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Biochemistry

कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके लिपिड बाइलेयर में पार्श्व गतिशीलता और आयन चैनल गतिविधि की एकल-अणु इमेजिंग

Published: February 17, 2023 doi: 10.3791/64970
Automatic Translation
1, 1
1Biophysics Department, Institute of Biomaterials and Biomolecular Systems, University of Stuttgart

Summary

यह प्रोटोकॉल बताता है कि व्यक्तिगत आयन चैनलों को ट्रैक करने और समर्थित लिपिड झिल्ली में उनकी गतिविधि निर्धारित करने के लिए टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी का उपयोग कैसे करें, जिससे पार्श्व झिल्ली आंदोलन और चैनल फ़ंक्शन के बीच परस्पर क्रिया को परिभाषित किया जा सके। यह वर्णन करता है कि झिल्ली कैसे तैयार करें, डेटा रिकॉर्ड करें और परिणामों का विश्लेषण करें।

Abstract

उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग तकनीकों से पता चला है कि कई आयन चैनल स्थिर नहीं हैं, लेकिन अत्यधिक गतिशील प्रक्रियाओं के अधीन हैं, जिसमें छिद्र बनाने और सहायक सबयूनिट्स, पार्श्व प्रसार और अन्य प्रोटीनों के साथ क्लस्टरिंग का क्षणिक संबंध शामिल है। हालांकि, पार्श्व प्रसार और कार्य के बीच संबंध खराब समझा जाता है। इस समस्या से निपटने के लिए, हम वर्णन करते हैं कि कैसे समर्थित लिपिड झिल्ली में व्यक्तिगत चैनलों की पार्श्व गतिशीलता और गतिविधि की निगरानी की जा सकती है और कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके सहसंबद्ध किया जा सकता है। बूंद इंटरफ़ेस बाइलेयर (डीआईबी) तकनीक का उपयोग करके अल्ट्राथिन हाइड्रोगेल सब्सट्रेट पर झिल्ली बनाई जाती है। अन्य प्रकार के मॉडल झिल्ली की तुलना में, इन झिल्लियों में यांत्रिक रूप से मजबूत और अत्यधिक संवेदनशील विश्लेषणात्मक तकनीकों के लिए उपयुक्त होने का लाभ है। यह प्रोटोकॉल झिल्ली के करीब निकटता में सीए2 + संवेदनशील डाई के प्रतिदीप्ति उत्सर्जन को देखकर एकल चैनलों के माध्यम से सीए2 + आयन प्रवाह को मापता है। शास्त्रीय एकल-अणु ट्रैकिंग दृष्टिकोण के विपरीत, कोई फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन या लेबल, जो झिल्ली में पार्श्व आंदोलन और कार्य में हस्तक्षेप कर सकता है, की आवश्यकता नहीं होती है। प्रोटीन के संवहन परिवर्तनों से जुड़े आयन प्रवाह में संभावित परिवर्तन केवल झिल्ली में प्रोटीन पार्श्व गति के कारण होते हैं। प्रतिनिधि परिणाम माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन ट्रांसलोकेशन चैनल टीओएम-सीसी और बैक्टीरियल चैनल ओएमपीएफ का उपयोग करके दिखाए जाते हैं। ओएमपीएफ के विपरीत, टीओएम-सीसी की गेटिंग आणविक कारावास और पार्श्व प्रसार की प्रकृति के प्रति बहुत संवेदनशील है। इसलिए, समर्थित ड्रॉपलेट-इंटरफ़ेस बाइलेयर पार्श्व प्रसार और आयन चैनलों के कार्य के बीच की कड़ी को चिह्नित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हैं।

Introduction

वर्तमान प्रोटोकॉल का उद्देश्य यह वर्णन करना है कि बहुलक-समर्थित बूंद-इंटरफ़ेस बाइलेयर (डीआईबी) झिल्ली 1,2,3 में झिल्ली प्रोटीन की झिल्ली गतिशीलता और आयन चैनल पारगम्यता के बीच सहसंबंध का अध्ययन कैसे किया जाए।

वर्तमान तकनीक उन्नत ऑप्टिकल और सतह विश्लेषणात्मक उपकरणों की एक प्रभावशाली सरणी का पूरक है, जैसे कि एकल कण ट्रैकिंग 4,5, प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी 6,7, और उच्च गति परमाणु बल माइक्रोस्कोपी 8,9,10। ये झिल्ली की गतिशील संरचना और संरचना में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं जो झिल्ली-आधारित प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करते हैं 11,12,13. जबकि प्रोटीन की गति और पार्श्व प्रसार झिल्ली में प्रोटीन के स्थानीय घनत्व पर निर्भर करता है, व्यक्तिगत प्रोटीन अणुओं को लिपिड राफ्ट14 और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन15,16 में भी फंसाया जा सकता है। झिल्ली से बाह्य वातावरण या साइटोसोल में फैले प्रोटीन डोमेन के आधार पर, प्रोटीन गतिशीलता अत्यधिक मोबाइल से पूरी तरह से गतिहीन तक भिन्न हो सकती है। हालांकि, झिल्ली और इसकी परिधीय संरचनाओं की जटिलता के कारण, पार्श्व गतिशीलता और प्रोटीन फ़ंक्शन17 की प्रकृति के बीच परस्पर क्रिया को समझना अक्सर मुश्किल होता है।

डीआईबी झिल्ली झिल्ली प्रोटीन18,19,20,21,22 के बायोफिज़िकल एकल-अणु विश्लेषण के लिए एक कुशल मंच साबित हुआ है। तेल चरण में हाइड्रोगेल-समर्थित सब्सट्रेट्स के साथ जलीय बूंदों के संपर्क के माध्यम से लिपिड स्व-असेंबली द्वारा बनाए जाते हैं। आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले समर्थित लिपिड बाइलेयर (एसएलबी) 1,23,24,25 के समान, डीआईबी उपयुक्त लिगेंड 17 के साथ कार्यात्मक होने पर बहुलक मैट्रिक्स में प्रोटीन के अस्थायी या स्थायी बंधन द्वारा पार्श्व गतिशीलता की स्थानीय ट्यूनिंग की अनुमति देता है। उत्तरार्द्ध एक विषम प्रोटीन वितरण 10 के साथ कोशिका झिल्ली में जैव रासायनिक प्रक्रियाओं के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में काम करसकता है।

यहां वर्णित प्रयोगात्मक दृष्टिकोण टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके झिल्ली2,22 के निकट निकटता में अलग-अलग चैनलों के माध्यम से सीए2 + आयन प्रवाह को मापने के लिए सीए2 + संवेदनशील रंगों की प्रतिदीप्ति पर निर्भर करता है। यह ऑप्टिकल दृष्टिकोण नमूने की रोशनी को झिल्ली के करीब एक दूरी तक सीमित करता है, जो कि एवेनेसेंट उत्तेजना प्रकाश के भौतिक गुणों के कारण, प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि की महत्वपूर्ण कमी की ओर जाता है। उत्तरार्द्ध एक शर्त है यदि एकल अणुओं का पता लगाने के लिए उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प की आवश्यकता होती है। शास्त्रीय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विधियों26,27 के विपरीत, व्यक्तिगत चैनलों के माध्यम से आयन प्रवाह का अध्ययन करने के लिए कोई झिल्ली वोल्टेज की आवश्यकता नहीं होती है। इसके अलावा, विधि को फ्लोरोसेंट रंजक या अणुओं के साथ लेबलिंग की आवश्यकता नहीं होती है जो झिल्ली में चैनलों के पार्श्व आंदोलन में हस्तक्षेप कर सकते हैं।

शास्त्रीय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग किए बिना एकल अणु स्तर पर झिल्ली में एम्बेडेड प्रोटीन चैनलों का अध्ययन करने के लिए विधि विशेष रूप से उपयोगी है। न्यूरोस्पोरा क्रैसा28,29,30 और ओएमपीएफ से माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन-संचालन चैनल टीओएम-सीसी का उपयोग करते हुए, जो एस्चेरिचिया कोलाई17,31 की बाहरी झिल्ली में छोटे हाइड्रोफिलिक अणुओं के प्रसार का समर्थन करता है, हम बताते हैं कि दो प्रोटीनों की झिल्ली मोबिलिटी और चैनल गतिविधियों का अध्ययन और सहसंबद्ध कैसे किया जा सकता है। हम सुझाव देते हैं कि यह दृष्टिकोण, हालांकि टीओएम-सीसी और ओएमपीएफ के लिए अनुकूलित है, अन्य प्रोटीन चैनलों पर आसानी से लागू किया जा सकता है।

Protocol

1. प्रोटीन उत्पादन

नोट: यह खंड एस्चेरिचिया कोलाई बीई बीएल 21 (डीई 3) ओएमपी 631,32 से ओएमपीएफ को अलग करने की प्रक्रिया का वर्णन करता है, जिसमें लैम्ब और ओएमपीसी का अभाव है, और न्यूरोस्पोरा क्रैसा से टीओएम कोर कॉम्प्लेक्स (चित्रा 1)28,29। क्रैसा स्ट्रेन 28 से अलग माइटोकॉन्ड्रिया की आवश्यकता होती है जिसमें टीओएम सबयूनिट टॉम22 (चित्रा 1 ए) का 6xHis-लेबल रूप होता है, जिसे वर्णित28 के रूप में अलग किया जा सकता है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल आमतौर पर एन क्रैसा टीओएम-सीसी के 1-2 मिलीग्राम और ई कोलाई ओएमपीएफ के 10 मिलीग्राम का उत्पादन करते हैं। यदि मात्रा को समायोजित किया जाना है, तो यह महत्वपूर्ण है कि प्रोटीन / डिटर्जेंट अनुपात ठीक से बनाए रखा जाए। जब तक अन्यथा निर्दिष्ट न किया जाए, सभी चरणों को 4 डिग्री सेल्सियस पर किया जाना चाहिए।

  1. टीओएम कोर कॉम्प्लेक्स का अलगाव
    1. बोसेविन एट अल.30 के अनुसार, 20 एमएम ट्राइस-एचसीएल (पीएच 8.5), 1% (डब्ल्यू /वी) डीडीएम, 20% (वी / वी) ग्लिसरॉल, 300 एमएम एनएसीएल, 20 एमएम आईएमएल, 200 एमएम एनएमसी एनसीएल, 20 एमएम (4 एमएम एनसीएल) में 10 मिलीग्राम / एमएल की प्रोटीन सांद्रता पर लगभग 1.5 किलोग्राम (गीला वजन) हाइफे से अंतर अवसादन द्वारा प्राप्त शुद्ध एन क्रैसा माइटोकॉन्ड्रिया (2 ग्राम प्रोटीन)
      चेतावनी: पीएमएसएफ विषाक्त है। उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें।
    2. घुलनशील माइटोकॉन्ड्रिया को अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट के लिए अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा घुलनशील झिल्ली प्रोटीन से गैर-घुलनशील झिल्ली को अलग करें और मानक-ग्रेड फिल्टर पेपर के साथ निस्पंदन करें।
    3. स्वचालित प्रोटीन शोधन प्रणाली का उपयोग करके बफर ए 1 (तालिका 1) के लगभग 5 कॉलम वॉल्यूम (सीवी) के साथ एक प्रीपैक्ड नी-एनटीए कॉलम (5 एमएल की मात्रा) को बराबर करें। सभी चरणों के दौरान 1 एमएल / मिनट की निरंतर प्रवाह दर पर नी-एनटीए कॉलम चलाएं। यदि प्रोटीन को माइटोकॉन्ड्रिया के 2 ग्राम से कम से अलग किया गया है तो कम मात्रा कॉलम (1 एमएल) का उपयोग करें।
    4. 1 एमएल / मिनट की प्रवाह दर पर नी-एनटीए कॉलम पर घुलनशील प्रोटीन नमूने को लोड करें।
    5. अनबाउंड प्रोटीन को हटाने के लिए एनआई-एनटीए कॉलम को बफर ए 1 (तालिका 1) के 5 सीवी के साथ धोएं।
    6. एल्यूट हिज-टैग किए गए टीओएम-सीसी 30% बफर ए 2 (तालिका 1; 300 एमएम इमिडाज़ोल) के साथ और प्रोटीन शिखर को इकट्ठा करते हैं जैसा कि यह 280 एनएम क्रोमैटोग्राम (चित्रा 1 बी) में दिखाई देता है।
    7. टीओएम-सीसी के आगे शुद्धिकरण के लिए, स्वचालित प्रोटीन शोधन प्रणाली का उपयोग करके बफर बी 1, बी 2 और बी 1 (तालिका 1) के प्रत्येक 5 सीवी के साथ प्रीपैक्ड आयन एक्सचेंज कॉलम (1 एमएल) को बराबर करें। सभी चरणों के दौरान 1 एमएल / मिनट की निरंतर प्रवाह दर पर आयन विनिमय स्तंभ चलाएं।
    8. आयन विनिमय स्तंभ (1 एमएल / मिनट की प्रवाह दर) पर टीओएम-सीसी पीक अंश (चरण 1.1.6) लोड करें।
    9. बफर बी 1 (तालिका 1) के 5 सीवी और 0% -20% बफर बी 2 (तालिका 1) के रैखिक नमक ढाल के साथ कॉलम को धोकर अनबाउंड प्रोटीन को हटा दें।
    10. 20% -35% बफर बी 2 के रैखिक नमक ढाल के साथ एल्यूट टीओएम-सीसी, और प्रोटीन पीक अंश एकत्र करें जैसा कि यह 280 एनएम क्रोमैटोग्राम (चित्रा 1 सी) में दिखाई देता है।
    11. एसडीएस-पेज (चित्रा 1 डी) द्वारा नमूना शुद्धता का आकलन करें और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटीन परख का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    12. तरल नाइट्रोजन में प्रोटीन के नमूनों को फ्रीज करें और उन्हें आगे के उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      सावधानी: तरल नाइट्रोजन को अच्छी तरह से हवादार क्षेत्रों में संभाला जाना चाहिए। उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें।
       
  2. ओएमपीएफ का अलगाव
    1. ई. कोलाई स्ट्रेन बीई बीएल21 (डीई3) ओएमपी6, जिसमें लैम्ब और ओएमपीसी32 की कमी होती है, को बाँझ परिस्थितियों में जमे हुए ग्लिसरॉल स्टॉक से रिकवर करें, और लूरिया-बर्टानी (एलबी) एगर प्लेट पर लकीरें (तालिका 2)। ऐसा करने के लिए, धीरे-धीरे नमूने को पूरी प्लेट पर समान रूप से फैलाएं।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ढक्कन बंद करने और इनक्यूबेट करने से पहले, नमूने को 5 मिनट के लिए आगर में भिगोने दें।
    3. एक एकल ई कोलाई कॉलोनी का चयन करें, बाँझ टूथपिक का उपयोग करके इस एकल कॉलोनी के साथ 7.5 एमएल एलबी माध्यम (तालिका 2) का टीकाकरण करें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर आंदोलन (170 आरपीएम) के साथ रात भर (14 घंटे) बढ़ने के लिए छोड़ दें।
    4. बाँझ पिपेट के साथ ई कोलाई कोशिकाओं के 2 x 1 एमएल को एलबी माध्यम (तालिका 2) में स्थानांतरित करें, और एक शेकर में आंदोलन (~ 170 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर (~ 14 घंटे) बढ़ने के लिए छोड़ दें।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 5,000 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को काटें, गोली को तरल नाइट्रोजन में फ्रीज करें, और आगे के उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: सेल पेलेट का गीला वजन आमतौर पर 5 ग्राम प्रति 1 एल संस्कृति है। इस बिंदु पर, प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है।
    6. लाइसिस बफर सी 1 (तालिका 2) के 20 एमएल में कोशिकाओं (2 ग्राम) को पिघलाएं और पुन: निलंबित करें, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार, 35 एमएल की अधिकतम नमूना मात्रा के साथ प्रीकूल्ड (4 डिग्री सेल्सियस) उच्च दबाव सेल व्यवधान प्रणाली के माध्यम से 1,000 पीएसआई पर तीन बार निलंबन पारित करें।
      चेतावनी: एक फ्रांसीसी प्रेस के उपयोग से गंभीर चोटें आ सकती हैं। उपयोग किए गए सेल की दबाव सीमा से अधिक कभी न करें। उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें।
    7. 15 मिनट के लिए 4,000 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा लाइसेट से अटूट कोशिकाओं को हटा दें, और सतह पर तैरने वाले को इकट्ठा करें।
    8. 1 घंटे के लिए 100,000 x g पर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा झिल्ली एकत्र करें।
    9. झिल्ली गोली को बफर सी 2 (तालिका 2) के 10 एमएल में पुन: निलंबित करें, और गेंद-असर ग्लास होमोजेनाइज़र का उपयोग करके एसडीएस बफर सी 3 (तालिका 2) की समान मात्रा के साथ मिलाएं।
      चेतावनी: बफर सी 3 में β-मर्काप्टोएथेनॉल विषाक्त है। सभी प्रासंगिक सुरक्षा नियमों का पालन करें।
    10. निलंबन को 30 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में इनक्यूबेट करें।
    11. नमूने को 1 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर 100,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    12. गेंद-असर ग्लास होमोजेनाइज़र का उपयोग करके एसडीएस बफर सी 4 (तालिका 2) के 10 एमएल में झिल्ली गोली को फिर से निलंबित करें, और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में निलंबन को इनक्यूबेट करें।
      नोट: यदि गोली को फिर से निलंबित नहीं किया जा सकता है, तो 20 एमएल की मात्रा तक अधिक एसडीएस बफर सी 4 जोड़ें।
    13. नमूने को 30 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर 100,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, और सुपरनैटेंट एकत्र करें।
    14. ऑक्टिल पॉलीऑक्सीथिलीन (ऑक्टिल पीओई) के साथ सुपरनैटेंट को 0.5% (डब्ल्यू / वी) की अंतिम डिटर्जेंट एकाग्रता में मिलाएं, और 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बफर सी 5 (तालिका 2) के खिलाफ नमूने को दो बार डायलाइज करें। इस उद्देश्य के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार, 20 केडीए के कट ऑफ के साथ डायलिसिस ट्यूबिंग का उपयोग करें, और नमूना डायलिसिस ट्यूबिंग या डिवाइस में रखें।
      नोट: डायलिसिस ट्यूबिंग के कट ऑफ को समायोजित करने की आवश्यकता है यदि अन्य आणविक द्रव्यमान वाले प्रोटीन को डायलाइज्ड किया जाना चाहिए।
    15. एसडीएस-पेज द्वारा नमूना शुद्धता का आकलन करें और निर्माता के प्रोटोकॉल (सामग्री की तालिका) के अनुसार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटीन परख का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करें।
      नोट: 95 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किए गए नमूने मोनोमेरिक ओएमपीएफ दिखाते हैं। गर्म नहीं किए गए नमूने ओएमपीएफ को अपने ट्रिमरिक रूप में दिखाते हैं (चित्रा 1 एफ)।
    16. शॉक-फ्रीज डायलाइज्ड ओएमपीएफ तरल नाइट्रोजन में एलिकोट में, और आगे के उपयोग तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      सावधानी: तरल नाइट्रोजन को अच्छी तरह से हवादार क्षेत्रों में संभाला जाना चाहिए। उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें।

2. डीआईबी झिल्ली में आयन चैनलों की ऑप्टिकल सिंगल-चैनल रिकॉर्डिंग

नोट: यह खंड एकल आयन चैनल17 के माध्यम से पार्श्व प्रोटीन आंदोलन और आयन प्रवाह की निगरानी के लिए माइक्रोफैब्रिकेटेड पॉलीमिथाइल मेथैक्रिलेट (पीएमएमए) कक्ष2 में डीआईबी झिल्ली तैयार करने की प्रक्रिया का वर्णन करता है। चैंबर के निर्माण के लिए आयाम और सटीक चित्र लेप्थिन एट अल 2 में पाए जा सकते हैं। चित्रा 2 पीएमएमए कक्ष2 की असेंबली और डीआईबी झिल्ली के गठन का अवलोकन देता है। जब तक अन्यथा निर्दिष्ट नहीं किया जाता है, सभी चरण कमरे के तापमान (आरटी) पर किए जाते हैं। चित्रा 3 एक डीआईबी झिल्ली का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दिखाता है और कैसे एकल चैनल प्रोटीन के माध्यम से सीए2 + फ्लक्स का उपयोग झिल्ली में आंदोलन और चैनल की खुली-बंद स्थिति दोनों की निगरानी के लिए किया जाता है।

  1. लिपिड की तैयारी
    1. लिपिड स्टॉक समाधान को हटा दें जिसमें 1,2-डाइफाइटानोयल-एसएन-ग्लिसेरो-3-फॉस्फोकोलाइन (25 मिलीग्राम / एमएल डीपीएचपीसी) होता है जो -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीजर से क्लोरोफॉर्म में घुल जाता है, और आरटी को गर्म करता है। इस उद्देश्य के लिए, आमतौर पर कुछ मिनटों के लिए हाथ से धीरे-धीरे नमूने को गर्म करना पर्याप्त होता है।
      चेतावनी: क्लोरोफॉर्म विषाक्त है। उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें और फ्यूम हुड के तहत क्लोरोफॉर्म से जुड़ी सभी प्रक्रियाओं को करें।
    2. डीपीएचपीसी स्टॉक समाधान (25 मिलीग्राम / एमएल डीपीएचपीसी) के 380 μL को कांच की शीशी में स्थानांतरित करें। रबर सीलिंग वाले पिपेट से बचें। इसके बजाय, स्टेनलेस स्टील प्लंजर के साथ माइक्रोलीटर ग्लास सिरिंज का उपयोग करें।
    3. लिपिड स्टॉक समाधान को संभालने के बाद, लिपिड ऑक्सीकरण को रोकने के लिए एआर या एन2 गैस के साथ लिपिड स्टॉक समाधान को ओवरले करें। कार्बनिक विलायक के वाष्पीकरण से बचने के लिए सबसे कम संभव गैस प्रवाह का उपयोग करें जिसमें लिपिड घुल जाते हैं या शीशी से विलायक स्प्रे के छींटे पड़ते हैं। सुनिश्चित करें कि कार्बनिक विलायक के साथ लिपिड युक्त कांच की शीशियों के ढक्कन अंदर की ओर पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन (पीटीएफई) के साथ लेपित होते हैं।
    4. एन 2 की एक धारा के तहत लिपिड नमूना (चरण 2.1.2) को सुखाएं, और तेल मुक्त वैक्यूम पंप का उपयोग करके वैक्यूम (2.0 एमबार) के तहत रात भर लिपिड नमूने से शेष कार्बनिक विलायक को हटा दें।
    5. सिलिकॉन तेल समाधान में लिपिड फिल्म को 9.5 मिलीग्राम / एमएल की अंतिम लिपिड एकाग्रता में एक माइक्रोलीटर ग्लास सिरिंज का उपयोग करके हेक्साडेकेन और सिलिकॉन तेल (प्रत्येक 500 μL) की समान मात्रा जोड़कर भंग करें।
      नोट: लिपिड समाधान कई हफ्तों के लिए आरटी पर स्थिर है।
  2. अगारोस हाइड्रोजेल की तैयारी
    1. डबल विआयनीकृत पानी में लगभग 1 एमएल कम पिघलने वाला अगारोस घोल (0.75% [डब्ल्यू / वी]) तैयार करें, और स्पिन कोटिंग ग्लास कवरलिप्स के लिए उपयोग किए जाने वाले 20 मिनट के लिए हीटिंग ब्लॉक में 85 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
      नोट: अगारोस समाधान को कई हफ्तों तक आरटी में रखा जा सकता है और इसे कई बार गर्म किया जा सकता है।
    2. 0.66 M CaCl 2 और 8.8 mM HEPES (pH 7.2) में कम पिघलने वाला2.5 % (w/v) अगारोस घोल तैयार करें, और 20 मिनट के लिए एक हीटिंग ब्लॉक में 85 °C तक गर्म करें। सुनिश्चित करें कि अगारोस अच्छी तरह से पिघला हुआ है।
      नोट: Agarose समाधान को आरटी में कई हफ्तों तक रखा जा सकता है और स्पिन कोटिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले अगारोस (चरण 2.2.1) की तरह कई बार फिर से गर्म किया जा सकता है।
  3. सिलिकॉन तेल इंटरफ़ेस पर पॉलीमिथाइल मेथैक्रिलेट (पीएमएमए) चैंबर असेंबली और लिपिड मोनोलेयर गठन
    1. स्टेनलेस-स्टील कवरस्लिप होल्डर में कुछ ग्लास कवरलिप्स (40 मिमी x 24 मिमी x 0.13 मिमी) रखें, और उन्हें अल्ट्रासोनिक क्लीनर में एसीटोन के साथ 10 मिनट के लिए ग्लास बीकर में साफ करें। कवरलिप्स को डुबोने के लिए पर्याप्त एसीटोन का उपयोग करें और बीकर को ग्लास प्लेट के साथ शिथिल रूप से कवर करें ताकि एक दबाव रहित, बंद प्रणाली बनाई जा सके जो सफाई प्रक्रिया के दौरान वाष्प के पलायन को कम करती है।
      चेतावनी: एसीटोन कम फ्लैश बिंदु के साथ एक अत्यधिक ज्वलनशील विलायक है। वाष्प / वायु मिश्रण विस्फोटक हैं। अल्ट्रासोनिक क्लीनर को अच्छी तरह से हवादार क्षेत्र में संचालित करें। उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें और आधिकारिक सुरक्षा सावधानियों का पालन करें (उदाहरण के लिए, कोई खुली आग नहीं और कोई चिंगारियां नहीं)।
    2. ग्लास कवरलिप्स को डबल-आयनीकृत पानी से धोएं और उन्हें एन2 की धारा के नीचे सुखाएं।
      नोट: इस तरह से साफ किए गए कवरलिप्स को कई हफ्तों तक संग्रहीत किया जा सकता है।
    3. इसके अलावा 5 मिनट के लिए ऑक्सीजन (0.5 एमबार) के साथ प्लाज्मा क्लीनर में एक कवरस्लिप को साफ और हाइड्रोफिलाइज करें।
      नोट: अगारोस समाधान के साथ स्पिन कोटिंग से पहले इस चरण को तुरंत करें, क्योंकि प्लाज्मा सफाई का हाइड्रोफिलिक प्रभाव समय के साथ बंद हो जाता है।
    4. एक स्पिन कोटर पर प्लाज्मा-उपचारित कवरस्लिप माउंट करें (चित्रा 2, चरण 1)।
    5. 200 μL पिपेट (चित्रा 2, चरण 1) का उपयोग करके 30 सेकंड के लिए 3,000 आरपीएम पर धीरे-धीरे 140 μL गर्म 0.75% (w/v) कम पिघलने वाले अगारोस (चरण 2.2.1) को जोड़कर अगारोस की एक उप-माइक्रोमीटर-मोटी फिल्म के साथ कवरस्लिप को कोट करें।
      नोट: अगारोस फिल्म की मोटाई परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) द्वारा निर्धारित की जा सकती है, जैसा किवर्णित 17 है।
    6. तुरंत पीएमएमए चैंबर2 के नीचे की ओर अगारोस हाइड्रोगेल की पतली परत के साथ स्पिन-लेपित कवरस्लिप संलग्न करें। सुनिश्चित करें कि अगारोस हाइड्रोगेल ऊपर की ओर इंगित करता है (चित्रा 2, चरण 2)।
    7. कवरस्लिप के किनारों को पारदर्शी चिपकने वाले टेप के साथ पीएमएमए माइक्रो-मशीन डिवाइस पर ठीक करें।
    8. पीएमएमए डिवाइस को 35 डिग्री सेल्सियस तक गर्म गर्म प्लेट पर रखें (चित्रा 2, चरण 3)।
    9. हवा के बुलबुले बनाए बिना, एक पिपेट (चित्रा 2, चरण 3) के साथ कक्ष के इनलेट में 2.5% अगारोस समाधान (चरण 2.2.2) के 200 μL को सावधानीपूर्वक डालें ताकि स्पिन कोटिंग द्वारा लागू पतला हाइड्रोगेल 2.5% अगारोस समाधान के बफर के साथ बराबरी कर सके और हाइड्रेटेड रह सके। सुनिश्चित करें कि 2.5% अगारोस समाधान स्पिन-लेपित अगारोस हाइड्रोगेल के चारों ओर फैला हुआ है, लेकिन इसके ऊपर नहीं (चित्रा 3 ए), जिसे हीटिंग प्लेट पर पीएमएमए कक्ष को धीरे से दबाकर टाला जा सकता है।
    10. पीएमएमए कक्ष (चित्रा 2, चरण 4) के कुओं को कुल 60 μL लिपिड / तेल समाधान (चरण 2.1.5) के साथ तुरंत कवर करें, ताकि अगारोस-तेल इंटरफ़ेस पर लिपिड मोनोलेयर गठन शुरू किया जा सके और पीएमएमए कक्ष के कुओं में स्पिन-लेपित अगारोस के निर्जलीकरण से बचा जा सके। डिवाइस को लगभग 2 घंटे के लिए 35 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म प्लेट पर रखें।
      नोट: पीएमएमए कक्ष में गोलाकार कुओं का व्यास 0.5 मिमी और गहराई 1.8 मिमी है, पहले प्रकाशित कार्य2 के अनुसार।
  4. सिलिकॉन तेल समाधान में लिपिड-लेपित जलीय बूंदों की तैयारी
    1. सिलिकॉन तेल समाधान (चरण 2.1.5) को एक बूंद इनक्यूबेशन कक्ष में कई माइक्रोफैब्रिकेटेड कुओं में से प्रत्येक के लिए लिपिड हेक्साडेकेन / सिलिकॉन तेल समाधान (चरण 2.1.5) का 20 μL रखें (चित्रा 2, चरण 4)। सिलिकॉन तेल समाधान के लिए उपयुक्त कंटेनर एक पतली पीएमएमए प्लेट2 में 40 मिमी x 30 मिमी x 3.5 मिमी के छोटे अवकाश हैं।
    2. ऊर्ध्वाधर या क्षैतिज माइक्रोपिपेट पुलर (उदाहरण के लिए, पैच पिपेट या तेज ग्लास इलेक्ट्रोड बनाने के लिए उपयोग किया जाता है) का उपयोग करके 20 μm के टिप ओपनिंग व्यास के साथ एक माइक्रोकेशिका ग्लास सुई तैयार करें। 7.5x और 35x के बीच ज़ूम रेंज में कम आवर्धन पर दूरबीन स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत माइक्रोकेशिका ग्लास सुई के शुरुआती व्यास का अनुमान लगाएं।
      नोट: ग्लास केशिका खींचने से पहले प्रीहीटिंग मोड के लिए सेटिंग्स, खींचने के लिए हीटिंग मोड, और कर्षण बल को पहले से प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए, पुलिंग डिवाइस के निर्माता के विनिर्देशों और केशिका के प्रकार के अनुसार।
    3. माइक्रोकेशिका ग्लास सुई को 5 μL जलीय इंजेक्शन समाधान के साथ भरें जिसमें 8.8 mM HEPES (pH 7.2), 7 μM Fluo-8, 400 μM EDTA, 1.32 M KCl, और 30 nM TOM कोर कॉम्प्लेक्स, या वैकल्पिक रूप से 20 nM OmpF एक माइक्रोकेशिका पिपेट टिप का उपयोग करके होता है। जलीय इंजेक्शन समाधान तैयार करने के लिए केवल डबल-डिस्टिल्ड पानी का उपयोग करें जिसे पहले एक चेलटिंग राल के साथ इलाज किया गया था जो मल्टीवेलेंट धातु आयनों (सीए2 +) को बांधता है।
    4. पीजो-संचालित नैनोइंजेक्टर पर जलीय इंजेक्शन समाधान के साथ माइक्रोकेशिका ग्लास सुई को माउंट करें।
    5. 100-200 nL जलीय बूंदों (चित्रा 2, चरण 4) को 8.8 mM HEPES (pH 7.2), 7 μM Fluo-8, 400 μM EDTA, 1.32 M KCl, और 30 nM TOM कोर कॉम्प्लेक्स (चरण 1.1.12), या वैकल्पिक रूप से 20 nM OmpF (चरण 1.2.16) को बूंद इनक्यूबेशन कक्ष में इंजेक्ट करें । सुनिश्चित करें कि बूंदें कुओं में कई मिलीमीटर (>10 मिमी) अलग रखकर एक-दूसरे को न छुएं। अन्यथा, यदि लिपिड मोनोलेयर अभी तक तेल / बफर इंटरफ़ेस पर नहीं बने हैं, तो वे बड़ी बूंदों में विलय हो जाएंगे।
      नोट: यदि कोई वर्ग केशिकाएं और कोई नैनोइंजेक्टर उपलब्ध नहीं हैं, तो बूंदों को वैकल्पिक रूप से 0.1 μL और 0.5 μL के बीच वॉल्यूम के लिए एकल-चैनल माइक्रोलीटर पिपेट के साथ मैन्युअल रूप से तैयार किया जा सकता है, जैसा किवर्णित 2 है। इस मामले में, हालांकि, बूंद की मात्रा उतनी सटीक नहीं है।
    6. तेल इंटरफ़ेस पर लगभग 2 घंटे के लिए एक लिपिड मोनोलेयर के गठन की अनुमति दें, जिसमें पीएमएमए और ड्रॉपलेट इनक्यूबेशन कक्षों (चित्रा 2, चरण 4) को 35 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जाता है।
  5. डीआईबी झिल्ली में एकल आयन चैनलों की तैयारी और इमेजिंग
    1. 10 μL डिस्पोजेबल पॉलीप्रोपाइलीन टिप के साथ एकल-चैनल माइक्रोलीटर पिपेट का उपयोग करके, स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत बूंद इनक्यूबेशन कक्ष के कुओं से व्यक्तिगत जलीय बूंदों को मैन्युअल रूप से पीएमएमए कक्ष (चित्रा 2, चरण 5) के कुओं में स्थानांतरित करें। बूंदों और अगारोस हाइड्रोगेल के बीच लिपिड बाइलेयर (चित्रा 3) बनाने के लिए बूंदों को लगभग 5 मिनट के लिए हाइड्रोगेल-ऑयल इंटरफेस पर गठित लिपिड मोनोलेयर पर डूबने दें।
    2. उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप के नमूना धारक पर डीआईबी झिल्ली के साथ पीएमएमए कक्ष को माउंट करें और 10 एक्स हॉफमैन मॉड्यूलेशन कंट्रास्ट उद्देश्य (चित्रा 2, चरण 6) का उपयोग करके झिल्ली गठन का आकलन करें। डीआईबी झिल्ली गठन को बूंद और हाइड्रोगेल (चित्रा 4 ए) के बीच इंटरफेस पर एक स्पष्ट सफेद अंगूठी द्वारा इंगित किया जाता है। डीआईबी झिल्ली जो टूट गई है, इस अंगूठी को नहीं दिखाती है (चित्रा 4 बी)।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, डीआईबी झिल्ली को चरण कंट्रास्ट या डिफरेंशियल इंटरफेरेंस कंट्रास्ट (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी द्वारा 10x आवर्धन पर देखा जा सकता है।
    3. यदि डीआईबी झिल्ली का गठन हुआ है, तो एपिफ्लोरेसेंस रोशनी के लिए पारंपरिक प्रकाश स्रोत से लैस टीआईआरएफ माइक्रोस्कोप (चित्रा 2, चरण 7) के नमूना धारक पर पीएमएमए कक्ष को माउंट करें, एक 488 एनएम लेजर (पीअधिकतम = 100 एमडब्ल्यू), और ~ 0.16 μm के पिक्सेल आकार को प्राप्त करने के लिए एक बैक-इल्युमिनेटेड इलेक्ट्रॉन-गुणा सीसीडी कैमरा (512 x 512 पिक्सेल; >95% क्यूई)।
    4. जीएफपी फिल्टर सेट का उपयोग करके उच्च तीव्रता वाले प्रकाश स्रोत के साथ एपिफ्लोरेसेंस रोशनी के तहत 10x आवर्धन उद्देश्य के साथ डीआईबी झिल्ली के किनारे पर ध्यान केंद्रित करें।
    5. 100x/N.A. 1.49 एपोक्रोमैट तेल TIRF उद्देश्य के साथ उच्च आवर्धन पर डीआईबी झिल्ली के एक ही किनारे पर ध्यान केंद्रित करें, फिर से एपिफ्लोरेसेंस रोशनी के तहत, जीएफपी फिल्टर सेट का उपयोग करके उच्च तीव्रता वाले प्रकाश स्रोत के साथ जो बूंद में फ्लोरोसेंट डाई फ्लूओ -8 की कमजोर पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति की कल्पना करने की अनुमति देता है (चित्रा 4 सी)।
    6. फ़िल्टर सेटिंग को GFP से क्वाड-बैंड TIRF फ़िल्टर सेट में परिवर्तित करें।
    7. 488 एनएम लेजर पर स्विच करें और उद्देश्य लेंस पर लेजर की तीव्रता को 8 mW और 10 mW के बीच मान पर सेट करें।
      नोट: चूंकि उद्देश्य लेंस पर लेजर तीव्रता पर अक्सर कोई मात्रात्मक जानकारी नहीं होती है, इसलिए निर्माता के विनिर्देशों के अनुसार, लेजर तीव्रता सेटिंग्स को लेंस पर अलग-अलग मापों में पहले से कैलिब्रेट किया जाना चाहिए, जिसमें फोटोडायोड सेंसर से लैस ऑप्टिकल लेजर पावर मीटर होता है।
      चेतावनी: लेजर के सुरक्षित संचालन को सुनिश्चित करने के लिए, ऑपरेटर को लेजर विकिरण के संभावित खतरों और दुर्घटना रोकथाम नियमों के बारे में पता होना चाहिए।
    8. एकल आयन चैनलों की कल्पना करने के लिए, टीआईआरएफ कोण और ईएमसीसीडी कैमरा गेन (जैसे, ईएम गेन मल्टीप्लायर सेटिंग: 285) को समायोजित करें ताकि डीआईबी झिल्ली में खुले आयन चैनल अंधेरे पृष्ठभूमि (चित्रा 4 डी-जी) पर उच्च-कंट्रास्ट फ्लोरोसेंट स्पॉट के रूप में दिखाई दें, और सिग्नल-टू-बैकग्राउंड अनुपात, जब नेत्रहीन निरीक्षण किया जाता है, तो अधिकतम तक पहुंच जाता है। सुनिश्चित करें कि एकल आयन चैनलों के माध्यम से सीए2 + -फ्लक्स के अनुरूप धब्बे, फोकस में रहते हैं और केंद्र में उच्च तीव्रता के साथ एक गोल आकार रखते हैं और धीरे-धीरे परिधि की ओर कम होते हैं। चैनलों के बिना झिल्ली केवल पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति दिखाती है (चित्रा 4 सी)।
    9. समय के साथ अलग-अलग चैनलों की गति और खुली-बंद गतिविधि को रिकॉर्ड करने से पहले, जांचें कि फ्लोरोसेंट स्पॉट फोकस में हैं, यह सुनिश्चित करने के लिए कि आयन चैनल डीआईबी झिल्ली में पुनर्गठित हो गए हैं और झिल्ली विमान में पार्श्व रूप से आगे बढ़ रहे हैं। यदि ऐसा नहीं है, तो यह संकेत दे सकता है कि एक फ्लोरोसेंट अणु झिल्ली के पास लेजर द्वारा उत्पन्न इवानसेंट क्षेत्र में और बाहर डूब रहा है।
    10. झिल्ली छवियों की एक श्रृंखला रिकॉर्ड करें जो व्यक्तिगत आयन चैनलों की खुली-बंद स्थिति की स्थिति और निगरानी की उचित ट्रैकिंग की अनुमति देती है। पार्श्व गतिशीलता के प्रकार (उदाहरण के लिए, मुक्त गति बनाम क्षणिक एंकरेज [संदर्भ के लिए,16 देखें]) और चैनल गतिविधि की स्थिति (जैसे, खुला या बंद) निर्धारित करने के लिए, पर्याप्त रूप से लंबा (जैसे, 30 सेकंड से 1 मिनट) और अच्छी तरह से नमूना प्रक्षेपपथ (जैसे, 48 एस -1 की फ्रेम दर) प्राप्त करें।
      नोट: चैनल, प्रतिबंधित, या हॉप प्रसार16 के अवलोकन के लिए आवश्यक है कि सीमित सीमाओं के भीतर अप्रतिबंधित प्रसार को मापने के लिए नमूना दर पर्याप्त रूप से तेज हो। इसके अलावा, सुनिश्चित करें कि डेटा नमूनाकरण समय असीमित से विवश प्रसार तक संक्रमण को मापने के लिए पर्याप्त रूप से लंबा है (विवरण के लिए, जैकबसन एट अल.16 देखें)।
  6. छवि और डेटा प्रसंस्करण
    नोट: ओपन-सोर्स इमेज प्रोसेसिंग पैकेज33 या वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर पैकेजों पर आधारित स्व-लिखित दिनचर्या17 का उपयोग डीआईबी में व्यक्तिगत आयन चैनलों की स्थानिक गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है। व्यक्तिगत चैनलों के माध्यम से आयन प्रवाह के साथ पार्श्व झिल्ली गतिशीलता को सहसंबंधित करने में सक्षम होने के लिए, कोई फ़िल्टर एल्गोरिदम लागू नहीं किया जाना चाहिए।
    1. स्व-लिखित दिनचर्या का उपयोग करके मानक प्रक्रियाओंको लागू करके ब्लीचिंग के लिए सही छवि समय श्रृंखला, पूर्ण छवि की औसत फ्रेम तीव्रता Equation 1 को Equation 2फिट करके, जहां टी फ्रेम इंडेक्स (समय) है और एककेफिटिंग पैरामीटर है। फिर, समय श्रृंखला को सही करें Equation 3, जहां I(t) तीव्रता है। वैकल्पिक रूप से, प्रारंभिक डेटा विश्लेषण के लिए, कैमरे के स्पॉट और पिक्सेल आकार (जैसे, 50 पिक्सेल) के आधार पर कार्यान्वित रोलिंग-बॉल एल्गोरिदम33 और रोलिंग-बॉल त्रिज्या के साथ ओपन सोर्स सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके पृष्ठभूमि सुधार करें।
    2. एक परिभाषित क्षेत्र (आरओआई) (जैसे, 30 x 30 पिक्सेल) के भीतर एक फ्लोरेसेंस स्पॉट की स्थानिक स्थिति और आयामों को निर्धारित करें, एक निश्चित समय पर आई (टी) को प्लानर झुकाव के साथ दो-आयामी गॉसियन फ़ंक्शन में फिट करके जो संभावित स्थानीय रोशनी ग्रेडिएंट के Equation 4लिए जिम्मेदार है। यहां, x = (x, y) प्रतिदीप्ति तीव्रता जानकारी के साथ ROI है, A और σ गॉसियन के आयाम और चौड़ाई हैं, pk पैरामीटर हैं जो ROI की पृष्ठभूमि तीव्रता को चिह्नित करते हैं, और μ = (x0, y0) गॉसियन की स्थिति को परिभाषित करता है। एक व्यक्तिगत चैनल के माध्यम से आयन प्रवाह पैरामीटर ए द्वारा दिया गया है। चैनल का प्रक्षेपवक्र एक्स द्वारा दिया गया है, और चैनल की पार्श्व गतिशीलता निर्धारित करने की अनुमति देता है। वैकल्पिक रूप से, ओपन-सोर्स प्लेटफॉर्म33 और प्लग-इन का उपयोग करके व्यक्तिगत स्थानों की स्थिति और तीव्रता निर्धारित करना संभव है जैसा कि35,36 वर्णित है। ईएमसीसीडी कैमरा रीडआउट को फोटॉन संख्या38 में बदलने के बाद स्थितिगत सटीकता37 का अनुमान लगाएं।
    3. चैनल के माध्यम से चैनल प्रसार और आयन प्रवाह के बीच संभावित सहसंबंध निर्धारित करने के लिए प्रतिदीप्ति आयाम ए बनाम समय और संबंधित प्रक्षेपवक्र एक्स को प्लॉट करें। किसी भी ग्राफिक्स सॉफ्टवेयर के साथ इसे निष्पादित करें। मुक्त पार्श्व चैनल आंदोलन के मामले में, समय की देरी के रैखिक प्रतिगमन द्वारा पार्श्व प्रसार गुणांक डी निर्धारित करें, और x से धब्बों के औसत वर्ग विस्थापन की गणना करेंEquation 5।
      नोट: डीआईबी झिल्ली में स्वतंत्र रूप से चलने वाले टीओएम-सीसी और ओएमपीएफ के लिए विशिष्ट प्रसार गुणांक17 0.5 और 1.5 μm2 s-1 के बीच होता है। अणु जिनका प्रसार स्थिरांक 0.01 मिमी2.एस -1 से कम है, उन्हें स्थिर 17 के रूप में परिभाषित कियागया है।

Representative Results

रियल-टाइम इलेक्ट्रोड-फ्री ऑप्टिकल सिंगल-चैनल रिकॉर्डिंग से पार्श्व प्रोटीन आंदोलन और डीआईबी झिल्ली में व्यक्तिगत आयन चैनलों के कार्य के बीच परस्पर क्रिया का पता चलता है। माइटोकॉन्ड्रियल टीओएम कोर कॉम्प्लेक्स (चित्रा 1 ए) का डीआईबी झिल्ली (चित्रा 4 डी) में पुनर्गठन पार्श्व गतिशीलता और आयन पारगम्यता (चित्रा 5 ए) के बीच एक मजबूत अस्थायी सहसंबंध दिखाता है। टीओएम-सीसी गेटिंग पार्श्व आंदोलन17 के मोड के प्रति संवेदनशील प्रतीत होता है। चलते चैनल अपने छिद्रों और उच्च प्रतिदीप्ति बिंदु तीव्रता के माध्यम से सीए2 + फ्लक्स दिखाते हैं। फंसे हुए, गैर-गतिशील अणु कम और मध्यम प्रतिदीप्ति तीव्रता दिखाते हैं। माइटोकॉन्ड्रिया टीओएम-सीसी के सामान्य प्रोटीन आयात छिद्र के लिए, इस एकल अणु दृष्टिकोण ने पार्श्व गतिशीलता और आयन पारगम्यता के बीच एक मजबूत अस्थायी सहसंबंध का खुलासा किया, यह सुझाव देते हुए कि टीओएम-सीसी चैनल में मेकेनोसेंसिटिव गुणहैं। स्वतंत्र रूप से चलने वाले टीओएम-सीसी अणुओं का एक पार्श्व स्टॉप टीओएम-सीसी चैनल के आंशिक या पूर्ण बंद होने के साथ होता है। ओएमपीएफ (चित्रा 1 ई और चित्रा 4 एफ) के साथ इमेजिंग डीआईबी झिल्ली, जो झिल्ली में लगभग पूरी तरह से एम्बेडेड है, कोई स्टॉप-एंड-गो प्रभाव नहीं दिखाती है (चित्रा 5 बी)। ओएमपीएफ के यादृच्छिक स्टॉप तीव्रता में बदलाव से जुड़े नहीं हैं और इस प्रकार, इसके छिद्रों के बंद होने के साथ। प्रतिदीप्ति संकेत38 के आधार पर, व्यक्तिगत चैनलों की स्थितिगत सटीकता का अनुमान 5 और 10 एनएम के बीच की सीमा में लगाया जा सकता है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यह सटीकता प्राप्त नहीं की जा सकती है यदि चैनल अगारोस हाइड्रोगेल के साथ मोबाइल एंकरिंग के कारण थोड़ा लड़खड़ाते हैं, जैसा कि दिखाया गया है, उदाहरण के लिए, टीओएम-सीसी अणुओं के लिए एक मध्यवर्ती अवस्था में 120 एनएम (चित्रा 5 ए) के रूट औसत विस्थापन के साथ।

Figure 1
चित्रा 1: टीओएम-सीसी का अलगाव। (ए) एन क्रैसा टीओएम-सीसी30,39 की क्रायो ईएम संरचना। एक एन क्रैसा स्ट्रेन से माइटोकॉन्ड्रिया जिसमें टॉम 22 होता है, जिसमें 6xHis टैग होता है, डीडीएम में घुलनशील होते हैं और Ni-NTA आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी (बी) और आयन-एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी (सी) के अधीन होते हैं। (घ) पृथक टीओएम-सीसी का एसडीएस-पेज। (ई) शुद्ध ई कोलाई ओएमपीएफ की क्रिस्टल संरचना (पीडीबी, 1 ओपीएफ) और (एफ) एसडीएस-पेज। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: पीएमएमए कक्ष असेंबली का प्रवाह चार्ट। चरण 1: एक ग्लास कवरस्लिप को एक अगारोस हाइड्रोगेल के साथ स्पिन-लेपित किया जाता है। चरण 2: स्पिन-लेपित कवरस्लिप को कस्टम-निर्मित पीएमएमए माइक्रोस्कोपी कक्ष में रखा गया है। चरण 3: अतिरिक्त कम पिघला हुआ अगारोस 35 डिग्री सेल्सियस गर्म प्लेट पर पीएमएमए कक्ष के इनलेट पोर्ट में जोड़ा जाता है। चरण 4: लिपिड मोनोलेयर एक बफर / तेल इंटरफ़ेस (बाएं) पर जलीय बूंदों के आसपास और अगारोस हाइड्रोगेल / तेल इंटरफ़ेस (दाएं) पर बनते हैं। चरण 5: दो लिपिड मोनोलेयर के संपर्क में आने पर लिपिड बाइलेयर बनाने के लिए पीएमएमए कक्ष के कुओं में अलग-अलग जलीय बूंदों को पाइप किया जाता है। चरण 6: डीआईबी झिल्ली का गठन हॉफमैन मॉड्यूलेशन कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी द्वारा मान्य है। चरण 7: सम्मिलित आयन चैनलों के साथ डीआईबी झिल्ली के चयनित क्षेत्रों की छवियां टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त की जाती हैं। हरा: 0.75% एगारोस; पीला: 2.5% एगारोस जिसमें सीए2 + आयन होते हैं; मैजेंटा: लिपिड / तेल चरण; गहरा नीला: जलीय बूंद बफर जिसमें सीए2 + संवेदनशील डाई और प्रोटीन होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: प्रायोगिक सेटअप. (A) एक PMMA कुएं में एक DIB झिल्ली का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. बाइलेयर एक अल्ट्राथिन 0.75% अगारोस फिल्म पर टिका हुआ है जो ट्रांस में सीए2 + संवेदनशील फ्लोरेसेंस डाई (फ्लूओ -8) का उपयोग करके समय के साथ आयन चैनल के माध्यम से सीए2 + -फ्लक्स की टीआईआरएफ इमेजिंग की अनुमति देता है। (B)Ca2+-फ्लक्स को विशेष रूप से सीआईएस से ट्रांस तक आसमाटिक दबाव द्वारा नियंत्रित किया जाता है। यह झिल्ली में स्थिति के निर्धारण और चैनल की खुली-बंद अवस्था दोनों की अनुमति देता है। यहां दिखाया गया चैनल एन क्रैसा माइटोकॉन्ड्रिया30 का प्रोटीन-संचालन चैनल टीओएम-सीसी है। (सी) एक टीओएम-सीसी चैनल का प्रक्षेपवक्र। ग्रीन: मूविंग चैनल; पीला: गैर-चलती चैनल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: डीआईबी झिल्ली में टीओएम-सीसी और ओएमपीएफ की इमेजिंग। (ए) हॉफमैन मॉड्यूलेशन कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी द्वारा चित्रित डीआईबी झिल्ली हाइड्रोगेल और बूंद के बीच बाइलेयर संपर्क क्षेत्र को दर्शाती है। (बी) टूटी हुई डीआईबी झिल्ली को (ए) के रूप में चित्रित किया गया है। तीर, पीएमएमए कक्ष का किनारा। (सी) प्रोटीन चैनलों के बिना टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी द्वारा चित्रित डीआईबी झिल्ली। (डी) पुनर्गठित टीओएम-सीसी के साथ डीआईबी झिल्ली, जिसे टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी द्वारा चित्रित किया गया है। सफेद वर्ग उच्च (एसएच), मध्यवर्ती (एसआई), और निम्न (एसएल) तीव्रता के धब्बे चिह्नित करते हैं। (ई) (ए) में चिह्नित तीन स्थानों की प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रोफ़ाइल को दो-आयामी गॉसियन कार्यों में फिट करने से चैनल के माध्यम से व्यक्तिगत टीओएम-सीसी और सीए2 + फ्लक्स की स्थिति का पता चलता है। (एफ) पुनर्गठित ओएमपीएफ के साथ डीआईबी झिल्ली। (जी) गॉसियन फ्लोरोसेंट स्पॉट (एफ) में चिह्नित है। दो-छिद्र β-बैरल प्रोटीन कॉम्प्लेक्स टीओएम-सीसी के विपरीत, तीन-छिद्र β-बैरल ओएमपीएफ केवल एक पारगम्यता स्थिति का खुलासा करता है। पिक्सेल आकार, 0.16 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
(ए) टीओएम-सीसी के फ्लोरोसेंट आयाम ट्रेस (ऊपर) और संबंधित प्रक्षेपवक्र (नीचे) इंगित करते हैं कि टीओएम-सीसी की खुली-बंद चैनल गतिविधि परिसर की पार्श्व झिल्ली गतिशीलता से संबंधित है। प्रक्षेपवक्र तीन पारगम्यता अवस्थाओं को प्रदर्शित करता है। हरा: पूरी तरह से खुली स्थिति; पीला: मध्यवर्ती पारगम्यता स्थिति; लाल: बंद चैनल राज्य; लाल तारा: मध्यवर्ती अवस्था में टीओएम-सीसी अपनी औसत स्थिति के चारों ओर लगभग ±60 एनएम तक लड़खड़ाता है। पूरी तरह से खुले और मध्यवर्ती राज्यों में प्रतिदीप्ति संकेतों के आधार पर स्थितिगत अशुद्धियाँ37 5 एनएम और 10 एनएम के बीच होती हैं। (बी) ओएमपीएफ के फ्लोरोसेंट आयाम ट्रेस (ऊपर) और संबंधित प्रक्षेपवक्र (नीचे)। ओएमपीएफ केवल एक तीव्रता स्तर का खुलासा करता है, भले ही यह गति में हो या फंसा हुआ हो। फंसे हुए अणुओं की समय अवधि के अनुरूप प्रक्षेपवक्र खंडों को ग्रे में चिह्नित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

बफ़र  अभिकर्मक सांद्रता आयतन
A1* 20 mM Tris-HCl pH 8.5, 0.1% (w/v) n-dodecyl-β-D-माल्टोसाइड (DDM), 10% (v/v) ग्लिसरॉल, 300 mM NaCl, और 1 mM फेनिलमेथिलसल्फोनाइल फ्लोराइड (PMSF) 100 mL
A2* 20 mM Tris-HCl pH 8.5, 0.1% (w/v) DDM, 10% (v/v) ग्लिसरॉल, 1 M Imidazole और 1 mM PMSF 100 mL
B1* 20 mM HEPES pH 7.2, 0.1% (w/v) DDM, 2% (v/v) डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (DMSO) 100 mL
B2* 20 mM HEPES pH 7.2, 0.1% (w/v) DDM, 1 M KCl, 2% (v/v) डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (DMSO) 100 mL
* उपयोग करने से पहले 0.22 μm फ़िल्टर से गुजरना और गुजरना।

तालिका 1: टीओएम-सीसी अलगाव के लिए बफर समाधान।

बफ़र  अभिकर्मक सांद्रता आयतन
LB* 1% (w/v) ट्रिपटोन, 1% (w/v) NaCl और 0.5% (w/v) खमीर निकालने 1100 mL
C1 2 mM MgCl2, और ~ 750 इकाइयाँ DNAse और 50 mM Tris-HCl pH 7.5 20 mL
C2 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 50 mL
C3 4% (डब्ल्यू / वी) सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस), 2 एमएम β-मर्काप्टोएथेनॉल और 50 एमएम ट्राइस-एचसीएल पीएच 7.5 50 mL
C4 2% (w/v) SDS, 500 mM NaCl और 50 mM Tris-HCl pH 7.5 50 mL
C5 0.5% (डब्ल्यू / वी) ऑक्टिल पॉलीऑक्सीथिलीन (ऑक्टिल पीओई), 1 एमएम ईडीटीए और 20 एमएम ट्राइस पीएच 8.5 1000 mL
* उपयोग से पहले निष्फल करें।

तालिका 2: ओएमपीएफ अलगाव के लिए बफर समाधान।

Discussion

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एकल-अणु टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके पार्श्व आयन चैनल आंदोलन और चैनल फ़ंक्शन के बीच परस्पर क्रिया का अध्ययन करने के लिए डीआईबी झिल्ली के उपयोग का परिचय प्रदान करता है। सर्वोत्तम संभव डेटा प्राप्त करने के लिए, अलग-अलग कणों की समय श्रृंखला प्राप्त करने के लिए यथासंभव कई अच्छी तरह से अलग चैनलों के साथ स्थिर डीआईबी झिल्ली की तैयारी महत्वपूर्ण है, जिसका संतोषजनक विश्लेषण किया जा सकता है।

अनुकूलित किए जाने वाले महत्वपूर्ण मापदंडों में लिपिड की पसंद, तेल चरण में लिपिड एकाग्रता और जलीय बूंदों में प्रोटीन और डिटर्जेंट सांद्रता शामिल हैं। नियोजित लिपिड असामान्य हैं, जिसमें वे कम तापमान पर कोई स्पष्ट चरण संक्रमण नहीं दिखाते हैं। डीपीएचपीसी स्थिर झिल्ली प्रणाली40 का उत्पादन करने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला लिपिड है। सिद्धांत रूप में, कोई भी लिपिड जो कम तापमान पर अपने द्रव वातावरण को बनाए रखता है, इस आवेदन के लिए उपयुक्त हो सकता है। इसके अलावा, लिपिड ऑक्सीकरण के प्रति संवेदनशील नहीं होना चाहिए। झिल्ली टूटने से बचने के लिए बूंदों में डिटर्जेंट एकाग्रता जितना संभव हो उतना कम होना चाहिए। स्थिर झिल्ली और अच्छी प्रोटीन निगमन दर आम तौर पर महत्वपूर्ण मिसेल एकाग्रता (सीएमसी) से नीचे डिटर्जेंट सांद्रता के साथ प्राप्त की जाती है, यह देखते हुए कि झिल्ली प्रोटीन अवक्षेपित नहीं होता है।

यदि डीआईबी झिल्ली विशिष्ट डिटर्जेंट21,41 को सहन नहीं करती है, या यदि प्रोटीन डीआईबी झिल्ली में कम डिटर्जेंट समाधान से एकीकृत नहीं होते हैं, तो प्रोटीन चैनलों को पहले छोटे यूनिलैमेलर लिपिड पुटिकाओं (एसयूवी) में पुनर्गठित किया जा सकता है, जो बाद में बूंद पक्ष से डीआईबी झिल्ली से जुड़े होते हैं, जैसा कि ई कोलाई एमएससीएल42 के लिए सफलतापूर्वक दिखाया गया है। . कभी-कभी, डीआईबी झिल्ली नहीं बनती है क्योंकि तेल चरण में लिपिड एकाग्रता बहुत कम होती है। डीआईबी झिल्ली को फटने से रोकने के लिए, किसी को यह भी पता होना चाहिए कि हाइड्रोगेल और बूंद के बीच आसमाटिक दबाव को सीआईएस से ट्रांस तक सीए2 + -फ्लक्स को प्रभावित किए बिना ठीक से संतुलित किया जाना चाहिए। झिल्ली प्रोटीन के प्रसार का निरीक्षण करने के लिए अनुकूलित अगारोस मोटाई और जाल का आकार महत्वपूर्ण प्रतीत होता है। अगारोस परत के किसी भी सूखने से बचा जाना चाहिए। मोटाई परमाणु बल माइक्रोस्कोपी17 का उपयोग करके निर्धारित की जा सकती है। स्पिन कोटिंग के दौरान अगारोस एकाग्रता, मात्रा और रोटेशन गति को बदलकर, हाइड्रोगेल के जाल आकार और मोटाई को अनुकूलित किया जा सकता है। ध्यान दें, हालांकि, हाइड्रोगेल परत की मोटाई छवि कंट्रास्ट को प्रभावित करती है। डीआईबी में झिल्ली प्रोटीन को पकड़ने के लिए, अगारोस हाइड्रोगेल को कस्टम-संश्लेषित, गैर-क्रॉसलिंक्ड, नी-एनटीए-संशोधित, कम पिघलने वाले अगारोस द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है ताकि उन्हें हिस-टैग17 के माध्यम से फंसाया जा सके। अत्यधिक उच्च प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि अक्सर डीआईबी झिल्ली के टूटने के कारण होती है। यह विशेष रूप से बहु-कुएं कक्षों के साथ एक समस्या है, क्योंकि सीए2 + संवेदनशील डाई हाइड्रोगेल में फैलती है। इस मामले में, आसन्न कुओं से बचना चाहिए। झिल्ली के ऊपर सीए2 + संवेदनशील डाई की प्रतिदीप्ति विरंजन एक महत्वपूर्ण सीमित कारक नहीं होना चाहिए, क्योंकि यह टीआईआरएफ एवेनेसेंट क्षेत्र के बाहर बूंद (चित्रा 3 ए) के थोक में उत्तेजित रंगों द्वारा आदान-प्रदान किया जाता है। प्रोटीन के लिए स्थानीयकरण परिशुद्धता धब्बे और पिक्सेल आकार को फिट करने की सटीकता द्वारा दी जाती है।

कमजोर प्रतिदीप्ति संकेत चैनल के माध्यम से कम सीए2 + -फ्लक्स के कारण हो सकते हैं। संभावित कारणों में शामिल हैं: (i) गलत टीआईआरएफ सेटिंग्स (जैसे, लेजर तीव्रता), (ii) झिल्ली के पार आसमाटिक सीए2 + दबाव, या (iii) चैनलों की आंतरिक सीए2 + -पारगम्यता बहुत कम है। पहले मुद्दे से निपटने के लिए, लेजर तीव्रता, टीआईआरएफ कोण और कैमरा लाभ को अनुकूलित करने की आवश्यकता है। बाद के दो मुद्दों को झिल्ली 2,43 में एक विद्युत क्षमता के आवेदन से दूर किया जा सकता है। हालांकि, बाहरी वोल्टेज का अनुप्रयोग परिणाम को विकृत कर सकता है, क्योंकि विद्युत प्रभाव लिगैंड-गेटेड या मेकेनोसेंसिटिव आयन चैनलों के चैनल खोलने को प्रभावित कर सकते हैं जो वास्तव में वोल्टेज-नियंत्रित नहीं हैं। ऐसे चैनलों के उदाहरण माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन ट्रांसलोकेस टीओएम-सीसी27, और इसके चैनल बनाने वाले सबयूनिट टॉम 40 26,44,45,46 हैं। अंत में, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि, वांछित कार्यक्षमता प्राप्त करने के लिए एक विशिष्ट अभिविन्यास में डीआईबी झिल्ली में झिल्ली प्रोटीन डालना मुश्किल है, और मात्रात्मक अध्ययन दुर्लभ47,48 हैं। कुछ मामलों में, एकीकृत प्रोटीन का अभिविन्यास यादृच्छिक है। यह झिल्ली प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए एक गंभीर समस्या है, क्योंकि कुछ झिल्ली प्रोटीन झिल्ली के केवल एक तरफ सक्रिय होते हैं।

टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी प्लानर समर्थित झिल्ली49 में एकल-अणु घटनाओं को संबोधित करने के लिए एक शक्तिशाली विधि है। उदाहरणों में चैनल प्रोटीन जैसे α-हेमोलिसिन50, परफ्रिंगोलिसिन ओ51 और ओएमपीजी52 के संयोजन और फोल्डिंग मार्ग स्पष्टीकरण शामिल हैं। इन अध्ययनों में एक अतिरिक्त तकनीक के रूप में फ्रेट शामिल था। इसके अलावा, मेकेनोसेंसिटिव आयन चैनल एमएससीएल के सक्रियण का अध्ययन पहले वर्तमान माप का उपयोग करके समर्थित डीआईबी बाइलेयर42 की यांत्रिक उत्तेजना द्वारा किया गया है। इस काम के आधार पर, भविष्य के अध्ययन यहां वर्णित मंच को एकल-अणु फ्रेट प्रयोगों के साथ जोड़ सकते हैं ताकि ऑप्टिकल तरीके से एकल-अणु स्तर पर मेकेनोसेंसिटिव चैनलों को संबोधितकिया जा सके। बूंद में बफर का इंजेक्शन, आंतरिक डीआईबी मोनोलेयर को खींचना, या अंतर्निहित हाइड्रोगेल के लिए व्यक्तिगत चैनलों के लक्षित बंधन का उपयोग न केवल यांत्रिक रूप से सक्रिय चैनलों के भौतिक तंत्र का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, जो झिल्ली तनाव और / या वक्रता का जवाब देते हैं जैसा कि एमएससीएल और एमएससीएस, दो-छिद्र डोमेन के + -चैनल, ट्रेक -1, ट्रेक -2, और टीआरएएके, और पीईज़ो (समीक्षा के लिए,53 देखें), लेकिन सेलुलर साइटोस्केलेटन के लिए स्थानीय बंधन भी, जैसा कि स्पर्श-संवेदनशील आयन चैनल एनओएमपीसी54,55 के लिए दिखाया गया है।

Disclosures

हम हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

हम प्रोटीन तैयार करने में मदद के लिए बीट नित्शके और व्यावहारिक चर्चाओं के लिए रॉबिन घोष, माइकल श्विकर्ट (स्टटगार्ट), और मैक्सिमिलन उलब्रिच (फ्रीबर्ग) को धन्यवाद देते हैं। इस काम को स्टटगार्ट रिसर्च सेंटर सिस्टम बायोलॉजी (एसआरसीएसबी) और बाडेन वुर्टेमबर्ग फाउंडेशन (बायोएफएमओ -6 से एसएन) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850356C
100x Oil objective Apochromat N.A. 1.49 Nikon MRD01991 TIRF microscope 
10x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.25  Nikon Microscope to assess DIB membrane formation  
10x objective N.A. 0.25 Nikon MRL00102 TIRF microscope 
40x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.55 Nikon Microscope to assess DIB membrane formation  
488 nm laser, 100 mW   Visitron TIRF microscope 
Adhesive tape
Äkta pure   Cytiva Protein purification system
Bradford assay kit, Pierce Thermo Fisher  23236
CaCl2 Roth 5239.2
Chelax 100 resin Biorad 143-2832
Chloroform  Sigma-Aldrich MC1024452500
Dialysis cassettes Slide-A-Lyzer 20 k MWCO Thermo Fisher  87735
DIB chamber  Custom made PMMA chamber for DIB membranes
Digital power meter and energy console Thorlabs PM100D Laser power meter 
Dimethyl sulfoxide Roth  4720.1
Double distilled H2O
Eclipse TS 100 Hoffmann modulation contrast microscope  Nikon Microscope to assess DIB membrane formation  
EDTA Roth 8042.2
EMCCD camera iXon Ultra 897 Andor TIRF microscope 
Ethanol Sigma-Aldrich 32205-M
Fixed angle rotor Ti70 Beckman Coulter
Fluo-8, CalciFluorTM Santa Cruz Biotechnology SC-362561 Ca2+-sensitive dye
French press cell disruption homogenizer Igneus Igneus 40000 psi
GFP filter AHF Filter seeting used for excitation of DIB-membranes by epifluorescence with white light source 
Glass capillaries World Precision Instruments 4878
Glass coverslips 40 mm x 24 mm x 0.13 mm Roth 1870.2
Glycerol Roth 3783.2
Hamilton syringe 10 mL Roth X033.1
Hamilton syringe 100 mL Roth X049.1
Hamilton syringe 500 mL Roth EY49.1
Heating block  Eppendorf Thermomixer comfort
Heating plate Minitube  HT200
Hepes Roth  9205.3
Hexadcane Sigma-Aldrich 296317
His Trap HP 1 mL Cytiva 29051021 Ni-NTA column
Imidazole Sigma-Aldrich 1.04716.1000
KCl Honeywell 10314243
KLM spin coater  Schaefer Tec SCV-10
List medical L/M-3P-A vertical pipette puller Artisan Technology Group 57761-1
Low melting point agarose Sigma-Aldrich  A9414
M8 Stereomicroscope Wild Stereomicrosope 
Matlab  MathWorks R2022a
Methanol Sigma-Aldrich 34860
MicroFil pipette tips World Precision Instruments MF34G-5
N2 gas
NaCl Roth 3957.1
Nanoliter 2010 injector  World Precision Instruments Nanoliter 2010 
n-dodecyl-b-D-maltoside Glycon Biochemicals D97002-C
Ni-NTA agarose, non-crosslinked Cube Biotech 124115393 Custom made
NIS-Elements AR software Nikon MQS31100/MQS42560/MQS42580/MQS42780/MQS41930 Imaging software
n-octyl-polyoxyethylene Sigma-Aldrich 40530
O2 gas
Phenylmethylsulfonyl fluoride Roth  6367.3
Photodiode sensor  Si, 400 - 1100 nm, 500 mW Thorlabs S130C Sensor for laser power meter 
Plasma cleaner Diener Electronics Zepto
Preparative ultracentrifuge Optima Beckman Coulter
Quad-band TIRF-filter 446/523/600/677 HC AHF Filter setting used for excitation of DIB-membranes with 488 nm laser 
Resource Q 1 mL Cytiva 17117701 Anion exchange column
Silicon oil AR 20 Sigma-Aldrich 10836
Sodium dodecyl sulfate Roth 2326.2
Super LoLux camera JVC Stereomicrosope 
Thermoshaker Gerhardt THL 500/1
Ti-E Fluorescence microscope   Nikon MEA53100
Tris-HCl Sigma-Aldrich 9090.3
Tryptone Roth 8952.2
Ultrasonic bath  Bandelin Sonorex RK 100
Vaccum pump Vacuubrand MD 4C NT
White light source for epifluorescence illumination (100 W) Nikon MBF72655 TIRF microscope 
Yeast extract Roth 2363.2
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148

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जैव रसायन अंक 192
कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके लिपिड बाइलेयर में पार्श्व गतिशीलता और आयन चैनल गतिविधि की एकल-अणु इमेजिंग
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Wang, S., Nussberger, S.… More

Wang, S., Nussberger, S. Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy. J. Vis. Exp. (192), e64970, doi:10.3791/64970 (2023).

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