Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Single-Molecule Imaging van Laterale Mobiliteit en Ion Channel Activity in Lipid Bilayers met behulp van Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopie

Published: February 17, 2023 doi: 10.3791/64970
Automatic Translation
1, 1
1Biophysics Department, Institute of Biomaterials and Biomolecular Systems, University of Stuttgart

Summary

Dit protocol beschrijft hoe TIRF-microscopie kan worden gebruikt om individuele ionkanalen te volgen en hun activiteit in ondersteunde lipidemembranen te bepalen, waardoor het samenspel tussen laterale membraanbeweging en kanaalfunctie wordt gedefinieerd. Het beschrijft hoe de membranen moeten worden voorbereid, de gegevens moeten worden vastgelegd en de resultaten moeten worden geanalyseerd.

Abstract

Hoge resolutie beeldvormingstechnieken hebben aangetoond dat veel ionkanalen niet statisch zijn, maar onderhevig aan zeer dynamische processen, waaronder de voorbijgaande associatie van porievorming en hulpsubeenheden, laterale diffusie en clustering met andere eiwitten. De relatie tussen laterale diffusie en functie is echter slecht begrepen. Om dit probleem te benaderen, beschrijven we hoe laterale mobiliteit en activiteit van individuele kanalen in ondersteunde lipidemembranen kunnen worden gecontroleerd en gecorreleerd met behulp van totale interne reflectiefluorescentie (TIRF) microscopie. Membranen worden vervaardigd op een ultradun hydrogelsubstraat met behulp van de druppelinterface bilayer (DIB) -techniek. In vergelijking met andere soorten modelmembranen hebben deze membranen het voordeel dat ze mechanisch robuust zijn en geschikt voor zeer gevoelige analysetechnieken. Dit protocol meet Ca 2+ ionenflux door enkele kanalen door de fluorescentie-emissie van een Ca2+-gevoelige kleurstof in de nabijheid van het membraan te observeren. In tegenstelling tot klassieke single-molecule trackingbenaderingen, zijn er geen fluorescerende fusie-eiwitten of labels nodig, die de laterale beweging en functie in het membraan kunnen verstoren. Mogelijke veranderingen in ionenflux geassocieerd met conformatieveranderingen van het eiwit zijn alleen te wijten aan de laterale beweging van het eiwit in het membraan. Representatieve resultaten worden getoond met behulp van het mitochondriale eiwittranslocatiekanaal TOM-CC en het bacteriële kanaal OmpF. In tegenstelling tot OmpF is de gating van TOM-CC zeer gevoelig voor moleculaire opsluiting en de aard van laterale diffusie. Daarom zijn ondersteunde droplet-interface bilayers een krachtig hulpmiddel om het verband tussen laterale diffusie en de functie van ionkanalen te karakteriseren.

Introduction

Dit protocol heeft tot doel te beschrijven hoe de correlatie tussen membraanmobiliteit en ionkanaalpermeabiliteit van membraaneiwitten in polymeerondersteunde druppel-interface dubbellaagse (DIB) membranen 1,2,3 kan worden bestudeerd.

De huidige techniek is een aanvulling op een indrukwekkende reeks geavanceerde optische en oppervlakteanalytische hulpmiddelen, zoals single particle tracking4,5, fluorescentiecorrelatiespectroscopie 6,7 en high-speed atomic force microscopie 8,9,10. Deze geven waardevolle inzichten in de dynamische samenstelling en structuur van membranen die membraanreacties beïnvloeden11,12,13. Terwijl de beweging en laterale diffusie van eiwitten afhankelijk is van de lokale dichtheid van eiwitten in het membraan, kunnen individuele eiwitmoleculen ook worden gevangen in lipidenvlotten14 en door eiwit-eiwitinteracties15,16. Afhankelijk van de eiwitdomeinen die uit het membraan in de extracellulaire omgeving of cytosol steken, kan eiwitmobiliteit variëren van zeer mobiel tot volledig onbeweeglijk. Vanwege de complexiteit van het membraan en zijn perifere structuren is het echter vaak moeilijk om het samenspel tussen de aard van laterale mobiliteit en eiwitfunctie te ontcijferen17.

DIB-membranen hebben bewezen een efficiënt platform te zijn voor biofysische single-molecule analyses van membraaneiwitten 18,19,20,21,22. Ze worden gevormd door zelfassemblage van lipiden door het contact van waterige druppels met hydrogel-ondersteunde substraten in een lipide / oliefase. Vergelijkbaar met de veelgebruikte ondersteunde lipide bilayers (SLBs)1,23,24,25, maken DIBs lokale afstemming van de laterale mobiliteit mogelijk door tijdelijke of permanente binding van eiwitten aan de polymeermatrix wanneer gefunctionaliseerd met geschikte liganden17. Dit laatste kan dienen als modelsysteem voor biochemische processen in celmembranen met een heterogene eiwitverdeling10.

De experimentele benadering die hier wordt beschreven, is gebaseerd op de fluorescentie van Ca 2+-gevoelige kleurstoffen om de Ca 2+ ionenflux te meten door individuele kanalen in de nabijheid van het membraan 2,22 met behulp van TIRF-microscopie. Deze optische benadering beperkt de verlichting van het monster tot een afstand dicht bij het membraan, wat, vanwege de fysieke eigenschappen van het evanescente excitatielicht, leidt tot een significante vermindering van de fluorescentieachtergrond. Dit laatste is een voorwaarde als een hoge ruimtelijke en temporele resolutie vereist is voor de detectie van afzonderlijke moleculen. In tegenstelling tot klassieke elektrofysiologische methoden26,27 zijn er geen membraanspanningen nodig om de ionenflux door individuele kanalen te bestuderen. Bovendien vereist de methode geen etikettering met fluorescerende kleurstoffen of moleculen die de laterale beweging van de kanalen in het membraan kunnen verstoren.

De methode is vooral nuttig voor het bestuderen van eiwitkanalen ingebed in het membraan op het niveau van één molecuul zonder gebruik te maken van klassieke elektrofysiologie. Met behulp van mitochondriaal eiwitgeleidend kanaal TOM-CC van Neurospora crassa28,29,30 en OmpF, dat de diffusie van kleine hydrofiele moleculen over het buitenmembraan van Escherichia coli17,31 ondersteunt, illustreren we hoe de membraanmobiliteit en kanaalactiviteiten van de twee eiwitten kunnen worden bestudeerd en gecorreleerd. We stellen voor dat deze aanpak, hoewel geoptimaliseerd voor TOM-CC en OmpF, gemakkelijk kan worden toegepast op andere eiwitkanalen.

Protocol

1. Eiwitproductie

OPMERKING: In deze sectie wordt de procedure beschreven voor het isoleren van OmpF uit Escherichia coli BE BL21(DE3) omp631,32, dat LamB en OmpC mist, en TOM-kerncomplex uit Neurospora crassa (figuur 1)28,29. Dit laatste vereist mitochondriën geïsoleerd uit een N. crassa-stam 28 met een 6xHis-gelabelde vorm van de TOM-subeenheid Tom22 (figuur 1A), die kan worden geïsoleerd zoals beschreven28. De volgende protocollen leveren meestal 1-2 mg N. crassa TOM-CC en 10 mg E. coli OmpF op. Als de hoeveelheid moet worden aangepast, is het belangrijk dat de eiwit/wasmiddelverhoudingen nauwkeurig worden gehandhaafd. Tenzij anders aangegeven, moeten alle stappen worden uitgevoerd bij 4 °C.

  1. Isolatie van TOM-kerncomplex
    1. Solubilize gezuiverde N. crassa mitochondriën (2 g eiwit) verkregen door differentiële sedimentatie van ongeveer 1,5 kg (nat gewicht) schimmeldraden, volgens Bausewein et al.30, bij een eiwitconcentratie van 10 mg / ml in 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 1% (w / v) DDM, 20% (v / v) glycerol, 300 mM NaCl, 20 mM imidazool en 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) gedurende 30 minuten bij 4 °C.
      LET OP: PMSF is giftig. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.
    2. Breng de opgeloste mitochondriën over in ultracentrifugebuizen en scheid de niet-opgeloste membranen van opgeloste membraaneiwitten door ultracentrifugatie bij 130.000 x g gedurende 40 minuten bij 4 °C en filtratie met filterpapier van standaardkwaliteit.
    3. Balanceer een voorverpakte Ni-NTA-kolom (volume van 5 ml) met ongeveer 5 kolomvolumes (CV) van buffer A1 (tabel 1) met behulp van een geautomatiseerd eiwitzuiveringssysteem. Voer de Ni-NTA-kolom uit met een constant debiet van 1 ml/min tijdens alle stappen. Gebruik een kolom met een lager volume (1 ml) als de eiwitten zijn geïsoleerd uit minder dan 2 g mitochondriën.
    4. Laad het opgeloste eiwitmonster op de Ni-NTA-kolom met een stroomsnelheid van 1 ml / min.
    5. Was de Ni-NTA-kolom met 5 CV buffer A1 (tabel 1) om ongebonden eiwitten te verwijderen.
    6. Elute His-tagged TOM-CC met 30% buffer A2 (tabel 1; 300 mM imidazool) en verzamel de eiwitpiek zoals deze voorkomt in het 280 nm chromatogram (figuur 1B).
    7. Voor verdere zuivering van TOM-CC moet de voorverpakte anionenuitwisselingskolom (1 ml) in evenwicht worden gebracht met elk 5 CV van buffer B1, B2 en B1 (tabel 1) met behulp van het geautomatiseerde eiwitzuiveringssysteem. Voer de anionenwisselkolom uit met een constant debiet van 1 ml/min tijdens alle stappen.
    8. Laad de TOM-CC-piekfractie (stap 1.1.6) op de anionenuitwisselingskolom (debiet van 1 ml/min).
    9. Verwijder de ongebonden eiwitten door de kolom te wassen met 5 CV buffer B1 (tabel 1) en een lineaire zoutgradiënt van 0%-20% buffer B2 (tabel 1).
    10. Elueer TOM-CC met een lineaire zoutgradiënt van 20%-35% buffer B2 en verzamel de eiwitpiekfractie zoals deze voorkomt in het 280 nm chromatogram (figuur 1C).
    11. Beoordeel de zuiverheid van het monster met SDS-PAGE (figuur 1D) en bepaal de eiwitconcentratie met behulp van een in de handel verkrijgbare eiwittest, volgens het protocol van de fabrikant (zie materiaaltabel).
    12. Vries de eiwitmonsters in vloeibare stikstof in en bewaar ze bij -80 °C tot verder gebruik.
      LET OP: Vloeibare stikstof moet worden behandeld in goed geventileerde ruimtes. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.
       
  2. Isolatie van OmpF
    1. Herstel de E. coli-stam BE BL21(DE3) omp6, zonder LamB en OmpC32, uit een bevroren glycerolvoorraad onder steriele omstandigheden en strijk op een Luria-Bertani (LB) agarplaat (tabel 2). Om dit te doen, verdeelt u het monster geleidelijk gelijkmatig over de hele plaat.
    2. Laat het monster 5 minuten in de agar weken, voordat u de plaat met gesloten deksel omkeert en een nacht bij 37 °C incubeert.
    3. Selecteer een enkele E. coli-kolonie , ent 7,5 ml LB-medium (tabel 2) met deze enkele kolonie met behulp van een steriele tandenstoker en laat een nacht (14 uur) groeien met roeren (170 tpm) bij 37 °C.
    4. Breng 2 x 1 ml E. coli-cellen met steriele pipetten over in 2 x 500 ml LB-medium (tabel 2) en laat een nacht (~ 14 uur) groeien bij 37 ° C met roeren (~ 170 rpm) in een shaker.
    5. Oogst de cellen door centrifugeren bij 5.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C, vries de pellet in vloeibare stikstof in en bewaar bij -80 °C tot verder gebruik.
      OPMERKING: Het natte gewicht van de celpellet is meestal 5 g per 1 L cultuur. Op dit punt kan het protocol worden gepauzeerd.
    6. Ontdooi en resuspensie van de cellen (2 g) in 20 ml lysisbuffer C1 (tabel 2) en passeer de suspensie driemaal bij 1.000 psi door een voorgekoeld (4 °C) hogedrukcelverstoringssysteem, met een maximaal monstervolume van 35 ml, volgens de instructies van de fabrikant.
      LET OP: Het gebruik van een Franse pers kan leiden tot ernstige verwondingen. Overschrijd nooit de druklimiet van de gebruikte cel. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.
    7. Verwijder ongebroken cellen uit het lysaat door centrifugatie bij 4.000 x g gedurende 15 minuten en verzamel het supernatant.
    8. Verzamel de membranen door ultracentrifugatie bij 100.000 x g gedurende 1 uur.
    9. Resuspendeer de membraanpellet in 10 ml buffer C2 (tabel 2) en meng met een gelijk volume SDS-buffer C3 (tabel 2) met behulp van een kogelgelagerde glashomogenisator.
      LET OP: β-mercaptoethanol in buffer C3 is giftig. Volg alle relevante veiligheidsvoorschriften.
    10. Incubeer de suspensie in een waterbad bij 50 °C gedurende 30 minuten.
    11. Centrifugeer het monster gedurende 1 uur bij 100.000 x g bij 20 °C.
    12. Resuspensie van de membraankorrel in 10 ml SDS-buffer C4 (tabel 2) met behulp van een kogelgelagerde glashomogenisator en incubeer de suspensie in een waterbad bij 37 °C gedurende 30 minuten.
      OPMERKING: Als de pellet niet kan worden geresususeerd, voegt u meer SDS-buffer C4 toe tot een volume van 20 ml.
    13. Centrifugeer het monster gedurende 30 minuten bij 100.000 x g bij 20 °C en verzamel het supernatant.
    14. Meng het supernatant met octylpolyoxyethyleen (octyl-POE) tot een uiteindelijke wasmiddelconcentratie van 0,5% (g/v) en dialyseer het monster tweemaal tegen buffer C5 (tabel 2) bij 4 °C gedurende 24 uur. Gebruik voor dit doel dialysebuizen met een afsnijding van 20 kDa, volgens de instructies van de fabrikant, en plaats het monster in de dialysebuis of het apparaat.
      OPMERKING: De afsnijding van de dialysebuizen moet worden aangepast als eiwitten met andere moleculaire massa's worden gedialyseerd.
    15. Beoordeel de zuiverheid van het monster met SDS-PAGE en bepaal de eiwitconcentratie met behulp van een in de handel verkrijgbare eiwittest, volgens het protocol van de fabrikant (materiaaltabel).
      OPMERKING: Monsters verwarmd tot 95 °C tonen monomeer OmpF. Monsters die niet zijn verwarmd, tonen OmpF in zijn trimerische vorm (figuur 1F).
    16. Shock-freeze gedialyseerd OmpF in aliquots in vloeibare stikstof, en bewaren bij -20 °C tot verder gebruik.
      LET OP: Vloeibare stikstof moet worden behandeld in goed geventileerde ruimtes. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.

2. Optische eenkanaalsopname van ionkanalen in DIB-membranen

OPMERKING: In dit gedeelte wordt de procedure beschreven voor het voorbereiden van DIB-membranen in microgefabriceerde polymethylmethacrylaat (PMMA) kamers2 om laterale eiwitbeweging en ionenflux door enkele ionkanalente controleren 17. De afmetingen en exacte tekeningen voor de productie van de kamer zijn te vinden in Lepthin et al.2. Figuur 2 geeft een overzicht van de assemblage van de PMMA-kamer2 en de vorming van de DIB-membranen. Tenzij anders aangegeven, worden alle stappen uitgevoerd bij kamertemperatuur (RT). Figuur 3 toont een schematische weergave van een DIB-membraan en hoe Ca2+ flux door een enkelkanaalseiwit wordt gebruikt om zowel beweging in het membraan als de open-gesloten toestand van het kanaal te volgen.

  1. Bereiding van lipiden
    1. Verwijder de in chloroform opgeloste lipide-stockoplossing met 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (25 mg/ml DPhPC) opgelost in chloroform uit de vriezer bij -20 °C en warm tot RT. Voor dit doel is het over het algemeen voldoende om het monster langzaam met de hand gedurende enkele minuten op te warmen.
      LET OP: Chloroform is giftig. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen en voer alle procedures met chloroform uit onder een zuurkast.
    2. Breng 380 μL DPhPC-stockoplossing (25 mg/ml DPhPC) over in een glazen injectieflacon. Vermijd pipetten met rubberen afdichtingen. Gebruik in plaats daarvan microliter glazen spuiten met roestvrijstalen plunjers.
    3. Nadat u de lipidestockoplossing hebt gehanteerd, bedekt u de lipidestockoplossing met Ar- of N2-gas om lipideoxidatie te voorkomen. Gebruik een zo laag mogelijke gasstroom om verdamping van het organische oplosmiddel waarin de lipiden zijn opgelost of spatten van de oplosmiddelsprays uit de injectieflacon te voorkomen. Zorg ervoor dat de deksels van de glazen injectieflacons met lipiden met organisch oplosmiddel aan de binnenkant zijn bedekt met polytetrafluorethyleen (PTFE).
    4. Droog het lipidenmonster (stap 2.1.2) onder een stroom van N 2 en verwijder het resterende organische oplosmiddel 's nachts onder vacuüm (2,0 mbar) uit het lipidenmonster met behulp van een olievrije vacuümpomp.
    5. Los de lipidefilm op in hexadecaan/siliconenolie-oplossing door gelijke volumes hexadecaan en siliconenolie (elk 500 μL) toe te voegen met behulp van een glazen spuit van microliter tot een uiteindelijke lipideconcentratie van 9,5 mg/ml.
      OPMERKING: De lipidenoplossing is stabiel bij RT gedurende enkele weken.
  2. Bereiding van agarose hydrogel
    1. Bereid ongeveer 1 ml laagsmeltende agarose-oplossing (0,75% [m/v]) in dubbel gedeïoniseerd water en verwarm gedurende 20 minuten tot 85 °C in een verwarmingsblok voor gebruik voor het spinnen van glazen dekplaten.
      OPMERKING: De agarose-oplossing kan enkele weken bij RT worden bewaard en kan meerdere keren worden opgewarmd.
    2. Bereid laagsmeltende agarose-oplossing van 2,5% (m/v) in 0,66 M CaCl 2 en 8,8 mM HEPES (pH7,2 ) en verwarm gedurende 20 minuten tot 85 °C in een verwarmingsblok. Zorg ervoor dat de agarose goed gesmolten is.
      OPMERKING: De agarose-oplossing kan enkele weken bij RT worden bewaard en kan meerdere keren opnieuw worden opgewarmd, net als de agarose (stap 2.2.1) die wordt gebruikt voor spincoating.
  3. Polymethylmethacrylaat (PMMA) kamerassemblage en lipide monolaagvorming op het hydrogel hexadecaan / siliconen olie raakvlak
    1. Plaats enkele glazen afdekplaten (40 mm x 24 mm x 0,13 mm) in een roestvrijstalen afdekplaathouder en reinig ze gedurende 10 minuten in een glazen bekerglas met aceton in een ultrasone reiniger. Gebruik net genoeg aceton om de afdekstroken onder te dompelen en bedek het bekerglas losjes met een glasplaat om een drukloos, gesloten systeem te creëren dat het ontsnappen van dampen tijdens het reinigingsproces minimaliseert.
      LET OP: Aceton is een licht ontvlambaar oplosmiddel met een laag vlampunt. Damp/luchtmengsels zijn explosief. Bedien de ultrasone reiniger in een goed geventileerde ruimte. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen en neem de officiële veiligheidsmaatregelen in acht (bijv. geen open vuur en geen vonken).
    2. Spoel de glazen afdekplaten af met dubbel gedeïoniseerd water en droog ze onder een stroom van N2.
      OPMERKING: Coverslips die op deze manier worden gereinigd, kunnen enkele weken worden bewaard.
    3. Reinig en hydrofiliseer een coverslip verder in een plasmareiniger met zuurstof (0,5 mbar) gedurende 5 min.
      OPMERKING: Voer deze stap uit onmiddellijk vóór het spinnen van de coating met agarose-oplossing, omdat het hydrofiele effect van plasmareiniging na verloop van tijd afneemt.
    4. Monteer een met plasma behandelde coverslip op een spincoater (figuur 2, stap 1).
    5. Bedek de deklaag met een submicrometer dikke film van agarose door langzaam 140 μL verwarmde 0,75% (w/v) laagsmeltende agarose (stap 2.2.1) toe te voegen bij 3.000 tpm gedurende 30 s, met behulp van een pipet van 200 μL (figuur 2, stap 1).
      OPMERKING: De dikte van de agarosefilm kan worden bepaald door atoomkrachtmicroscopie (AFM), zoals beschreven17.
    6. Bevestig de met spincoating bedekte coverslip met de dunne laag van de agarose hydrogel onmiddellijk aan de onderkant van de PMMA-kamer2. Zorg ervoor dat de agarose hydrogel naar boven wijst (figuur 2, stap 2).
    7. Bevestig de randen van de coverslip met transparant plakband aan het PMMA micro-machinaal apparaat.
    8. Plaats het PMMA-apparaat op een kookplaat die is verwarmd tot 35 °C (figuur 2, stap 3).
    9. Giet voorzichtig 200 μL 2,5% agarose-oplossing (stap 2.2.2) met een pipet in de inlaat van de kamer (figuur 2, stap 3), zonder luchtbellen te creëren, zodat de dunne hydrogel die door spincoating wordt aangebracht, in evenwicht kan komen met de buffer van de 2,5% agarose-oplossing en gehydrateerd blijft. Zorg ervoor dat de 2,5% agarose-oplossing rond de met spincoating bedekte agarosehydrogel wordt verspreid, maar er niet overheen (figuur 3A), wat kan worden vermeden door de PMMA-kamer voorzichtig op de verwarmingsplaat te drukken.
    10. Bedek de putjes van de PMMA-kamer (figuur 2, stap 4) onmiddellijk met in totaal 60 μl lipide/olieoplossing (stap 2.1.5), om de vorming van lipidemonolagen op het agarose-olie-grensvlak te initiëren en uitdroging van de met spin bedekte agarose in de putjes van de PMMA-kamer te voorkomen. Houd het apparaat ongeveer 2 uur op een hete plaat bij 35 °C.
      OPMERKING: De cirkelvormige putten in de PMMA-kamer hebben een diameter van 0,5 mm en een diepte van 1,8 mm, volgens eerder gepubliceerd werk2.
  4. Bereiding van met lipiden gecoate waterige druppeltjes in hexadecaan/siliconenolie-oplossing
    1. Breng 20 μl lipidehexadecaan/siliconenolieoplossing (stap 2.1.5) aan op elk van de verschillende microgefabriceerde putjes in een druppelincubatiekamer (figuur 2, stap 4). Geschikte containers voor de lipide hexadecaan / siliconenolie-oplossing zijn kleine uitsparingen van 40 mm x 30 mm x 3,5 mm in een dunne PMMA-plaat2.
    2. Bereid een microcapillaire glazen naald met een tipopeningsdiameter van 20 μm met behulp van een verticale of horizontale micropipettrekker (bijvoorbeeld gebruikt voor het maken van patchpipetten of scherpe glaselektroden). Schat de openingsdiameter van de microcapillaire glazen naald onder een binoculaire stereomicroscoop bij lage vergroting, in een zoombereik tussen 7,5x en 35x.
      OPMERKING: De instellingen voor de voorverwarmingsmodus voordat aan het glazen capillair wordt getrokken, de verwarmingsmodus voor het trekken en de trekkracht moeten van tevoren experimenteel worden bepaald, volgens de specificaties van de fabrikant van het trekapparaat en het type capillair.
    3. Vul de microcapillaire glazen naald met 5 μL waterige injectieoplossing met 8,8 mM HEPES (pH 7,2), 7 μM Fluo-8, 400 μM EDTA, 1,32 M KCl en 30 nM TOM-kerncomplex, of als alternatief 20 nM OmpF met behulp van een microcapillaire pipetpunt. Gebruik alleen dubbel gedestilleerd water dat eerder is behandeld met een chelaathars die multivalente metaalionen (Ca2+) bindt om de waterige injectieoplossing te bereiden.
    4. Monteer de microcapillaire glazen naald met de waterige injectie-oplossing op een piëzo-aangedreven nanoinjector.
    5. Injecteer 100-200 nL waterige druppels (figuur 2, stap 4) met 8,8 mM HEPES (pH 7,2), 7 μM Fluo-8, 400 μM EDTA, 1,32 M KCl en 30 nM TOM-kerncomplex (stap 1.1.12), of als alternatief 20 nM OmpF (stap 1.2.16) in de putjes in de druppelincubatiekamer gevuld met lipide hexadecaan/siliconenolie-oplossing (zie 2.1.5) met behulp van de nanoinjector. Zorg ervoor dat de druppels elkaar niet raken door ze enkele millimeters (>10 mm) uit elkaar in de putjes te plaatsen. Anders, als lipide monolagen zich nog niet hebben gevormd op het olie/ buffer grensvlak, zullen ze samensmelten tot grotere druppels.
      OPMERKING: Als er geen klassecapillairen en nano-injectoren beschikbaar zijn, kunnen de druppels ook handmatig worden bereid met eenkanaals microliterpipetten voor volumes tussen 0,1 μl en 0,5 μl, zoals beschreven2. In dit geval zijn de druppelvolumes echter niet zo nauwkeurig.
    6. Laat de vorming van een lipide monolaag op het druppel/olie-grensvlak gedurende ongeveer 2 uur toe door de PMMA- en druppelincubatiekamers (figuur 2, stap 4) op een tot 35 °C verwarmde hete plaat te houden.
  5. Voorbereiding en beeldvorming van enkele ionkanalen in DIB-membranen
    1. Breng handmatig individuele waterige druppels uit de putjes van de druppelincubatiekamer onder een stereomicroscoop over in de putjes van de PMMA-kamer (figuur 2, stap 5), met behulp van een eenkanaals microliterpipet met een polypropyleenpunt van 10 μL voor eenmalig gebruik. Laat de druppels gedurende ongeveer 5 minuten op de lipide monolagen gevormd op de hydrogel-olie interfaces zinken om een lipide bilaag (figuur 3) te vormen tussen de druppels en de agarose hydrogel.
    2. Monteer de PMMA-kamer met DIB-membranen op de monsterhouder van een microscoop met omgekeerd licht en beoordeel de membraanvorming met behulp van een 10x Hoffman modulatiecontrastobjectief (figuur 2, stap 6). DIB-membraanvorming wordt aangegeven door een heldere witte ring op het grensvlak tussen de druppel en de hydrogel (figuur 4A). DIB-membranen die zijn gebroken, tonen deze ring niet (figuur 4B).
      OPMERKING: Als alternatief kunnen de DIB-membranen worden gevisualiseerd bij 10x vergroting door fasecontrast of differentieel interferentiecontrast (DIC) microscopie.
    3. Als DIB-membranen zijn gevormd, monteer dan de PMMA-kamer op de monsterhouder van een TIRF-microscoop (figuur 2, stap 7) uitgerust met een conventionele lichtbron voor epifluorescentieverlichting, een 488 nm-laser (Pmax = 100 mW) en een verlichte elektronenvermenigvuldigende CCD-camera (512 x 512 pixels; >95% QE) om een pixelgrootte van ~ 0,16 μm te bereiken.
    4. Focus de rand van een DIB-membraan met een 10x vergrotingsobjectief onder epifluorescentieverlichting met een lichtbron met hoge intensiteit met behulp van een GFP-filterset.
    5. Fijnfocus op dezelfde rand van het DIB-membraan bij hoge vergroting met een 100x/N.A. 1.49 apochromaatolie TIRF-objectief, opnieuw onder epifluorescentieverlichting, met de lichtbron met hoge intensiteit met behulp van een GFP-filterset waarmee zwakke achtergrondfluorescentie van de fluorescerende kleurstof Fluo-8 in de druppel kan worden gevisualiseerd (figuur 4C).
    6. Wijzig de filterinstelling van GFP in de quad-band TIRF-filterset.
    7. Schakel de 488 nm laser in en stel de intensiteit van de laser op de objectieflens in op een waarde tussen 8 mW en 10 mW.
      OPMERKING: Aangezien er vaak geen kwantitatieve informatie is over de laserintensiteit bij de objectieflens, moeten de laserintensiteitsinstellingen vooraf worden gekalibreerd in afzonderlijke metingen aan de lens, met een optische laservermogensmeter uitgerust met een fotodiodesensor, volgens de specificaties van de fabrikant.
      LET OP: Om een veilige werking van de laser te garanderen, moet de operator zich bewust zijn van de mogelijke gevaren van laserstraling en de voorschriften voor ongevallenpreventie.
    8. Om afzonderlijke ionkanalen te visualiseren, past u de TIRF-hoek en EMCCD-cameraversterking aan (bijv. EM-versterkingsmultiplicatorinstelling: 285) zodat open ionkanalen in het DIB-membraan verschijnen als fluorescerende vlekken met hoog contrast op een donkere achtergrond (figuur 4D-G) en de signaal-achtergrondverhouding, wanneer visueel geïnspecteerd, een maximum bereikt. Zorg ervoor dat de vlekken, overeenkomend met Ca2+-flux door enkele ionkanalen, scherp blijven en een ronde vorm hebben, met een hoge intensiteit in het midden en geleidelijk afnemend naar de periferie. Membranen zonder kanalen vertonen alleen achtergrondfluorescentie (figuur 4C).
    9. Voordat u de beweging en open-gesloten activiteit van afzonderlijke kanalen in de loop van de tijd registreert, controleert u of fluorescerende vlekken scherp zijn, om ervoor te zorgen dat de ionkanalen zich in de DIB-membranen hebben gereconstitueerd en lateraal in het membraanvlak bewegen. Als dit niet het geval is, kan dit erop wijzen dat een fluorescerend molecuul in en uit het evanescente veld duikt dat door de laser in de buurt van het membraan wordt gegenereerd.
    10. Neem een reeks membraanbeelden op die een goede tracking van de positie en monitoring van de open-gesloten toestand van de afzonderlijke ionkanalen mogelijk maken. Om het type laterale mobiliteit (bijv. vrije beweging versus voorbijgaande verankering [ter referentie, zie16]) en de toestand van kanaalactiviteit (bijv. open of gesloten) te bepalen, verwerven voldoende lange (bijv. 30 s tot 1 min) en goed bemonsterde trajecten (bijv. framesnelheid van 48 s-1).
      OPMERKING: De waarneming van gekanaliseerde, beperkte of hopdiffusie16 vereist dat de bemonsteringssnelheid voldoende snel is om onbeperkte diffusie binnen beperkende grenzen te meten. Zorg er bovendien voor dat de bemonsteringstijd van de gegevens lang genoeg is om de overgang van ongelimiteerde naar beperkte diffusie te meten (zie Jacobson et al.16 voor details).
  6. Beeld- en gegevensverwerking
    OPMERKING: Open-source beeldverwerkingspakketten33 of zelfgeschreven routines17 op basis van commerciële softwarepakketten kunnen worden gebruikt om de spatiotemporele dynamiek van individuele ionkanalen in DIBs te analyseren. Om laterale membraanmobiliteit te kunnen correleren met de ionenflux door de afzonderlijke kanalen, mogen geen filteralgoritmen worden toegepast.
    1. Corrigeer beeldtijdreeksen voor bleken door standaardprocedures34 toe te passen met behulp van zelfgeschreven routines, door de gemiddelde frame-intensiteit van het volledige beeld aan te passen aan Equation 2, waarbij t de frame-index Equation 1 (tijd) is en akde aanpassingsparameters. Corrigeer vervolgens de tijdreeks volgens Equation 3, waarbij I(t) de intensiteit is. Als alternatief kunt u voor initiële gegevensanalyses achtergrondcorrecties uitvoeren met behulp van open source-software met geïmplementeerde rollende balalgoritmen33 en een rollende balradius, afhankelijk van de spot en pixelgrootte van de camera (bijvoorbeeld 50 pixels).
    2. Bepaal de ruimtelijke posities en amplitudes van een fluorescentiespot binnen een gedefinieerd gebied van belang (ROI) (bijvoorbeeld 30 x 30 pixels), door I(t) op een bepaald moment t aan te passen aan een tweedimensionale Gaussische functie met vlakke kanteling die rekening houdt met mogelijke lokale verlichtingsgradiënten volgens .Equation 4 Hier is x = (x, y) de ROI met de fluorescentie-intensiteitsinformatie, A en σ zijn de amplitude en breedtes van de Gauss, pk zijn parameters die de achtergrondintensiteit van de ROI karakteriseren en μ = (x 0, y 0) definieert de positie van de Gauss. De ionenflux door een individueel kanaal wordt gegeven door de parameter A. De baan van het kanaal wordt gegeven door x en maakt het mogelijk om de laterale mobiliteit van het kanaal te bepalen. Als alternatief is het mogelijk om de posities en intensiteiten van individuele spots te bepalen met behulp van open-source platforms33 en plug-ins zoals beschreven35,36. Schat de positionele nauwkeurigheid37 na conversie van de EMCCD-camera-uitlezing in fotonennummers38.
    3. Plot de fluorescentieamplitude A versus tijd en het bijbehorende traject x om een mogelijke correlatie tussen de kanaaldiffusiviteit en de ionenflux door het kanaal te bepalen. Voer dit uit met elke grafische software. Bepaal in geval van vrije laterale kanaalbeweging de laterale diffusiecoëfficiënt D door lineaire regressie van de tijdvertraging τ en bereken de gemiddelde kwadratische verplaatsing van de vlekken van x volgens Equation 5.
      OPMERKING: Typische diffusiecoëfficiënten17 voor TOM-CC en OmpF die vrij bewegen in DIB-membranen variëren tussen 0,5 en 1,5 μm2 s-1. Moleculen waarvan de diffusieconstante kleiner is dan 0,01 mm2·s-1 worden gedefinieerd als geïmmobiliseerd17.

Representative Results

Real-time elektrodevrije optische eenkanaalsopname onthult het samenspel tussen laterale eiwitbeweging en de functie van individuele ionkanalen in DIB-membranen. Reconstitutie van het mitochondriale TOM-kerncomplex (figuur 1A) in een DIB-membraan (figuur 4D) illustreert een sterke temporele correlatie tussen laterale mobiliteit en ionenpermeabiliteit (figuur 5A). De TOM-CC gating lijkt gevoelig te zijn voor de modus van zijdelingse beweging17. Bewegende kanalen vertonen Ca2+ flux door hun poriën en hoge fluorescentiepuntintensiteiten. Ingesloten, niet-bewegende moleculen vertonen lage en gemiddelde fluorescentie-intensiteiten. Voor de algemene eiwitimportporie van mitochondriën TOM-CC onthulde deze benadering met één molecuul een sterke temporele correlatie tussen laterale mobiliteit en ionenpermeabiliteit, wat suggereert dat het TOM-CC-kanaal mechanosensitieve eigenschappen heeft17. Een laterale stop van vrij bewegende TOM-CC-moleculen gaat gepaard met een gedeeltelijke of volledige sluiting van het TOM-CC-kanaal. Het afbeelden van DIB-membranen met OmpF (figuur 1E en figuur 4F), dat bijna volledig in het membraan is ingebed, toont geen stop-and-go-effecten (figuur 5B). Willekeurige stops van OmpF zijn niet geassocieerd met een verandering in intensiteit en dus met het sluiten van de poriën. Op basis van de fluorescentiesignalen38 kan de positionele nauwkeurigheid van de afzonderlijke kanalen worden geschat in het bereik tussen 5 en 10 nm. Er moet echter worden opgemerkt dat deze nauwkeurigheid niet kan worden bereikt als de kanalen enigszins wiebelen als gevolg van mobiele verankering met de agarose-hydrogel, zoals bijvoorbeeld wordt getoond voor de TOM-CC-moleculen in een tussentoestand met een wortelgemiddelde verplaatsing van 120 nm (figuur 5A).

Figure 1
Figuur 1: Isolatie van TOM-CC. (A) Cryo EM-structuur van N. crassa TOM-CC30,39. Mitochondriën van een N. crassa-stam met een Tom22 met een 6xHis-tag werden opgelost in DDM en onderworpen aan Ni-NTA-affiniteitschromatografie (B) en anionenwisselingschromatografie (C). (D) SDS-PAGE van geïsoleerde TOM-CC. (E) Kristalstructuur (VOB, 1OPF) en (F) SDS-PAGE van gezuiverde E. coli OmpF. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Stroomschema van pmma-kamerassemblage. Stap 1: Een glazen coverslip wordt gecoat met een agarose hydrogel. Stap 2: De spin-coated coverslip wordt gemonteerd in een op maat gemaakte PMMA microscopiekamer. Stap 3: Extra laagsmeltende agarose wordt toegevoegd aan de inlaatpoort van de PMMA-kamer op een hete plaat van 35 °C. Stap 4: Lipide monolagen worden gevormd rond waterige druppels op een buffer/olie interface (links) en op de agarose hydrogel/olie interface (rechts). Stap 5: Individuele waterige druppels worden in de putjes van de PMMA-kamer gepipetteerd om een lipide dubbellaag te vormen bij contact van de twee lipide monolagen. Stap 6: De vorming van de DIB-membranen wordt gevalideerd door Hofmann modulatiecontrastmicroscopie. Stap 7: Beelden van geselecteerde gebieden van de DIB-membranen met ingebrachte ionkanalen worden verkregen door TIRF-microscopie. Groen: 0,75% agarose; geel: 2,5% agarose met Ca2+ ionen; magenta: lipide/olie fase; donkerblauw: waterige druppelbuffer met Ca2+-gevoelige kleurstof en eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Experimentele opstelling. (A) Schematische weergave van een DIB-membraan in een PMMA-put. De dubbellaag rust op een ultradunne 0,75% agarosefilm om TIRF-beeldvorming van Ca 2+-flux door een ionkanaal in de loop van de tijd mogelijk te maken met behulp van een Ca2+-gevoelige fluorescentiekleurstof (Fluo-8) in trans. (B) De Ca2+-flux wordt uitsluitend geregeld door de osmotische druk van cis naar trans. Dit maakt zowel de bepaling van de positie in het membraan als de open-gesloten toestand van het kanaal mogelijk. Het hier getoonde kanaal is het eiwitgeleidende kanaal TOM-CC van N. crassa mitochondriën30. (C) Traject van een enkel TOM-CC kanaal. Groen: bewegend kanaal; geel: niet-bewegend kanaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Imaging TOM-CC en OmpF in DIB membranen . (A) DIB membraan in beeld gebracht door Hoffmann modulatie contrast microscopie van het dubbellaagse contactoppervlak tussen de hydrogel en de druppel. (B) Gebroken DIB-membraan afgebeeld als in (A). Pijl, rand van PMMA-kamer. (C) DIB-membraan in beeld gebracht door TIRF-microscopie zonder eiwitkanalen. (D) DIB-membraan met gereconstitueerde TOM-CC, in beeld gebracht met TIRF-microscopie. De witte vierkanten markeren vlekken van hoge (SH), intermediaire (SI) en lage (SL) intensiteit. (E) Het aanpassen van het fluorescentie-intensiteitsprofiel van de drie onder (A) gemarkeerde vlekken aan tweedimensionale Gaussische functies onthult de positie van individuele TOM-CC's en de Ca2+ flux door het kanaal. F) DIB-membraan met gereconstitueerde OmpF. (G) Gaussische pasvorm van de fluorescerende vlek gemarkeerd in (F). In tegenstelling tot het twee-porie β-barrel eiwitcomplex TOM-CC, onthult de drie-porie β-barrel OmpF slechts één permeabiliteitstoestand. Pixelgrootte, 0,16 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Kanaalactiviteit correleert met laterale mobiliteit van TOM-CC. (A) Het fluorescerende amplitudespoor (boven) en het overeenkomstige traject (onder) van TOM-CC geven aan dat de open-gesloten kanaalactiviteit van TOM-CC correleert met de laterale membraanmobiliteit van het complex. Het traject vertoont drie permeabiliteitstoestanden. Groen: volledig open staat; geel: tussenliggende permeabiliteitstoestand; rood: gesloten kanaalstatus; rode ster: TOM-CC in de tussenliggende toestand wiebelt rond zijn gemiddelde positie met ongeveer ±60 nm. De positionele nauwkeurigheid37 op basis van de fluorescentiesignalen in de volledig open en tussenliggende toestanden varieert tussen 5 nm en 10 nm. (B) Fluorescerend amplitudespoor (boven) en corresponderend traject (onder) van OmpF. OmpF onthult slechts één intensiteitsniveau, ongeacht of het in beweging is of vastzit. De trajectsegmenten die overeenkomen met de tijdsperioden van gevangen moleculen zijn grijs gemarkeerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Buffer  Reagensconcentraties Volume
A1* 20 mM Tris-HCl pH 8,5, 0,1 % (m/v) n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM), 10% (v/v) glycerol, 300 mM NaCl en 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) 100 ml
A2* 20 mM Tris-HCl pH 8,5, 0,1% (w/v) DDM, 10% (v/v) glycerol, 1 M Imidazool en 1 mM PMSF 100 ml
B1* 20 mM HEPES pH 7,2, 0,1% (w/v) DDM, 2% (v/v) dimethylsulfoxide (DMSO) 100 ml
B2* 20 mM HEPES pH 7,2, 0,1% (m/v) DDM, 1 M KCl, 2% (v/v) dimethylsulfoxide (DMSO) 100 ml
* Ontgassen en voor gebruik door een filter van 0,22 μm gaan.

Tabel 1: Bufferoplossingen voor TOM-CC isolatie.

Buffer  Reagensconcentraties Volume
POND* 1% (w/v) trypton, 1% (w/v) NaCl en 0,5% (w/v) gistextract 1100 ml
C1 2 mM MgCl2, en ~ 750 eenheden DNAse en 50 mM Tris-HCl pH 7,5 20 ml
C2 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 50 ml
C3 4% (m/v) natriumdodecylsulfaat (SDS), 2 mM β-mercaptoethanol en 50 mM Tris-HCl pH 7,5 50 ml
C4 2% (w/v) SDS, 500 mM NaCl en 50 mM Tris-HCl pH 7,5 50 ml
C5 0,5% (m/v) octylpolyoxyethyleen (octyl-POE), 1 mM EDTA en 20 mM Tris pH 8,5 1000 ml
* Steriliseren voor gebruik.

Tabel 2: Bufferoplossingen voor OmpF-isolatie.

Discussion

Het hier gepresenteerde protocol biedt een inleiding tot het gebruik van DIB-membranen om het samenspel tussen laterale ionkanaalbeweging en kanaalfunctie te bestuderen met behulp van TIRF-microscopie met één molecuul. Om de best mogelijke gegevens te verkrijgen, is de bereiding van stabiele DIB-membranen met zoveel mogelijk goed gescheiden kanalen cruciaal voor het verkrijgen van tijdreeksen van individuele deeltjes, die naar tevredenheid kunnen worden geanalyseerd.

Kritische parameters die moeten worden geoptimaliseerd, zijn onder meer de keuze van lipide, de lipidenconcentratie in de oliefase en de eiwit- en reinigingsmiddelconcentraties in de waterige druppels. De gebruikte lipiden zijn ongebruikelijk, omdat ze bij lage temperaturen geen duidelijke faseovergang vertonen. DPhPC is een veelgebruikte lipide om stabiele membraansystemente produceren 40. In principe kan elke lipide die zijn vloeibare omgeving bij lage temperaturen behoudt, geschikt zijn voor deze toepassing. Bovendien mag het lipide niet gevoelig zijn voor oxidatie. De wasmiddelconcentratie in de druppels moet zo laag mogelijk zijn om membraanbreuk te voorkomen. Stabiele membranen en goede eiwitopnamesnelheden worden over het algemeen bereikt met detergentconcentraties onder de kritische micelconcentratie (cmc), aangezien het membraaneiwit niet neerslaat.

Als de DIB-membranen specifieke detergentia21,41 niet verdragen, of als de eiwitten niet uit een oplossing met een laag wasmiddelgehalte in de DIB-membranen integreren, kunnen de eiwitkanalen eerst worden gereconstitueerd tot kleine unilamellaire lipideblaasjes (SUV's), die vervolgens vanaf de druppelzijde met de DIB-membranen worden gefuseerd, zoals met succes is aangetoond voor E. coli MscL 42 . Soms vormen DIB-membranen zich niet omdat de lipideconcentratie in de oliefase te laag is. Om te voorkomen dat DIB-membranen barsten, moet men zich er ook van bewust zijn dat de osmotische druk tussen de hydrogel en de druppel nauwkeurig moet worden gebalanceerd zonder de Ca2 +-flux van cis naar trans overmatig te beïnvloeden. Geoptimaliseerde agarosedikte en maaswijdte lijken cruciaal te zijn om de diffusie van membraaneiwitten waar te nemen. Elke uitdroging van de agaroselaag moet worden vermeden. De dikte kan worden bepaald met behulp van atoomkrachtmicroscopie17. Door de agaroseconcentratie, het volume en de rotatiesnelheid tijdens het centrifugeren te variëren, kunnen de maaswijdte en dikte van de hydrogel worden geoptimaliseerd. Merk echter op dat de dikte van de hydrogellaag het beeldcontrast beïnvloedt. Om membraaneiwitten in DIBs te vangen, kan de agarose-hydrogel worden vervangen door op maat gesynthetiseerde, niet-gecrosslinkte, Ni-NTA-gemodificeerde, laagsmeltende agarose om ze te vangen via een His-tag17. Een te hoge fluorescentieachtergrond wordt vaak veroorzaakt door scheuring van de DIB-membranen. Dit is met name een probleem met multi-well kamers, omdat de Ca2+ -gevoelige kleurstof diffundeert in de hydrogel. In dit geval moeten aangrenzende putten worden vermeden. Fluorescentiebleking van de Ca2+-gevoelige kleurstof boven het membraan mag geen significante beperkende factor zijn, omdat deze wordt uitgewisseld door niet-opgewonden kleurstoffen in het grootste deel van de druppel (figuur 3A) buiten het TIRF-evanescente veld. De lokalisatieprecisie voor het eiwit wordt gegeven door de nauwkeurigheid van het passen van de vlekken en de pixelgrootte.

Zwakke fluorescentiesignalen kunnen worden veroorzaakt door een lage Ca2+-flux door het kanaal. Mogelijke redenen zijn: (i) onnauwkeurige TIRF-instellingen (bijv. Laserintensiteit), (ii) de osmotische Ca 2+ druk over het membraan, of (iii) de intrinsieke Ca2+-permeabiliteit van de kanalen is te laag. Om het eerste probleem het hoofd te bieden, moeten de laserintensiteit, TIRF-hoek en cameraversterking worden geoptimaliseerd. De laatste twee problemen kunnen worden ondervangen door de toepassing van een elektrische potentiaal over het membraan 2,43. De toepassing van externe spanningen kan het resultaat echter vervormen, omdat elektrische effecten de kanaalopening van ligand-gated of mechanosensitieve ionkanalen kunnen beïnvloeden die eigenlijk niet spanningsgestuurd zijn. Voorbeelden van dergelijke kanalen zijn het mitochondriale eiwit translocase TOM-CC27 en de kanaalvormende subeenheid Tom40 26,44,45,46. Ten slotte moet worden opgemerkt dat het inbrengen van membraaneiwitten in DIB-membranen in een specifieke oriëntatie om een gewenste functionaliteit te bereiken lastig is, en kwantitatieve studies zijn zeldzaam47,48. In sommige gevallen is de oriëntatie van de geïntegreerde eiwitten willekeurig. Dit is een ernstig probleem voor het bestuderen van membraaneiwitten, omdat bepaalde membraaneiwitten slechts aan één kant van het membraan worden geactiveerd.

TIRF-microscopie is een krachtige methode voor het aanpakken van gebeurtenissen met één molecuul in planaire ondersteunde membranen49. Voorbeelden hiervan zijn assemblage en vouwroute-opheldering van kanaaleiwitten zoals α-hemolysine50, perfringolysine O 51 en OmpG52. Deze studies omvatten FRET als een aanvullende techniek. Bovendien is de activering van het mechanosensitieve ionkanaal MscL eerder bestudeerd door mechanische stimulatie van ondersteunde DIB-bilayers42 met behulp van stroommetingen. Op basis van dit werk zouden toekomstige studies het hier beschreven platform kunnen combineren met FRET-experimenten met één molecuul om mechanosensitieve kanalen op het niveau van één molecuul op een optische manier aan te pakken17. Injectie van buffer in de druppel, het uitrekken van de binnenste DIB-monolaag of gerichte binding van individuele kanalen aan de onderliggende hydrogel kan worden gebruikt om niet alleen het fysieke mechanisme van mechanisch geactiveerde kanalen verder te bestuderen, die reageren op membraanspanning en / of kromming zoals getoond voor MscL en MscS, het twee-poriën domein K + -kanalen, TREK-1, TREK-2, en TRAAK, en PIEZO (voor beoordeling, zie53), maar ook lokale binding aan het cellulaire cytoskelet, zoals getoond voor het aanraakgevoelige ionkanaal NOMPC54,55.

Disclosures

Wij verklaren geen belangenconflicten.

Acknowledgments

We bedanken Beate Nitschke voor haar hulp bij de eiwitbereiding en Robin Ghosh, Michael Schweikert (Stuttgart) en Maximilan Ulbrich (Freiburg) voor inzichtelijke discussies. Dit werk werd ondersteund door het Stuttgart Research Center Systems Biology (SRCSB) en een subsidie van de Baden Württemberg Foundation (BiofMO-6 to SN).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850356C
100x Oil objective Apochromat N.A. 1.49 Nikon MRD01991 TIRF microscope 
10x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.25  Nikon Microscope to assess DIB membrane formation  
10x objective N.A. 0.25 Nikon MRL00102 TIRF microscope 
40x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.55 Nikon Microscope to assess DIB membrane formation  
488 nm laser, 100 mW   Visitron TIRF microscope 
Adhesive tape
Äkta pure   Cytiva Protein purification system
Bradford assay kit, Pierce Thermo Fisher  23236
CaCl2 Roth 5239.2
Chelax 100 resin Biorad 143-2832
Chloroform  Sigma-Aldrich MC1024452500
Dialysis cassettes Slide-A-Lyzer 20 k MWCO Thermo Fisher  87735
DIB chamber  Custom made PMMA chamber for DIB membranes
Digital power meter and energy console Thorlabs PM100D Laser power meter 
Dimethyl sulfoxide Roth  4720.1
Double distilled H2O
Eclipse TS 100 Hoffmann modulation contrast microscope  Nikon Microscope to assess DIB membrane formation  
EDTA Roth 8042.2
EMCCD camera iXon Ultra 897 Andor TIRF microscope 
Ethanol Sigma-Aldrich 32205-M
Fixed angle rotor Ti70 Beckman Coulter
Fluo-8, CalciFluorTM Santa Cruz Biotechnology SC-362561 Ca2+-sensitive dye
French press cell disruption homogenizer Igneus Igneus 40000 psi
GFP filter AHF Filter seeting used for excitation of DIB-membranes by epifluorescence with white light source 
Glass capillaries World Precision Instruments 4878
Glass coverslips 40 mm x 24 mm x 0.13 mm Roth 1870.2
Glycerol Roth 3783.2
Hamilton syringe 10 mL Roth X033.1
Hamilton syringe 100 mL Roth X049.1
Hamilton syringe 500 mL Roth EY49.1
Heating block  Eppendorf Thermomixer comfort
Heating plate Minitube  HT200
Hepes Roth  9205.3
Hexadcane Sigma-Aldrich 296317
His Trap HP 1 mL Cytiva 29051021 Ni-NTA column
Imidazole Sigma-Aldrich 1.04716.1000
KCl Honeywell 10314243
KLM spin coater  Schaefer Tec SCV-10
List medical L/M-3P-A vertical pipette puller Artisan Technology Group 57761-1
Low melting point agarose Sigma-Aldrich  A9414
M8 Stereomicroscope Wild Stereomicrosope 
Matlab  MathWorks R2022a
Methanol Sigma-Aldrich 34860
MicroFil pipette tips World Precision Instruments MF34G-5
N2 gas
NaCl Roth 3957.1
Nanoliter 2010 injector  World Precision Instruments Nanoliter 2010 
n-dodecyl-b-D-maltoside Glycon Biochemicals D97002-C
Ni-NTA agarose, non-crosslinked Cube Biotech 124115393 Custom made
NIS-Elements AR software Nikon MQS31100/MQS42560/MQS42580/MQS42780/MQS41930 Imaging software
n-octyl-polyoxyethylene Sigma-Aldrich 40530
O2 gas
Phenylmethylsulfonyl fluoride Roth  6367.3
Photodiode sensor  Si, 400 - 1100 nm, 500 mW Thorlabs S130C Sensor for laser power meter 
Plasma cleaner Diener Electronics Zepto
Preparative ultracentrifuge Optima Beckman Coulter
Quad-band TIRF-filter 446/523/600/677 HC AHF Filter setting used for excitation of DIB-membranes with 488 nm laser 
Resource Q 1 mL Cytiva 17117701 Anion exchange column
Silicon oil AR 20 Sigma-Aldrich 10836
Sodium dodecyl sulfate Roth 2326.2
Super LoLux camera JVC Stereomicrosope 
Thermoshaker Gerhardt THL 500/1
Ti-E Fluorescence microscope   Nikon MEA53100
Tris-HCl Sigma-Aldrich 9090.3
Tryptone Roth 8952.2
Ultrasonic bath  Bandelin Sonorex RK 100
Vaccum pump Vacuubrand MD 4C NT
White light source for epifluorescence illumination (100 W) Nikon MBF72655 TIRF microscope 
Yeast extract Roth 2363.2
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437 (7059), 656-663 (2005).
  2. Leptihn, S., et al. Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil. Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).
  3. Thompson, J. R., Heron, A. J., Santoso, Y., Wallace, M. I. Enhanced stability and fluidity in droplet on hydrogel bilayers for measuring membrane protein diffusion. Nano Letters. 7 (12), 3875-3878 (2007).
  4. Kusumi, A., et al. Paradigm shift of the plasma membrane concept from the two-dimensional continuum fluid to the partitioned fluid: high-speed single-molecule tracking of membrane molecules. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 34 (1), 351-378 (2005).
  5. Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems. Biophysical Journal. 60 (4), 910-921 (1991).
  6. Kusumi, A., Shirai, Y. M., Koyama-Honda, I., Suzuki, K. G. N., Fujiwara, T. K. Hierarchical organization of the plasma membrane: Investigations by single-molecule tracking vs. fluorescence correlation spectroscopy. FEBS Letters. 584 (9), 1814-1823 (2010).
  7. Betaneli, V., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy to examine protein-lipid interactions in membranes. Methods in Molecular Biology. 974, 253-278 (2013).
  8. Ando, T., et al. A high-speed atomic force microscope for studying biological macromolecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (22), 12468-12472 (2001).
  9. Casuso, I., et al. Characterization of the motion of membrane proteins using high-speed atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 7 (8), 525-529 (2012).
  10. Karner, A., et al. Tuning membrane protein mobility by confinement into nanodomains. Nature Nanotechnology. 12 (3), 260-266 (2017).
  11. Rajendran, L., Simons, K. Lipid rafts and membrane dynamics. Journal of Cell Science. 118 (6), 1099-1102 (2005).
  12. Schink, K. O., Tan, K. -W., Stenmark, H. Phosphoinositides in control of membrane dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), 143-171 (2016).
  13. Schafer, D. A. Coupling actin dynamics and membrane dynamics during endocytosis. Current Opinion in Cell Biology. 14 (1), 76-81 (2002).
  14. Lingwood, D., Ries, J., Schwille, P., Simons, K. Plasma membranes are poised for activation of raft phase coalescence at physiological temperature. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (29), 10005-10010 (2008).
  15. Engelman, D. M. Membranes are more mosaic than fluid. Nature. 438 (7068), 578-580 (2005).
  16. Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. The lateral organization and mobility of plasma membrane components. Cell. 177 (4), 806-819 (2019).
  17. Wang, S., et al. Spatiotemporal stop-and-go dynamics of the mitochondrial TOM core complex correlates with channel activity. Communications Biology. 5 (1), 471 (2022).
  18. Ide, T., Yanagida, T. An artificial lipid bilayer formed on an agarose-coated glass for simultaneous electrical and optical measurement of single ion channels. Biochemical and Biophysical Research Communications. 265 (2), 595-599 (1999).
  19. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid bilayer formation by contacting monolayers in a microfluidic device for membrane protein analysis. Analytical Chemistry. 78 (24), 8169-8174 (2006).
  20. Heron, A. J., Thompson, J. R., Mason, A. E., Wallace, M. I. Direct detection of membrane channels from gels using water-in-oil droplet bilayers. Journal of the American Chemical Society. 129 (51), 16042-16047 (2007).
  21. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. Molecular BioSystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  22. Huang, S., Romero-Ruiz, M., Castell, O. K., Bayley, H., Wallace, M. I. High-throughput optical sensing of nucleic acids in a nanopore array. Nature Nanotechnology. 10 (11), 986-991 (2015).
  23. Sackmann, E. Supported membranes: scientific and practical applications. Science. 271 (5245), 43-48 (1996).
  24. Kiessling, V., Yang, S. -T., Tamm, L. K. Supported lipid bilayers as models for studying membrane domains. Current Topics in Membranes. 75, 1-23 (2015).
  25. Murray, D. H., Tamm, L. K., Kiessling, V. Supported double membranes. Journal of Structural Biology. 168 (1), 183-189 (2009).
  26. Hill, K., et al. Tom40 forms the hydrophilic channel of the mitochondrial import pore for preproteins. Nature. 395 (6701), 516-521 (1998).
  27. Poynor, M., Eckert, R., Nussberger, S. Dynamics of the preprotein translocation channel of the outer membrane of mitochondria. Biophysical Journal. 95 (3), 1511-1522 (2008).
  28. Künkele, K. P., et al. The preprotein translocation channel of the outer membrane of mitochondria. Cell. 93 (6), 1009-1019 (1998).
  29. Ahting, U., et al. The TOM core complex: the general protein import pore of the outer membrane of mitochondria. The Journal of Cell Biology. 147 (5), 959-968 (1999).
  30. Bausewein, T., et al. Cryo-EM structure of the TOM core complex from Neurospora crassa. Cell. 170 (4), 693-700 (2017).
  31. Cowan, S. W., et al. Crystal structures explain functional properties of two E. coli porins. Nature. 358 (6389), 727-733 (1992).
  32. Bieligmeyer, M., et al. Reconstitution of the membrane protein OmpF into biomimetic block copolymer-phospholipid hybrid membranes. Beilstein Journal of Nanotechnology. 7, 881-892 (2016).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  34. Vicente, N. B., Zamboni, J. E. D., Adur, J. F., Paravani, E. V., Casco, V. H. Photobleaching correction in fluorescence microscopy images. Journal of Physics: Conference Series. 90 (1), 012068 (2007).
  35. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  36. Ershov, D., et al. TrackMate 7: integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines. Nature Methods. 19 (7), 829-832 (2022).
  37. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  38. Hirsch, M., Wareham, R. J., Martin-Fernandez, M. L., Hobson, M. P., Rolfe, D. J. A stochastic model for electron multiplication charge-coupled devices - From theory to practice. PLoS One. 8 (1), 53671 (2013).
  39. Bausewein, T., Naveed, H., Liang, J., Nussberger, S. The structure of the TOM core complex in the mitochondrial outer membrane. Biological Chemistry. 401 (6-7), 687-697 (2020).
  40. Lindsey, H., Petersen, N. O., Chan, S. I. Physicochemical characterization of 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine in model membrane systems. Biochimica et Biophysica Acta. 555 (1), 147-167 (1979).
  41. Manafirad, A. Single ion-channel analysis in droplet interface bilayer. Methods in Molecular Biology. 2186, 187-195 (2021).
  42. Rosholm, K. R., et al. Activation of the mechanosensitive ion channel MscL by mechanical stimulation of supported Droplet-Hydrogel bilayers. Scientific Reports. 7 (1), 45180 (2017).
  43. Wang, Y., et al. Electrode-free nanopore sensing by DiffusiOptoPhysiology. Science Advances. 5 (9), (2019).
  44. Ahting, U., et al. the pore-forming component of the protein-conducting TOM channel in the outer membrane of mitochondria. The Journal of Cell Biology. 153 (6), 1151-1160 (2001).
  45. Romero-Ruiz, M., Mahendran, K. R., Eckert, R., Winterhalter, M., Nussberger, S. Interactions of mitochondrial presequence peptides with the mitochondrial outer membrane preprotein translocase TOM. Biophysical Journal. 99 (3), 774-781 (2010).
  46. Kuszak, A. J., et al. Evidence of distinct channel conformations and substrate binding affinities for the mitochondrial outer membrane protein translocase pore Tom40. The Journal of Biological Chemistry. 290 (43), 26204-26217 (2015).
  47. Yanagisawa, M., Iwamoto, M., Kato, A., Yoshikawa, K., Oiki, S. Oriented reconstitution of a membrane protein in a giant unilamellar vesicle: Experimental verification with the potassium channel KcsA. Journal of the American Chemical Society. 133 (30), 11774-11779 (2011).
  48. Goers, R., et al. Optimized reconstitution of membrane proteins into synthetic membranes. Communications Chemistry. 1, 35 (2018).
  49. Castell, O. K., Dijkman, P. M., Wiseman, D. N., Goddard, A. D. Single molecule fluorescence for membrane proteins. Methods. 147, 221-228 (2018).
  50. Thompson, J. R., Cronin, B., Bayley, H., Wallace, M. I. Rapid assembly of a multimeric membrane protein pore. Biophysical Journal. 101 (11), 2679-2683 (2011).
  51. Senior, M. J. T., et al. Single-molecule tracking of perfringolysin O assembly and membrane insertion uncoupling. The FEBS Journal. , (2022).
  52. Weatherill, E. E., et al. Fast slow folding of an outer membrane porin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (20), 2121487119 (2022).
  53. Kefauver, J. M., Ward, A. B., Patapoutian, A. Discoveries in structure and physiology of mechanically activated ion channels. Nature. 587 (7835), 567-576 (2020).
  54. Yan, Z., et al. Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation. Nature. 493 (7431), 221-225 (2013).
  55. Wang, Y., et al. The push-to-open mechanism of the tethered mechanosensitive ion channel NompC. eLife. 10, 58388 (2021).

Tags

Biochemie Nummer 192
Single-Molecule Imaging van Laterale Mobiliteit en Ion Channel Activity in Lipid Bilayers met behulp van Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, S., Nussberger, S.… More

Wang, S., Nussberger, S. Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy. J. Vis. Exp. (192), e64970, doi:10.3791/64970 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter