Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu Kullanılarak Lipid Çift Katmanlarında Yanal Mobilite ve İyon Kanalı Aktivitesinin Tek Moleküllü Görüntülenmesi

Published: February 17, 2023 doi: 10.3791/64970
Automatic Translation
1, 1
1Biophysics Department, Institute of Biomaterials and Biomolecular Systems, University of Stuttgart

Summary

Bu protokol, bireysel iyon kanallarını izlemek ve desteklenen lipit membranlarındaki aktivitelerini belirlemek için TIRF mikroskopisinin nasıl kullanılacağını açıklar, böylece yanal membran hareketi ile kanal fonksiyonu arasındaki etkileşimi tanımlar. Membranların nasıl hazırlanacağını, verilerin nasıl kaydedileceğini ve sonuçların nasıl analiz edileceğini açıklar.

Abstract

Yüksek çözünürlüklü görüntüleme teknikleri, birçok iyon kanalının statik olmadığını, ancak gözenek oluşturan ve yardımcı alt birimlerin geçici ilişkisi, yanal difüzyon ve diğer proteinlerle kümelenme dahil olmak üzere oldukça dinamik süreçlere tabi olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, lateral difüzyon ve fonksiyon arasındaki ilişki tam olarak anlaşılamamıştır. Bu soruna yaklaşmak için, desteklenen lipid membranlarındaki bireysel kanalların lateral hareketliliğinin ve aktivitesinin, toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu kullanılarak nasıl izlenebileceğini ve ilişkilendirilebileceğini açıklıyoruz. Membranlar, damlacık arayüzü çift katmanlı (DIB) tekniği kullanılarak ultra ince bir hidrojel substrat üzerinde üretilir. Diğer model membran tipleriyle karşılaştırıldığında, bu membranlar mekanik olarak sağlam ve son derece hassas analitik teknikler için uygun olma avantajına sahiptir. Bu protokol, membrana yakın bir yerde Ca 2 + 'ya duyarlı bir boyanın floresan emisyonunu gözlemleyerek tek kanallardan Ca2 + iyon akışını ölçer. Klasik tek moleküllü izleme yaklaşımlarının aksine, membrandaki yanal harekete ve fonksiyona müdahale edebilecek floresan füzyon proteinleri veya etiketleri gerekli değildir. Proteinin konformasyonel değişiklikleri ile ilişkili iyon akısındaki olası değişiklikler sadece membrandaki protein yanal hareketinden kaynaklanmaktadır. Temsili sonuçlar, mitokondriyal protein translokasyon kanalı TOM-CC ve bakteri kanalı OmpF kullanılarak gösterilmiştir. OmpF'nin aksine, TOM-CC'nin kapısı moleküler hapsedilmeye ve lateral difüzyonun doğasına karşı çok hassastır. Bu nedenle, desteklenen damlacık arayüzü çift katmanları, yanal difüzyon ile iyon kanallarının işlevi arasındaki bağlantıyı karakterize etmek için güçlü bir araçtır.

Introduction

Bu protokol, polimer destekli damlacık arayüzlü çift katmanlı (DIB) membranlarda membran proteinlerinin membran mobilitesi ile iyon kanalı geçirgenliği arasındaki korelasyonun nasıl çalışılacağını açıklamayı amaçlamaktadır 1,2,3.

Mevcut teknik, tek parçacık izleme 4,5, floresan korelasyon spektroskopisi 6,7 ve yüksek hızlı atomik kuvvet mikroskobu 8,9,10 gibi etkileyici bir dizi gelişmiş optik ve yüzey analitik aracını tamamlamaktadır. Bunlar, membran bazlı reaksiyonları etkileyen membranların dinamik bileşimi ve yapısı hakkında değerli bilgiler sağlar11,12,13. Proteinlerin hareketi ve yanal difüzyonu, membrandaki proteinlerin yerel yoğunluğuna bağlı olsa da, bireysel protein molekülleri de lipit sallarında14 ve protein-protein etkileşimleri 15,16 ile tutulabilir. Membrandan hücre dışı ortama veya sitosol'e çıkıntı yapan protein alanlarına bağlı olarak, protein hareketliliği oldukça hareketliden tamamen hareketsizliğe kadar değişebilir. Bununla birlikte, membranın karmaşıklığı ve periferik yapıları nedeniyle, yanal hareketliliğin doğası ile protein fonksiyonu arasındaki etkileşimi deşifre etmek genellikle zordur17.

DIB membranlarının, membran proteinlerinin biyofiziksel tek moleküllü analizleri için etkili bir platform olduğu kanıtlanmıştır 18,19,20,21,22. Bir lipit/yağ fazında sulu damlacıkların hidrojel destekli substratlarla teması yoluyla lipitlerin kendi kendine montajı ile oluşurlar. Yaygın olarak kullanılan desteklenen lipit çift katmanlarına (SLB'ler)1,23,24,25 benzer şekilde, DIB'ler, uygun ligandlarla işlevselleştirildiğinde proteinlerin polimer matrisine geçici veya kalıcı olarak bağlanmasıyla yanal hareketliliğin lokal olarak ayarlanmasına izin verir17. İkincisi, heterojen bir protein dağılımına sahip hücre zarlarındaki biyokimyasal işlemler için bir model sistem olarak hizmet edebilir10.

Burada açıklanan deneysel yaklaşım, TIRF mikroskobu kullanarak membran 2,22'ye yakın bir yerde bireysel kanallardan Ca2+ iyon akısını ölçmek için Ca2+ duyarlı boyaların floresansına dayanır. Bu optik yaklaşım, numunenin aydınlatılmasını, kaçan uyarma ışığının fiziksel özellikleri nedeniyle, floresan arka planın önemli ölçüde azalmasına yol açan membrana yakın bir mesafeyle sınırlar. İkincisi, tek moleküllerin tespiti için yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlük gerekiyorsa bir önkoşuldur. Klasik elektrofizyolojik yöntemlerinaksine 26,27, iyon akısını tek tek kanallardan incelemek için membran voltajlarına gerek yoktur. Ayrıca, yöntem, membrandaki kanalların yanal hareketine müdahale edebilecek floresan boyalar veya moleküllerle etiketleme gerektirmez.

Bu yöntem, klasik elektrofizyolojiyi kullanmadan membrana gömülü protein kanallarını tek molekül seviyesinde incelemek için özellikle yararlıdır. Neurospora crassa 28,29,30'dan mitokondriyal protein ileten kanal TOM-CC'yi ve Escherichia coli 17,31'in dış zarı boyunca küçük hidrofilik moleküllerin difüzyonunu destekleyen OmpF'yi kullanarak, iki proteinin membran hareketliliklerinin ve kanal aktivitelerinin nasıl incelenebileceğini ve ilişkilendirilebileceğini gösteriyoruz. Bu yaklaşımın, TOM-CC ve OmpF için optimize edilmiş olmasına rağmen, diğer protein kanallarına kolayca uygulanabileceğini öneriyoruz.

Protocol

1. Protein üretimi

NOT: Bu bölümde, LamB ve OmpC'den yoksun olan Escherichia coli BE BL21(DE3) omp631,32'den OmpF'yi ve Neurospora crassa'dan TOM çekirdek kompleksini izole etme prosedürü açıklanmaktadır (Şekil 1)28,29. İkincisi, TOM alt birimi Tom22'nin 6xHis etiketli bir formunu içeren bir N. crassa suşu28'den izole edilmiş mitokondri gerektirir (Şekil 1A), tarif edildiği gibi izole edilebilir28. Aşağıdaki protokoller genellikle 1-2 mg N. crassa TOM-CC ve 10 mg E. coli OmpF verir. Miktar ayarlanacaksa, protein/deterjan oranlarının tam olarak korunması önemlidir. Aksi belirtilmedikçe, tüm adımlar 4 °C'de gerçekleştirilmelidir.

  1. TOM çekirdek kompleksinin izolasyonu
    1. Bausewein ve ark.30'a göre, yaklaşık 1.5 kg (ıslak ağırlık) hiften diferansiyel çökeltme ile elde edilen saflaştırılmış N. crassa mitokondrisini (2 g protein), 20 mM Tris-HCl (pH 8.5), %1 (w/v) DDM, %20 (v/v) gliserol, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol ve 1 mM fenilmetilsülfonil florür (PMSF) içinde 10 mg/mL'lik bir protein konsantrasyonunda 4 °C'de 30 dakika boyunca çözün.
      DİKKAT: PMSF toksiktir. Uygun kişisel koruyucu ekipman giyin.
    2. Çözünür mitokondrileri ultrasantrifüj tüplerine aktarın ve çözünmeyen membranları, 4 ° C'de 40 dakika boyunca 130.000 x g'de ultrasantrifüjleme ve standart sınıf filtre kağıdı ile filtreleme yoluyla çözünür membran proteinlerinden ayırın.
    3. Otomatik bir protein saflaştırma sistemi kullanarak önceden paketlenmiş bir Ni-NTA sütununu (5 mL hacim) yaklaşık 5 sütun hacmi (CV) tampon A1 (Tablo 1) ile dengeleyin. Ni-NTA sütununu tüm adımlarda 1 mL/dak sabit akış hızında çalıştırın. Proteinler 2 g'dan az mitokondriden izole edilmişse daha düşük hacimli bir sütun (1 mL) kullanın.
    4. Çözünür protein numunesini Ni-NTA kolonuna 1 mL/dak akış hızında yükleyin.
    5. Bağlanmamış proteinleri çıkarmak için Ni-NTA sütununu 5 CV tampon A1 (Tablo 1) ile yıkayın.
    6. His etiketli TOM-CC'yi %30 tampon A2 (Tablo 1; 300 mM imidazol) ile elute edin ve 280 nm kromatogramda göründüğü gibi protein tepesini toplayın (Şekil 1B).
    7. TOM-CC'nin daha fazla saflaştırılması için, otomatik protein saflaştırma sistemini kullanarak önceden paketlenmiş anyon değişim sütununu (1 mL) B1, B2 ve B1 tamponlarının her biri 5 CV ile dengeleyin (Tablo 1). Tüm adımlarda anyon değişim sütununu 1 mL/dak sabit akış hızında çalıştırın.
    8. TOM-CC tepe fraksiyonunu (adım 1.1.6) anyon değişim sütununa (1 mL/dak akış hızı) yükleyin.
    9. Kolonu 5 CV tampon B1 (Tablo 1) ve% 0-20 tampon B2 doğrusal tuz gradyanı ile yıkayarak bağlanmamış proteinleri çıkarın (Tablo 1).
    10. TOM-CC'yi %20-%35 tampon B2 doğrusal tuz gradyanı ile değerlendirin ve 280 nm kromatogramda göründüğü gibi protein tepe fraksiyonunu toplayın (Şekil 1C).
    11. Numune saflığını SDS-PAGE ile değerlendirin (Şekil 1D) ve üreticinin protokolüne göre ticari olarak temin edilebilen bir protein testi kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin (bkz.
    12. Protein numunelerini sıvı azotta dondurun ve bir sonraki kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.
      DİKKAT: Sıvı azot iyi havalandırılan alanlarda kullanılmalıdır. Uygun kişisel koruyucu ekipman giyin.
       
  2. OmpF İzolasyonu
    1. LamB ve OmpC32'den yoksun olan E. coli suşu BE BL21 (DE3) omp6'yı steril koşullar altında donmuş bir gliserol stoğundan geri kazanın ve bir Luria-Bertani (LB) agar plakasına çizin (Tablo 2). Bunu yapmak için, numuneyi yavaş yavaş tüm plakaya eşit olarak yayın.
    2. Plakayı kapak kapalıyken ters çevirmeden ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe etmeden önce numunenin 5 dakika boyunca agarın içine batırılmasına izin verin.
    3. Tek bir E. coli kolonisi seçin, steril bir kürdan kullanarak bu tek koloni ile 7.5 mL LB ortamını (Tablo 2) aşılayın ve 37 ° C'de ajitasyon (170 rpm) ile gece boyunca (14 saat) büyümeye bırakın.
    4. Steril pipetli 2 x 1 mL E. coli hücrelerini 2 x 500 mL LB ortamına aktarın (Tablo 2) ve bir çalkalayıcıda ajitasyonla (~170 rpm) 37 ° C'de gece boyunca (~14 saat) büyümeye bırakın.
    5. Hücreleri 4 ° C'de 20 dakika boyunca 5.000 x g'de santrifüjleme yoluyla toplayın, pelet sıvı azotta dondurun ve bir sonraki kullanıma kadar -80 ° C'de saklayın.
      NOT: Hücre peletinin ıslak ağırlığı tipik olarak 1 L kültür başına 5 g'dır. Bu noktada, protokol duraklatılabilir.
    6. Hücreleri (2 g) 20 mL lizis tamponu C1'de (Tablo 2) çözün ve yeniden askıya alın ve süspansiyonu, üreticinin talimatlarına göre, maksimum numune hacmi 35 mL'lik olan önceden soğutulmuş (4 ° C) yüksek basınçlı hücre bozulma sisteminden 1.000 psi'de üç kez geçirin.
      DİKKAT: Fransız basınının kullanılması ciddi yaralanmalara yol açabilir. Kullanılan hücrenin basınç sınırını asla aşmayın. Uygun kişisel koruyucu ekipman giyin.
    7. Kırılmamış hücreleri 15 dakika boyunca 4.000 x g'de santrifüjleme ile lizattan çıkarın ve süpernatanı toplayın.
    8. Membranları 1 saat boyunca 100.000 x g'de ultrasantrifüjleme ile toplayın.
    9. Membran peletini 10 mL tampon C2'de (Tablo 2) tekrar askıya alın ve bilyalı yataklı cam homojenizatör kullanarak eşit hacimde SDS tampon C3 (Tablo 2) ile karıştırın.
      DİKKAT: C3 tamponundaki β-merkaptoetanol toksiktir. İlgili tüm güvenlik düzenlemelerine uyun.
    10. Süspansiyonu 50 ° C'de bir su banyosunda 30 dakika boyunca inkübe edin.
    11. Numuneyi 100.000 x g'de 20 °C'de 1 saat boyunca santrifüjleyin.
    12. Bilyalı yataklı cam homojenizatör kullanarak membran peletini 10 mL SDS tampon C4'te (Tablo 2) yeniden askıya alın ve süspansiyonu 30 dakika boyunca 37 °C'de bir su banyosunda inkübe edin.
      NOT: Pelet yeniden askıya alınamıyorsa, 20 mL'lik bir hacme kadar daha fazla SDS tampon C4 ekleyin.
    13. Numuneyi 20 °C'de 100.000 x g'de 30 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanı toplayın.
    14. Süpernatantı oktil polioksietilen (oktil POE) ile %0,5'lik (w/v) nihai deterjan konsantrasyonuna kadar karıştırın ve numuneyi 24 saat boyunca 4 °C'de tampon C5'e (Tablo 2) karşı iki kez diyaliz edin. Bu amaçla, üreticinin talimatlarına göre 20 kDa'lık bir kesimle diyaliz tüpü kullanın ve numuneyi diyaliz tüpüne veya cihazına yerleştirin.
      NOT: Diğer moleküler kütlelere sahip proteinlerin diyalize edilmesi durumunda diyaliz tüpünün kesilmesinin ayarlanması gerekir.
    15. Numune saflığını SDS-PAGE ile değerlendirin ve üreticinin protokolüne göre ticari olarak temin edilebilen bir protein testi kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin (Malzeme Tablosu).
      NOT: 95 °C'ye ısıtılan numuneler monomerik OmpF gösterir. Isıtılmamış numuneler OmpF'yi trimerik formunda gösterir (Şekil 1F).
    16. Şokla dondurulan OmpF, sıvı azot içindeki alikotlarda diyalizlenir ve daha sonraki kullanıma kadar -20 ° C'de saklanır.
      DİKKAT: Sıvı azot iyi havalandırılan alanlarda kullanılmalıdır. Uygun kişisel koruyucu ekipman giyin.

2. DIB membranlarında iyon kanallarının optik tek kanallı kaydı

NOT: Bu bölümde, tek iyon kanalları17 üzerinden yanal protein hareketini ve iyon akısını izlemek için mikrofabrikasyon polimetil metakrilat (PMMA) odaları2'de DIB membranlarının hazırlanması prosedürü açıklanmaktadır. Odanın üretimi için boyutlar ve kesin çizimler Lepthin ve ark.2'de bulunabilir. Şekil 2, PMMA haznesi2'nin montajına ve DIB membranlarının oluşumuna genel bir bakış sunmaktadır. Aksi belirtilmedikçe, tüm adımlar oda sıcaklığında (RT) gerçekleştirilir. Şekil 3, bir DIB membranının şematik bir temsilini ve tek kanallı bir proteinden geçen Ca2 + akının, hem membrandaki hareketi hem de kanalın açık-kapalı durumunu izlemek için nasıl kullanıldığını göstermektedir.

  1. Lipitlerin hazırlanması
    1. Kloroform içinde çözünmüş 1,2-difitanoyl-sn-glisero-3-fosfokolin (25 mg/mL DPhPC) içeren lipit stok çözeltisini -20 °C'de dondurucudan çıkarın ve RT'ye ısındırın. Bu amaçla, numuneyi birkaç dakika boyunca elle yavaşça ısıtmak genellikle yeterlidir.
      DİKKAT: Kloroform toksiktir. Uygun kişisel koruyucu ekipman giyin ve bir duman davlumbazının altında kloroform içeren tüm prosedürleri uygulayın.
    2. 380 μL DPhPC stok çözeltisini (25 mg/mL DPhPC) bir cam şişeye aktarın. Kauçuk sızdırmazlıklı pipetlerden kaçının. Bunun yerine, paslanmaz çelik pistonlu mikrolitre cam şırıngalar kullanın.
    3. Lipit stok çözeltisini işledikten sonra, lipit oksidasyonunu önlemek için lipit stok çözeltisini Ar veyaN2 gazı ile kaplayın. Lipitlerin çözündüğü organik çözücünün buharlaşmasını veya çözücü spreylerinin şişeden sıçramasını önlemek için mümkün olan en düşük gaz akışını kullanın. Organik çözücülü lipitler içeren cam şişelerin kapaklarının iç kısımda politetrafloroetilen (PTFE) ile kaplandığından emin olun.
    4. Lipit numunesini (adım 2.1.2) birN2 akışı altında kurutun ve kalan organik çözücüyü yağsız bir vakum pompası kullanarak gece boyunca vakum altında (2.0 mbar) lipit numunesinden çıkarın.
    5. 9.5 mg/mL'lik nihai lipit konsantrasyonuna mikrolitre cam şırınga kullanarak eşit miktarda hekzadekan ve silikon yağı (her biri 500 μL) ekleyerek lipit filmini hekzadekan/silikon yağı çözeltisi içinde çözün.
      NOT: Lipit çözeltisi RT'de birkaç hafta stabildir.
  2. Agaroz hidrojelinin hazırlanması
    1. Çift deiyonize suda yaklaşık 1 mL düşük erime noktalı agaroz çözeltisi (% 0.75 [w / v]) hazırlayın ve spin kaplama cam örtülerinde kullanılmak üzere 20 dakika boyunca bir ısıtma bloğunda 85 ° C'ye ısıtın.
      NOT: Agaroz çözeltisi RT'de birkaç hafta tutulabilir ve birkaç kez yeniden ısıtılabilir.
    2. 0,66 M CaCl 2 ve 8,8 mM HEPES (pH 7,2) içinde düşük erime noktalı%2,5 (w / v) agaroz çözeltisi hazırlayın ve 20 dakika boyunca bir ısıtma bloğunda 85 ° C'ye ısıtın. Agarozun iyi eridiğinden emin olun.
      NOT: Agaroz çözeltisi RT'de birkaç hafta tutulabilir ve tıpkı spin kaplama için kullanılan agaroz (adım 2.2.1) gibi birkaç kez yeniden ısıtılabilir.
  3. Polimetil metakrilat (PMMA) haznesi tertibatı ve hidrojel hekzadekan/silikon yağ arayüzünde lipit tek katmanlı oluşumu
    1. Bazı cam kapak kapaklarını (40 mm x 24 mm x 0,13 mm) paslanmaz çelik bir kapak tutucusuna yerleştirin ve ultrasonik bir temizleyicide asetonla 10 dakika boyunca bir cam beherde temizleyin. Kapakları suya batırmak için yeterli aseton kullanın ve temizleme işlemi sırasında buharların kaçışını en aza indiren basınçsız, kapalı bir sistem oluşturmak için beheri gevşek bir şekilde cam bir plaka ile örtün.
      DİKKAT: Aseton, düşük parlama noktasına sahip oldukça yanıcı bir çözücüdür. Buhar/hava karışımları patlayıcıdır. Ultrasonik temizleyiciyi iyi havalandırılan bir alanda çalıştırın. Uygun kişisel koruyucu ekipman giyin ve resmi güvenlik önlemlerine uyun (örneğin, açık alev ve kıvılcım yok).
    2. Cam kapakları çift deiyonize suyla durulayın ve birN2 akışı altında kurutun.
      NOT: Bu şekilde temizlenen kapak fişleri birkaç hafta boyunca saklanabilir.
    3. Bir plazma temizleyicideki bir kapak kaymasını 5 dakika boyunca oksijenle (0,5 mbar) daha da temizleyin ve hidrofilize edin.
      NOT: Bu adımı, plazma temizlemenin hidrofilik etkisi zamanla aşındığından, agaroz çözeltisi ile spin kaplamadan hemen önce gerçekleştirin.
    4. Plazma işlemli bir kapak kaymasını bir spin kaplayıcı üzerine monte edin (Şekil 2, adım 1).
    5. 200 μL'lik bir pipet kullanarak, 30 sn boyunca 3.000 rpm'de 140 μL ısıtılmış% 0.75 (w / v) düşük erime noktalı agaroz (adım 2.2.1) yavaşça ekleyerek kapak kaymasını mikrometre kalınlığında bir agaroz filmi ile kaplayın (Şekil 2, adım 1).
      NOT: Agaroz filminin kalınlığı,17'de açıklandığı gibi atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ile belirlenebilir.
    6. Spin kaplı kapak kaymasını, agaroz hidrojelinin ince tabakası ile derhal PMMA odası2'nin alt tarafına takın. Agaroz hidrojelinin yukarı doğru işaret ettiğinden emin olun (Şekil 2, adım 2).
    7. Kapak kaymasının kenarlarını şeffaf yapışkan bant ile PMMA mikro işlenmiş cihaza sabitleyin.
    8. PMMA cihazını 35 °C'ye ısıtılmış bir sıcak plakaya yerleştirin (Şekil 2, adım 3).
    9. Hava kabarcıkları oluşturmadan, 200 μL% 2.5 agaroz çözeltisinin (adım 2.2.2) odanın girişine bir pipetle (Şekil 2, adım 3) dikkatlice dökün, böylece spin kaplama ile uygulanan ince hidrojel% 2.5 agaroz çözeltisinin tamponu ile dengelenebilir ve hidratlanmış kalabilir. % 2.5 agaroz çözeltisinin, spin kaplı agaroz hidrojelinin etrafına yayıldığından ancak üzerine yayılmadığından emin olun (Şekil 3A), PMMA odasını ısıtma plakasına hafifçe bastırarak önlenebilir.
    10. Agaroz-yağ arayüzünde lipit tek katmanlı oluşumunu başlatmak ve PMMA odasının kuyularında spin kaplı agarozun dehidrasyonunu önlemek için PMMA odasının kuyularını (Şekil 2, adım 4) toplam 60 μL lipit/yağ çözeltisi (adım 2.1.5) ile derhal örtün. Cihazı yaklaşık 2 saat boyunca 35 ° C'de bir sıcak plakada tutun.
      NOT: PMMA odasındaki dairesel kuyular, daha önce yayınlanan çalışma2'ye göre 0,5 mm çapa ve 1,8 mm derinliğe sahiptir.
  4. Lipid kaplı sulu damlacıkların hekzadekan/silikon yağ çözeltisinde hazırlanması
    1. Bir damlacık inkübasyon odasındaki birkaç mikrofabrikasyon kuyucuğun her birine 20 μL lipid hekzadekan/silikon yağı çözeltisi (adım 2.1.5) yerleştirin (Şekil 2, adım 4). Lipid hekzadekan/silikon yağı çözeltisi için uygun kaplar, ince bir PMMA plaka2'de 40 mm x 30 mm x 3,5 mm'lik küçük girintilerdir.
    2. Dikey veya yatay bir mikropipet çektirme makinesi (ör. yama pipetleri veya keskin cam elektrotlar yapmak için kullanılır) kullanarak uç açma çapı 20 μm olan bir mikrokapiler cam iğne hazırlayın. Mikrokapiler cam iğnenin açılma çapını, 7,5x ile 35x arasında bir yakınlaştırma aralığında, düşük büyütmede bir dürbün stereomikroskop altında tahmin edin.
      NOT: Cam kılcal damar çekilmeden önce ön ısıtma modu, çekme için ısıtma modu ve çekiş kuvveti ayarları, üreticinin çekme cihazının özelliklerine ve kılcal damar tipine göre deneysel olarak önceden belirlenmelidir.
    3. Mikrokapiler cam iğneyi, 8,8 mM HEPES (pH 7,2), 7 μM Fluo-8, 400 μM EDTA, 1,32 M KCl ve 30 nM TOM çekirdek kompleksi içeren 5 μL sulu enjeksiyon çözeltisi veya alternatif olarak bir mikrokapiler pipet ucu kullanarak 20 nM OmpF ile doldurun. Sulu enjeksiyon çözeltisini hazırlamak için sadece çok değerli metal iyonlarını (Ca2+) bağlayan bir şelatlama reçinesi ile daha önce işlenmiş çift damıtılmış su kullanın.
    4. Mikrokapiler cam iğneyi, piezo tahrikli bir nanoenjektör üzerine sulu enjeksiyon çözeltisi ile monte edin.
    5. Nanoenjektörü kullanarak lipid hekzadekan/silikon yağı çözeltisi (bkz. 2.1.5) ile doldurulmuş damlacık inkübasyon odasındaki kuyucuklara 8.8 mM HEPES (pH 7.2), 7 μM Fluo-8, 400 μM EDTA, 1.32 M KCl ve 30 nM TOM çekirdek kompleksi (adım 1.1.12) veya alternatif olarak 20 nM OmpF (adım 1.2.16) içeren 100-200 nL sulu damlacıkları (Şekil 2, adım 4) enjekte edin. Damlacıkların birbirine temas etmediğinden emin olun, birkaç milimetre (>10 mm) aralıklarla kuyucuklara yerleştirin. Aksi takdirde, yağ / tampon arayüzünde lipit monokatmanları henüz oluşmamışsa, daha büyük damlacıklar halinde birleşirler.
      NOT: Sınıf kılcal damarlar ve nanoenjektörler mevcut değilse, damlacıklar alternatif olarak2'de açıklandığı gibi 0,1 μL ile 0,5 μL arasındaki hacimler için tek kanallı mikrolitre pipetlerle manuel olarak hazırlanabilir. Ancak bu durumda, damlacık hacimleri o kadar doğru değildir.
    6. PMMA ve damlacık inkübasyon odalarını (Şekil 2, adım 4) 35 °C'ye ısıtılmış bir sıcak plaka üzerinde tutarak damlacık/yağ arayüzünde yaklaşık 2 saat boyunca bir lipit tek tabaka oluşumuna izin verin.
  5. DİB membranlarında tek iyon kanallarının hazırlanması ve görüntülenmesi
    1. Tek kullanımlık polipropilen uçlu tek kanallı bir mikrolitre pipet kullanarak, stereomikroskop altında damlacık inkübasyon odasının kuyucuklarından PMMA odasının kuyucuklarına (Şekil 2, adım 5) tek tek sulu damlacıkları manuel olarak aktarın. Damlacıkların, damlacıklar ve agaroz hidrojel arasında bir lipit çift katmanı (Şekil 3) oluşturmak için yaklaşık 5 dakika boyunca hidrojel-yağ arayüzlerinde oluşan lipit monokatmanlarına batmasına izin verin (Şekil 3).
    2. PMMA haznesini ters çevrilmiş bir ışık mikroskobunun numune tutucusuna DIB membranlarla monte edin ve 10x Hoffman modülasyon kontrast hedefi kullanarak membran oluşumunu değerlendirin (Şekil 2, adım 6). DIB membran oluşumu, damlacık ve hidrojel arasındaki arayüzde berrak beyaz bir halka ile gösterilir (Şekil 4A). Kırılan DİB membranları bu halkayı göstermez (Şekil 4B).
      NOT: Alternatif olarak, DIB membranları faz kontrastı veya diferansiyel girişim kontrastı (DIC) mikroskobu ile 10x büyütmede görselleştirilebilir.
    3. DIB membranları oluşmuşsa, ~ 0,16 μm'lik bir piksel boyutu elde etmek için PMMA odasını epifloresan aydınlatması için geleneksel bir ışık kaynağı, 488 nm lazer (Pmax = 100 mW) ve arkadan aydınlatmalı elektron çarpan CCD kamera (512 x 512 piksel; >% 95 QE) ile donatılmış bir TIRF mikroskobunun (Şekil 2, adım 7) numune tutucusuna monte edin.
    4. GFP filtre seti kullanarak yüksek yoğunluklu bir ışık kaynağı ile epifloresan aydınlatma altında 10x büyütme hedefine sahip bir DIB membranının kenarına odaklanın.
    5. DIB membranının aynı kenarını 100x/N.A. 1.49 apokromat yağ TIRF hedefi ile, yine epifloresan aydınlatma altında, damlacıktaki floresan boya Fluo-8'in zayıf arka plan floresansını görselleştirmeye izin veren bir GFP filtre seti kullanarak yüksek yoğunluklu ışık kaynağı ile yüksek büyütmede ince odaklayın (Şekil 4C).
    6. GFP'den dört bantlı TIRF filtre kümesine filtre ayarını değiştirin.
    7. 488 nm lazeri açın ve objektif lensteki lazerin yoğunluğunu 8 mW ile 10 mW arasında bir değere ayarlayın.
      NOT: Objektif lensteki lazer yoğunluğu hakkında genellikle nicel bir bilgi bulunmadığından, lazer yoğunluğu ayarları, üreticinin spesifikasyonlarına göre, fotodiyot sensörü ile donatılmış bir optik lazer güç ölçer ile lenste ayrı ölçümlerde önceden kalibre edilmelidir.
      DİKKAT: Lazerin güvenli çalışmasını sağlamak için, operatör lazer radyasyonunun olası tehlikelerinin ve kaza önleme yönetmeliklerinin farkında olmalıdır.
    8. Tek iyon kanallarını görselleştirmek için, TIRF açısını ve EMCCD kamera kazancını (örneğin, EM kazanç çarpanı ayarı: 285) DIB membranındaki açık iyon kanallarının koyu bir arka plan üzerinde yüksek kontrastlı floresan lekeler olarak görünmesi (Şekil 4D-G) ve görsel olarak incelendiğinde sinyal-arka plan oranı maksimuma ulaşacak şekilde ayarlayın. Tek iyon kanalları aracılığıyla Ca2 + -akıyına karşılık gelen noktaların odakta kalmasını ve merkezde yüksek yoğunlukta ve çevreye doğru kademeli olarak azalan yuvarlak bir şekle sahip olmasını sağlayın. Kanalsız membranlar sadece arka plan floresansını gösterir (Şekil 4C).
    9. Tek tek kanalların zaman içindeki hareketini ve açık-kapalı aktivitesini kaydetmeden önce, iyon kanallarının DIB membranlarına yeniden oluştuğundan ve membran düzleminde yanal olarak hareket ettiğinden emin olmak için floresan noktaların odakta olup olmadığını kontrol edin. Durum böyle değilse, bir floresan molekülünün lazer tarafından zarın yakınında üretilen kaçan alana girip çıktığını gösterebilir.
    10. Konumun düzgün bir şekilde izlenmesini ve tek tek iyon kanallarının açık-kapalı durumunun izlenmesini sağlayan bir dizi membran görüntüsü kaydedin. Yanal hareketliliğin türünü (örneğin, serbest hareket vs geçici ankraj [referans için, bkz.16]) ve kanal aktivitesinin durumunu (örneğin, açık veya kapalı) belirlemek için, yeterince uzun (örneğin, 30 s ila 1 dakika) ve iyi örneklenmiş yörüngeler (örneğin, 48 s-1 kare hızı) elde edin.
      NOT: Kanallı, kısıtlı veya atlamalı difüzyon16'nın gözlemlenmesi, örnekleme hızının sınırlayıcı sınırlar içinde sınırsız difüzyonu ölçmek için yeterince hızlı olmasını gerektirir. Ek olarak, veri örnekleme süresinin, kısıtlanmamış difüzyondan kısıtlı difüzyona geçişi ölçmek için yeterince uzun olduğundan emin olun (ayrıntılar için Jacobson ve ark.16'ya bakınız).
  6. Görüntü ve veri işleme
    NOT: Açık kaynaklı görüntü işleme paketleri33 veya ticari yazılım paketlerine dayalı kendi kendine yazılmış rutinler17 , DIB'lerdeki bireysel iyon kanallarının mekansal zamansal dinamiklerini analiz etmek için kullanılabilir. Yanal membran hareketliliğini tek tek kanallar üzerinden iyon akısı ile ilişkilendirebilmek için, filtre algoritmaları uygulanmamalıdır.
    1. Kendi kendine yazılan rutinleri kullanarak standart prosedürler34 uygulayarak, tam görüntünün ortalama kare yoğunluğunu Equation 1 , t'nin kare indeksi (zaman) ve k'ninuygun parametreler olduğu yere Equation 2sığdırarak ağartma için görüntü zaman serilerini düzeltin. Ardından, zaman serilerini , I(t)'nin yoğunluk olduğu yere Equation 3göre düzeltin. Alternatif olarak, ilk veri analizleri için, kameranın spot noktasına ve piksel boyutuna (örneğin, 50 piksel) bağlı olarak, uygulanan yuvarlanma topu algoritmaları33 ve bir yuvarlanan top yarıçapı ile açık kaynaklı yazılım kullanarak arka plan düzeltmeleri gerçekleştirin.
    2. Tanımlanmış bir ilgi alanı (ROI) (örneğin, 30 x 30 piksel) içindeki bir floresan noktasının uzamsal konumlarını ve genliklerini, belirli bir zamanda t'ye göre olası yerel aydınlatma gradyanlarınıEquation 4 hesaba katan düzlemsel eğimli iki boyutlu bir Gauss fonksiyonuna yerleştirerek belirleyin. Burada, x = (x, y) floresan yoğunluğu bilgisine sahip ROI'dir, A ve σ Gaussian'ın genliği ve genişlikleridir, pk ROI'nin arka plan yoğunluğunu karakterize eden parametrelerdir ve μ = (x 0, y 0) Gaussian'ın konumunu tanımlar. Tek bir kanaldan geçen iyon akısı, A parametresi tarafından verilir. Kanalın yörüngesi x tarafından verilir ve kanalın yanal hareketliliğini belirlemeye izin verir. Alternatif olarak, 35,36'da açıklandığı gibi açık kaynaklı platformlar 33 ve eklentileri kullanarak bireysel noktaların konumlarını ve yoğunluklarını belirlemek mümkündür. EMCCD kamera okumasının foton sayıları38'e dönüştürülmesinden sonra konumsal doğruluğu37 tahmin edin.
    3. Kanal difüzyonu ile kanaldaki iyon akısı arasındaki olası bir korelasyonu belirlemek için floresan genliği A'yı zamana ve karşılık gelen yörünge x'e karşı çizin. Bunu herhangi bir grafik yazılımıyla gerçekleştirin. Serbest yanal kanal hareketi durumunda, τ zaman gecikmesinin doğrusal regresyonu ile yanal difüzyon katsayısı D'yi belirleyin ve noktaların x'ten Equation 5ortalama kare yer değiştirmesini .
      NOT: TOM-CC ve DIB membranlarında serbestçe hareket eden OmpF için tipik difüzyon katsayıları17 , 0,5 ila 1,5 μm2 s-1 arasında değişmektedir. Difüzyon sabiti 0,01 mm2·s-1'den az olan moleküller hareketsiz17 olarak tanımlanır.

Representative Results

Gerçek zamanlı elektrotsuz optik tek kanallı kayıt, yanal protein hareketi ile DIB membranlarındaki bireysel iyon kanallarının işlevi arasındaki etkileşimi ortaya çıkarır. Mitokondriyal TOM çekirdek kompleksinin (Şekil 1A) bir DIB membranına (Şekil 4D) yeniden yapılandırılması, yanal hareketlilik ile iyon geçirgenliği arasında güçlü bir zamansal korelasyon olduğunu göstermektedir (Şekil 5A). TOM-CC geçidi, yanal hareket moduna duyarlı görünmektedir17. Hareketli kanallar, gözeneklerinden ve yüksek floresan noktası yoğunluklarından Ca2+ akı gösterir. Sıkışmış, hareket etmeyen moleküller düşük ve orta floresan yoğunlukları gösterir. Mitokondri TOM-CC'nin genel protein ithalat gözenekleri için, bu tek moleküllü yaklaşım, yanal hareketlilik ile iyon geçirgenliği arasında güçlü bir zamansal korelasyon ortaya koymuştur, bu da TOM-CC kanalının mekanosensitif özelliklere sahip olduğunu düşündürmektedir17. Serbestçe hareket eden TOM-CC moleküllerinin yanal olarak durmasına, TOM-CC kanalının kısmen veya tamamen kapanması eşlik eder. Membranın içine neredeyse tamamen gömülü olan OmpF (Şekil 1E ve Şekil 4F) ile DIB membranlarının görüntülenmesi dur-kalk etkisi göstermez (Şekil 5B). OmpF'nin rastgele duraklamaları, yoğunluktaki bir değişiklikle ve dolayısıyla gözeneklerinin kapanmasıyla ilişkili değildir. Floresan sinyalleri 38'e dayanarak, bireysel kanalların konumsal doğruluğu 5 ila 10 nm arasında tahmin edilebilir. Bununla birlikte, örneğin kök ortalama deplasmanı 120 nm olan bir ara durumdaki TOM-CC molekülleri için gösterildiği gibi, agaroz hidrojeli ile mobil ankraj nedeniyle kanallar hafifçe sallanırsa, bu doğruluğun elde edilemeyeceğine dikkat edilmelidir (Şekil 5A).

Figure 1
Resim 1: TOM-CC izolasyonu. (A) N. crassa TOM-CC30,39'un kriyo EM yapısı. 6xHis etiketli bir Tom22 içeren bir N. crassa suşundan mitokondri, DDM'de çözündü ve Ni-NTA afinite kromatografisine (B) ve anyon değişim kromatografisine (C) tabi tutuldu. (D) İzole edilmiş TOM-CC'nin SDS-PAGE'i. (E) Saflaştırılmış E. coli OmpF'nin kristal yapısı (PDB, 1OPF) ve (F) SDS-PAGE. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Resim 2: PMMA oda tertibatının akış şeması. Adım 1: Bir cam kapak, bir agaroz hidrojeli ile spin kaplanır. Adım 2: Spin kaplı kapak kayması, özel yapım bir PMMA mikroskopi odasına monte edilir. Adım 3: PMMA odasının giriş portuna 35 ° C'lik bir sıcak plaka üzerinde ilave düşük erimeli agaroz eklenir. Adım 4: Lipid monokatmanları, bir tampon / yağ arayüzünde (solda) ve agaroz hidrojel / yağ arayüzünde (sağda) sulu damlacıkların etrafında oluşur. Adım 5: Tek tek sulu damlacıklar, iki lipit tek katmanının teması üzerine bir lipit çift katmanı oluşturmak için PMMA odasının kuyucuklarına pipetlenir. Adım 6: DIB membranlarının oluşumu Hofmann modülasyon kontrast mikroskobu ile doğrulanır. Adım 7: Yerleştirilen iyon kanalları ile DİB membranlarının seçilmiş bölgelerinin görüntüleri TIRF mikroskobu ile elde edilir. Yeşil:% 0.75 agaroz; sarı: Ca2+ iyonları içeren% 2.5 agaroz; macenta: lipit/yağ fazı; koyu mavi: Ca2 + duyarlı boya ve protein içeren sulu damlacık tamponu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Deney düzeneği. (A) Bir PMMA kuyusundaki bir DIB membranının şematik gösterimi. Çift katmanlı, transta Ca2 + duyarlı floresan boya (Fluo-8) kullanılarak zaman içinde bir iyon kanalından Ca2 + -akısının TIRF görüntülemesine izin vermek için% 0.75'lik ultra ince% 0.75'lik bir agaroz filmine dayanır. (B) Ca2 + -akısı, yalnızca cis'den trans'a ozmotik basınç ile kontrol edilir. Bu, hem membrandaki pozisyonun belirlenmesine hem de kanalın açık-kapalı durumuna izin verir. Burada gösterilen kanal, N. crassa mitokondri30'un protein ileten kanalı TOM-CC'dir. (C) Tek bir TOM-CC kanalının yörüngesi. Yeşil: hareketli kanal; sarı: hareket etmeyen kanal. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: DIB membranlarında TOM-CC ve OmpF'nin görüntülenmesi. (A) Hoffmann modülasyon kontrast mikroskobu ile hidrojel ve damlacık arasındaki çift katmanlı temas alanını gösteren DIB membranı. (B) (A)'daki gibi görüntülenen kırık DIB membranı. Ok, PMMA odasının kenarı. (C) Protein kanalları olmadan TIRF mikroskobu ile görüntülenen DIB membranı. (D) TIRF mikroskobu ile görüntülenen, yeniden yapılandırılmış TOM-CC'li DIB membranı. Beyaz kareler yüksek (SH), orta (SI) ve düşük (SL) yoğunluktaki noktaları işaretler. (E) (A) ile işaretlenmiş üç noktanın floresan yoğunluk profilinin iki boyutlu Gauss fonksiyonlarına takılması, tek tek TOM-CC'lerin ve kanal boyunca Ca2+ akısının konumunu ortaya çıkarır. (F) Yeniden yapılandırılmış OmpF'li DIB membranı. (G) (F) ile işaretlenmiş floresan noktanın Gauss uyumu. İki gözenekli β varilli protein kompleksi TOM-CC'nin aksine, üç gözenekli β namlulu OmpF sadece bir geçirgenlik durumu ortaya çıkarır. Piksel boyutu, 0,16 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Kanal aktivitesi TOM-CC'nin yanal hareketliliği ile ilişkilidir. (A) TOM-CC'nin floresan genlik izi (üstte) ve buna karşılık gelen yörüngesi (alt), TOM-CC'nin açık-kapalı kanal aktivitesinin kompleksin yanal membran hareketliliği ile ilişkili olduğunu gösterir. Yörünge üç geçirgenlik durumu gösterir. Yeşil: tamamen açık durum; sarı: ara geçirgenlik durumu; kırmızı: kapalı kanal durumu; kırmızı yıldız: Orta seviyedeki TOM-CC, ortalama konumunun etrafında yaklaşık ±60 nm sallanır. Tamamen açık ve ara durumlardaki floresan sinyallerine dayanan konumsal doğruluklar37, 5 nm ile 10 nm arasında değişmektedir. (B) OmpF'nin floresan genlik izi (üstte) ve buna karşılık gelen yörüngesi (altta). OmpF, hareket halinde veya sıkışmış olmasına bakılmaksızın yalnızca bir yoğunluk seviyesini ortaya çıkarır. Sıkışmış moleküllerin zaman periyotlarına karşılık gelen yörünge segmentleri gri renkle işaretlenmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Arabellek  Reaktif konsantrasyonları Hacim
A1* 20 mM Tris-HCl pH 8,5, % 0,1 (w/v) n-dodesil-β-D-maltosid (DDM), %10 (v/v) gliserol, 300 mM NaCl ve 1 mM fenilmetilsülfonil florür (PMSF) 100 mL
A2* 20 mM Tris-HCl pH 8,5, %0,1 (w/v) DDM, %10 (v/v) gliserol, 1 M Imidazol ve 1 mM PMSF 100 mL
B1* 20 mM HEPES pH 7,2, %0,1 (w/v) DDM, %2 (v/v) dimetil sülfoksit (DMSO) 100 mL
B2* 20 mM HEPES pH 7,2, %0,1 (w/v) DDM, 1 M KCl, %2 (v/v) dimetil sülfoksit (DMSO) 100 mL
* Gazdan arındırın ve kullanmadan önce 0,22 μm'lik bir filtreden geçirin.

Tablo 1: TOM-CC yalıtımı için tampon çözeltileri.

Arabellek  Reaktif konsantrasyonları Hacim
LB* %1 (w/v) tripton, %1 (w/v) NaCl ve %0,5 (w/v) maya ekstraktı 1100 mL
C1 2 mM MgCl2 ve ~ 750 birim DNAse ve 50 mM Tris-HCl pH 7.5 20 mL
C2 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 50 mL
C3 %4 (w/v) sodyum dodesil sülfat (SDS), 2 mM β-merkaptoetanol ve 50 mM Tris-HCl pH 7,5 50 mL
C4 %2 (w/v) SDS, 500 mM NaCl ve 50 mM Tris-HCl pH 7,5 50 mL
C5 %0,5 (w/v) oktil polioksietilen (oktil POE), 1 mM EDTA ve 20 mM Tris pH 8,5 1000 mL
* Kullanmadan önce sterilize ediniz.

Tablo 2: OmpF izolasyonu için tampon çözeltileri.

Discussion

Burada sunulan protokol, tek moleküllü TIRF mikroskobu kullanarak lateral iyon kanalı hareketi ile kanal fonksiyonu arasındaki etkileşimi incelemek için DIB membranlarının kullanımına bir giriş sağlar. Mümkün olan en iyi verileri elde etmek için, mümkün olduğunca çok sayıda iyi ayrılmış kanala sahip kararlı DIB membranlarının hazırlanması, tatmin edici bir şekilde analiz edilebilen bireysel parçacıkların zaman serilerini elde etmek için çok önemlidir.

Optimize edilmesi gereken kritik parametreler arasında lipit seçimi, yağ fazındaki lipit konsantrasyonu ve sulu damlacıklardaki protein ve deterjan konsantrasyonları bulunur. Kullanılan lipitler olağandışıdır, çünkü düşük sıcaklıklarda net bir faz geçişi göstermezler. DPhPC, kararlı membran sistemleri üretmek için yaygın olarak kullanılan bir lipittir40. Prensip olarak, sıvı ortamını düşük sıcaklıklarda tutan herhangi bir lipit bu uygulama için uygun olabilir. Ek olarak, lipit oksidasyona duyarlı olmamalıdır. Membran yırtılmasını önlemek için damlacıklardaki deterjan konsantrasyonu mümkün olduğunca düşük olmalıdır. Kararlı membranlar ve iyi protein birleştirme oranları, membran proteininin çökelmemesi göz önüne alındığında, genellikle kritik misel konsantrasyonunun (cmc) altındaki deterjan konsantrasyonları ile elde edilir.

DIB membranları spesifik deterjanları21,41 tolere etmezse veya proteinler düşük deterjan çözeltisinden DIB membranlarına entegre olmazsa, protein kanalları önce küçük unilamellar lipid veziküllerine (SUV'ler) yeniden oluşturulabilir, bunlar daha sonra E. coli MscL 42 için başarıyla gösterildiği gibi damlacık tarafından DIB membranlarına kaynaştırılır . Bazen, yağ fazındaki lipit konsantrasyonu çok düşük olduğu için DIB membranları oluşmaz. DIB membranlarının patlamasını önlemek için, hidrojel ve damlacık arasındaki ozmotik basıncın, Ca2 + - akısını cis'den transa aşırı derecede etkilemeden tam olarak dengelenmesi gerektiğinin de farkında olunmalıdır. Optimize edilmiş agaroz kalınlığı ve ağ boyutu, membran proteinlerinin difüzyonunu gözlemlemek için çok önemli görünmektedir. Agaroz tabakasının kurumasından kaçınılmalıdır. Kalınlık atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak belirlenebilir17. Spin kaplama sırasında agaroz konsantrasyonunu, hacmini ve dönme hızını değiştirerek, hidrojelin ağ boyutu ve kalınlığı optimize edilebilir. Bununla birlikte, hidrojel tabakası kalınlığının görüntü kontrastını etkilediğini unutmayın. DIB'lerdeki membran proteinlerini yakalamak için, agaroz hidrojeli, bir His-tag17 aracılığıyla onları yakalamak için özel sentezlenmiş, çapraz bağlanmamış, Ni-NTA modifiye edilmiş, düşük erime noktalı agaroz ile değiştirilebilir. Aşırı yüksek floresan arka plan genellikle DIB membranlarının yırtılmasından kaynaklanır. Bu, özellikle çok kuyucuklu odalarda bir sorundur, çünkü Ca2 + 'ya duyarlı boya hidrojelin içine yayılır. Bu durumda, bitişik kuyulardan kaçınılmalıdır. Membranın üzerindeki Ca2 + 'ya duyarlı boyanın floresan ağartılması, TIRF kaçan alanının dışındaki damlacığın kütlesinde (Şekil 3A) uyarılmamış boyalarla değiştirildiği için önemli bir sınırlayıcı faktör olmamalıdır. Protein için lokalizasyon hassasiyeti, lekelerin ve piksel boyutunun sığdırılmasının doğruluğu ile verilir.

Zayıf floresan sinyalleri, kanal boyunca düşük Ca2 + - akıyından kaynaklanabilir. Olası nedenler şunlardır: (i) yanlış TIRF ayarları (örneğin, lazer yoğunluğu), (ii) membran boyunca ozmotik Ca2+ basıncı veya (iii) kanalların içsel Ca2 + geçirgenliği çok düşüktür. İlk sorunla başa çıkmak için lazer yoğunluğu, TIRF açısı ve kamera kazancının optimize edilmesi gerekir. Son iki sorun, membran 2,43 boyunca bir elektrik potansiyelinin uygulanmasıyla aşılabilir. Bununla birlikte, harici voltajların uygulanması sonucu bozabilir, çünkü elektriksel etkiler aslında voltaj kontrollü olmayan ligand kapılı veya mekanosensitif iyon kanallarının kanal açılmasını etkileyebilir. Bu tür kanallara örnek olarak mitokondriyal protein translokazı TOM-CC27 ve kanal oluşturan alt birimi Tom40 26,44,45,46 verilebilir. Son olarak, membran proteinlerinin istenen işlevselliği elde etmek için belirli bir oryantasyonda DIB membranlarına yerleştirilmesinin zor olduğu ve nicel çalışmaların nadir olduğubelirtilmelidir 47,48. Bazı durumlarda, entegre proteinlerin oryantasyonu rastgeledir. Bu, membran proteinlerini incelemek için ciddi bir problemdir, çünkü bazı membran proteinleri membranın sadece bir tarafında aktive edilir.

TIRF mikroskopisi, düzlemsel destekli membranlardaki tek moleküllü olayları ele almak için güçlü bir yöntemdir49. Örnekler arasında α-hemolizin50, perfringolizin O 51 ve OmpG52 gibi kanal proteinlerinin montaj ve katlama yolunun aydınlatılması sayılabilir. Bu çalışmalar ek bir teknik olarak FRET'i içeriyordu. Ek olarak, mekanosensitif iyon kanalı MscL'nin aktivasyonu daha önce mevcut ölçümler kullanılarak desteklenen DIB çift katmanlı42'nin mekanik stimülasyonu ile incelenmiştir. Bu çalışmaya dayanarak, gelecekteki çalışmalar, burada açıklanan platformu, tek moleküllü seviyedeki mekanosensitif kanalları optik bir şekilde ele almak için tek moleküllü FRET deneyleriyle birleştirebilir17. Damlacık içine tampon enjeksiyonu, iç DIB tek katmanının gerilmesi veya bireysel kanalların altta yatan hidrojele hedeflenen bağlanması, sadece MscL ve MscS, iki gözenekli alan K + kanalları, TREK-1 için gösterildiği gibi membran gerginliğine ve / veya eğriliğine yanıt veren mekanik olarak aktive edilmiş kanalların fiziksel mekanizmasını daha fazla incelemek için kullanılabilir. TREK-2, TRAAK ve PIEZO (inceleme için, bkz.53), aynı zamanda dokunmaya duyarlı iyon kanalı NOMPC54,55 için gösterildiği gibi hücresel hücre iskeletine lokal bağlanma.

Disclosures

Çıkar çatışması olmadığını beyan ederiz.

Acknowledgments

Beate Nitschke'ye protein hazırlama konusundaki yardımları için ve Robin Ghosh, Michael Schweikert (Stuttgart) ve Maximilan Ulbrich'e (Freiburg) anlayışlı tartışmalar için teşekkür ederiz. Bu çalışma Stuttgart Araştırma Merkezi Sistem Biyolojisi (SRCSB) ve Baden Württemberg Vakfı'ndan (BiofMO-6'dan SN'ye) bir hibe ile desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850356C
100x Oil objective Apochromat N.A. 1.49 Nikon MRD01991 TIRF microscope 
10x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.25  Nikon Microscope to assess DIB membrane formation  
10x objective N.A. 0.25 Nikon MRL00102 TIRF microscope 
40x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.55 Nikon Microscope to assess DIB membrane formation  
488 nm laser, 100 mW   Visitron TIRF microscope 
Adhesive tape
Äkta pure   Cytiva Protein purification system
Bradford assay kit, Pierce Thermo Fisher  23236
CaCl2 Roth 5239.2
Chelax 100 resin Biorad 143-2832
Chloroform  Sigma-Aldrich MC1024452500
Dialysis cassettes Slide-A-Lyzer 20 k MWCO Thermo Fisher  87735
DIB chamber  Custom made PMMA chamber for DIB membranes
Digital power meter and energy console Thorlabs PM100D Laser power meter 
Dimethyl sulfoxide Roth  4720.1
Double distilled H2O
Eclipse TS 100 Hoffmann modulation contrast microscope  Nikon Microscope to assess DIB membrane formation  
EDTA Roth 8042.2
EMCCD camera iXon Ultra 897 Andor TIRF microscope 
Ethanol Sigma-Aldrich 32205-M
Fixed angle rotor Ti70 Beckman Coulter
Fluo-8, CalciFluorTM Santa Cruz Biotechnology SC-362561 Ca2+-sensitive dye
French press cell disruption homogenizer Igneus Igneus 40000 psi
GFP filter AHF Filter seeting used for excitation of DIB-membranes by epifluorescence with white light source 
Glass capillaries World Precision Instruments 4878
Glass coverslips 40 mm x 24 mm x 0.13 mm Roth 1870.2
Glycerol Roth 3783.2
Hamilton syringe 10 mL Roth X033.1
Hamilton syringe 100 mL Roth X049.1
Hamilton syringe 500 mL Roth EY49.1
Heating block  Eppendorf Thermomixer comfort
Heating plate Minitube  HT200
Hepes Roth  9205.3
Hexadcane Sigma-Aldrich 296317
His Trap HP 1 mL Cytiva 29051021 Ni-NTA column
Imidazole Sigma-Aldrich 1.04716.1000
KCl Honeywell 10314243
KLM spin coater  Schaefer Tec SCV-10
List medical L/M-3P-A vertical pipette puller Artisan Technology Group 57761-1
Low melting point agarose Sigma-Aldrich  A9414
M8 Stereomicroscope Wild Stereomicrosope 
Matlab  MathWorks R2022a
Methanol Sigma-Aldrich 34860
MicroFil pipette tips World Precision Instruments MF34G-5
N2 gas
NaCl Roth 3957.1
Nanoliter 2010 injector  World Precision Instruments Nanoliter 2010 
n-dodecyl-b-D-maltoside Glycon Biochemicals D97002-C
Ni-NTA agarose, non-crosslinked Cube Biotech 124115393 Custom made
NIS-Elements AR software Nikon MQS31100/MQS42560/MQS42580/MQS42780/MQS41930 Imaging software
n-octyl-polyoxyethylene Sigma-Aldrich 40530
O2 gas
Phenylmethylsulfonyl fluoride Roth  6367.3
Photodiode sensor  Si, 400 - 1100 nm, 500 mW Thorlabs S130C Sensor for laser power meter 
Plasma cleaner Diener Electronics Zepto
Preparative ultracentrifuge Optima Beckman Coulter
Quad-band TIRF-filter 446/523/600/677 HC AHF Filter setting used for excitation of DIB-membranes with 488 nm laser 
Resource Q 1 mL Cytiva 17117701 Anion exchange column
Silicon oil AR 20 Sigma-Aldrich 10836
Sodium dodecyl sulfate Roth 2326.2
Super LoLux camera JVC Stereomicrosope 
Thermoshaker Gerhardt THL 500/1
Ti-E Fluorescence microscope   Nikon MEA53100
Tris-HCl Sigma-Aldrich 9090.3
Tryptone Roth 8952.2
Ultrasonic bath  Bandelin Sonorex RK 100
Vaccum pump Vacuubrand MD 4C NT
White light source for epifluorescence illumination (100 W) Nikon MBF72655 TIRF microscope 
Yeast extract Roth 2363.2
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437 (7059), 656-663 (2005).
  2. Leptihn, S., et al. Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil. Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).
  3. Thompson, J. R., Heron, A. J., Santoso, Y., Wallace, M. I. Enhanced stability and fluidity in droplet on hydrogel bilayers for measuring membrane protein diffusion. Nano Letters. 7 (12), 3875-3878 (2007).
  4. Kusumi, A., et al. Paradigm shift of the plasma membrane concept from the two-dimensional continuum fluid to the partitioned fluid: high-speed single-molecule tracking of membrane molecules. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 34 (1), 351-378 (2005).
  5. Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems. Biophysical Journal. 60 (4), 910-921 (1991).
  6. Kusumi, A., Shirai, Y. M., Koyama-Honda, I., Suzuki, K. G. N., Fujiwara, T. K. Hierarchical organization of the plasma membrane: Investigations by single-molecule tracking vs. fluorescence correlation spectroscopy. FEBS Letters. 584 (9), 1814-1823 (2010).
  7. Betaneli, V., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy to examine protein-lipid interactions in membranes. Methods in Molecular Biology. 974, 253-278 (2013).
  8. Ando, T., et al. A high-speed atomic force microscope for studying biological macromolecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (22), 12468-12472 (2001).
  9. Casuso, I., et al. Characterization of the motion of membrane proteins using high-speed atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 7 (8), 525-529 (2012).
  10. Karner, A., et al. Tuning membrane protein mobility by confinement into nanodomains. Nature Nanotechnology. 12 (3), 260-266 (2017).
  11. Rajendran, L., Simons, K. Lipid rafts and membrane dynamics. Journal of Cell Science. 118 (6), 1099-1102 (2005).
  12. Schink, K. O., Tan, K. -W., Stenmark, H. Phosphoinositides in control of membrane dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), 143-171 (2016).
  13. Schafer, D. A. Coupling actin dynamics and membrane dynamics during endocytosis. Current Opinion in Cell Biology. 14 (1), 76-81 (2002).
  14. Lingwood, D., Ries, J., Schwille, P., Simons, K. Plasma membranes are poised for activation of raft phase coalescence at physiological temperature. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (29), 10005-10010 (2008).
  15. Engelman, D. M. Membranes are more mosaic than fluid. Nature. 438 (7068), 578-580 (2005).
  16. Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. The lateral organization and mobility of plasma membrane components. Cell. 177 (4), 806-819 (2019).
  17. Wang, S., et al. Spatiotemporal stop-and-go dynamics of the mitochondrial TOM core complex correlates with channel activity. Communications Biology. 5 (1), 471 (2022).
  18. Ide, T., Yanagida, T. An artificial lipid bilayer formed on an agarose-coated glass for simultaneous electrical and optical measurement of single ion channels. Biochemical and Biophysical Research Communications. 265 (2), 595-599 (1999).
  19. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid bilayer formation by contacting monolayers in a microfluidic device for membrane protein analysis. Analytical Chemistry. 78 (24), 8169-8174 (2006).
  20. Heron, A. J., Thompson, J. R., Mason, A. E., Wallace, M. I. Direct detection of membrane channels from gels using water-in-oil droplet bilayers. Journal of the American Chemical Society. 129 (51), 16042-16047 (2007).
  21. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. Molecular BioSystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  22. Huang, S., Romero-Ruiz, M., Castell, O. K., Bayley, H., Wallace, M. I. High-throughput optical sensing of nucleic acids in a nanopore array. Nature Nanotechnology. 10 (11), 986-991 (2015).
  23. Sackmann, E. Supported membranes: scientific and practical applications. Science. 271 (5245), 43-48 (1996).
  24. Kiessling, V., Yang, S. -T., Tamm, L. K. Supported lipid bilayers as models for studying membrane domains. Current Topics in Membranes. 75, 1-23 (2015).
  25. Murray, D. H., Tamm, L. K., Kiessling, V. Supported double membranes. Journal of Structural Biology. 168 (1), 183-189 (2009).
  26. Hill, K., et al. Tom40 forms the hydrophilic channel of the mitochondrial import pore for preproteins. Nature. 395 (6701), 516-521 (1998).
  27. Poynor, M., Eckert, R., Nussberger, S. Dynamics of the preprotein translocation channel of the outer membrane of mitochondria. Biophysical Journal. 95 (3), 1511-1522 (2008).
  28. Künkele, K. P., et al. The preprotein translocation channel of the outer membrane of mitochondria. Cell. 93 (6), 1009-1019 (1998).
  29. Ahting, U., et al. The TOM core complex: the general protein import pore of the outer membrane of mitochondria. The Journal of Cell Biology. 147 (5), 959-968 (1999).
  30. Bausewein, T., et al. Cryo-EM structure of the TOM core complex from Neurospora crassa. Cell. 170 (4), 693-700 (2017).
  31. Cowan, S. W., et al. Crystal structures explain functional properties of two E. coli porins. Nature. 358 (6389), 727-733 (1992).
  32. Bieligmeyer, M., et al. Reconstitution of the membrane protein OmpF into biomimetic block copolymer-phospholipid hybrid membranes. Beilstein Journal of Nanotechnology. 7, 881-892 (2016).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  34. Vicente, N. B., Zamboni, J. E. D., Adur, J. F., Paravani, E. V., Casco, V. H. Photobleaching correction in fluorescence microscopy images. Journal of Physics: Conference Series. 90 (1), 012068 (2007).
  35. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  36. Ershov, D., et al. TrackMate 7: integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines. Nature Methods. 19 (7), 829-832 (2022).
  37. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  38. Hirsch, M., Wareham, R. J., Martin-Fernandez, M. L., Hobson, M. P., Rolfe, D. J. A stochastic model for electron multiplication charge-coupled devices - From theory to practice. PLoS One. 8 (1), 53671 (2013).
  39. Bausewein, T., Naveed, H., Liang, J., Nussberger, S. The structure of the TOM core complex in the mitochondrial outer membrane. Biological Chemistry. 401 (6-7), 687-697 (2020).
  40. Lindsey, H., Petersen, N. O., Chan, S. I. Physicochemical characterization of 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine in model membrane systems. Biochimica et Biophysica Acta. 555 (1), 147-167 (1979).
  41. Manafirad, A. Single ion-channel analysis in droplet interface bilayer. Methods in Molecular Biology. 2186, 187-195 (2021).
  42. Rosholm, K. R., et al. Activation of the mechanosensitive ion channel MscL by mechanical stimulation of supported Droplet-Hydrogel bilayers. Scientific Reports. 7 (1), 45180 (2017).
  43. Wang, Y., et al. Electrode-free nanopore sensing by DiffusiOptoPhysiology. Science Advances. 5 (9), (2019).
  44. Ahting, U., et al. the pore-forming component of the protein-conducting TOM channel in the outer membrane of mitochondria. The Journal of Cell Biology. 153 (6), 1151-1160 (2001).
  45. Romero-Ruiz, M., Mahendran, K. R., Eckert, R., Winterhalter, M., Nussberger, S. Interactions of mitochondrial presequence peptides with the mitochondrial outer membrane preprotein translocase TOM. Biophysical Journal. 99 (3), 774-781 (2010).
  46. Kuszak, A. J., et al. Evidence of distinct channel conformations and substrate binding affinities for the mitochondrial outer membrane protein translocase pore Tom40. The Journal of Biological Chemistry. 290 (43), 26204-26217 (2015).
  47. Yanagisawa, M., Iwamoto, M., Kato, A., Yoshikawa, K., Oiki, S. Oriented reconstitution of a membrane protein in a giant unilamellar vesicle: Experimental verification with the potassium channel KcsA. Journal of the American Chemical Society. 133 (30), 11774-11779 (2011).
  48. Goers, R., et al. Optimized reconstitution of membrane proteins into synthetic membranes. Communications Chemistry. 1, 35 (2018).
  49. Castell, O. K., Dijkman, P. M., Wiseman, D. N., Goddard, A. D. Single molecule fluorescence for membrane proteins. Methods. 147, 221-228 (2018).
  50. Thompson, J. R., Cronin, B., Bayley, H., Wallace, M. I. Rapid assembly of a multimeric membrane protein pore. Biophysical Journal. 101 (11), 2679-2683 (2011).
  51. Senior, M. J. T., et al. Single-molecule tracking of perfringolysin O assembly and membrane insertion uncoupling. The FEBS Journal. , (2022).
  52. Weatherill, E. E., et al. Fast slow folding of an outer membrane porin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (20), 2121487119 (2022).
  53. Kefauver, J. M., Ward, A. B., Patapoutian, A. Discoveries in structure and physiology of mechanically activated ion channels. Nature. 587 (7835), 567-576 (2020).
  54. Yan, Z., et al. Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation. Nature. 493 (7431), 221-225 (2013).
  55. Wang, Y., et al. The push-to-open mechanism of the tethered mechanosensitive ion channel NompC. eLife. 10, 58388 (2021).

Tags

Biyokimya Sayı 192
Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu Kullanılarak Lipid Çift Katmanlarında Yanal Mobilite ve İyon Kanalı Aktivitesinin Tek Moleküllü Görüntülenmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, S., Nussberger, S.… More

Wang, S., Nussberger, S. Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy. J. Vis. Exp. (192), e64970, doi:10.3791/64970 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter