Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Enkeltmolekylavbildning av lateral mobilitet og ionkanalaktivitet i lipiddobbeltlag ved bruk av total intern refleksjonsfluorescens (TIRF) mikroskopi

Published: February 17, 2023 doi: 10.3791/64970
Automatic Translation
1, 1
1Biophysics Department, Institute of Biomaterials and Biomolecular Systems, University of Stuttgart

Summary

Denne protokollen beskriver hvordan man bruker TIRF-mikroskopi til å spore individuelle ionekanaler og bestemme deres aktivitet i støttede lipidmembraner, og derved definere samspillet mellom lateral membranbevegelse og kanalfunksjon. Den beskriver hvordan du klargjør membranene, registrerer dataene og analyserer resultatene.

Abstract

Høyoppløselige bildebehandlingsteknikker har vist at mange ionkanaler ikke er statiske, men underlagt svært dynamiske prosesser, inkludert forbigående forening av poredannende og hjelpeunderenheter, lateral diffussjon og klynging med andre proteiner. Forholdet mellom lateral diffusjon og funksjon er imidlertid dårlig forstått. For å nærme oss dette problemet beskriver vi hvordan lateral mobilitet og aktivitet av individuelle kanaler i støttede lipidmembraner kan overvåkes og korreleres ved hjelp av total intern refleksjonsfluorescens (TIRF) mikroskopi. Membraner fremstilles på et ultratynt hydrogelsubstrat ved hjelp av DIB-teknikken (Droplet Interface Bilayer). Sammenlignet med andre typer modellmembraner har disse membranene fordelen av å være mekanisk robuste og egnet for svært følsomme analytiske teknikker. Denne protokollen måler Ca 2+ ionfluks gjennom enkeltkanaler ved å observere fluorescensutslipp av et Ca2+-følsomt fargestoff i nærheten av membranen. I motsetning til klassiske enkeltmolekylære sporingsmetoder, er det ikke nødvendig med fluorescerende fusjonsproteiner eller etiketter, som kan forstyrre lateral bevegelse og funksjon i membranen. Mulige endringer i ioneflux assosiert med konformasjonsendringer av proteinet skyldes bare proteinlateral bevegelse i membranen. Representative resultater er vist ved bruk av mitokondrieproteintranslokasjonskanalen TOM-CC og bakteriekanalen OmpF. I motsetning til OmpF er gating av TOM-CC svært følsom for molekylær innesperring og arten av lateral diffusjon. Derfor er støttede dråpegrensesnitt dobbeltlag et kraftig verktøy for å karakterisere koblingen mellom lateral diffusjon og funksjonen til ionkanaler.

Introduction

Denne protokollen tar sikte på å beskrive hvordan man studerer korrelasjonen mellom membranmobilitet og ionekanalpermeabilitet av membranproteiner i polymerstøttede dråpegrensesnitt dobbeltlag (DIB) membraner 1,2,3.

Den nåværende teknikken utfyller et imponerende utvalg av avanserte optiske og overflateanalytiske verktøy, for eksempel enkeltpartikkelsporing4,5, fluorescenskorrelasjonsspektroskopi6,7 og høyhastighets atomkraftmikroskopi 8,9,10. Disse gir verdifull innsikt i membraners dynamiske sammensetning og struktur som påvirker membranbaserte reaksjoner11,12,13. Mens bevegelsen og lateral diffusjon av proteiner avhenger av den lokale tettheten av proteiner i membranen, kan individuelle proteinmolekyler også fanges i lipidflåter14 og ved protein-protein-interaksjoner15,16. Avhengig av proteindomenene som stikker ut fra membranen til det ekstracellulære miljøet eller cytosolen, kan proteinmobiliteten variere fra svært mobil til helt immobil. På grunn av membranens kompleksitet og dens perifere strukturer er det imidlertid ofte vanskelig å dechiffrere samspillet mellom arten av lateral mobilitet og proteinfunksjon17.

DIB-membraner har vist seg å være en effektiv plattform for biofysiske enkeltmolekylære analyser av membranproteiner 18,19,20,21,22. De dannes ved lipid selvmontering gjennom kontakt av vandige dråper med hydrogelstøttede substrater i en lipid / oljefase. I likhet med de ofte brukte støttede lipiddobbeltlagene (SLB)1,23,24,25, tillater DIB lokal innstilling av lateral mobilitet ved midlertidig eller permanent binding av proteiner til polymermatrisen når de funksjonaliseres med egnede ligander17. Sistnevnte kan tjene som et modellsystem for biokjemiske prosesser i cellemembraner med en heterogen proteinfordeling10.

Den eksperimentelle tilnærmingen beskrevet her er avhengig av fluorescensen av Ca 2+-følsomme fargestoffer for å måle Ca 2+ ionfluksen gjennom individuelle kanaler i nærheten av membranen 2,22 ved bruk av TIRF-mikroskopi. Denne optiske tilnærmingen begrenser belysningen av prøven til en avstand nær membranen, noe som på grunn av de fysiske egenskapene til det unnvikende eksitasjonslyset fører til en betydelig reduksjon av fluorescensbakgrunnen. Sistnevnte er en forutsetning dersom høy romlig og tidsmessig oppløsning er nødvendig for påvisning av enkeltmolekyler. I motsetning til klassiske elektrofysiologiske metoder26,27, kreves det ingen membranspenninger for å studere ionfluks gjennom individuelle kanaler. Videre krever metoden ikke merking med fluorescerende fargestoffer eller molekyler som kan forstyrre den laterale bevegelsen av kanalene i membranen.

Metoden er spesielt nyttig for å studere proteinkanaler innebygd i membranen på enkeltmolekylnivå uten å bruke klassisk elektrofysiologi. Ved å bruke mitokondriell proteinledende kanal TOM-CC fra Neurospora crassa28,29,30 og OmpF, som støtter diffusjonen av små hydrofile molekyler over den ytre membranen til Escherichia coli17,31, illustrerer vi hvordan membranmobilitetene og kanalaktivitetene til de to proteinene kan studeres og korreleres. Vi foreslår at denne tilnærmingen, selv om den er optimalisert for TOM-CC og OmpF, lett kan brukes på andre proteinkanaler.

Protocol

1. Proteinproduksjon

MERK: Dette avsnittet beskriver prosedyren for å isolere OmpF fra Escherichia coli BE BL21(DE3) omp631,32, som mangler lam og ompC, og TOM-kjernekompleks fra Neurospora crassa (figur 1)28,29. Sistnevnte krever mitokondrier isolert fra en N. crassa-stamme 28 som inneholder en 6xHis-merket form av TOM-subenheten Tom22 (figur 1A), som kan isoleres som beskrevet28. Følgende protokoller gir vanligvis 1-2 mg N. crassa TOM-CC og 10 mg E. coli OmpF. Hvis mengden skal justeres, er det viktig at forholdet mellom protein og vaskemiddel opprettholdes nøyaktig. Med mindre annet er spesifisert, skal alle trinn utføres ved 4 °C.

  1. Isolering av TOM-kjernekompleks
    1. Løselig renset N. crassa mitokondrier (2 g protein) oppnådd ved differensiell sedimentering fra ca. 1,5 kg (våtvekt) hyfer, ifølge Bausewein et al.30, ved en proteinkonsentrasjon på 10 mg / ml i 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 1% (w / v) DDM, 20% (v / v) glyserol, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol og 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) i 30 minutter ved 4 ° C.
      FORSIKTIG: PMSF er giftig. Bruk egnet personlig verneutstyr.
    2. Overfør de oppløselige mitokondriene til ultrasentrifugerør og separer de ikke-oppløselige membranene fra oppløselige membranproteiner ved ultrasentrifugering ved 130 000 x g i 40 minutter ved 4 ° C og filtrering med filterpapir av standardkvalitet.
    3. Balansere en ferdigpakket Ni-NTA-kolonne (volum på 5 ml) med ca. 5 kolonnevolum (CV) buffer A1 (tabell 1) ved hjelp av et automatisert proteinrensesystem. Kjør Ni-NTA-kolonnen med en konstant strømningshastighet på 1 ml/min under alle trinn. Bruk en kolonne med lavere volum (1 ml) hvis proteinene er isolert fra mindre enn 2 g mitokondrier.
    4. Legg den løselige proteinprøven på Ni-NTA-kolonnen med en strømningshastighet på 1 ml / min.
    5. Vask Ni-NTA-kolonnen med 5 CV buffer A1 (tabell 1) for å fjerne ubundne proteiner.
    6. Elute His-tagged TOM-CC med 30 % buffer A2 (tabell 1; 300 mM imidazol) og samle proteintoppen slik den vises i 280 nm kromatogrammet (figur 1B).
    7. For ytterligere rensing av TOM-CC, øk den ferdigpakkede anionbyttekolonnen (1 ml) med 5 CV hver av buffer B1, B2 og B1 (tabell 1) ved hjelp av det automatiserte proteinrensesystemet. Kjør anionbyttekolonnen med en konstant strømningshastighet på 1 ml/min under alle trinn.
    8. Legg TOM-CC-toppfraksjonen (trinn 1.1.6) på anionbyttekolonnen (strømningshastighet på 1 ml/min).
    9. Fjern de ubundne proteinene ved å vaske kolonnen med 5 CV buffer B1 (tabell 1) og en lineær saltgradient på 0%-20% buffer B2 (tabell 1).
    10. Elute TOM-CC med en lineær saltgradient på 20%-35% buffer B2, og samle proteinmaksfraksjonen slik den vises i 280 nm kromatogrammet (figur 1C).
    11. Vurder prøvens renhet ved SDS-PAGE (figur 1D) og bestem proteinkonsentrasjonen ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig proteinanalyse, i henhold til produsentens protokoll (se materialtabell).
    12. Frys ned proteinprøvene i flytende nitrogen og oppbevar dem ved -80 °C inntil videre bruk.
      FORSIKTIG: Flytende nitrogen bør håndteres i godt ventilerte områder. Bruk egnet personlig verneutstyr.
       
  2. Isolering av OmpF
    1. Gjenopprett E. coli-stammen BE BL21(DE3) omp6, som mangler lam og OmpC32, fra en frossen glyserolbestand under sterile forhold, og strek på en Luria-Bertani (LB) agarplate (tabell 2). For å gjøre dette, spred prøven gradvis jevnt over hele platen.
    2. La prøven trekke inn i agaren i 5 minutter, før den snus platen med lokket lukket og ruges over natten ved 37 °C.
    3. Velg en enkelt E. coli-koloni , inokuler 7,5 ml LB-medium (tabell 2) med denne ene kolonien ved hjelp av en steril tannpirker, og la den vokse over natten (14 timer) med omrøring (170 o / min) ved 37 ° C.
    4. Overfør 2 x 1 ml E. coli-celler med sterile pipetter til 2 x 500 ml LB-medium (tabell 2), og la det vokse over natten (~14 timer) ved 37 °C med omrøring (~170 rpm) i en shaker.
    5. Høst cellene ved sentrifugering ved 5000 x g i 20 minutter ved 4 °C, frys pelleten i flytende nitrogen og oppbevar ved -80 °C inntil videre bruk.
      MERK: Den våte vekten av cellepelleten er vanligvis 5 g per 1 liter kultur. På dette tidspunktet kan protokollen settes på pause.
    6. Tine og resuspendere cellene (2 g) i 20 ml lysisbuffer C1 (tabell 2), og før suspensjonen tre ganger ved 1000 psi gjennom et forkjølt (4 °C) høytrykkscelleforstyrrelsessystem, med et maksimalt prøvevolum på 35 ml, i henhold til produsentens instruksjoner.
      FORSIKTIG: Bruk av fransk presse kan føre til alvorlige skader. Overskrid aldri trykkgrensen for cellen som brukes. Bruk egnet personlig verneutstyr.
    7. Fjern ubrutte celler fra lysatet ved sentrifugering ved 4000 x g i 15 minutter, og samle supernatanten.
    8. Samle membranene ved ultrasentrifugering ved 100.000 x g i 1 time.
    9. Resuspender membranpelleten i 10 ml buffer C2 (tabell 2), og bland med et likt volum SDS-buffer C3 (tabell 2) ved bruk av en kulelagerglasshomogenisator.
      FORSIKTIG: β-merkaptoetanol i buffer C3 er giftig. Følg alle relevante sikkerhetsforskrifter.
    10. Inkuber suspensjonen i et vannbad ved 50 °C i 30 minutter.
    11. Sentrifuger prøven ved 100 000 x g ved 20 °C i 1 time.
    12. Resuspender membranpelleten i 10 ml SDS-buffer C4 (tabell 2) ved hjelp av en kulelagerglasshomogenisator, og inkuber suspensjonen i et vannbad ved 37 °C i 30 minutter.
      MERK: Hvis pelleten ikke kan resuspenderes, tilsett mer SDS-buffer C4 opp til et volum på 20 ml.
    13. Sentrifuger prøven ved 100 000 x g ved 20 °C i 30 minutter, og samle supernatanten.
    14. Bland supernatanten med oktylpolyoksyetylen (oktyl-POE) til en endelig vaskemiddelkonsentrasjon på 0,5 % (w/v), og dialyser prøven to ganger mot buffer C5 (tabell 2) ved 4 °C i 24 timer. Til dette formål, bruk dialyseslanger med en avskjæring på 20 kDa, i henhold til produsentens instruksjoner, og plasser prøven i dialyseslangen eller enheten.
      MERK: Avskjæringen av dialyseslangen må justeres dersom proteiner med andre molekylmasser blir dialysert.
    15. Vurder prøvens renhet ved SDS-PAGE og bestem proteinkonsentrasjonen ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig proteinanalyse, i henhold til produsentens protokoll (materialfortegnelse).
      MERK: Prøver oppvarmet til 95 °C viser monomer OmpF. Prøver som ikke er oppvarmet, viser OmpF i trimerisk form (figur 1F).
    16. Sjokkfrys dialysert OmpF i alikoter i flytende nitrogen, og oppbevares ved -20 °C inntil videre bruk.
      FORSIKTIG: Flytende nitrogen bør håndteres i godt ventilerte områder. Bruk egnet personlig verneutstyr.

2. Optisk enkanalsopptak av ionekanaler i DIB-membraner

MERK: Denne delen beskriver prosedyren for fremstilling av DIB-membraner i mikrofabrikerte polymetylmetakrylatkamre (PMMA) 2 for å overvåke lateral proteinbevegelse og ioneflux gjennom enkeltionkanaler17. Dimensjonene og de nøyaktige tegningene for fremstilling av kammeret finnes i Lepthin et al.2. Figur 2 gir en oversikt over monteringen av PMMA-kammeret2 og dannelsen av DIB-membranene. Med mindre annet er spesifisert, utføres alle trinn ved romtemperatur (RT). Figur 3 viser en skjematisk fremstilling av en DIB-membran og hvordan Ca2+-fluks gjennom et enkeltkanalprotein brukes til å overvåke både bevegelse i membranen og kanalens åpne-lukkede tilstand.

  1. Fremstilling av lipider
    1. Fjern lipidstamoppløsningen inneholdende 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (25 mg/ml DPhPC) oppløst i kloroform fra fryseren ved -20 °C, og varm til RT. For dette formålet er det vanligvis tilstrekkelig å varme opp prøven sakte for hånd i noen minutter.
      FORSIKTIG: Kloroform er giftig. Bruk egnet personlig verneutstyr og utfør alle prosedyrer som involverer kloroform under en avtrekkshette.
    2. Overfør 380 mikrol DPhPC stamløsning (25 mg/ml DPhPC) til et hetteglass. Unngå pipetter med gummipakninger. Bruk i stedet sprøyter i mikroliter glass med stempler i rustfritt stål.
    3. Etter håndtering av lipidstamløsningen, overlegg lipidstamløsningen med Ar- ellerN2-gass for å forhindre lipidoksidasjon. Bruk lavest mulig gasstrøm for å unngå fordampning av det organiske løsningsmidlet der lipidene er oppløst eller sprut av løsningsmiddelsprayene fra hetteglasset. Forsikre deg om at lokkene på hetteglassene med lipider med organisk oppløsningsmiddel er belagt med polytetrafluoretylen (PTFE) på innsiden.
    4. Tørk lipidprøven (trinn 2.1.2) under en strøm av N 2, og fjern det gjenværende organiske løsningsmidlet fra lipidprøven over natten under vakuum (2,0 mbar) ved hjelp av en oljefri vakuumpumpe.
    5. Løs opp lipidfilmen i heksadekan/silikonoljeløsning ved å tilsette like store mengder heksadekan og silikonolje (500 μL hver) ved hjelp av en mikroliter glasssprøyte til en endelig lipidkonsentrasjon på 9,5 mg/ml.
      MERK: Lipidoppløsningen er stabil ved RT i flere uker.
  2. Fremstilling av agarosehydrogel
    1. Forbered ca. 1 ml lavsmeltende agaroseoppløsning (0,75 % [w/v]) i dobbelt avionisert vann, og varm opp til 85 °C i en varmeblokk i 20 minutter som skal brukes til spinnbelegg av glassdeksler.
      MERK: Agaroseoppløsningen kan oppbevares på RT i flere uker og kan varmes opp flere ganger.
    2. Forbered lavsmeltende 2,5 % (w/v) agaroseoppløsning i 0,66 M CaCl 2 og 8,8 mM HEPES (pH7,2 ), og varm opp til 85 °C i en varmeblokk i 20 minutter. Pass på at agarosen er godt smeltet.
      MERK: Agaroseoppløsningen kan oppbevares i flere uker ved RT og kan varmes opp flere ganger, akkurat som agarose (trinn 2.2.1) som brukes til spinnbelegg.
  3. Kammermontering av polymetylmetakrylat (PMMA) og dannelse av lipidmonolag ved hydrogelheksadekan/silikonoljegrensesnittet
    1. Plasser noen glassdeksler (40 mm x 24 mm x 0,13 mm) i en dekselholder i rustfritt stål, og rengjør dem i et glassbeger i 10 minutter med aceton i en ultralydrenser. Bruk akkurat nok aceton til å senke dekslene og dekke begeret løst med en glassplate for å skape et trykkløst, lukket system som minimerer rømning av damp under rengjøringsprosessen.
      FORSIKTIG: Aceton er et svært brannfarlig løsningsmiddel med lavt flammepunkt. Damp/luft-blandinger er eksplosive. Bruk ultralydrenseren i et godt ventilert område. Bruk egnet personlig verneutstyr og følg offisielle sikkerhetsregler (f.eks. ingen åpen ild og ingen gnister).
    2. Skyll glassdekslene med dobbeltavionisert vann og tørk dem under en strøm av N2.
      MERK: Coverslips rengjort på denne måten kan lagres i flere uker.
    3. Rengjør og hydrofiliser et deksel i en plasmarenser med oksygen (0,5 mbar) i 5 minutter.
      MERK: Utfør dette trinnet umiddelbart før spinnbelegg med agaroseoppløsning, da den hydrofile effekten av plasmarengjøring slites av over tid.
    4. Monter en plasmabehandlet dekselseddel på en sentrifugering (figur 2, trinn 1).
    5. Belegg dekselet med en submikrometer tykk film av agarose ved sakte å tilsette 140 μL oppvarmet 0,75 % (w / v) lavsmeltende agarose (trinn 2.2.1) ved 3000 o / min i 30 s, ved hjelp av en 200 μL pipette (figur 2, trinn 1).
      MERK: Tykkelsen på agarosefilmen kan bestemmes ved atomkraftmikroskopi (AFM), som beskrevet17.
    6. Fest umiddelbart det spinnbelagte dekselet med det tynne laget av agarosehydrogelen på undersiden av PMMA-kammeret2. Sørg for at agarosehydrogelen peker oppover (figur 2, trinn 2).
    7. Fest kantene på dekselet til PMMA-mikromaskinert enhet med gjennomsiktig tape.
    8. Plasser PMMA-enheten på en kokeplate oppvarmet til 35 °C (figur 2, trinn 3).
    9. Hell forsiktig 200 μL 2,5% agaroseoppløsning (trinn 2.2.2) i innløpet av kammeret med en pipette (figur 2, trinn 3), uten å skape luftbobler, slik at den tynne hydrogelen påført av spinnbelegg kan balansere med bufferen til 2,5% agaroseoppløsningen og forbli hydrert. Sørg for at 2,5% agaroseoppløsningen spres rundt den spinnbelagte agarosehydrogelen, men ikke over den (figur 3A), noe som kan unngås ved å trykke PMMA-kammeret forsiktig på varmeplaten.
    10. Dekk umiddelbart brønnene i PMMA-kammeret (figur 2, trinn 4) med totalt 60 μL lipid/oljeløsning (trinn 2.1.5), for å initiere lipidmonolagsdannelse ved agaroseoljegrensesnittet og for å unngå dehydrering av den spinnbelagte agarose i brønnene i PMMA-kammeret. Hold apparatet på en kokeplate ved 35 °C i ca. 2 timer.
      MERK: De sirkulære brønnene i PMMA-kammeret har en diameter på 0,5 mm og en dybde på 1,8 mm, ifølge tidligere publisert arbeid2.
  4. Fremstilling av lipidbelagte vandige dråper i heksadekan/silikonoljeoppløsning
    1. Plasser 20 μL lipidheksadekan/silikonoljeløsning (trinn 2.1.5) til hver av flere mikrofabrikerte brønner i et dråpeinkubasjonskammer (figur 2, trinn 4). Egnede beholdere for lipidheksadekan/silikonoljeløsning er små utsparinger på 40 mm x 30 mm x 3,5 mm i en tynn PMMA-plate2.
    2. Klargjør en mikrokapillær glassnål med en spissåpningsdiameter på 20 μm ved hjelp av en vertikal eller horisontal mikropipetteavtrekker (f.eks. brukt til å lage lappepipetter eller skarpe glasselektroder). Beregn åpningsdiameteren til den mikrokapillære glassnålen under et kikkertstereomikroskop ved lav forstørrelse, i et zoomområde mellom 7,5x og 35x.
      NOTAT: Innstillingene for forvarmingsmodus før glasskapillæren trekkes, oppvarmingsmodus for trekking og trekkraft bør bestemmes eksperimentelt på forhånd, i henhold til produsentens spesifikasjoner for trekkanordningen og typen kapillær.
    3. Fyll den mikrokapillære glasskanylen med 5 μL vandig injeksjonsoppløsning inneholdende 8,8 mM HEPES (pH 7,2), 7 μM Fluo-8, 400 μM EDTA, 1,32 M KCl og 30 nM TOM kjernekompleks, eller alternativt 20 nM OmpF ved bruk av en mikrokapillær pipettespiss. Bruk bare dobbeltdestillert vann som tidligere er behandlet med en chelaterende harpiks som binder multivalente metallioner (Ca2+) for å fremstille den vandige injeksjonsoppløsningen.
    4. Monter mikrokapillærglassnålen med den vandige injeksjonsløsningen på en piezodrevet nanoinjektor.
    5. Injiser 100-200 nL vandige dråper (figur 2, trinn 4) inneholdende 8,8 mM HEPES (pH 7,2), 7 μM Fluo-8, 400 μM EDTA, 1,32 M KCl og 30 nM TOM kjernekompleks (trinn 1.1.12), eller alternativt 20 nM OmpF (trinn 1.2.16) i brønnene i dråpeinkubasjonskammeret fylt med lipidheksadekan / silikonoljeløsning (se 2.1.5) ved hjelp av nanoinjektoren. Pass på at dråpene ikke berører hverandre ved å plassere dem flere millimeter (>10 mm) fra hverandre i brønnene. Ellers, hvis lipidmonolag ennå ikke har dannet seg ved olje / buffergrensesnittet, vil de fusjonere til større dråper.
      MERK: Hvis ingen klassekapillærer og ingen nanoinjektorer er tilgjengelige, kan dråpene alternativt fremstilles manuelt med enkanals mikroliterpipetter for volumer mellom 0,1 μL og 0,5 μL, som beskrevet2. I dette tilfellet er imidlertid dråpevolumene ikke like nøyaktige.
    6. Tillat dannelsen av et lipidmonolag ved dråpe-/oljegrensesnittet i ca. 2 timer ved å opprettholde PMMA- og dråpeinkubasjonskamrene (figur 2, trinn 4) på en kokeplate oppvarmet til 35 °C.
  5. Fremstilling og avbildning av enkeltionekanaler i DIB-membraner
    1. Overfør manuelt individuelle vandige dråper fra brønnene i dråpeinkubasjonskammeret under et stereomikroskop til brønnene i PMMA-kammeret (figur 2, trinn 5), ved bruk av en enkeltkanals mikroliterpipette med en 10 μL engangspolypropylenspiss. La dråpene synke ned på lipidmonolagene dannet ved hydrogel-oljegrensesnittene i ca. 5 minutter for å danne et lipid-dobbeltlag (figur 3) mellom dråpene og agarosehydrogelen.
    2. Monter PMMA-kammeret med DIB-membraner på prøveholderen til et invertert lysmikroskop og vurder membrandannelsen ved hjelp av et 10x Hoffman-modulasjonskontrastmål (figur 2, trinn 6). DIB-membrandannelse indikeres av en klar hvit ring ved grenseflaten mellom dråpen og hydrogelen (figur 4A). DIB-membraner som er brukket, viser ikke denne ringen (figur 4B).
      MERK: Alternativt kan DIB-membranene visualiseres ved 10x forstørrelse ved fasekontrast eller differensiell interferenskontrast (DIC) mikroskopi.
    3. Hvis DIB-membraner har dannet seg, monter PMMA-kammeret på prøveholderen til et TIRF-mikroskop (figur 2, trinn 7) utstyrt med en konvensjonell lyskilde for epifluorescensbelysning, en 488 nm laser (Pmax = 100 mW) og et bakbelyst elektronmultipliserende CCD-kamera (512 x 512 piksler; >95% QE) for å oppnå en pikselstørrelse på ~ 0,16 μm.
    4. Fokuser kanten av en DIB-membran med et 10x forstørrelsesmål under epifluorescensbelysning med en høyintensiv lyskilde ved hjelp av et GFP-filtersett.
    5. Fin fokus på samme kant av DIB-membranen ved høy forstørrelse med et 100x / N.A. 1.49 apokromatolje TIRF-mål, igjen under epifluorescensbelysning, med høyintensitetslyskilden ved hjelp av et GFP-filtersett som gjør det mulig å visualisere svak bakgrunnsfluorescens av fluorescerende fargestoff Fluo-8 i dråpen (figur 4C).
    6. Endre filterinnstillingen fra GFP til quad-band TIRF-filtersettet.
    7. Slå på 488 nm laser og sett intensiteten til laseren på objektivlinsen til en verdi mellom 8 mW og 10 mW.
      MERK: Siden det ofte ikke er kvantitativ informasjon om laserintensiteten ved objektivlinsen, bør laserintensitetsinnstillingene kalibreres på forhånd i separate målinger på objektivet, med en optisk laserstrømmåler utstyrt med en fotodiodesensor, i henhold til produsentens spesifikasjoner.
      FORSIKTIG: For å sikre sikker bruk av laseren, må operatøren være oppmerksom på de mulige farene ved laserstråling og ulykkesforebyggende forskrifter.
    8. For å visualisere enkeltionkanaler, juster TIRF-vinkelen og EMCCD-kameraforsterkningen (f.eks. EM-forsterkningsmultiplikatorinnstilling: 285) slik at åpne ionekanaler i DIB-membranen vises som fluorescerende flekker med høy kontrast på mørk bakgrunn (figur 4D-G), og signal-til-bakgrunn-forholdet, når det visuelt inspiseres, når et maksimum. Sørg for at flekkene, tilsvarende Ca2+-fluks gjennom enkeltionekanaler, forblir i fokus og har en rund form, med høy intensitet i midten og gradvis avtagende mot periferien. Membraner uten kanaler viser bare bakgrunnsfluorescens (figur 4C).
    9. Før du registrerer bevegelsen og den åpne-lukkede aktiviteten til de enkelte kanalene over tid, må du kontrollere at fluorescerende flekker er i fokus, for å sikre at ionekanalene har rekonstituert seg i DIB-membranene og beveger seg lateralt i membranplanet. Hvis dette ikke er tilfelle, kan det indikere at et fluorescerende molekyl dypper inn og ut av det unnvikende feltet som genereres av laseren nær membranen.
    10. Ta opp en serie membranbilder som muliggjør riktig sporing av posisjonen og overvåking av den åpne-lukkede tilstanden til de enkelte ionkanaler. For å bestemme typen lateral mobilitet (f.eks. fri bevegelse vs forbigående forankring [for referanse, se16]) og tilstanden til kanalaktiviteten (f.eks. åpen eller lukket), oppnå tilstrekkelig lange (f.eks. 30 s til 1 min) og godt samplede baner (f.eks. bildefrekvens på 48 s-1).
      MERK: Observasjon av kanalisert, begrenset eller hoppdiffusjon16 krever at prøvetakingshastigheten er tilstrekkelig rask til å måle ubegrenset diffusjon innenfor begrensede grenser. I tillegg må du sørge for at dataprøvetakingstiden er tilstrekkelig lang til å måle overgangen fra ubegrenset til begrenset diffusjon (for detaljer, se Jacobson et al.16).
  6. Bilde- og databehandling
    MERK: Bildebehandlingspakker med åpen kildekode33 eller selvskrevne rutiner17 basert på kommersielle programvarepakker kan brukes til å analysere den spatiotemporale dynamikken til individuelle ionkanaler i DIB. For å kunne korrelere lateral membranmobilitet med ionefluksen gjennom de enkelte kanalene, bør ingen filteralgoritmer brukes.
    1. Korrigere bildetidsserier for bleking ved å bruke standardprosedyrer34 ved hjelp av selvskrevne rutiner, ved å tilpasse den gjennomsnittlige bildeintensiteten Equation 1 til hele bildet til Equation 2, der t er rammeindeksen (tid) og enker tilpasningsparametrene. Korriger deretter tidsserien i henhold til Equation 3, der I(t) er intensiteten. Alternativt, for innledende dataanalyser, kan du utføre bakgrunnskorrigeringer ved å bruke åpen kildekode-programvare med implementerte rulleballalgoritmer33 og en rulleballradius, avhengig av kameraets spot og pikselstørrelse (f.eks. 50 piksler).
    2. Bestem de romlige posisjonene og amplitudene til et fluorescenspunkt innenfor et definert interesseområde (ROI) (f.eks. 30 x 30 piksler), ved å tilpasse I (t) på et gitt tidspunkt t til en todimensjonal gaussisk funksjon med plan tilt som tar hensyn til mulige lokale belysningsgradienter i henhold til Equation 4. Her er x = (x, y) avkastningen med fluorescensintensitetsinformasjonen, A og σ er amplituden og bredden til Gaussian, pk er parametere som karakteriserer bakgrunnsintensiteten til avkastningen, og μ = (x 0, y 0) definerer posisjonen til Gaussian. Ionstrømmen gjennom en enkelt kanal er gitt ved parameteren A. Kanalens bane er gitt av x, og gjør det mulig å bestemme kanalens laterale mobilitet. Alternativt er det mulig å bestemme posisjonene og intensitetene til individuelle flekker ved hjelp av åpen kildekode-plattformer33 og plugin-moduler som beskrevet35,36. Beregn posisjonsnøyaktigheten37 etter konvertering av EMCCD-kameraavlesningen til fotonnummer38.
    3. Plott fluorescensamplituden A versus tiden og den tilsvarende banen x for å bestemme en mulig korrelasjon mellom kanaldiffusiviteten og ionefluksen gjennom kanalen. Utfør dette med hvilken som helst grafikkprogramvare. Ved fri lateral kanalbevegelse, bestem lateral diffusjonskoeffisient D ved lineær regresjon av tidsforsinkelsen τ, og beregne gjennomsnittlig kvadratforskyvning av flekkene fra x i henhold til Equation 5.
      MERK: Typiske diffusjonskoeffisienter17 for TOM-CC og OmpF beveger seg fritt i DIB-membraner mellom 0,5 og 1,5 μm2 s-1. Molekyler hvis diffusjonskonstant er mindre enn 0,01 mm2 · s-1 er definert som immobilisert17.

Representative Results

Sanntids elektrodefritt optisk enkeltkanalsopptak avslører samspillet mellom lateral proteinbevegelse og funksjonen til individuelle ionekanaler i DIB-membraner. Rekonstituering av det mitokondrielle TOM-kjernekomplekset (figur 1A) til en DIB-membran (figur 4D) illustrerer en sterk tidsmessig korrelasjon mellom lateral mobilitet og ionepermeabilitet (figur 5A). TOM-CC-gatingen ser ut til å være følsom for modusen for lateral bevegelse17. Bevegelige kanaler viser Ca2+ fluks gjennom porene og høy fluorescenspunktintensitet. Fangede, ikke-bevegelige molekyler viser lav og middels fluorescensintensitet. For den generelle proteinimportporen til mitokondriene TOM-CC avslørte denne enkeltmolekyltilnærmingen en sterk tidsmessig korrelasjon mellom lateral mobilitet og ionepermeabilitet, noe som tyder på at TOM-CC-kanalen har mekanosensitive egenskaper17. En lateral stopp av fritt bevegelige TOM-CC-molekyler ledsages av en delvis eller fullstendig lukking av TOM-CC-kanalen. Imaging DIB-membraner med OmpF (figur 1E og figur 4F), som er nesten helt innebygd i membranen, viser ingen stop-and-go-effekter (figur 5B). Tilfeldige stopp av OmpF er ikke forbundet med endring i intensitet og dermed med lukking av porene. Basert på fluorescenssignalene38 kan posisjonsnøyaktigheten til de enkelte kanalene estimeres i området mellom 5 og 10 nm. Det skal imidlertid bemerkes at denne nøyaktigheten ikke kan oppnås hvis kanalene vingler litt på grunn av mobil forankring med agarosehydrogelen, som for eksempel vist for TOM-CC-molekylene i en mellomtilstand med en rotmiddelforskyvning på 120 nm (figur 5A).

Figure 1
Figur 1: Isolering av TOM-CC. (A) Cryo EM-struktur av N. crassa TOM-CC30,39. Mitokondrier fra en N. crassa-stamme inneholdende en Tom22 med 6x-kode ble solubilisert i DDM og utsatt for Ni-NTA affinitetskromatografi (B) og anionbyttekromatografi (C). (D) SDS-PAGE av isolert TOM-CC. (E) Krystallstruktur (PDB, 1OPF) og (F) SDS-SIDE av renset E. coli OmpF. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Flytdiagram over PMMA-kammermontering. Trinn 1: Et glassdeksel er spinnbelagt med en agarosehydrogel. Trinn 2: Det spinnbelagte dekselet er montert i et skreddersydd PMMA-mikroskopikammer. Trinn 3: Ytterligere agarose med lav smelte tilsettes innløpsporten i PMMA-kammeret på en kokeplate på 35 °C. Trinn 4: Lipidmonolag dannes rundt vandige dråper ved et buffer / oljegrensesnitt (venstre) og på agarosehydrogel / oljegrensesnittet (høyre). Trinn 5: Individuelle vandige dråper pipetteres inn i brønnene i PMMA-kammeret for å danne et lipid-dobbeltlag ved kontakt av de to lipidmonolagene. Trinn 6: Dannelsen av DIB-membranene valideres ved hjelp av Hofmann-modulasjonskontrastmikroskopi. Trinn 7: Bilder av utvalgte områder av DIB-membranene med innsatte ionekanaler tas ved TIRF-mikroskopi. Grønn: 0,75% agarose; gul: 2,5% agarose som inneholder Ca2+ ioner; magenta: lipid / olje fase; mørk blå: vandig dråpebuffer inneholdende Ca2+-følsomt fargestoff og protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Eksperimentelt oppsett. (A) Skjematisk fremstilling av en DIB-membran i en PMMA-brønn. Dobbeltlaget hviler på en ultratynn 0,75% agarosefilm for å tillate TIRF-avbildning av Ca 2+-fluks gjennom en ionkanal over tid ved bruk av et Ca2+-følsomt fluorescensfargestoff (Fluo-8) i trans. (B) Ca2 +-fluksen styres utelukkende av det osmotiske trykket fra cis til trans. Dette tillater både bestemmelse av posisjonen i membranen og kanalens åpne lukkede tilstand. Kanalen vist her er den proteinledende kanalen TOM-CC av N. crassa mitokondrier30. (C) Banen til en enkelt TOM-CC-kanal. Grønn: bevegelig kanal; gul: ikke-bevegelig kanal. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Avbildning av TOM-CC og OmpF i DIB-membraner . (A) DIB-membran avbildet av Hoffmann-modulasjonskontrastmikroskopi som viser tolagskontaktområdet mellom hydrogelen og dråpen. (B) Ødelagt DIB-membran avbildet som i (A). Pil, kanten av PMMA-kammeret. (C) DIB-membran avbildet ved TIRF-mikroskopi uten proteinkanaler. (D) DIB-membran med rekonstituert TOM-CC, fotografert ved TIRF-mikroskopi. De hvite firkantene markerer flekker med høy (SH), mellomliggende (SI) og lav (SL) intensitet. (E) Montering av fluorescensintensitetsprofilen til de tre flekkene merket i (A) til todimensjonale gaussiske funksjoner avslører posisjonen til individuelle TOM-CCs og Ca2+ -fluksen gjennom kanalen. (F) DIB membran med rekonstituert OmpF. (G) Gaussisk passform av fluorescerende flekk merket i (F). I motsetning til det to-pore β-fat proteinkomplekset TOM-CC, avslører den tre-pore β-fat OmpF bare en permeabilitetstilstand. Pikselstørrelse, 0,16 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Kanalaktivitet korrelerer med lateral mobilitet av TOM-CC. (A) Det fluorescerende amplitudesporet (øverst) og den tilsvarende banen (bunnen) til TOM-CC indikerer at den åpne-lukkede kanalaktiviteten til TOM-CC korrelerer med kompleksets laterale membranmobilitet. Banen viser tre permeabilitetstilstander. Grønn: helt åpen tilstand; gul: mellomliggende permeabilitetstilstand; rød: lukket kanaltilstand; rød stjerne: TOM-CC i mellomtilstanden vingler rundt sin gjennomsnittlige posisjon med ca. ±60 nm. Posisjonsnøyaktighetene37 basert på fluorescenssignalene i helt åpne og mellomliggende tilstander varierer mellom 5 nm og 10 nm. (B) Fluorescerende amplitudespor (øverst) og tilsvarende bane (bunn) av OmpF. OmpF avslører bare ett intensitetsnivå, uansett om det er i bevegelse eller fanget. Banesegmentene som tilsvarer tidsperiodene for fangede molekyler er merket med grått. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Buffer  Reagenskonsentrasjoner Volum
A1* 20 mM Tris-HCl pH 8,5, 0,1 % (w/v) n-dodecyl-β-D-maltosid (DDM), 10 % (v/v) glyserol, 300 mM NaCl og 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) 100 ml
A2* 20 mM Tris-HCl pH 8,5, 0,1 % (w/v) DDM, 10 % (v/v) glyserol, 1 M imidazol og 1 mM PMSF 100 ml
B1* 20 mM HEPES pH 7,2, 0,1 % (w/v) DDM, 2 % (v/v) dimetylsulfoksid (DMSO) 100 ml
B2* 20 mM HEPES pH 7,2, 0,1 % (w/v) DDM, 1 M KCl, 2 % (v/v) dimetylsulfoksid (DMSO) 100 ml
* Degas og pass gjennom et 0,22 μm filter før bruk.

Tabell 1: Bufferløsninger for TOM-CC-isolasjon.

Buffer  Reagenskonsentrasjoner Volum
LB* 1 % (w/v) trypton, 1 % (w/v) NaCl og 0,5 % (w/v) gjærekstrakt 1100 ml
C1 2 mM MgCl2 og ~750 enheter DNAse og 50 mM Tris-HCl pH 7,5 20 ml
C2 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 50 ml
C3 4 % (w/v) natriumdodecylsulfat (SDS), 2 mM β-merkaptoetanol og 50 mM Tris-HCl pH 7,5 50 ml
C4 2 % (w/v) SDS, 500 mM NaCl og 50 mM Tris-HCl pH 7,5 50 ml
C5 0,5 % (w/v) oktylpolyoksyetylen (oktyl POE), 1 mM EDTA og 20 mM Tris pH 8,5 1000 ml
* Steriliser før bruk.

Tabell 2: Bufferløsninger for OmpF-isolasjon.

Discussion

Protokollen som presenteres her gir en innføring i bruk av DIB-membraner for å studere samspillet mellom lateral ionekanalbevegelse og kanalfunksjon ved hjelp av enkeltmolekylær TIRF-mikroskopi. For å få best mulig data er fremstilling av stabile DIB-membraner med flest mulig godt separerte kanaler avgjørende for å oppnå tidsserier av enkeltpartikler, som kan analyseres tilfredsstillende.

Kritiske parametere som skal optimaliseres inkluderer valg av lipid, lipidkonsentrasjonen i oljefasen og protein- og vaskemiddelkonsentrasjonene i de vandige dråpene. Lipidene som brukes er uvanlige, ved at de ikke viser noen klar faseovergang ved lave temperaturer. DPhPC er et vanlig lipid for å produsere stabile membransystemer40. I prinsippet kan ethvert lipid som opprettholder sitt væskemiljø ved lave temperaturer være egnet for denne applikasjonen. I tillegg bør lipidet ikke være følsomt for oksidasjon. Vaskemiddelkonsentrasjonen i dråpene bør være så lav som mulig for å unngå membranbrudd. Stabile membraner og gode proteininkorporeringshastigheter oppnås vanligvis med vaskemiddelkonsentrasjoner under den kritiske micellekonsentrasjonen (cmc), gitt at membranproteinet ikke felles ut.

Hvis DIB-membranene ikke tåler spesifikke vaskemidler21,41, eller hvis proteinene ikke integreres fra lavvaskemiddelløsning i DIB-membranene, kan proteinkanalene først rekonstitueres i små unilamellære lipidvesikler (SUVer), som deretter fusjoneres til DIB-membranene fra dråpesiden, slik det har blitt vist for E. coli MscL 42 . Noen ganger dannes ikke DIB-membraner fordi lipidkonsentrasjonen i oljefasen er for lav. For å forhindre at DIB-membraner sprekker, bør man også være oppmerksom på at det osmotiske trykket mellom hydrogelen og dråpen må balanseres nøyaktig uten å påvirke Ca2+-fluksen fra cis til trans for mye. Optimalisert agarosetykkelse og maskestørrelse synes å være avgjørende for å observere diffusjon av membranproteiner. Eventuell tørking av agaroselaget bør unngås. Tykkelsen kan bestemmes ved hjelp av atomkraftmikroskopi17. Ved å variere agarosekonsentrasjonen, volumet og rotasjonshastigheten under sentrifugeringsbelegget, kan maskestørrelsen og tykkelsen på hydrogelen optimaliseres. Vær imidlertid oppmerksom på at hydrogellagtykkelsen påvirker bildekontrasten. For å fange membranproteiner i DIB, kan agarosehydrogelen erstattes av spesialsyntetisert, ikke-tverrbundet, Ni-NTA-modifisert, lavsmeltende agarose for å fange dem via en His-tag17. En for høy fluorescensbakgrunn skyldes ofte brudd på DIB-membranene. Dette er spesielt et problem med flerbrønnskamre, da det Ca2+-følsomme fargestoffet diffunderer inn i hydrogelen. I dette tilfellet bør tilstøtende brønner unngås. Fluorescensbleking av det Ca2+-følsomme fargestoffet over membranen bør ikke være en signifikant begrensende faktor, da det byttes ut av ikke-eksiterte fargestoffer i hoveddelen av dråpen (figur 3A) utenfor TIRF-evanescentfeltet. Lokaliseringspresisjonen for proteinet er gitt av nøyaktigheten av montering av flekkene og pikselstørrelsen.

Svake fluorescenssignaler kan skyldes lav Ca2+-fluks gjennom kanalen. Mulige årsaker inkluderer: (i) unøyaktige TIRF-innstillinger (f.eks. laserintensitet), (ii) det osmotiske Ca 2+-trykket over membranen, eller (iii) kanalens indre Ca2+-permeabilitet er for lav. For å takle det første problemet må laserintensitet, TIRF-vinkel og kameraforsterkning optimaliseres. De to sistnevnte problemene kan overvinnes ved anvendelse av et elektrisk potensial over membranen 2,43. Imidlertid kan anvendelsen av eksterne spenninger forvride resultatet, da elektriske effekter kan påvirke kanalåpningen av ligandstyrte eller mekanosensitive ionkanaler som faktisk ikke er spenningsstyrte. Eksempler på slike kanaler er mitokondrieproteintranslokasen TOM-CC27 og dens kanaldannende underenhet Tom40 26,44,45,46. Til slutt skal det bemerkes at det er vanskelig å sette membranproteiner inn i DIB-membraner i en bestemt retning for å oppnå ønsket funksjonalitet, og kvantitative studier er sjeldne47,48. I noen tilfeller er orienteringen av de integrerte proteinene tilfeldig. Dette er et alvorlig problem for å studere membranproteiner, fordi visse membranproteiner aktiveres på bare den ene siden av membranen.

TIRF-mikroskopi er en kraftig metode for å håndtere enkeltmolekylære hendelser i plane støttede membraner49. Eksempler inkluderer montering og folding av veioppklaring av kanalproteiner som α-hemolysin50, perfringolysin O 51 og OmpG52. Disse studiene inkluderte FRET som tilleggsteknikk. I tillegg har aktivering av den mekanosensitive ionekanalen MscL tidligere blitt studert ved mekanisk stimulering av støttede DIB-dobbeltlag42 ved bruk av strømmålinger. Basert på dette arbeidet kan fremtidige studier kombinere plattformen beskrevet her med enkeltmolekylære FRET-eksperimenter for å adressere mekanosensitive kanaler på enkeltmolekylnivå på en optisk måte17. Injeksjon av buffer i dråpen, strekking av det indre DIB-monolaget eller målrettet binding av individuelle kanaler til den underliggende hydrogelen kan brukes til å studere ikke bare den fysiske mekanismen til mekanisk aktiverte kanaler, som reagerer på membranspenning og / eller krumning som vist for MscL og MscS, toporedomenet K +-kanaler, TREK-1, TREK-2, og TRAAK og PIEZO (for gjennomgang, se53), men også lokal binding til det cellulære cytoskjelettet, som vist for den berøringsfølsomme ionekanalen NOMPC54,55.

Disclosures

Vi oppgir ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi takker Beate Nitschke for hennes hjelp med proteintilberedning og Robin Ghosh, Michael Schweikert (Stuttgart) og Maximilan Ulbrich (Freiburg) for innsiktsfulle diskusjoner. Dette arbeidet ble støttet av Stuttgart Research Center Systems Biology (SRCSB) og et stipend fra Baden Württemberg Foundation (BiofMO-6 til SN).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850356C
100x Oil objective Apochromat N.A. 1.49 Nikon MRD01991 TIRF microscope 
10x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.25  Nikon Microscope to assess DIB membrane formation  
10x objective N.A. 0.25 Nikon MRL00102 TIRF microscope 
40x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.55 Nikon Microscope to assess DIB membrane formation  
488 nm laser, 100 mW   Visitron TIRF microscope 
Adhesive tape
Äkta pure   Cytiva Protein purification system
Bradford assay kit, Pierce Thermo Fisher  23236
CaCl2 Roth 5239.2
Chelax 100 resin Biorad 143-2832
Chloroform  Sigma-Aldrich MC1024452500
Dialysis cassettes Slide-A-Lyzer 20 k MWCO Thermo Fisher  87735
DIB chamber  Custom made PMMA chamber for DIB membranes
Digital power meter and energy console Thorlabs PM100D Laser power meter 
Dimethyl sulfoxide Roth  4720.1
Double distilled H2O
Eclipse TS 100 Hoffmann modulation contrast microscope  Nikon Microscope to assess DIB membrane formation  
EDTA Roth 8042.2
EMCCD camera iXon Ultra 897 Andor TIRF microscope 
Ethanol Sigma-Aldrich 32205-M
Fixed angle rotor Ti70 Beckman Coulter
Fluo-8, CalciFluorTM Santa Cruz Biotechnology SC-362561 Ca2+-sensitive dye
French press cell disruption homogenizer Igneus Igneus 40000 psi
GFP filter AHF Filter seeting used for excitation of DIB-membranes by epifluorescence with white light source 
Glass capillaries World Precision Instruments 4878
Glass coverslips 40 mm x 24 mm x 0.13 mm Roth 1870.2
Glycerol Roth 3783.2
Hamilton syringe 10 mL Roth X033.1
Hamilton syringe 100 mL Roth X049.1
Hamilton syringe 500 mL Roth EY49.1
Heating block  Eppendorf Thermomixer comfort
Heating plate Minitube  HT200
Hepes Roth  9205.3
Hexadcane Sigma-Aldrich 296317
His Trap HP 1 mL Cytiva 29051021 Ni-NTA column
Imidazole Sigma-Aldrich 1.04716.1000
KCl Honeywell 10314243
KLM spin coater  Schaefer Tec SCV-10
List medical L/M-3P-A vertical pipette puller Artisan Technology Group 57761-1
Low melting point agarose Sigma-Aldrich  A9414
M8 Stereomicroscope Wild Stereomicrosope 
Matlab  MathWorks R2022a
Methanol Sigma-Aldrich 34860
MicroFil pipette tips World Precision Instruments MF34G-5
N2 gas
NaCl Roth 3957.1
Nanoliter 2010 injector  World Precision Instruments Nanoliter 2010 
n-dodecyl-b-D-maltoside Glycon Biochemicals D97002-C
Ni-NTA agarose, non-crosslinked Cube Biotech 124115393 Custom made
NIS-Elements AR software Nikon MQS31100/MQS42560/MQS42580/MQS42780/MQS41930 Imaging software
n-octyl-polyoxyethylene Sigma-Aldrich 40530
O2 gas
Phenylmethylsulfonyl fluoride Roth  6367.3
Photodiode sensor  Si, 400 - 1100 nm, 500 mW Thorlabs S130C Sensor for laser power meter 
Plasma cleaner Diener Electronics Zepto
Preparative ultracentrifuge Optima Beckman Coulter
Quad-band TIRF-filter 446/523/600/677 HC AHF Filter setting used for excitation of DIB-membranes with 488 nm laser 
Resource Q 1 mL Cytiva 17117701 Anion exchange column
Silicon oil AR 20 Sigma-Aldrich 10836
Sodium dodecyl sulfate Roth 2326.2
Super LoLux camera JVC Stereomicrosope 
Thermoshaker Gerhardt THL 500/1
Ti-E Fluorescence microscope   Nikon MEA53100
Tris-HCl Sigma-Aldrich 9090.3
Tryptone Roth 8952.2
Ultrasonic bath  Bandelin Sonorex RK 100
Vaccum pump Vacuubrand MD 4C NT
White light source for epifluorescence illumination (100 W) Nikon MBF72655 TIRF microscope 
Yeast extract Roth 2363.2
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437 (7059), 656-663 (2005).
  2. Leptihn, S., et al. Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil. Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).
  3. Thompson, J. R., Heron, A. J., Santoso, Y., Wallace, M. I. Enhanced stability and fluidity in droplet on hydrogel bilayers for measuring membrane protein diffusion. Nano Letters. 7 (12), 3875-3878 (2007).
  4. Kusumi, A., et al. Paradigm shift of the plasma membrane concept from the two-dimensional continuum fluid to the partitioned fluid: high-speed single-molecule tracking of membrane molecules. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 34 (1), 351-378 (2005).
  5. Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems. Biophysical Journal. 60 (4), 910-921 (1991).
  6. Kusumi, A., Shirai, Y. M., Koyama-Honda, I., Suzuki, K. G. N., Fujiwara, T. K. Hierarchical organization of the plasma membrane: Investigations by single-molecule tracking vs. fluorescence correlation spectroscopy. FEBS Letters. 584 (9), 1814-1823 (2010).
  7. Betaneli, V., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy to examine protein-lipid interactions in membranes. Methods in Molecular Biology. 974, 253-278 (2013).
  8. Ando, T., et al. A high-speed atomic force microscope for studying biological macromolecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (22), 12468-12472 (2001).
  9. Casuso, I., et al. Characterization of the motion of membrane proteins using high-speed atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 7 (8), 525-529 (2012).
  10. Karner, A., et al. Tuning membrane protein mobility by confinement into nanodomains. Nature Nanotechnology. 12 (3), 260-266 (2017).
  11. Rajendran, L., Simons, K. Lipid rafts and membrane dynamics. Journal of Cell Science. 118 (6), 1099-1102 (2005).
  12. Schink, K. O., Tan, K. -W., Stenmark, H. Phosphoinositides in control of membrane dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), 143-171 (2016).
  13. Schafer, D. A. Coupling actin dynamics and membrane dynamics during endocytosis. Current Opinion in Cell Biology. 14 (1), 76-81 (2002).
  14. Lingwood, D., Ries, J., Schwille, P., Simons, K. Plasma membranes are poised for activation of raft phase coalescence at physiological temperature. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (29), 10005-10010 (2008).
  15. Engelman, D. M. Membranes are more mosaic than fluid. Nature. 438 (7068), 578-580 (2005).
  16. Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. The lateral organization and mobility of plasma membrane components. Cell. 177 (4), 806-819 (2019).
  17. Wang, S., et al. Spatiotemporal stop-and-go dynamics of the mitochondrial TOM core complex correlates with channel activity. Communications Biology. 5 (1), 471 (2022).
  18. Ide, T., Yanagida, T. An artificial lipid bilayer formed on an agarose-coated glass for simultaneous electrical and optical measurement of single ion channels. Biochemical and Biophysical Research Communications. 265 (2), 595-599 (1999).
  19. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid bilayer formation by contacting monolayers in a microfluidic device for membrane protein analysis. Analytical Chemistry. 78 (24), 8169-8174 (2006).
  20. Heron, A. J., Thompson, J. R., Mason, A. E., Wallace, M. I. Direct detection of membrane channels from gels using water-in-oil droplet bilayers. Journal of the American Chemical Society. 129 (51), 16042-16047 (2007).
  21. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. Molecular BioSystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  22. Huang, S., Romero-Ruiz, M., Castell, O. K., Bayley, H., Wallace, M. I. High-throughput optical sensing of nucleic acids in a nanopore array. Nature Nanotechnology. 10 (11), 986-991 (2015).
  23. Sackmann, E. Supported membranes: scientific and practical applications. Science. 271 (5245), 43-48 (1996).
  24. Kiessling, V., Yang, S. -T., Tamm, L. K. Supported lipid bilayers as models for studying membrane domains. Current Topics in Membranes. 75, 1-23 (2015).
  25. Murray, D. H., Tamm, L. K., Kiessling, V. Supported double membranes. Journal of Structural Biology. 168 (1), 183-189 (2009).
  26. Hill, K., et al. Tom40 forms the hydrophilic channel of the mitochondrial import pore for preproteins. Nature. 395 (6701), 516-521 (1998).
  27. Poynor, M., Eckert, R., Nussberger, S. Dynamics of the preprotein translocation channel of the outer membrane of mitochondria. Biophysical Journal. 95 (3), 1511-1522 (2008).
  28. Künkele, K. P., et al. The preprotein translocation channel of the outer membrane of mitochondria. Cell. 93 (6), 1009-1019 (1998).
  29. Ahting, U., et al. The TOM core complex: the general protein import pore of the outer membrane of mitochondria. The Journal of Cell Biology. 147 (5), 959-968 (1999).
  30. Bausewein, T., et al. Cryo-EM structure of the TOM core complex from Neurospora crassa. Cell. 170 (4), 693-700 (2017).
  31. Cowan, S. W., et al. Crystal structures explain functional properties of two E. coli porins. Nature. 358 (6389), 727-733 (1992).
  32. Bieligmeyer, M., et al. Reconstitution of the membrane protein OmpF into biomimetic block copolymer-phospholipid hybrid membranes. Beilstein Journal of Nanotechnology. 7, 881-892 (2016).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  34. Vicente, N. B., Zamboni, J. E. D., Adur, J. F., Paravani, E. V., Casco, V. H. Photobleaching correction in fluorescence microscopy images. Journal of Physics: Conference Series. 90 (1), 012068 (2007).
  35. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  36. Ershov, D., et al. TrackMate 7: integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines. Nature Methods. 19 (7), 829-832 (2022).
  37. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  38. Hirsch, M., Wareham, R. J., Martin-Fernandez, M. L., Hobson, M. P., Rolfe, D. J. A stochastic model for electron multiplication charge-coupled devices - From theory to practice. PLoS One. 8 (1), 53671 (2013).
  39. Bausewein, T., Naveed, H., Liang, J., Nussberger, S. The structure of the TOM core complex in the mitochondrial outer membrane. Biological Chemistry. 401 (6-7), 687-697 (2020).
  40. Lindsey, H., Petersen, N. O., Chan, S. I. Physicochemical characterization of 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine in model membrane systems. Biochimica et Biophysica Acta. 555 (1), 147-167 (1979).
  41. Manafirad, A. Single ion-channel analysis in droplet interface bilayer. Methods in Molecular Biology. 2186, 187-195 (2021).
  42. Rosholm, K. R., et al. Activation of the mechanosensitive ion channel MscL by mechanical stimulation of supported Droplet-Hydrogel bilayers. Scientific Reports. 7 (1), 45180 (2017).
  43. Wang, Y., et al. Electrode-free nanopore sensing by DiffusiOptoPhysiology. Science Advances. 5 (9), (2019).
  44. Ahting, U., et al. the pore-forming component of the protein-conducting TOM channel in the outer membrane of mitochondria. The Journal of Cell Biology. 153 (6), 1151-1160 (2001).
  45. Romero-Ruiz, M., Mahendran, K. R., Eckert, R., Winterhalter, M., Nussberger, S. Interactions of mitochondrial presequence peptides with the mitochondrial outer membrane preprotein translocase TOM. Biophysical Journal. 99 (3), 774-781 (2010).
  46. Kuszak, A. J., et al. Evidence of distinct channel conformations and substrate binding affinities for the mitochondrial outer membrane protein translocase pore Tom40. The Journal of Biological Chemistry. 290 (43), 26204-26217 (2015).
  47. Yanagisawa, M., Iwamoto, M., Kato, A., Yoshikawa, K., Oiki, S. Oriented reconstitution of a membrane protein in a giant unilamellar vesicle: Experimental verification with the potassium channel KcsA. Journal of the American Chemical Society. 133 (30), 11774-11779 (2011).
  48. Goers, R., et al. Optimized reconstitution of membrane proteins into synthetic membranes. Communications Chemistry. 1, 35 (2018).
  49. Castell, O. K., Dijkman, P. M., Wiseman, D. N., Goddard, A. D. Single molecule fluorescence for membrane proteins. Methods. 147, 221-228 (2018).
  50. Thompson, J. R., Cronin, B., Bayley, H., Wallace, M. I. Rapid assembly of a multimeric membrane protein pore. Biophysical Journal. 101 (11), 2679-2683 (2011).
  51. Senior, M. J. T., et al. Single-molecule tracking of perfringolysin O assembly and membrane insertion uncoupling. The FEBS Journal. , (2022).
  52. Weatherill, E. E., et al. Fast slow folding of an outer membrane porin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (20), 2121487119 (2022).
  53. Kefauver, J. M., Ward, A. B., Patapoutian, A. Discoveries in structure and physiology of mechanically activated ion channels. Nature. 587 (7835), 567-576 (2020).
  54. Yan, Z., et al. Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation. Nature. 493 (7431), 221-225 (2013).
  55. Wang, Y., et al. The push-to-open mechanism of the tethered mechanosensitive ion channel NompC. eLife. 10, 58388 (2021).

Tags

Biokjemi utgave 192
Enkeltmolekylavbildning av lateral mobilitet og ionkanalaktivitet i lipiddobbeltlag ved bruk av total intern refleksjonsfluorescens (TIRF) mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, S., Nussberger, S.… More

Wang, S., Nussberger, S. Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy. J. Vis. Exp. (192), e64970, doi:10.3791/64970 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter