החלת דבק הפיזור; אחרת, הסיב עלול להישבר, או שהדבק עלול להימרח עם הסיב המשתנה (איור 1).

איור 2 מראה את מנגנון המדידה. בדוגמה זו, למחזיקים הן עבור דגימת הרקמה והן עבור הגשושית יש יכולות התאמה בשלושה ממדים (איור 2). הצמדת הדגימה והבדיקה למניפולטורים מסייעת ביישור אך אינה חיונית; ניתן היה לחבר את הגשושית לעמדה נייחת. התנועות הפתורות ביותר של המניפולטורים צריכות להיות מכוונות בכיוון האנכי, בכיוון z, כך שניתן יהיה לקבוע במדויק את המיקום ברקמה ו/או את הכמות שבה הגשושיות נעות (איור 2A). סטריאומיקרוסקופ רכוב על בום יכול להיות שימושי כאשר הוא ממוקם כך שניתן לראות את הבמה, הגשושית והדגימה דרך העינית כדי לבדוק את היישור של הגשושית עם הבמה, הצלחת והדגימה (איור 2B). צפייה בספקטרום בזמן אמת תוך הורדת הדגימה אל הגשושית מועילה מכיוון שאם הספקטרום שנמדד על ידי הגשושית משתנה פתאום, הדבר מצביע על כך שהדגימה ממוקמת בהצלחה בתוך הרקמה המתפזרת או הבולעת מאוד או שהגשושית מתכופפת או נשברת. שינויים פתאומיים בצורה ובעוצמה של הספקטרום מצביעים ככל הנראה על כניסה לרקמה, בעוד ששינויי עוצמה פתאומיים ללא שינוי צורה מצביעים על כך שהגשושית מתכופפת או נשברת. בחלק העליון של רקמת הצדפות, יש קרום דק ושקוף כי הבדיקה לא יכול לחדור בלי להישבר. במקרה כזה, יש לעקוב אחר החלק העליון של הרקמה כדי לראות מתי הגשושית עומדת לצאת, ולעצור את המדידות בנקודה זו כדי שהבדיקה לא תישבר.

איור 3 מראה את דגימת ביופסיית הרקמה המשובצת בצלוחית פטרי של ג'לטין, כמתואר בסעיף 2. יש חור בתחתית צלחת הפטרי כדי לאפשר את החדרת הגשושית האופטית לרקמה מתחת. קוטר הביופסיה הוא 8 מ"מ והיא ממורכזת מעל החור בצלוחית הפטרי (איור 3A). יש כמות קטנה של ג'לטין מתחת לדגימת הרקמה, והג'לטין ממולא עד החלק העליון של הצלחת מעל הרקמה (איור 3B).

איור 4A מראה את הגשושית כשהיא מתחילה לצאת מהחלק העליון של הרקמה, ואיור 4B מראה את הנתונים המייצגים. סקריפט Matlab (קובץ משלים 2) שימש ליצירת העקבות באיור 4B. ציר ה-x הוא אורך הגל, וציר ה-y הוא אחוז האור בעומק רקמה ביחס לספקטרום קו הבסיס. מדידות בודדות לעומק הרקמה מסומנות על ידי הקווים עם צבע בקנה מידה אפור. מדידות שנלקחות עמוק יותר ברקמה מיוצגות על ידי קו כהה יותר. ספקטרום קו הבסיס הוא המדידה בדגימת ג'לטין בלבד ומשמש לאפיון המנורה ותגובת הגשושית למנורה. לג'לטין יש בליעה ופיזור קלים, כלומר האות לבליעת ג'לטין כנגד אורך הגל אינו שטוח לחלוטין. לכן, הספקטרום שנלקח לאורך הרקמה מחולק על ידי הספקטרום של הגשושית בג'לטין או על ידי הספקטרום של הגשושית בחלק העליון של הרקמה, כך שהנתונים הספקטרליים המוצגים באיור 4B מייצגים את אחוז האור רק עבור דגימת הרקמה ולכן אינם תלויים במקור האור, את הג'לטין, ואת הפרטים של כל בדיקה בודדת.

איור 1: שלבי הייצור של הגשושית הרדיומטרית התוך-רקמתית המיקרו-אופטית. (A) סכמה של הגשושית האופטית. (B) מבט על הגשושית האופטית המוגמרת. (C) תקריב של כדור הפיזור המחובר לסיב האופטי הנמשך בתוך תמיכת צינור הזכוכית. (D) הסיב האופטי שנמשך ונוקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: תמונות ודיאגרמות של מערך הניסוי למדידת קרינה סקלרית בתוך הרקמה . (A) סכמה כוללת ותמונה של מערך הניסוי. (B) תקריב של מחזיק צלחת פטרי לדוגמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: ביופסיה של רקמת צדפה. (A) מבט מלמעלה ו-(B) מבט מהצד על ביופסיה של רקמת צדפה מוכנה למדידה בצלחת פטרי שהשתנתה מלאה בג'לטין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: נתונים מייצגים . (A) תמונה במיקרוסקופ של איך הגשושית נראית כשהיא עולה דרך הרקמה. (B) נתונים מייצגים שהתקבלו באמצעות בדיקת רדיומטריה תוך-רקמתית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1: סקריפט Matlab המשמש לטעינה ולעיבוד הנתונים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2: סקריפט Matlab המשמש ליצירת העקבות באיור 4B. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר טכניקה לאפיון שיטתי של הסביבה האופטית באמצעות נפח גדול של רקמה חיה ברזולוציה מרחבית בערך בקנה מידה של תאים בודדים. שיטה זולה, גמישה וניתנת לעיבוד שדה זו יכולה להיות שימושית לכל חוקר החוקר את התפשטות האור בתוך מערכות חיות. מניסיון, בהשוואה^{לשיטות 7} הקיימות, בדיקות אלה דורשות מעט יותר תרגול ומיומנות כדי לבנות אך מביאות לפחות נזק לרקמות וליכולת לאפיין באופן מקיף יותר נפחים גדולים יותר של רקמה צפופה.

שיטה זו מורכבת מארבעה חלקים. החלק הראשון, בניית הגשושית, נוצר בהשראת עיצובים קודמים של מכשירים^10,11. הגישה הנוכחית פותחה עבור סריקות שיטתיות ופחות הרסניות של כל הרקמה העבה, שכן מחט הזכוכית הנמשכת יכולה להחליק בעדינות בין תאים. זה גם מקובל לשימוש במעבדת שדה^12,13,14. פרוטוקול זה יוצר גשושיות עם קצוות בקוטר ~20 מיקרומטר למדידת הקרינה כלפי מטה וכדור פיזור אופציונלי בקוטר 50-100 מיקרומטר למדידת הקרינה הסקלרית. ניתן לפתח כדורי קרינה סקלריים גדולים או קטנים יותר על ידי שינוי החומרים המשמשים, למשל, דבק הניתן לריפוי UV עם צמיגות התחלתית שונה. ניתן לכוונן את המשקל הן במשיכת פיפטה והן בתהליך הסיבים כדי לגרום לירידה פחות או יותר. ניתן לשנות את קצב החימום גם באמצעות המרחק מלהבת הלפיד כדי להתאים את תהליך המשיכה ואת הטייפר המתקבל.

טכניקת בניית הגשושית דורשת מיומנות ידנית מסוימת וניסוי וטעייה כדי לשכלל, אך יכולה להפוך לאמינה ומהירה עם תרגול. כאן מוצגים כמה ניואנסים לפתרון בעיות שפותחו לאורך זמן. משיכת הסיב האופטי מטה מהקצה המכוסה במעטפת יוצרת טייפרים עקביים יותר. חשוב למרוח את העט האטום לפני הוספת קצה הפיזור הכדורי, שכן תכונות ההרטבה של הדיו האטום משפיעות לטובה על היווצרות כדור דבק מסודר בקצה הסיב. אם כדור הדבק שנוצר מעוות, ניתן למשוך אותו ולנסות שוב. כדי לעשות זאת, micromanipulator ניתן להשתמש כדי להחליק את הכדור כולו לתוך מאגר דבק ולאחר מכן נסוג לאט מאוד. פעולה זו בדרך כלל מושכת את הניסיון הראשון, המעוות, משאירה אותו במאגר הדבק ומאפשרת לנסות שוב.

מטופלים בזהירות, בדיקות אלה ניתן להשתמש שוב ושוב עבור דגימות שונות. הסכנה הגדולה ביותר היא להפיל בטעות את קצה הגשושית לתוך משהו תוך כדי הזזתו. בין מדידה, יש לנקות אותם מפסולת תאית באמצעות אלכוהול איזופרופיל ואוויר דחוס. ניתן לאחסן את הגשושיות במשך שבועות כל עוד קצה הגשושית אינו נוגע בשום דבר ואין כוחות על מכלול הסיב האופטי שעלולים לפרק את הסרט והדבק המחזיקים את הגשושית בתוך שרוול הזכוכית. ניתן להשיג זאת על ידי הידוק פיפטת הסיבים והזכוכית במספר מקומות לקצה מדף גבוה.

החלק השני והשלישי של שיטה זו כוללים את ההיבטים המכנו-אופטיים של הניסוי ואבטחת הרקמה למדידה. חלק זה של השיטה פותח במיוחד למדידת קרינה סקלרית תוך-רקמתית בתוך רקמת צדפות ענקית¹². כאן מוצגים פרטים לפתרון בעיות בהיבטים אלה של השיטה. ראשית, הביופסיה צריכה להיות גדולה ביחס לבדיקה. זה מונע מהבדיקה להזיז את הרקמה בזמן שהיא עוברת. בנוסף, הרקמה צריכה לשבת על תחתית צלחת הפטרי, כך שהגמישות והמשקל של הג'לטין משתלבים כדי לשמור על הרקמה במקומה במהלך המדידה. חשוב גם שהחדר יהיה קריר מספיק כדי לשמור על הג'לטין במצב אלסטי ומוצק תחת מקור האור הניסיוני. באופן דומה, זה עוזר להשתמש LED או מקור אחר עם ייצור חום קטן יחסית יחסית לאור נראה.

הפרמטרים הגיאומטריים והאופטומכניים של השיטה גמישים מאוד. לדוגמה, בדיקת הקרינה הסקלרית שימשה למדידת קרינה בתוך מוחו של עכבר שלם ורקמת שומן^13,14. כדי לעשות זאת, הגשושית הותקנה על המניפולטורים על מסגרת סטריאוטקטית סטנדרטית של מכרסמים, ומקור האור הותקן והצביע לעבר הרוסטרום של העכבר. בכל גיאומטריה, המפתח לשימוש מוצלח בשיטה זו הוא לאסוף תמיד מנורה מתאימה וספקטרום ייחוס כהה בתחילת כל מדידה נתונה. אם בדיקה נשברת במהלך מדידת רקמה ואין אפיון ראשוני ללא הרקמה במקום, הנתונים יהיו קשים או בלתי אפשריים לפענוח, ויהיה צורך להתחיל מחדש עם בדיקה חדשה. לעומת זאת, עם הפניות מתאימות בהתחלה, מדידות חלקיות הן נתונים שמישים.

החלק האחרון של שיטה זו נוגע לרכישת נתונים. מתואר השימוש בספקטרומטר סיבים אופטיים לניטור אותות מהגשושית, המבטיח את קלות צימוד SMA ומספק מידע על אורך גל ספקטרלי מלא. עם זאת, עבור מערכות עם שטף פוטונים נמוך יותר, ניתן גם להתאים את הגשושיות האלה לצינורות פוטו-מכפילים או פוטודיודות מפולת שלגים. בכל מקרה, כל הגלאים דורשים מדידות ייחוס לכל מדידה חדשה. לכן, עם התאמות קלות בלבד לשיטות איסוף הנתונים המתוארות, ניתן לאפיין את כל הסוגים השונים של פרמטרים אופטיים.

שימושים מעניינים עתידיים בשיטה זו יכולים להיות כימות האור עמוק בתוך גופם של יונקים גדולים יותר ובתוך צמחים בעלי תכונות העברת קרינה מורכבות, כגון סוקולנטים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1" travel ball bearing center+D11+A2:D31+A2:A2:D31	Edmond Optics	37-935	Part 2 of manipulator for lowering sample
1/4" thick acrylic sheet	McMaster-Carr	8505K754	For making Petri dish holder
3/4" mini spring clamp	Anvil	99693	Use as weight for pulling optical fiber
8 mm biopsy punch	Fisher Scientific	NC9324386	For tissue sample
Butane Torch	McMaster-Carr	MT-51	Heat source for pulling fiber and pipette
Collimating lens	Thorlabs	LLG5A1-A	To collimate light source through liquid light guide
Compressed air	McMaster-Carr	7437K35	For drying pulled fiber and pipette
Cyanoacrylate glue - liquid	McMaster-Carr	66635A31	For securing tapered fiber end at top of pulled pipette
Electrical tape	McMaster-Carr	76455A21	For securing fiber in pipette and for adding grip to clamps
Fine grade carborundum paper	McMaster-Carr	4649A24	Small triangle on exacto knife holder works well
Gelatin	Knox	10043000048679	For securing the tissue biopsy in the petri dish
Glass Pasteur Pipete	Fisher Scientific	13-678-20B	Disposable glass pipette 5.75" in length
Insulin syringes, 31G needle	BD	320440	For applying glue
Isopropanol	McMaster-Carr	54845T42	For cleaning pulled fiber and pipette
Kimwipe	Cole-Parmer	SKU 33670-04	For wiping optical fiber and glass pipette clean
LED driver	Thorlabs	LEDD1B	For powering the UV LEDs
Light source for measurements	Cole-Parmer	UX-78905-05	Low heat white light source for measurements
Linear metric X-Y-Z axis rack and pinion stage	Edmond Optics	55-023	Part 1 of manipulator for lowering sample
Liquid light guide	Thorlabs	LLG5-4T	For light source in measurements
Magnetic feet	Siskiyou	MGB 8-32	For use with magnetic strips
Magnetic strips	Siskiyou	MS-6.0	For mounting magnetically to breadboard
Manipulator #1	Siskiyou	MX10R	4-axis manipulator with pipette holder
Opaquer pen, small	WindowTint	TOP01	For opaquing side of optical fiber to prevent stray light from enter probe
Optical breadboard	Edmond Optics	03-640	For stable affixation of probe holder, sample, microscope and light source
Optical fibers	Ocean Optics	P-100-2-UV-VIS	About 4 fibers are good to have
Plasma light source	Thorlabs	HPLS345	For tissue radiometry measurements
Plastic plier clamp	McMaster-Carr	5070A11	Plier clamp used for weight in pulling pipette
Polystyrene Petri dishes	Thomas scientific	3488N10	Sample holders, enough volume to hold sample thickness plus ~10 mm of gelatin on top
Razor blades	McMaster-Carr	3962A3	For stripping jacketing from optical fiber
Silicone oil lubricant	Thomas scientific	1232E30	For reducing friction between probe and tissue
Software for analyzing data	Matlab		Chosen software for data analysis
Spectrometer + spectrometer software	Avantes	AvaSpec-2048L	Spectrometer can be any brand, this one is compatible with sma-terminated optical fibers and comes with its own software for running the spectrometer
Titanium dioxide powder	Sigma Aldrich	718467-100G	For making scattering sphere
Toolour tabletop clip	Toolour	Toolour0004	For holding pipette while pulling and for holding finished probes
Trigger-action bar clamps	mcMaster-Carr	51755A2	Good for holding optical fibers while pulling or curing
UV curable adhesive	Delo Photobond	GB368	For making scattering sphere
UV light source	Thorlabs	M365FP1	Light source for curing adhesive in scattering ball, this one is sma-fiber compatible, higher intensity = less cure time
White LED light source	Thorlabs	MCWHF2	For characterizing pulled fiber and scattering sphere