Imagem de molécula única da mobilidade lateral e atividade do canal iônico em bicamadas lipídicas usando microscopia de fluorescência por reflexão interna total (TIRF)

O presente protocolo tem como objetivo descrever como estudar a correlação entre a mobilidade da membrana e a permeabilidade do canal iônico de proteínas de membrana em membranas de bicamada de interface gota-gota (DIB) suportada por polímero ^1,2,3.

A presente técnica complementa uma impressionante gama de ferramentas ópticas e analíticas de superfície avançadas, tais como rastreamento de partículas únicas ^4,5, espectroscopia de correlação de fluorescência^6,7 e microscopia de força atômica de alta velocidade 8,9,10. Estes fornecem informações valiosas sobre a composição dinâmica e a estrutura das membranas que influenciam as reações baseadas em membranas^11,12,13. Enquanto o movimento e a difusão lateral das proteínas dependem da densidade local das proteínas na membrana, moléculas proteicas individuais também podem ser aprisionadas em jangadas lipídicas¹⁴ e por interações proteína-proteína^15,16. Dependendo dos domínios proteicos que se projetam da membrana para o meio extracelular ou citosol, a mobilidade da proteína pode variar de altamente móvel a completamente imóvel. No entanto, devido à complexidade da membrana e de suas estruturas periféricas, muitas vezes é difícil decifrar a interação entre a natureza da mobilidade lateral e a função proteica¹⁷.

As membranas DIB têm se mostrado uma plataforma eficiente para análises biofísicas de moléculas únicas de proteínas de membrana 18,19,20,21,22. São formados pela automontagem lipídica através do contato de gotículas aquosas com substratos suportados em hidrogel em fase lipídica/oleosa. À semelhança das bicamadas lipídicas suportadas (BCLs) comumente utilizadas1,23,24,25^, as DIBs permitem sintonia local da mobilidade lateral pela ligação temporária ou permanente de proteínas à matriz polimérica quando funcionalizadas com ligantes ^adequados17. Este último pode servir como sistema modelo para processos bioquímicos em membranas celulares com distribuição heterogênea de^proteínas10.

A abordagem experimental aqui descrita baseia-se na fluorescência de corantes sensíveis ao Ca 2+ para medir o fluxo do íon Ca 2⁺ através de canais individuais próximos à membrana ^2,22 usando microscopia TIRF. Esta abordagem óptica limita a iluminação da amostra a uma distância próxima à membrana, o que, devido às propriedades físicas da luz de excitação evanescente, leva a uma redução significativa da fluorescência de fundo. Este último é um pré-requisito se alta resolução espacial e temporal for necessária para a detecção de moléculas únicas. Ao contrário dos métodos eletrofisiológicos clássicos^26,27, não são necessárias tensões de membrana para estudar o fluxo iônico através de canais individuais. Além disso, o método não requer marcação com corantes fluorescentes ou moléculas que possam interferir com o movimento lateral dos canais na membrana.

O método é particularmente útil para estudar canais de proteínas embutidas na membrana no nível de uma única molécula sem usar eletrofisiologia clássica. Usando o canal condutor de proteínas mitocondriais TOM-CC de Neurospora crassa^28,29,30 e OmpF, que suporta a difusão de pequenas moléculas hidrofílicas através da membrana externa de Escherichia coli^17,31, ilustramos como as mobilidades da membrana e as atividades de canal das duas proteínas podem ser estudadas e correlacionadas. Sugerimos que esta abordagem, embora otimizada para TOM-CC e OmpF, pode ser prontamente aplicada a outros canais de proteína.

1. Produção de proteínas

NOTA: Esta seção descreve o procedimento para isolar OmpF de Escherichia coli BE BL21(DE3) omp6^31,32, que não possui LamB e OmpC, e complexo core TOM de Neurospora crassa (Figura 1)^28,29. Este último requer mitocôndrias isoladas de uma cepa 28 de N. crassa contendo uma forma marcada com 6xHs da subunidade Tom22 do TOM (Figura 1A), que pode ser isolada conforme descrito²⁸. Os protocolos a seguir geralmente produzem 1-2 mg de N. crassa TOM-CC e 10 mg de E. coli OmpF. Para ajustar a quantidade, é importante que as relações proteína/detergente sejam mantidas com precisão. Salvo indicação em contrário, todas as etapas devem ser executadas a 4 °C.

1. Isolamento do complexo central TOM
   1. Solubilizar mitocôndrias purificadas de N. crassa (2 g de proteína) obtidas por sedimentação diferencial a partir de aproximadamente 1,5 kg (peso úmido) de hifas, segundo Bausewein et al.30, na concentração proteica de 10 mg/mL em Tris-HCl 20 mM (pH 8,5), DDM 1% (p/v), glicerol 20% (v/v), NaCl 300 mM, imidazol 20 mM e fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) 1 mM por ³⁰ min a 4 °C.
      CUIDADO: PMSF É TÓXICO. Usar equipamento de proteção individual adequado.
   2. Transfira as mitocôndrias solubilizadas para tubos de ultracentrífuga e separe as membranas não solubilizadas das proteínas de membrana solubilizadas por ultracentrifugação a 130.000 x g por 40 min a 4 °C e filtração com papel de filtro padrão.
   3. Equilibrar uma coluna de Ni-NTA pré-embalada (volume de 5 mL) com cerca de 5 volumes de coluna (CV) de tampão A1 (Tabela 1) usando um sistema automatizado de purificação de proteínas. Execute a coluna Ni-NTA a uma taxa de fluxo constante de 1 mL/min durante todas as etapas. Utilizar uma coluna de volume inferior (1 ml) se as proteínas tiverem sido isoladas de menos de 2 g de mitocôndrias.
   4. Carregar a amostra de proteína solubilizada na coluna Ni-NTA a um caudal de 1 ml/min.
   5. Lavar a coluna Ni-NTA com 5 CV de tampão A1 (Tabela 1) para remover as proteínas não ligadas.
   6. Elute TOM-CC marcado com 30% de tampão A2 (Tabela 1; imidazol 300 mM) e colete o pico proteico como aparece no cromatograma de 280 nm (Figura 1B).
   7. Para purificação adicional do TOM-CC, equilibre a coluna de troca aniônica pré-embalada (1 mL) com 5 CV cada de tampão B1, B2 e B1 (Tabela 1) usando o sistema automatizado de purificação de proteínas. Executar a coluna de troca aniônica a uma taxa de fluxo constante de 1 mL/min durante todas as etapas.
   8. Carregar a fração de pico do TOM-CC (passo 1.1.6) na coluna de troca aniônica (vazão de 1 mL/min).
   9. Remover as proteínas não ligadas lavando a coluna com 5 CV de tampão B1 (Tabela 1) e um gradiente linear de sal de 0%-20% de tampão B2 (Tabela 1).
   10. Eluir TOM-CC com um gradiente salino linear de 20%-35% tampão B2 e coletar a fração de pico proteica como aparece no cromatograma de 280 nm (Figura 1C).
   11. Avaliar a pureza da amostra por SDS-PAGE (Figura 1D) e determinar a concentração de proteína usando um ensaio de proteína disponível comercialmente, de acordo com o protocolo do fabricante (ver Tabela de Materiais).
   12. Congelar as amostras de proteínas em azoto líquido e armazená-las a -80 °C até nova utilização.
       CUIDADO: O nitrogênio líquido deve ser manuseado em áreas bem ventiladas. Usar equipamento de proteção individual adequado.
        
2. Isolamento de OmpF
   1. Recuperar a cepa de E. coli BE BL21(DE3) omp6, sem LamB e OmpC³², de um estoque congelado de glicerol em condições estéreis, e passar para uma placa de ágar Luria-Bertani (LB) (Tabela 2). Para fazer isso, espalhe gradualmente a amostra uniformemente por toda a placa.
   2. Deixar a amostra de molho no ágar durante 5 minutos, antes de inverter a placa com a tampa fechada e incubar durante a noite a 37 °C.
   3. Selecionar uma única colônia de E. coli , inocular 7,5 mL de meio LB (Tabela 2) com essa única colônia usando um palito estéril e deixar crescer durante a noite (14 h) com agitação (170 rpm) a 37 °C.
   4. Transferir 2 x 1 mL de células de E. coli com pipetas estéreis para 2 x 500 mL de meio LB (Tabela 2) e deixar crescer durante a noite (~14 h) a 37 °C com agitação (~170 rpm) em um agitador.
   5. Colher as células por centrifugação a 5.000 x g por 20 min a 4 °C, congelar o pellet em nitrogênio líquido e armazenar a -80 °C até novo uso.
      NOTA: O peso úmido do pellet de célula é tipicamente de 5 g por 1 L de cultura. Neste ponto, o protocolo pode ser pausado.
   6. Descongelar e ressuspender as células (2 g) em 20 mL de tampão de lise C1 (Tabela 2), e passar a suspensão três vezes a 1.000 psi através de um sistema de ruptura de células de alta pressão pré-resfriado (4 °C), com volume máximo de amostra de 35 mL, de acordo com as instruções do fabricante.
      CUIDADO: O uso de uma prensa francesa pode levar a ferimentos graves. Nunca exceda o limite de pressão da célula utilizada. Usar equipamento de proteção individual adequado.
   7. Remover as células intactas do lisado por centrifugação a 4.000 x g por 15 min e coletar o sobrenadante.
   8. Coletar as membranas por ultracentrifugação a 100.000 x g por 1 h.
   9. Ressuspender o pellet de membrana em 10 mL de tampão C2 (Tabela 2) e misturar com igual volume de tampão SDS C3 (Tabela 2) utilizando homogeneizador de vidro com esferas de rolamento.
      CUIDADO: β-mercaptoetanol no tampão C3 é tóxico. Siga todas as normas de segurança pertinentes.
   10. Incubar a suspensão em banho-maria a 50 °C durante 30 min.
   11. Centrifugar a amostra a 100.000 x g a 20 °C durante 1 h.
   12. Ressuspender o pellet de membrana em 10 mL de tampão SDS C4 (Tabela 2) usando homogeneizador de vidro com esferas e incubar a suspensão em banho-maria a 37 °C por 30 min.
       NOTA: Se o pellet não puder ser ressuspenso, adicione mais tampão SDS C4 até um volume de 20 mL.
   13. Centrifugar a amostra a 100.000 x g a 20 °C durante 30 minutos e recolher o sobrenadante.
   14. Misturar o sobrenadante com octil polioxietileno (octil POE) até uma concentração final de detergente de 0,5% (p/v) e dialisar a amostra duas vezes contra o tampão C5 (Tabela 2) a 4 °C por 24 h. Para isso, utilizar tubo de diálise com corte de 20 kDa, de acordo com as instruções do fabricante, e colocar a amostra no tubo ou dispositivo de diálise.
       NOTA: O corte da tubulação de diálise precisa ser ajustado caso proteínas com outras massas moleculares sejam dialisadas.
   15. Avaliar a pureza da amostra por SDS-PAGE e determinar a concentração de proteína usando um ensaio de proteína disponível comercialmente, de acordo com o protocolo do fabricante (Tabela de Materiais).
       NOTA: Amostras aquecidas a 95 °C apresentam OmpF monomérico. Amostras não aquecidas mostram OmpF em sua forma trimérica (Figura 1F).
   16. OmpF dialisado por congelamento por choque em alíquotas em nitrogênio líquido e armazenar a -20 °C até uso posterior.
       CUIDADO: O nitrogênio líquido deve ser manuseado em áreas bem ventiladas. Usar equipamento de proteção individual adequado.

2. Gravação óptica de canal único de canais iônicos em membranas DIB

NOTA: Esta seção descreve o procedimento de preparação de membranas DIB em câmaras microfabricadas de polimetilmetacrilato (PMMA)² para monitorar o movimento lateral de proteínas e o fluxo de íons através de canais iônicos únicos¹⁷. As dimensões e desenhos exatos para a fabricação da câmara podem ser encontrados em Lepthin et ^al.2. A Figura 2 dá uma visão geral da montagem da câmara² de PMMA e da formação das membranas DIB. A menos que especificado de outra forma, todas as etapas são executadas à temperatura ambiente (TR). A Figura 3 mostra uma representação esquemática de uma membrana DIB e como o fluxo de Ca²⁺ através de uma proteína de canal único é usado para monitorar tanto o movimento na membrana quanto o estado aberto-fechado do canal.

1. Preparação de lipídios
   1. Retirar do congelador a solução lipídica contendo 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (25 mg/ml DPhPC) dissolvida em clorofórmio a -20 °C e aquecer até RT. Para este fim, geralmente é suficiente aquecer a amostra lentamente à mão por alguns minutos.
      CUIDADO: O clorofórmio é tóxico. Usar equipamento de proteção individual adequado e realizar todos os procedimentos que envolvam clorofórmio sob uma capela de fumaça.
   2. Transferir 380 μL da solução-mãe de DPhPC (25 mg/ml de DPhPC) para um frasco para injetáveis de vidro. Evite pipetas com vedações de borracha. Em vez disso, use seringas de vidro de microlitro com êmbolos de aço inoxidável.
   3. Depois de manusear a solução de estoque lipídico, sobreponha a solução estoque de lipídios com gás Ar ou N₂ para evitar a oxidação lipídica. Use o menor fluxo de gás possível para evitar a evaporação do solvente orgânico no qual os lipídios são dissolvidos ou respingos dos sprays de solvente do frasco para injetáveis. Certifique-se de que as tampas dos frascos para injetáveis de vidro contendo lípidos com solvente orgânico estão revestidas com politetrafluoroetileno (PTFE) no interior.
   4. Secar a amostra lipídica (passo 2.1.2) sob uma corrente de N 2 e remover o solvente orgânico restante da amostra lipídica durante a noite sob vácuo (_2,0 mbar) utilizando uma bomba de vácuo isenta de óleo.
   5. Dissolver o filme lipídico em solução de hexadecano/óleo de silicone adicionando volumes iguais de hexadecano e óleo de silicone (500 μL cada) usando uma seringa de vidro de microlitro para uma concentração lipídica final de 9,5 mg/mL.
      NOTA: A solução lipídica é estável em RT por várias semanas.
2. Preparação de hidrogel de agarose
   1. Preparar aproximadamente 1 mL de solução de agarose de baixa fusão (0,75% [p/v]) em água dupla deionizada e aquecer a 85 °C em um bloco de aquecimento por 20 min para ser usado para tampas de vidro de revestimento de spin.
      NOTA: A solução de agarose pode ser mantida em RT por várias semanas e pode ser reaquecida várias vezes.
   2. Preparar solução de agarose a 2,5% (p/v) de baixa fusão em CaCl 2 0,66 M e HEPES 8,8 mM (pH_7,2 ) e aquecer a 85 °C em bloco de aquecimento por 20 min. Certifique-se de que a agarose está bem derretida.
      NOTA: A solução de agarose pode ser mantida por várias semanas em RT e pode ser reaquecida várias vezes, assim como a agarose (passo 2.2.1) usada para revestimento de spin.
3. Montagem da câmara de polimetilmetacrilato (PMMA) e formação de monocamada lipídica na interface hidrogel, hexadecano/óleo de silicone
   1. Coloque algumas lamínulas de vidro (40 mm x 24 mm x 0,13 mm) em um suporte de deslizamento de aço inoxidável e limpe-as em um copo de vidro por 10 minutos com acetona em um limpador ultrassônico. Use apenas acetona suficiente para submergir as lamínulas e cubra o copo frouxamente com uma placa de vidro para criar um sistema fechado e sem pressão que minimize a fuga de vapores durante o processo de limpeza.
      CUIDADO: A acetona é um solvente altamente inflamável com baixo ponto de fulgor. As misturas vapor/ar são explosivas. Opere o limpador ultrassônico em uma área bem ventilada. Use equipamentos de proteção individual apropriados e observe as precauções oficiais de segurança (por exemplo, sem chamas abertas e sem faíscas).
   2. Enxaguar as lamínulas de vidro com água duplamente deionizada e secá-las sob uma corrente de N₂.
      NOTA: As folhas de cobertura limpas desta forma podem ser armazenadas durante várias semanas.
   3. Limpe e hidrofilize ainda mais uma lamínula em um limpador de plasma com oxigênio (0,5 mbar) por 5 min.
      NOTA: Execute esta etapa imediatamente antes do revestimento de spin com solução de agarose, pois o efeito hidrofílico da limpeza a plasma se desgasta com o tempo.
   4. Monte uma lamínula tratada com plasma em um revestidor de spin (Figura 2, etapa 1).
   5. Revestir a lamínula com uma película submicrométrica de agarose adicionando lentamente 140 μL de agarose aquecida a 0,75% (p/v) de baixa fusão (passo 2.2.1) a 3.000 rpm por 30 s, usando uma pipeta de 200 μL (Figura 2, passo 1).
      NOTA: A espessura do filme de agarose pode ser determinada por microscopia de força atômica (AFM), conforme descrito¹⁷.
   6. Fixe imediatamente a lamínula revestida por spin com a fina camada do hidrogel de agarose à parte inferior da câmara de PMMA². Certifique-se de que o hidrogel de agarose aponte para cima (Figura 2, passo 2).
   7. Fixe as bordas da tampa no dispositivo microusinado de PMMA com fita adesiva transparente.
   8. Coloque o dispositivo de PMMA numa placa quente aquecida a 35 °C (Figura 2, passo 3).
   9. Deitar cuidadosamente 200 μL de solução de agarose a 2,5% (passo 2.2.2) na entrada da câmara com uma pipeta (Figura 2, passo 3), sem criar bolhas de ar, de modo a que o hidrogel fino aplicado pelo revestimento de spin possa equilibrar-se com o tampão da solução de agarose a 2,5% e permanecer hidratado. Certifique-se de que a solução de agarose a 2,5% seja espalhada ao redor do hidrogel de agarose revestido por spin, mas não sobre ele (Figura 3A), o que pode ser evitado pressionando suavemente a câmara de PMMA na placa de aquecimento.
   10. Cobrir imediatamente os poços da câmara de PMMA (Figura 2, passo 4) com um total de 60 μL de solução lipídica/oleosa (passo 2.1.5), para iniciar a formação de monocamada lipídica na interface agarose-óleo e evitar a desidratação da agarose revestida por spin nos poços da câmara de PMMA. Mantenha o dispositivo numa placa quente a 35 °C durante cerca de 2 horas.
       NOTA: Os poços circulares na câmara de PMMA têm diâmetro de 0,5 mm e profundidade de 1,8 mm, conforme trabalho publicado anteriormente².
4. Preparação de gotículas aquosas revestidas com lipídios em solução de hexadecano/óleo de silicone
   1. Colocar 20 μL de solução lipídica hexadecano/óleo de silicone (passo 2.1.5) em cada um dos vários poços microfabricados numa câmara de incubação de gotículas (Figura 2, passo 4). Os recipientes adequados para a solução de hexadecano/óleo de silicone lipídico são pequenos recessos de 40 mm x 30 mm x 3,5 mm em uma placa fina de PMMA².
   2. Prepare uma agulha de vidro microcapilar com um diâmetro de abertura da ponta de 20 μm usando um extrator de micropipeta vertical ou horizontal (por exemplo, usado para fazer pipetas de remendo ou eletrodos de vidro afiado). Estimar o diâmetro de abertura da agulha de vidro microcapilar sob estereomicroscópio binocular em baixa magnificação, em uma faixa de zoom entre 7,5x e 35x.
      NOTA: As configurações para o modo de pré-aquecimento antes do capilar de vidro ser puxado, o modo de aquecimento para puxar e a força de tração devem ser determinados experimentalmente com antecedência, de acordo com as especificações do fabricante do dispositivo de tração e o tipo de capilar.
   3. Encher a agulha de vidro microcapilar com 5 μL de solução aquosa de injeção contendo 8,8 mM HEPES (pH 7,2), 7 μM Fluo-8, 400 μM EDTA, 1,32 M KCl e 30 nM TOM core complex, ou alternativamente 20 nM OmpF usando uma ponta de pipeta microcapilar. Utilizar apenas água bidestilada previamente tratada com resina quelante que liga íons metálicos multivalentes (Ca²⁺) para preparar a solução aquosa de injeção.
   4. Monte a agulha de vidro microcapilar com a solução aquosa de injeção em um nanoinjetor acionado por piezo.
   5. Injectar 100-200 nL de gotículas aquosas (Figura 2, passo 4) contendo 8,8 mM HEPES (pH 7,2), 7 μM Fluo-8, 400 μM EDTA, 1,32 M KCl e 30 nM TOM core complex (passo 1.1.12), ou, alternativamente, 20 nM OmpF (passo 1.2.16) nos poços na câmara de incubação de gotículas preenchida com solução lipídica de hexadecano/óleo de silicone (ver 2.1.5) utilizando o nanoinjector. Certifique-se de que as gotículas não se tocam, colocando-as a vários milímetros (>10 mm) de distância nos poços. Caso contrário, se as monocamadas lipídicas ainda não se formaram na interface óleo/tampão, elas se fundirão em gotículas maiores.
      NOTA: Se não houver capilares de classe e nanoinjetores disponíveis, as gotículas podem alternativamente ser preparadas manualmente com pipetas de microlitro de canal único para volumes entre 0,1 μL e 0,5 μL, conforme descrito². Neste caso, no entanto, os volumes de gotículas não são tão precisos.
   6. Permitir a formação de uma monocamada lipídica na interface gota/óleo por cerca de 2 h mantendo as câmaras de incubação de PMMA e gotículas (Figura 2, passo 4) em uma placa quente aquecida a 35 °C.
5. Preparação e imageamento de canais iônicos únicos em membranas DIB
   1. Transferir manualmente gotículas aquosas individuais dos poços da câmara de incubação de gotas sob estereomicroscópio para os poços da câmara de PMMA (Figura 2, passo 5), usando uma pipeta de microlitro de canal único com uma ponta de polipropileno descartável de 10 μL. Deixar que as gotículas afundem nas monocamadas lipídicas formadas nas interfaces hidrogel-óleo por cerca de 5 min para formar uma bicamada lipídica (Figura 3) entre as gotículas e o hidrogel de agarose.
   2. Monte a câmara de PMMA com membranas DIB no porta-amostras de um microscópio de luz invertida e avalie a formação da membrana usando uma objetiva de contraste de modulação de Hoffman de 10x (Figura 2, passo 6). A formação da membrana DIB é indicada por um anel branco claro na interface entre a gota e o hidrogel (Figura 4A). As membranas DIB que foram quebradas não mostram esse anel (Figura 4B).
      NOTA: Alternativamente, as membranas DIB podem ser visualizadas em aumento de 10x por contraste de fase ou microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC).
   3. Se as membranas DIB se formaram, monte a câmara de PMMA no porta-amostras de um microscópio TIRF (Figura 2, passo 7) equipado com uma fonte de luz convencional para iluminação de epifluorescência, um laser de 488 nm (P_max = 100 mW) e uma câmera CCD multiplicadora de elétrons retroiluminada (512 x 512 pixels; >95% QE) para atingir um tamanho de pixel de ~0,16 μm.
   4. Focalize a borda de uma membrana DIB com uma objetiva de aumento de 10x sob iluminação de epifluorescência com uma fonte de luz de alta intensidade usando um conjunto de filtros GFP.
   5. Focalizar finamente a mesma borda da membrana DIB em alta magnificação com uma objetiva TIRF de óleo apocromático 100x/N.A. 1,49, novamente sob iluminação de epifluorescência, com a fonte de luz de alta intensidade usando um conjunto de filtros GFP que permite visualizar fluorescência de fundo fraca do corante fluorescente Fluo-8 na gota (Figura 4C).
   6. Altere a configuração do filtro de GFP para o conjunto de filtros TIRF quad-band.
   7. Ligue o laser de 488 nm e ajuste a intensidade do laser na lente objetiva para um valor entre 8 mW e 10 mW.
      NOTA: Como muitas vezes não há informações quantitativas sobre a intensidade do laser na lente objetiva, as configurações de intensidade do laser devem ser calibradas previamente em medições separadas na lente, com um medidor óptico de potência a laser equipado com um sensor de fotodiodo, de acordo com as especificações do fabricante.
      CUIDADO: Para garantir a operação segura do laser, o operador deve estar ciente dos possíveis perigos da radiação laser e das normas de prevenção de acidentes.
   8. Para visualizar canais de íons únicos, ajuste o ângulo TIRF e o ganho da câmera EMCCD (por exemplo, configuração do multiplicador de ganho EM: 285) para que os canais de íons abertos na membrana DIB apareçam como pontos fluorescentes de alto contraste em um fundo escuro (Figura 4D-G), e a relação sinal-fundo, quando inspecionada visualmente, atinja um máximo. Certifique-se de que as manchas, correspondentes ao fluxo de Ca²⁺ através de canais iônicos únicos, permaneçam em foco e tenham uma forma redonda, com alta intensidade no centro e diminuindo gradualmente em direção à periferia. Membranas sem canais mostram apenas fluorescência de fundo (Figura 4C).
   9. Antes de registrar o movimento e a atividade aberto-fechado de canais individuais ao longo do tempo, verifique se os pontos fluorescentes estão em foco, para garantir que os canais iônicos se reconstituíram nas membranas DIB e estão se movendo lateralmente no plano da membrana. Se este não for o caso, pode indicar que uma molécula fluorescente está mergulhando dentro e fora do campo evanescente gerado pelo laser perto da membrana.
   10. Grave uma série de imagens de membrana que permite o rastreamento adequado da posição e monitoramento do estado aberto-fechado dos canais iônicos individuais. Para determinar o tipo de mobilidade lateral (por exemplo, movimento livre vs ancoragem transitória [para referência, ver¹⁶]) e o estado de atividade do canal (por exemplo, aberto ou fechado), adquira trajetórias suficientemente longas (por exemplo, 30 s a 1 min) e bem amostradas (por exemplo, taxa de quadros de 48 ^s-1).
       NOTA: A observação da difusão canalizada, restrita ou lúpula¹⁶ requer que a taxa de amostragem seja suficientemente rápida para medir a difusão irrestrita dentro dos limites confinantes. Além disso, certifique-se de que o tempo de amostragem dos dados seja suficientemente longo para medir a transição da difusão irrestrita para a difusão restrita (para detalhes, ver Jacobson et ^al.16).
6. Processamento de imagens e dados
   NOTA: Pacotes de processamento de imagens de código aberto³³ ou rotinas auto-escritas¹⁷ baseadas em pacotes de software comerciais podem ser usados para analisar a dinâmica espaço-temporal de canais iônicos individuais em DIBs. Para poder correlacionar a mobilidade da membrana lateral com o fluxo de íons através dos canais individuais, nenhum algoritmo de filtro deve ser aplicado.
   1. Corrigir séries temporais de imagens para clareamento aplicando procedimentos padrão³⁴ usando rotinas autoescritas, ajustando a intensidade média de quadros da imagem completa a , onde t é o índice de quadros (tempo) e a k são os parâmetros de ajuste. Em seguida, corrija a série temporal de acordo com , onde I(t) é a intensidade. Alternativamente, para análises iniciais de dados, execute correções de plano de fundo usando software de código aberto com algoritmos rolling-ball implementados³³ e um raio rolling-ball, dependendo do ponto e do tamanho do pixel da câmera (por exemplo, 50 pixels).
   2. Determine as posições espaciais e amplitudes de um ponto de fluorescência dentro de uma região de interesse (ROI) definida (por exemplo, 30 x 30 pixels), ajustando I(t) em um determinado tempo t a uma função gaussiana bidimensional com inclinação planar que explica possíveis gradientes de iluminação local de acordo com . Aqui, x = (x, y) é a ROI com a informação da intensidade da fluorescência, A e σ são a amplitude e larguras do Gaussian, p_k são parâmetros que caracterizam a intensidade de fundo da ROI, e μ = (x 0, y ₀) define a posição do Gaussian. O fluxo de íons através de um canal individual é dado pelo parâmetro A. A trajetória do canal é dada por x, e permite determinar a mobilidade lateral do canal. Alternativamente, é possível determinar as posições e intensidades de pontos individuais usando plataformas open-source³³ e plug-ins conforme descrito^35,36. Estimar a precisão posicional³⁷ após a conversão da leitura da câmera EMCCD em números de fótons³⁸.
   3. Plotar a amplitude de fluorescência A versus tempo e a trajetória x correspondente para determinar uma possível correlação entre a difusividade do canal e o fluxo de íons através do canal. Execute isso com qualquer software gráfico. Em caso de movimento do canal lateral livre, determinar o coeficiente de difusão lateral D por regressão linear do tempo de atraso τ, e calcular o deslocamento quadrático médio dos pontos de x de acordo com .
      NOTA: Os coeficientes de difusão típicos¹⁷ para TOM-CC e OmpF movendo-se livremente em membranas DIB variam entre 0,5 e 1,5 μm^{2 s-1}. Moléculas cuja constante de difusão é inferior a 0,01 mm²·^s-1 são definidas como imobilizadas¹⁷.

A gravação óptica de canal único sem eletrodos em tempo real revela a interação entre o movimento lateral da proteína e a função de canais iônicos individuais em membranas DIB. A reconstituição do complexo mitocondrial TOM core (Figura 1A) em uma membrana DIB (Figura 4D) ilustra uma forte correlação temporal entre mobilidade lateral e permeabilidade iônica (Figura 5A). O gating TOM-CC parece ser sensível ao modo de movimento lateral17. Canais móveis mostram fluxo de Ca2+ através de seus poros e altas intensidades de ponto de fluorescência. Moléculas aprisionadas e não móveis apresentam baixas e médias intensidades de fluorescência. Para o poro geral de importação de proteínas da mitocôndria TOM-CC, esta abordagem de molécula única revelou uma forte correlação temporal entre mobilidade lateral e permeabilidade iônica, sugerindo que o canal TOM-CC tem propriedades mecanossensíveis17. Uma parada lateral de moléculas de TOM-CC em movimento livre é acompanhada por um fechamento parcial ou completo do canal de TOM-CC. A aquisição de imagens das membranas DIB com OmpF (Figura 1E e Figura 4F), que está quase totalmente embutida na membrana, não mostra efeitos stop-and-go (Figura 5B). As paradas aleatórias da OmpF não estão associadas a uma mudança de intensidade e, portanto, ao fechamento de seus poros. Com base nos sinais de fluorescência38, a precisão posicional dos canais individuais pode ser estimada na faixa entre 5 e 10 nm. No entanto, deve-se notar que essa precisão não pode ser alcançada se os canais oscilarem ligeiramente devido à ancoragem móvel com o hidrogel de agarose, como mostrado, por exemplo, para as moléculas TOM-CC em um estado intermediário com um deslocamento médio da raiz de 120 nm (Figura 5A).

Figura 1: Isolamento do TOM-CC. (A) Estrutura Cryo EM de N. crassa TOM-CC30,39. Mitocôndrias de uma cepa de N. crassa contendo Tom22 com tag 6xHis foram solubilizadas em DDM e submetidas à cromatografia de afinidade Ni-NTA (B) e cromatografia de troca iônica (C). (D) SDS-PAGE do TOM-CC isolado. (E) Estrutura cristalina (PDB, 1OPF) e (F) SDS-PAGE de E. coli OmpF purificada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Fluxograma de montagem da câmara de PMMA. Passo 1: Uma tampa de vidro é revestida com um hidrogel de agarose. Passo 2: A tampa revestida por spin é montada em uma câmara de microscopia de PMMA feita sob medida. Passo 3: Agarose adicional de baixo derretimento é adicionada à porta de entrada da câmara de PMMA em uma placa quente de 35 °C. Passo 4: As monocamadas lipídicas são formadas em torno de gotículas aquosas em uma interface tampão/óleo (esquerda) e na interface hidrogel/óleo de agarose (direita). Passo 5: Gotículas aquosas individuais são pipetadas nos poços da câmara de PMMA para formar uma bicamada lipídica ao entrar em contato com as duas monocamadas lipídicas. Passo 6: A formação das membranas DIB é validada pela microscopia de contraste modulada de Hofmann. Passo 7: Imagens de áreas selecionadas das membranas DIB com canais iônicos inseridos são adquiridas por microscopia TIRF. Verde: 0,75% agarose; amarelo: 2,5% de agarose contendo íons Ca2+ ; magenta: fase lipídica/oleosa; azul escuro: tampão aquoso de gotículas contendo corante e proteína sensíveis ao Ca2+. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Montagem experimental. (A) Representação esquemática de uma membrana DIB em um poço de PMMA. A bicamada repousa sobre um filme ultrafino de agarose a 0,75% para permitir a obtenção de imagens TIRF do fluxo de Ca 2+ através de um canal iônico ao longo do tempo usando um corante de fluorescência sensível ao Ca 2+ (Fluo-8) em trans. (B) O fluxo de Ca2+ é controlado exclusivamente pela pressão osmótica de cis para trans. Isso permite tanto a determinação da posição na membrana quanto do estado aberto-fechado do canal. O canal mostrado aqui é o canal condutor de proteínas TOM-CC da mitocôndria de N. crassa 30. (C) Trajetória de um único canal TOM-CC. Verde: canal móvel; amarelo: canal não móvel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Imagem TOM-CC e OmpF em membranas DIB. (A) Membrana DIB fotografada por microscopia de contraste modulada de Hoffmann mostrando a área de contato bicamada entre o hidrogel e a gota. (B) Membrana DIB quebrada como em (A). Seta, borda da câmara de PMMA. (C) Membrana DIB imageada por microscopia TIRF sem canais proteicos. (D) Membrana DIB com TOM-CC reconstituída, imageada por microscopia TIRF. Os quadrados brancos marcam pontos de alta (SH), intermediária (SI) e baixa (SL) intensidade. (E) O ajuste do perfil de intensidade de fluorescência dos três pontos marcados em (A) às funções gaussianas bidimensionais revela a posição dos TOM-CCs individuais e o fluxo de Ca2+ através do canal. (F) Membrana DIB com OmpF reconstituído. (G) Encaixe gaussiano da mancha fluorescente marcada em (F). Em contraste com o complexo proteico de β barris de dois poros TOM-CC, o OmpF de β de três poros revela apenas um estado de permeabilidade. Tamanho do pixel, 0,16 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: A atividade do canal correlaciona-se com a mobilidade lateral do TOM-CC. (A) O traçado de amplitude fluorescente (superior) e o trajeto correspondente (inferior) do TOM-CC indicam que a atividade do canal aberto-fechado do TOM-CC correlaciona-se com a mobilidade da membrana lateral do complexo. A trajetória apresenta três estados de permeabilidade. Verde: estado totalmente aberto; amarelo: estado intermediário de permeabilidade; vermelho: estado do canal fechado; estrela vermelha: TOM-CC no estado intermediário oscila em torno de sua posição média em cerca de ±60 nm. As precisões posicionais37 baseadas nos sinais de fluorescência nos estados totalmente aberto e intermediário variam entre 5 nm e 10 nm. (B) Traçado de amplitude fluorescente (superior) e trajetória correspondente (inferior) de OmpF. OmpF revela apenas um nível de intensidade, independentemente de estar em movimento ou preso. Os segmentos de trajetória correspondentes aos períodos de tempo das moléculas aprisionadas são marcados em cinza. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Soluções tampão para isolamento TOM-CC.

Tabela 2: Soluções tampão para isolamento de OmpF.

Declaramos a inexistência de conflitos de interesse.