Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Одномолекулярная визуализация латеральной подвижности и активности ионных каналов в липидных бислоях с использованием флуоресцентной микроскопии с полным внутренним отражением (TIRF)

Published: February 17, 2023 doi: 10.3791/64970
Automatic Translation
1, 1
1Biophysics Department, Institute of Biomaterials and Biomolecular Systems, University of Stuttgart

Summary

Этот протокол описывает, как использовать микроскопию TIRF для отслеживания отдельных ионных каналов и определения их активности в поддерживаемых липидных мембранах, тем самым определяя взаимодействие между боковым движением мембраны и функцией канала. В нем описывается, как подготовить мембраны, записать данные и проанализировать результаты.

Abstract

Методы визуализации с высоким разрешением показали, что многие ионные каналы не статичны, а подвержены высокодинамическим процессам, включая переходную ассоциацию порообразующих и вспомогательных субъединиц, латеральную диффузию и кластеризацию с другими белками. Однако взаимосвязь между латеральной диффузией и функцией плохо изучена. Чтобы подойти к этой проблеме, мы опишем, как можно контролировать и коррелировать латеральную подвижность и активность отдельных каналов в поддерживаемых липидных мембранах с помощью флуоресцентной микроскопии с полным внутренним отражением (TIRF). Мембраны изготавливаются на ультратонкой гидрогелевой подложке с использованием метода капельного интерфейса (DIB). По сравнению с другими типами модельных мембран эти мембраны имеют то преимущество, что они механически прочны и подходят для высокочувствительных аналитических методов. Этот протокол измеряет поток ионов Ca 2+ по отдельным каналам, наблюдая за флуоресцентным излучением Ca2+-чувствительного красителя в непосредственной близости от мембраны. В отличие от классических подходов к отслеживанию одной молекулы, не требуется флуоресцентных слитых белков или меток, которые могут мешать боковому движению и функции мембраны. Возможные изменения потока ионов, связанные с конформационными изменениями белка, обусловлены только боковым движением белка в мембране. Репрезентативные результаты показаны с использованием транслокационного канала митохондриального белка TOM-CC и бактериального канала OmpF. В отличие от OmpF, стробирование TOM-CC очень чувствительно к молекулярному удержанию и природе боковой диффузии. Следовательно, поддерживаемые бислои капельного интерфейса являются мощным инструментом для характеристики связи между боковой диффузией и функцией ионных каналов.

Introduction

Настоящий протокол направлен на то, чтобы описать, как изучить корреляцию между подвижностью мембраны и проницаемостью ионных каналов мембранных белков в двухслойных мембранах с капельным интерфейсом (DIB)на полимерной основе 1,2,3.

Настоящий метод дополняет впечатляющий набор передовых оптических и поверхностных аналитических инструментов, таких как отслеживание отдельных частиц4,5, флуоресцентная корреляционная спектроскопия6,7 и высокоскоростная атомно-силовая микроскопия 8,9,10. Они дают ценную информацию о динамическом составе и структуре мембран, которые влияют на мембранные реакции11,12,13. В то время как движение и латеральная диффузия белков зависят от локальной плотности белков в мембране, отдельные белковые молекулы также могут быть захвачены липидными рафтами14 и белок-белковыми взаимодействиями15,16. В зависимости от белковых доменов, выступающих из мембраны во внеклеточную среду или цитозоль, подвижность белка может варьироваться от высокоподвижной до полностью неподвижной. Однако из-за сложности мембраны и ее периферических структур часто бывает трудно расшифровать взаимодействие между природой латеральной подвижности и функцией белка17.

Мембраны DIB зарекомендовали себя как эффективная платформа для биофизического одномолекулярного анализа мембранных белков 18,19,20,21,22. Они образуются путем самосборки липидов в результате контакта водных капель с гидрогелевыми субстратами в липидно-масляной фазе. Подобно обычно используемым поддерживаемым липидным бислоям (SLB)1,23,24,25, DIB позволяют локально настраивать латеральную подвижность путем временного или постоянного связывания белков с полимерной матрицей при функционализации подходящими лигандами17. Последняя может служить модельной системой биохимических процессов в клеточных мембранах с гетерогенным распределениембелков10.

Описанный здесь экспериментальный подход основан на флуоресценции Ca 2+-чувствительных красителей для измерения потока ионов Ca 2+ через отдельные каналы в непосредственной близости от мембраны 2,22 с помощью TIRF-микроскопии. Такой оптический подход ограничивает освещение образца расстоянием, близким к мембране, что из-за физических свойств мимолетного возбуждающего света приводит к значительному снижению фона флуоресценции. Последнее является обязательным условием, если для обнаружения одиночных молекул требуется высокое пространственное и временное разрешение. В отличие от классических электрофизиологических методов26,27, для исследования потока ионов по отдельным каналам не требуется никаких мембранных напряжений. Кроме того, метод не требует маркировки флуоресцентными красителями или молекулами, которые могут мешать боковому движению каналов в мембране.

Метод особенно полезен для изучения белковых каналов, встроенных в мембрану, на уровне одной молекулы без использования классической электрофизиологии. Используя проводящий митохондриальный белок канал TOM-CC из Neurospora crassa28,29,30 и OmpF, который поддерживает диффузию небольших гидрофильных молекул через внешнюю мембрану Escherichia coli17,31, мы иллюстрируем, как можно изучать и коррелировать мобильность мембраны и активность каналов двух белков. Мы предполагаем, что этот подход, хотя и оптимизирован для TOM-CC и OmpF, может быть легко применен к другим белковым каналам.

Protocol

1. Производство белка

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается процедура выделения OmpF из Escherichia coli BE BL21(DE3) omp631,32, в котором отсутствуют LamB и OmpC, и основного комплекса TOM из Neurospora crassa (рис. 1)28,29. Для последнего требуются митохондрии, выделенные из штамма N. crassa 28, содержащего меченную 6xHis форму субъединицы TOM Tom22 (рис. 1A), которая может быть выделена, как описано28. Следующие протоколы обычно дают 1-2 мг N. crassa TOM-CC и 10 мг E. coli OmpF. Если количество должно быть скорректировано, важно, чтобы соотношение белка и детергента точно поддерживалось. Если не указано иное, все действия следует выполнять при температуре 4 °C.

  1. Изоляция основного комплекса ТОМа
    1. Солюбилизируют очищенные митохондрии N. crassa (2 г белка), полученные дифференциальным седиментированием из гиф весом приблизительно 1,5 кг (сырой массы), согласно Bausewein et al.30, при концентрации белка 10 мг/мл в 20 мМ Tris-HCl (рН 8,5), 1% (мас./об.) DDM, 20% (об./об.) глицерина, 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазола и 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF) в течение 30 мин при 4 °C.
      ВНИМАНИЕ: PMSF токсичен. Надевайте соответствующие средства индивидуальной защиты.
    2. Перенесите солюбилизированные митохондрии в ультрацентрифужные пробирки и отделите несолюбилизированные мембраны от солюбилизированных мембранных белков ультрацентрифугированием при 130 000 x g в течение 40 мин при 4 ° C и фильтрацией фильтровальной бумагой стандартного качества.
    3. Уравновесьте предварительно упакованную колонку Ni-NTA (объемом 5 мл) примерно с 5 объемами колонки (CV) буфера A1 (таблица 1) с помощью автоматизированной системы очистки белка. Запустите колонку Ni-NTA с постоянной скоростью потока 1 мл/мин на всех этапах. Используйте меньшую объемную колонку (1 мл), если белки были выделены из менее чем 2 г митохондрий.
    4. Загрузите образец солюбилизированного белка в колонку Ni-NTA со скоростью потока 1 мл/мин.
    5. Промойте колонку Ni-NTA 5 CV буфера A1 (таблица 1) для удаления несвязанных белков.
    6. Пометьте TOM-CC 30% буфером A2 (таблица 1; имидазол 300 мМ) и соберите пик белка, как он отображается на хроматограмме 280 нм (рис. 1B).
    7. Для дальнейшей очистки TOM-CC уравновесьте предварительно упакованную анионообменную колонку (1 мл) с 5 CV буфера B1, B2 и B1 (таблица 1) с помощью автоматизированной системы очистки белка. Запустите колонку анионного обмена с постоянной скоростью потока 1 мл / мин на всех этапах.
    8. Загрузите пиковую фракцию TOM-CC (этап 1.1.6) на колонку анионного обмена (расход 1 мл/мин).
    9. Удалите несвязанные белки, промыв колонку 5 CV буфера B1 (таблица 1) и линейным градиентом соли 0-20% буфера B2 (таблица 1).
    10. Elute TOM-CC с линейным градиентом соли 20%-35% буфера B2 и соберите пиковую фракцию белка, как она отображается на хроматограмме 280 нм (рис. 1C).
    11. Оцените чистоту образца с помощью SDS-PAGE (рис. 1D) и определите концентрацию белка с помощью коммерчески доступного анализа белка в соответствии с протоколом производителя (см. Таблицу материалов).
    12. Заморозьте образцы белка в жидком азоте и храните их при температуре -80 °C до дальнейшего использования.
      ВНИМАНИЕ: С жидким азотом следует обращаться в хорошо проветриваемых помещениях. Надевайте соответствующие средства индивидуальной защиты.
       
  2. Изоляция OmpF
    1. Извлеките штамм E. coli BE BL21 (DE3) omp6, в котором отсутствуют LamB и OmpC32, из замороженного глицеринового бульона в стерильных условиях и нанесите полосу на агаровую пластину Лурии-Бертани (LB) (таблица 2). Для этого постепенно распределите образец равномерно по всей тарелке.
    2. Дайте образцу впитаться в агар в течение 5 минут, прежде чем перевернуть тарелку с закрытой крышкой и инкубировать в течение ночи при 37 ° C.
    3. Выберите одну колонию E. coli , инокулируйте 7,5 мл среды LB (таблица 2) этой единственной колонией с помощью стерильной зубочистки и оставьте расти на ночь (14 часов) при перемешивании (170 об/мин) при 37 ° C.
    4. Перенесите 2 x 1 мл клеток E. coli стерильными пипетками в 2 x 500 мл среды LB (таблица 2) и оставьте расти на ночь (~ 14 часов) при 37 ° C при перемешивании (~ 170 об/мин) в шейкере.
    5. Соберите клетки центрифугированием при 5000 x g в течение 20 мин при 4 ° C, заморозьте гранулы в жидком азоте и храните при -80 ° C до дальнейшего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сырой вес гранулы клетки обычно составляет 5 г на 1 л культуры. На этом этапе протокол можно поставить на паузу.
    6. Разморозьте и ресуспендируйте клетки (2 г) в 20 мл лизисного буфера C1 (таблица 2) и трижды пропустите суспензию при давлении 1000 фунтов на квадратный дюйм через предварительно охлажденную (4 °C) систему разрушения ячеек высокого давления с максимальным объемом образца 35 мл в соответствии с инструкциями производителя.
      ВНИМАНИЕ: Использование френч-пресса может привести к серьезным травмам. Никогда не превышайте предел давления используемой ячейки. Надевайте соответствующие средства индивидуальной защиты.
    7. Удалите неразрушенные клетки из лизата центрифугированием при 4000 x g в течение 15 мин и соберите надосадочную жидкость.
    8. Собирают мембраны ультрацентрифугированием в дозе 100 000 x g в течение 1 ч.
    9. Ресуспендируют мембранную гранулу в 10 мл буфера С2 (таблица 2) и смешивают с равным объемом буфера SDS C3 (таблица 2) с помощью стеклогомогенизатора с шарикоподшипниками.
      ВНИМАНИЕ: β-меркаптоэтанол в буфере C3 токсичен. Соблюдайте все соответствующие правила техники безопасности.
    10. Выдерживают суспензию на водяной бане при температуре 50 °С в течение 30 мин.
    11. Центрифугируют образец при 100 000 x g при 20 °C в течение 1 часа.
    12. Ресуспендируют мембранную гранулу в 10 мл буфера SDS C4 (таблица 2) с помощью стеклянного гомогенизатора с шарикоподшипниками и инкубируют суспензию на водяной бане при 37 °C в течение 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если гранула не может быть ресуспендирована, добавьте больше буфера SDS C4 объемом до 20 мл.
    13. Центрифугируют образец при 100 000 x g при 20 °C в течение 30 мин и собирают надосадочную жидкость.
    14. Смешайте надосадочную жидкость с октилполиоксиэтиленом (октил POE) до конечной концентрации моющего средства 0,5% (мас./об.) и дважды диализируйте образец против буфера C5 (таблица 2) при 4 °C в течение 24 часов. Для этой цели используйте диализную трубку с отсечкой 20 кДа в соответствии с инструкциями производителя и поместите образец в диализную трубку или устройство.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отсечка диализной трубки должна быть отрегулирована, если белки с другими молекулярными массами будут диализованы.
    15. Оцените чистоту образца с помощью SDS-PAGE и определите концентрацию белка с помощью коммерчески доступного анализа белка в соответствии с протоколом производителя (Таблица материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы, нагретые до 95 °C, содержат мономерный OmpF. Образцы, не нагретые, показывают OmpF в его тримерной форме (рис. 1F).
    16. Диализованный OmpF методом шоковой заморозки в аликвотах в жидком азоте и хранить при -20 °C до дальнейшего использования.
      ВНИМАНИЕ: С жидким азотом следует обращаться в хорошо проветриваемых помещениях. Надевайте соответствующие средства индивидуальной защиты.

2. Оптическая одноканальная регистрация ионных каналов в мембранах DIB

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается процедура приготовления мембран DIB в микрофабрикованных камерах2 из полиметилметакрилата (ПММА) для мониторинга бокового движения белка и потока ионов через одиночные ионные каналы17. Размеры и точные чертежи для изготовления камеры можно найти в Lepthin et al.2. На рисунке 2 представлен обзор сборки камеры2 из ПММА и формирования мембран DIB. Если не указано иное, все этапы выполняются при комнатной температуре (RT). На рисунке 3 показано схематическое изображение мембраны DIB и то, как поток Ca2+ через одноканальный белок используется для мониторинга как движения в мембране, так и открыто-закрытого состояния канала.

  1. Подготовка липидов
    1. Извлеките из морозильной камеры раствор липидов, содержащий 1,2-дифитаноил-sn-глицеро-3-фосфохолин (25 мг/мл DPhPC), растворенный в хлороформе, из морозильной камеры при -20 °C и подогрейте до RT. Для этого, как правило, достаточно медленно разогреть образец вручную в течение нескольких минут.
      ВНИМАНИЕ: Хлороформ токсичен. Надевайте соответствующие средства индивидуальной защиты и выполняйте все процедуры, связанные с хлороформом, под вытяжным шкафом.
    2. Перелейте 380 мкл исходного раствора DPhPC (25 мг / мл DPhPC) в стеклянный флакон. Избегайте пипеток с резиновыми уплотнениями. Вместо этого используйте микролитровые стеклянные шприцы с поршнями из нержавеющей стали.
    3. После обработки липидного исходного раствора наложите липидный исходный раствор на газ Ar илиN2 , чтобы предотвратить окисление липидов. Используйте минимально возможный поток газа, чтобы избежать испарения органического растворителя, в котором растворены липиды, или разбрызгивания растворителя из флакона. Убедитесь, что крышки стеклянных флаконов, содержащих липиды с органическим растворителем, покрыты политетрафторэтиленом (ПТФЭ) изнутри.
    4. Высушите образец липидов (этап 2.1.2) под струей N 2 и удалите оставшийся органический растворитель из образца липидов в течение ночи в вакууме (2,0 мбар) с помощью безмасляного вакуумного насоса.
    5. Растворите липидную пленку в растворе гексадекана / силиконового масла, добавив равные объемы гексадекана и силиконового масла (по 500 мкл каждый) с помощью микролитрового стеклянного шприца до конечной концентрации липидов 9,5 мг / мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Липидный раствор стабилен при ЛТ в течение нескольких недель.
  2. Приготовление агарозного гидрогеля
    1. Приготовьте приблизительно 1 мл легкоплавкого раствора агарозы (0,75% [мас./об.]) в двойной деионизированной воде и нагрейте до 85 °C в нагревательном блоке в течение 20 мин, чтобы использовать его для отжима стеклянных покровных стекол.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор агарозы можно хранить при РТ в течение нескольких недель и несколько раз нагревать.
    2. Приготовьте тугоплавкий 2,5%-ный (мас./об.) раствор агарозы в 0,66 М CaCl 2 и 8,8 мМ HEPES (рН7,2 ) и нагрейте до 85 °C в нагревательном блоке в течение 20 мин. Следите за тем, чтобы агароза хорошо растаяла.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор агарозы можно выдерживать в течение нескольких недель при RT и нагревать несколько раз, точно так же, как агарозу (этап 2.2.1), используемую для отжима.
  3. Сборка камеры полиметилметакрилата (ПММА) и формирование липидного монослоя на границе раздела гидрогель гексадекан/силиконовое масло
    1. Поместите несколько стеклянных покровных листов (40 мм x 24 мм x 0,13 мм) в держатель покровного стекла из нержавеющей стали и очистите их в стеклянном стакане в течение 10 минут ацетоном в ультразвуковом очистителе. Используйте ровно столько ацетона, чтобы погрузить покровные стекла, и свободно накройте стакан стеклянной пластиной, чтобы создать замкнутую систему без давления, которая сводит к минимуму выход паров во время процесса очистки.
      ВНИМАНИЕ: Ацетон является легковоспламеняющимся растворителем с низкой температурой вспышки. Паровоздушные смеси взрывоопасны. Используйте ультразвуковой очиститель в хорошо проветриваемом помещении. Надевайте соответствующие средства индивидуальной защиты и соблюдайте официальные меры предосторожности (например, не используйте открытый огонь и искры).
    2. Промойте покровные стекла двойной деионизированной водой и высушите их под струей N2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очищенные таким образом покровные стекла могут храниться в течение нескольких недель.
    3. Далее очистите и гидрофилизируйте покровное стекло в плазменном очистителе с кислородом (0,5 мбар) в течение 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте этот этап непосредственно перед отжимным покрытием раствором агарозы, так как гидрофильный эффект плазменной очистки со временем стирается.
    4. Установите обработанное плазмой покровное стекло на устройство для нанесения спинового покрытия (рис. 2, шаг 1).
    5. Покройте покровное стекло пленкой агарозы толщиной субмикрон, медленно добавляя 140 мкл нагретой 0,75% (мас./об.) легкоплавкой агарозы (этап 2.2.1) при 3,000 об/мин в течение 30 с, используя пипетку объемом 200 мкл (рис. 2, шаг 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Толщина агарозной пленки может быть определена с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ), как описано17.
    6. Немедленно прикрепите покровное стекло с спиновым покрытием тонким слоем гидрогеля агарозы к нижней стороне камеры2 из ПММА. Убедитесь, что гидрогель агарозы направлен вверх (рис. 2, шаг 2).
    7. Прикрепите края покровного стекла к микрообработанному устройству из ПММА с помощью прозрачной клейкой ленты.
    8. Поместите устройство из ПММА на горячую плиту, нагретую до 35 °C (рис. 2, шаг 3).
    9. Осторожно налейте 200 мкл 2,5% раствора агарозы (этап 2.2.2) во входное отверстие камеры с помощью пипетки (рис. 2, шаг 3), не создавая пузырьков воздуха, чтобы тонкий гидрогель, нанесенный спиновым покрытием, мог уравновеситься с буфером 2,5% раствора агарозы и оставаться гидратированным. Убедитесь, что 2,5% раствор агарозы распределен вокруг гидрогеля агарозы с спиновым покрытием, но не над ним (рис. 3A), чего можно избежать, осторожно прижав камеру ПММА к нагревательной пластине.
    10. Немедленно накройте лунки камеры ПММА (рис. 2, шаг 4) в общей сложности 60 мкл липидно-нефтяного раствора (этап 2.1.5), чтобы инициировать образование липидного монослоя на границе раздела агароза и нефть и избежать обезвоживания агарозы с спиновым покрытием в лунках камеры ПММА. Держите устройство на горячей плите при температуре 35 °C около 2 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Круглые скважины в камере ПММА имеют диаметр 0,5 мм и глубину 1,8 мм, согласно ранее опубликованной работе2.
  4. Приготовление водных капель с липидным покрытием в растворе гексадекана/силиконового масла
    1. Поместите 20 мкл раствора липидного гексадекана/силиконового масла (этап 2.1.5) в каждую из нескольких микрообработанных лунок в капельной инкубационной камере (рис. 2, шаг 4). Подходящими контейнерами для раствора липидного гексадекана/силиконового масла являются небольшие углубления размером 40 мм x 30 мм x 3,5 мм в тонкой пластине из ПММА2.
    2. Приготовьте иглу из микрокапиллярного стекла с диаметром отверстия наконечника 20 мкм с помощью вертикального или горизонтального съемника микропипеток (например, используемого для изготовления патч-пипеток или острых стеклянных электродов). Оцените диаметр отверстия иглы из микрокапиллярного стекла под бинокулярным стереомикроскопом при малом увеличении в диапазоне от 7,5x до 35x.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки режима предварительного нагрева перед вытягиванием стеклянного капилляра, режима нагрева для вытягивания и силы тяги должны быть определены заранее экспериментально в соответствии со спецификациями производителя тянущего устройства и типом капилляра.
    3. Заполните иглу из микрокапиллярного стекла 5 мкл водного раствора для инъекций, содержащего 8,8 мМ HEPES (рН 7,2), 7 мкМ флуо-8, 400 мкМ ЭДТА, 1,32 М KCl и 30 нМ TOM основной комплекс или, альтернативно, 20 нМ OmpF, используя микрокапиллярный наконечник пипетки. Для приготовления водного раствора для инъекций используйте только дважды дистиллированную воду, предварительно обработанную хелатирующей смолой, которая связывает многовалентные ионы металлов (Ca2+).
    4. Установите иглу из микрокапиллярного стекла с водным раствором для инъекций на наноинжекторе с пьезоприводом.
    5. Вводят 100-200 нл водных капель (рис. 2, шаг 4), содержащих 8,8 мМ HEPES (рН 7,2), 7 мкМ флуоре-8, 400 мкМ ЭДТА, 1,32 М KCl и 30 нМ TOM (стадия 1.1.12), или, альтернативно, 20 нМ OmpF (этап 1.2.16), в лунки в капельной инкубационной камере, заполненные раствором липидного гексадекана/силиконового масла (см. 2.1.5), используя наноинжектор. Следите за тем, чтобы капли не касались друг друга, поместив их на расстоянии нескольких миллиметров (>10 мм) друг от друга в лунки. В противном случае, если липидные монослои еще не сформировались на границе раздела масло/буфер, они сольются в более крупные капли.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если капилляры класса и наноинжекторы недоступны, капли в качестве альтернативы можно приготовить вручную с помощью одноканальных микролитровых пипеток для объемов от 0,1 мкл до 0,5 мкл, как описано2. В этом случае, однако, объемы капель не так точны.
    6. Позвольте образованию липидного монослоя на границе раздела капля/масло в течение примерно 2 ч, поддерживая ПММА и капельные инкубационные камеры (рис. 2, шаг 4) на горячей плите, нагретой до 35 °C.
  5. Подготовка и визуализация одиночных ионных каналов в мембранах DIB
    1. Вручную перенесите отдельные водные капли из лунок камеры инкубации капель под стереомикроскопом в лунки камеры ПММА (рис. 2, шаг 5), используя одноканальную микролитровую пипетку с одноразовым полипропиленовым наконечником объемом 10 мкл. Дайте каплям опуститься на липидные монослои, образованные на границах раздела гидрогель-масло, в течение примерно 5 мин, чтобы сформировать липидный бислой (рис. 3) между каплями и агарозным гидрогелем.
    2. Установите камеру из ПММА с мембранами DIB на держатель образца микроскопа с инвертированным светом и оцените образование мембраны с помощью 10-кратного контрастного объектива модуляции Хоффмана (рис. 2, шаг 6). Образование мембраны DIB обозначено четким белым кольцом на границе раздела между каплей и гидрогелем (рис. 4A). Мембраны DIB, которые были сломаны, не показывают это кольцо (рис. 4B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы мембраны DIB могут быть визуализированы с 10-кратным увеличением с помощью фазового контраста или дифференциально-интерференционно-контрастной (DIC) микроскопии.
    3. Если мембраны DIB сформировались, установите камеру из ПММА на держатель образца микроскопа TIRF (рис. 2, шаг 7), оснащенный обычным источником света для эпифлуоресцентного освещения, лазером с длиной волны 488 нм (Pmax = 100 мВт) и ПЗС-камерой с электронным умножением с обратной подсветкой (512 x 512 пикселей; >95% QE) для достижения размера пикселя ~0,16 мкм.
    4. Сфокусируйте край мембраны DIB с объективом с 10-кратным увеличением при эпифлуоресцентном освещении источником света высокой интенсивности с помощью набора фильтров GFP.
    5. Точно сфокусируйте тот же край мембраны DIB при большом увеличении с помощью объектива TIRF с апохроматным маслом 100x/N.A. 1.49, опять же при эпифлуоресцентном освещении, с источником света высокой интенсивности с использованием набора фильтров GFP, который позволяет визуализировать слабую фоновую флуоресценцию флуоресцентного красителя Fluo-8 в капле (рис. 4C).
    6. Измените настройку фильтра с GFP на четырехдиапазонный набор фильтров TIRF.
    7. Включите лазер с длиной волны 488 нм и установите интенсивность лазера на линзе объектива в диапазоне от 8 мВт до 10 мВт.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку часто нет количественной информации об интенсивности лазера на линзе объектива, настройки интенсивности лазера должны быть предварительно откалиброваны в отдельных измерениях на линзе с помощью оптического измерителя мощности лазера, оснащенного фотодиодным датчиком, в соответствии со спецификациями производителя.
      ВНИМАНИЕ: Для обеспечения безопасной работы лазера оператор должен быть осведомлен о возможных опасностях лазерного излучения и правилах предотвращения несчастных случаев.
    8. Чтобы визуализировать одиночные ионные каналы, отрегулируйте угол TIRF и коэффициент усиления камеры EMCCD (например, настройку множителя усиления EM: 285) таким образом, чтобы открытые ионные каналы в мембране DIB выглядели как высококонтрастные флуоресцентные пятна на темном фоне (рис. 4D-G), а отношение сигнала к фону при визуальном осмотре достигало максимума. Убедитесь, что пятна, соответствующие потоку Ca2+ через одиночные ионные каналы, остаются в фокусе и имеют круглую форму, с высокой интенсивностью в центре и постепенно уменьшающейся к периферии. Мембраны без каналов показывают только фоновую флуоресценцию (рис. 4C).
    9. Прежде чем регистрировать движение и открытую-закрытую активность отдельных каналов с течением времени, убедитесь, что флуоресцентные пятна находятся в фокусе, чтобы убедиться, что ионные каналы восстановились в мембраны DIB и движутся латерально в плоскости мембраны. Если это не так, это может указывать на то, что флуоресцентная молекула погружается и выходит из мимолетного поля, генерируемого лазером вблизи мембраны.
    10. Запишите серию изображений мембраны, что позволяет правильно отслеживать положение и контролировать открытое-закрытое состояние отдельных ионных каналов. Чтобы определить тип боковой подвижности (например, свободное движение по сравнению с переходным креплением [для справки, см.16]) и состояние активности канала (например, открытое или закрытое), получите достаточно длинные (например, от 30 с до 1 мин) и хорошо отобранные траектории (например, частота кадров 48 с-1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдение направленной, ограниченной или скачкообразной диффузии16 требует, чтобы частота дискретизации была достаточно высокой для измерения неограниченной диффузии в ограничивающих границах. Кроме того, убедитесь, что время выборки данных достаточно велико для измерения перехода от неограниченной к ограниченной диффузии (подробнее см. Jacobson et al.16).
  6. Обработка изображений и данных
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пакеты33 обработки изображений с открытым исходным кодом или самописные процедуры17 , основанные на коммерческих программных пакетах, могут быть использованы для анализа пространственно-временной динамики отдельных ионных каналов в DIB. Чтобы иметь возможность коррелировать подвижность боковой мембраны с потоком ионов через отдельные каналы, не следует применять алгоритмы фильтрации.
    1. Скорректируйте временные ряды Equation 1 изображения для обесцвечивания, применив стандартные процедуры34 с использованием самописных процедур, подгонив среднюю интенсивность кадра всего изображения к Equation 2, где t - индекс кадра (время), аk- параметры подгонки. Затем скорректируйте временной ряд в соответствии с Equation 3, где I(t) — интенсивность. В качестве альтернативы, для анализа исходных данных выполняйте коррекцию фона с помощью программного обеспечения с открытым исходным кодом с реализованными алгоритмами33 катящегося шара и радиусом катящегося шара, в зависимости от пятна и размера пикселя камеры (например, 50 пикселей).
    2. Определите пространственные положения и амплитуды пятна флуоресценции в пределах определенной области интереса (ROI) (например, 30 x 30 пикселей), подгоняя I(t) в данный момент времени t к двумерной гауссовской функции с плоским наклоном, которая учитывает возможные локальные градиенты освещенности в соответствии с Equation 4. Здесь x = (x, y) — ROI с информацией об интенсивности флуоресценции, A и σ — амплитуда и ширина гаусса, pk — параметры, характеризующие фоновую интенсивность ROI, а μ = (x 0, y 0) определяет положение гаусса. Поток ионов по отдельному каналу определяется параметром А. Траектория канала задается выражением x и позволяет определить боковую подвижность канала. В качестве альтернативы можно определить положение и интенсивность отдельных пятен, используя платформы33 с открытым исходным кодом и подключаемые модули, как описано35,36. Оцените точностьпозиционирования 37 после преобразования показаний камеры EMCCD в числафотонов 38.
    3. Постройте график зависимости амплитуды флуоресценции A от времени и соответствующей траектории x , чтобы определить возможную корреляцию между диффузией канала и потоком ионов через канал. Выполните это с помощью любого графического программного обеспечения. В случае свободного бокового движения канала определите коэффициент боковой диффузии D путем линейной регрессии временной задержки τ и вычислите среднее квадратичное смещение пятен от x в соответствии с Equation 5.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Типичные коэффициенты диффузии17 для TOM-CC и OmpF, свободно движущихся в мембранах DIB, находятся в диапазоне от 0,5 до 1,5мкм 2 с-1. Молекулы, константа диффузии которых составляет менее 0,01 мм2·с-1 , определяются как иммобилизованные17.

Representative Results

Оптическая одноканальная запись без электродов в реальном времени выявляет взаимодействие между боковым движением белка и функцией отдельных ионных каналов в мембранах DIB. Восстановление митохондриального основного комплекса TOM (рис. 1A) в мембрану DIB (рис. 4D) иллюстрирует сильную временную корреляцию между латеральной подвижностью и проницаемостью ионов (рис. 5A). Стробирование TOM-CC, по-видимому, чувствительно к режиму бокового движения17. Движущиеся каналы показывают поток Ca2+ через свои поры и высокую интенсивность точки флуоресценции. Захваченные, неподвижные молекулы демонстрируют низкую и среднюю интенсивность флуоресценции. Для общей поры импорта белка митохондрий TOM-CC этот одномолекулярный подход выявил сильную временную корреляцию между латеральной подвижностью и проницаемостью ионов, предполагая, что канал TOM-CC обладает механочувствительными свойствами17. Боковая остановка свободно движущихся молекул TOM-CC сопровождается частичным или полным закрытием канала TOM-CC. Визуализация мембран DIB с помощью OmpF (рис. 1E и рис. 4F), которая почти полностью встроена в мембрану, не показывает эффектов остановки и движения (рис. 5B). Случайные остановки OmpF не связаны с изменением интенсивности и, таким образом, с закрытием его пор. Основываясь на флуоресцентных сигналах38, точность позиционирования отдельных каналов может быть оценена в диапазоне от 5 до 10 нм. Однако следует отметить, что эта точность не может быть достигнута, если каналы слегка колеблются из-за подвижного закрепления с агарозным гидрогелем, как показано, например, для молекул TOM-CC в промежуточном состоянии со средним корневым смещением 120 нм (рис. 5А).

Figure 1
Рисунок 1: Изоляция TOM-CC. (A) Крио-ЭМ-структура N. crassa TOM-CC30,39. Митохондрии штамма N. crassa, содержащего Tom22 с меткой 6xHis, растворяли в DDM и подвергали аффинной хроматографии Ni-NTA (B) и анионообменной хроматографии (C). (D) SDS-PAGE изолированного TOM-CC. (E) Кристаллическая структура (PDB, 1OPF) и (F) SDS-PAGE очищенной E. coli OmpF. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Блок-схема сборки камеры из ПММА. Шаг 1: Стеклянное покровное стекло покрывается агарозным гидрогелем. Шаг 2: Покровное стекло с спиновым покрытием монтируется в изготовленную по индивидуальному заказу камеру для микроскопии из ПММА. Шаг 3: Дополнительная агароза с низким содержанием расплава добавляется во входное отверстие камеры из ПММА на конфорке с температурой 35 °C. Шаг 4: Липидные монослои образуются вокруг водных капель на границе буфера/масла (слева) и на границе раздела агарозный гидрогель/масло (справа). Шаг 5: Отдельные водные капли пипеткой помещаются в лунки камеры из ПММА для образования липидного бислоя при контакте двух липидных монослоев. Шаг 6: Формирование мембран DIB подтверждается с помощью модуляционно-контрастной микроскопии Гофмана. Шаг 7: Изображения выбранных участков мембран DIB со вставленными ионными каналами получены с помощью TIRF-микроскопии. Зеленый: 0,75% агарозы; желтый: 2,5% агарозы, содержащей ионыCa2+ ; пурпурный: липидная/масляная фаза; темно-синий: водный буфер для капель, содержащий Ca2+-чувствительный краситель и белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Экспериментальная установка. (A) Схематическое изображение мембраны DIB в скважине из ПММА. Бислой опирается на ультратонкую 0,75% агарозную пленку, что позволяет TIRF визуализировать поток Ca 2+ через ионный канал с течением времени с использованием Ca 2+-чувствительного флуоресцентного красителя (Fluo-8) в транс. (B) Поток Ca2+ контролируется исключительно осмотическим давлением от цис-к к транс. Это позволяет как определять положение в мембране, так и открыто-закрытое состояние канала. Показанный здесь канал является белок-проводящим каналом TOM-CC митохондрий N. crassa 30. (C) Траектория одного канала TOM-CC. Зеленый: движущийся канал; Желтый: неподвижный канал. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Визуализация TOM-CC и OmpF в мембранах DIB. (A) Мембрана DIB, визуализированная с помощью модуляционно-контрастной микроскопии Гофмана, показывающая область двухслойного контакта между гидрогелем и каплей. (B) Сломанная мембрана DIB, изображенная как на (A). Стрелка, край камеры из ПММА. (C) Мембрана DIB, визуализированная с помощью микроскопии TIRF, без белковых каналов. (D) Мембрана DIB с восстановленным TOM-CC, визуализированная с помощью микроскопии TIRF. Белыми квадратами отмечены пятна высокой (SH), промежуточной (SI) и низкой (SL) интенсивности. (E) Подгонка профиля интенсивности флуоресценции трех пятен, отмеченных в (A), к двумерным гауссовским функциям позволяет выявить положение отдельных TOM-CC и потока Ca2+ через канал. (F) Мембрана DIB с восстановленным OmpF. (G) Гауссова подгонка флуоресцентного пятна, отмеченного в (F). В отличие от двухпорового белкового комплекса TOM-CC с β стволами, трехпористый β-ствольный OmpF обнаруживает только одно состояние проницаемости. Размер пикселя, 0,16 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Активность канала коррелирует с латеральной подвижностью TOM-CC. (A) Флуоресцентный амплитудный след (вверху) и соответствующая траектория (внизу) TOM-CC указывают на то, что активность открытого и закрытого канала TOM-CC коррелирует с подвижностью латеральной мембраны комплекса. Траектория отображает три состояния проницаемости. Зеленый: полностью открытое состояние; желтый: промежуточное состояние проницаемости; красный: состояние закрытого канала; Красная звезда: TOM-CC в промежуточном состоянии колеблется вокруг своего среднего положения примерно на ±60 нм. Позиционная точность37 на основе сигналов флуоресценции в полностью открытом и промежуточном состояниях находится в диапазоне от 5 нм до 10 нм. (B) Трасса амплитуды флуоресценции (вверху) и соответствующая траектория (внизу) OmpF. OmpF показывает только один уровень интенсивности, независимо от того, находится ли он в движении или в ловушке. Сегменты траектории, соответствующие периодам времени захваченных молекул, отмечены серым цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Буфер  Концентрации реагентов Том
А1* 20 мМ трис-HCl рН 8,5, 0,1 % (мас.) н-додецил-β-D-мальтозид (DDM), 10% (об. / об.) глицерина, 300 мМ NaCl и 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF) 100 мл
А2* 20 мМ Tris-HCl pH 8,5, 0,1% (мас./об.) DDM, 10% (об./об.) глицерина, 1 М имидазола и 1 мМ PMSF 100 мл
В1* 20 мМ HEPES pH 7,2, 0,1% (мас./об.) DDM, 2% (об./об.) диметилсульфоксид (ДМСО) 100 мл
В2* 20 мМ HEPES pH 7,2, 0,1% (мас./об.) DDM, 1 М KCl, 2% (об./об.) диметилсульфоксида (ДМСО) 100 мл
* Перед использованием дегазируйте и пропустите через фильтр 0,22 мкм.

Таблица 1: Буферные решения для изоляции TOM-CC.

Буфер  Концентрации реагентов Том
ФУНТ* 1% (мас./об.) триптона, 1% (мас./об.) NaCl и 0,5% (мас./об.) дрожжевого экстракта 1100 мл
С1 2 мМ MgCl2 и ~ 750 единиц ДНК и 50 мМ Tris-HCl pH 7,5 20 мл
С2 50 мМ Tris-HCl, рН 7,5 50 мл
С3 4% (мас./об.) додецилсульфат натрия (SDS), 2 мМ β-меркаптоэтанол и 50 мМ Tris-HCl pH 7,5 50 мл
С4 2% (мас./об.) SDS, 500 мМ NaCl и 50 мМ Tris-HCl pH 7,5 50 мл
С5 0,5% (мас./об.) октилполиоксиэтилена (октил POE), 1 мМ ЭДТА и 20 мМ Tris pH 8,5 1000 мл
* Стерилизуйте перед использованием.

Таблица 2: Буферные растворы для изоляции OmpF.

Discussion

Представленный здесь протокол представляет собой введение в использование мембран DIB для изучения взаимодействия между движением боковых ионных каналов и функцией канала с использованием одномолекулярной микроскопии TIRF. Для получения наилучших данных подготовка стабильных мембран DIB с как можно большим количеством хорошо разделенных каналов имеет решающее значение для получения временных рядов отдельных частиц, которые могут быть удовлетворительно проанализированы.

Критические параметры, подлежащие оптимизации, включают выбор липидов, концентрацию липидов в масляной фазе, а также концентрации белка и детергента в водных каплях. Используемые липиды необычны тем, что они не показывают четкого фазового перехода при низких температурах. DPhPC является широко используемым липидом для получения стабильных мембранных систем40. В принципе, любой липид, который поддерживает свою текучую среду при низких температурах, может быть пригоден для этого применения. Кроме того, липид не должен быть чувствителен к окислению. Концентрация моющего средства в каплях должна быть как можно ниже, чтобы избежать разрыва мембраны. Стабильные мембраны и хорошие скорости включения белка обычно достигаются при концентрациях детергента ниже критической концентрации мицелл (CMC), учитывая, что мембранный белок не выпадает в осадок.

Если мембраны DIB не переносят специфических детергентов21,41 или если белки не интегрируются из раствора с низким содержанием детергента в мембраны DIB, белковые каналы могут быть сначала восстановлены в небольшие однослойные липидные везикулы (SUV), которые затем сливаются с мембранами DIB со стороны капель, как было успешно показано для E. coli MscL 42 . Иногда мембраны DIB не образуются, потому что концентрация липидов в масляной фазе слишком низкая. Чтобы предотвратить разрыв мембран DIB, следует также знать, что осмотическое давление между гидрогелем и каплей должно быть точно сбалансировано, не влияя чрезмерно на поток Ca2+ из цис-в в транс. Оптимизированная толщина агарозы и размер ячеек, по-видимому, имеют решающее значение для наблюдения за диффузией мембранных белков. Следует избегать высыхания слоя агарозы. Толщину можно определить с помощью атомно-силовой микроскопии17. Изменяя концентрацию агарозы, объем и скорость вращения во время отжима, можно оптимизировать размер ячеек и толщину гидрогеля. Обратите внимание, однако, что толщина слоя гидрогеля влияет на контрастность изображения. Для захвата мембранных белков в DIB гидрогель агарозы может быть заменен специально синтезированной, несшитой, модифицированной Ni-NTA, легкоплавкой агарозой, чтобы улавливать их с помощью His-tag17. Чрезмерно высокий фон флуоресценции часто вызван разрывом мембран DIB. Это особенно актуально для многолуночных камер, поскольку Ca2+-чувствительный краситель диффундирует в гидрогель. В этом случае следует избегать соседних колодцев. Флуоресцентное отбеливание Ca2+-чувствительного красителя над мембраной не должно быть существенным ограничивающим фактором, так как он заменяется невозбужденными красителями в основной массе капли (рис. 3А) за пределами мимолетного поля TIRF. Точность локализации белка определяется точностью подгонки пятен и размером пикселя.

Слабые флуоресцентные сигналы могут быть вызваны низким потоком Ca2+ через канал. Возможные причины включают: (i) неточные настройки TIRF (например, интенсивность лазера), (ii) осмотическое давление Ca2+ через мембрану или (iii) внутренняя проницаемость каналов Ca2+ слишком низкая. Чтобы справиться с первой проблемой, необходимо оптимизировать интенсивность лазера, угол TIRF и усиление камеры. Последние две проблемы могут быть преодолены путем приложения электрического потенциала через мембрану 2,43. Однако применение внешних напряжений может исказить результат, так как электрические эффекты могут влиять на открытие канала лиганд-управляемых или механочувствительных ионных каналов, которые на самом деле не контролируются напряжением. Примерами таких каналов являются митохондриальный белок транслоказ TOM-CC27 и его каналообразующая субъединица Tom40 26,44,45,46. Наконец, следует отметить, что введение мембранных белков в мембраны DIB в определенной ориентации для достижения желаемой функциональности является сложной задачей, и количественные исследования редки47,48. В некоторых случаях ориентация интегрированных белков случайна. Это серьезная проблема для изучения мембранных белков, потому что некоторые мембранные белки активируются только на одной стороне мембраны.

Микроскопия TIRF является мощным методом для обработки одномолекулярных событий в планарных мембранах49. Примеры включают выяснение пути сборки и сворачивания канальных белков, таких как α-гемолизин50, перфринголизин O 51 и OmpG52. Эти исследования включали FRET в качестве дополнительного метода. Кроме того, активация механочувствительного ионного канала MscL ранее была изучена путем механической стимуляции поддерживаемых бислоев42 DIB с использованием измерений тока. Основываясь на этой работе, будущие исследования могли бы объединить описанную здесь платформу с одномолекулярными экспериментами FRET для оптического обращения к механочувствительным каналам на уровне одной молекулы17. Впрыскивание буфера в каплю, растягивание внутреннего монослоя DIB или целенаправленное связывание отдельных каналов с нижележащим гидрогелем может быть использовано для дальнейшего изучения не только физического механизма механически активированных каналов, которые реагируют на натяжение и/или искривление мембраны, как показано для MscL и MscS, двухпорового домена K+-каналов, TREK-1, TREK-2, и TRAAK, и PIEZO (для обзора см.53), а также локальное связывание с клеточным цитоскелетом, как показано для сенсорного ионного канала NOMPC54,55.

Disclosures

Мы не заявляем о конфликте интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим Беате Ничке за помощь в подготовке белка, а также Робина Гоша, Михаэля Швайкерта (Штутгарт) и Максимилиана Ульбриха (Фрайбург) за содержательные обсуждения. Эта работа была поддержана Штутгартским исследовательским центром системной биологии (SRCSB) и грантом Фонда Баден-Вюртемберга (BiofMO-6 to SN).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850356C
100x Oil objective Apochromat N.A. 1.49 Nikon MRD01991 TIRF microscope 
10x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.25  Nikon Microscope to assess DIB membrane formation  
10x objective N.A. 0.25 Nikon MRL00102 TIRF microscope 
40x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.55 Nikon Microscope to assess DIB membrane formation  
488 nm laser, 100 mW   Visitron TIRF microscope 
Adhesive tape
Äkta pure   Cytiva Protein purification system
Bradford assay kit, Pierce Thermo Fisher  23236
CaCl2 Roth 5239.2
Chelax 100 resin Biorad 143-2832
Chloroform  Sigma-Aldrich MC1024452500
Dialysis cassettes Slide-A-Lyzer 20 k MWCO Thermo Fisher  87735
DIB chamber  Custom made PMMA chamber for DIB membranes
Digital power meter and energy console Thorlabs PM100D Laser power meter 
Dimethyl sulfoxide Roth  4720.1
Double distilled H2O
Eclipse TS 100 Hoffmann modulation contrast microscope  Nikon Microscope to assess DIB membrane formation  
EDTA Roth 8042.2
EMCCD camera iXon Ultra 897 Andor TIRF microscope 
Ethanol Sigma-Aldrich 32205-M
Fixed angle rotor Ti70 Beckman Coulter
Fluo-8, CalciFluorTM Santa Cruz Biotechnology SC-362561 Ca2+-sensitive dye
French press cell disruption homogenizer Igneus Igneus 40000 psi
GFP filter AHF Filter seeting used for excitation of DIB-membranes by epifluorescence with white light source 
Glass capillaries World Precision Instruments 4878
Glass coverslips 40 mm x 24 mm x 0.13 mm Roth 1870.2
Glycerol Roth 3783.2
Hamilton syringe 10 mL Roth X033.1
Hamilton syringe 100 mL Roth X049.1
Hamilton syringe 500 mL Roth EY49.1
Heating block  Eppendorf Thermomixer comfort
Heating plate Minitube  HT200
Hepes Roth  9205.3
Hexadcane Sigma-Aldrich 296317
His Trap HP 1 mL Cytiva 29051021 Ni-NTA column
Imidazole Sigma-Aldrich 1.04716.1000
KCl Honeywell 10314243
KLM spin coater  Schaefer Tec SCV-10
List medical L/M-3P-A vertical pipette puller Artisan Technology Group 57761-1
Low melting point agarose Sigma-Aldrich  A9414
M8 Stereomicroscope Wild Stereomicrosope 
Matlab  MathWorks R2022a
Methanol Sigma-Aldrich 34860
MicroFil pipette tips World Precision Instruments MF34G-5
N2 gas
NaCl Roth 3957.1
Nanoliter 2010 injector  World Precision Instruments Nanoliter 2010 
n-dodecyl-b-D-maltoside Glycon Biochemicals D97002-C
Ni-NTA agarose, non-crosslinked Cube Biotech 124115393 Custom made
NIS-Elements AR software Nikon MQS31100/MQS42560/MQS42580/MQS42780/MQS41930 Imaging software
n-octyl-polyoxyethylene Sigma-Aldrich 40530
O2 gas
Phenylmethylsulfonyl fluoride Roth  6367.3
Photodiode sensor  Si, 400 - 1100 nm, 500 mW Thorlabs S130C Sensor for laser power meter 
Plasma cleaner Diener Electronics Zepto
Preparative ultracentrifuge Optima Beckman Coulter
Quad-band TIRF-filter 446/523/600/677 HC AHF Filter setting used for excitation of DIB-membranes with 488 nm laser 
Resource Q 1 mL Cytiva 17117701 Anion exchange column
Silicon oil AR 20 Sigma-Aldrich 10836
Sodium dodecyl sulfate Roth 2326.2
Super LoLux camera JVC Stereomicrosope 
Thermoshaker Gerhardt THL 500/1
Ti-E Fluorescence microscope   Nikon MEA53100
Tris-HCl Sigma-Aldrich 9090.3
Tryptone Roth 8952.2
Ultrasonic bath  Bandelin Sonorex RK 100
Vaccum pump Vacuubrand MD 4C NT
White light source for epifluorescence illumination (100 W) Nikon MBF72655 TIRF microscope 
Yeast extract Roth 2363.2
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437 (7059), 656-663 (2005).
  2. Leptihn, S., et al. Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil. Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).
  3. Thompson, J. R., Heron, A. J., Santoso, Y., Wallace, M. I. Enhanced stability and fluidity in droplet on hydrogel bilayers for measuring membrane protein diffusion. Nano Letters. 7 (12), 3875-3878 (2007).
  4. Kusumi, A., et al. Paradigm shift of the plasma membrane concept from the two-dimensional continuum fluid to the partitioned fluid: high-speed single-molecule tracking of membrane molecules. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 34 (1), 351-378 (2005).
  5. Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems. Biophysical Journal. 60 (4), 910-921 (1991).
  6. Kusumi, A., Shirai, Y. M., Koyama-Honda, I., Suzuki, K. G. N., Fujiwara, T. K. Hierarchical organization of the plasma membrane: Investigations by single-molecule tracking vs. fluorescence correlation spectroscopy. FEBS Letters. 584 (9), 1814-1823 (2010).
  7. Betaneli, V., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy to examine protein-lipid interactions in membranes. Methods in Molecular Biology. 974, 253-278 (2013).
  8. Ando, T., et al. A high-speed atomic force microscope for studying biological macromolecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (22), 12468-12472 (2001).
  9. Casuso, I., et al. Characterization of the motion of membrane proteins using high-speed atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 7 (8), 525-529 (2012).
  10. Karner, A., et al. Tuning membrane protein mobility by confinement into nanodomains. Nature Nanotechnology. 12 (3), 260-266 (2017).
  11. Rajendran, L., Simons, K. Lipid rafts and membrane dynamics. Journal of Cell Science. 118 (6), 1099-1102 (2005).
  12. Schink, K. O., Tan, K. -W., Stenmark, H. Phosphoinositides in control of membrane dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), 143-171 (2016).
  13. Schafer, D. A. Coupling actin dynamics and membrane dynamics during endocytosis. Current Opinion in Cell Biology. 14 (1), 76-81 (2002).
  14. Lingwood, D., Ries, J., Schwille, P., Simons, K. Plasma membranes are poised for activation of raft phase coalescence at physiological temperature. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (29), 10005-10010 (2008).
  15. Engelman, D. M. Membranes are more mosaic than fluid. Nature. 438 (7068), 578-580 (2005).
  16. Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. The lateral organization and mobility of plasma membrane components. Cell. 177 (4), 806-819 (2019).
  17. Wang, S., et al. Spatiotemporal stop-and-go dynamics of the mitochondrial TOM core complex correlates with channel activity. Communications Biology. 5 (1), 471 (2022).
  18. Ide, T., Yanagida, T. An artificial lipid bilayer formed on an agarose-coated glass for simultaneous electrical and optical measurement of single ion channels. Biochemical and Biophysical Research Communications. 265 (2), 595-599 (1999).
  19. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid bilayer formation by contacting monolayers in a microfluidic device for membrane protein analysis. Analytical Chemistry. 78 (24), 8169-8174 (2006).
  20. Heron, A. J., Thompson, J. R., Mason, A. E., Wallace, M. I. Direct detection of membrane channels from gels using water-in-oil droplet bilayers. Journal of the American Chemical Society. 129 (51), 16042-16047 (2007).
  21. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. Molecular BioSystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  22. Huang, S., Romero-Ruiz, M., Castell, O. K., Bayley, H., Wallace, M. I. High-throughput optical sensing of nucleic acids in a nanopore array. Nature Nanotechnology. 10 (11), 986-991 (2015).
  23. Sackmann, E. Supported membranes: scientific and practical applications. Science. 271 (5245), 43-48 (1996).
  24. Kiessling, V., Yang, S. -T., Tamm, L. K. Supported lipid bilayers as models for studying membrane domains. Current Topics in Membranes. 75, 1-23 (2015).
  25. Murray, D. H., Tamm, L. K., Kiessling, V. Supported double membranes. Journal of Structural Biology. 168 (1), 183-189 (2009).
  26. Hill, K., et al. Tom40 forms the hydrophilic channel of the mitochondrial import pore for preproteins. Nature. 395 (6701), 516-521 (1998).
  27. Poynor, M., Eckert, R., Nussberger, S. Dynamics of the preprotein translocation channel of the outer membrane of mitochondria. Biophysical Journal. 95 (3), 1511-1522 (2008).
  28. Künkele, K. P., et al. The preprotein translocation channel of the outer membrane of mitochondria. Cell. 93 (6), 1009-1019 (1998).
  29. Ahting, U., et al. The TOM core complex: the general protein import pore of the outer membrane of mitochondria. The Journal of Cell Biology. 147 (5), 959-968 (1999).
  30. Bausewein, T., et al. Cryo-EM structure of the TOM core complex from Neurospora crassa. Cell. 170 (4), 693-700 (2017).
  31. Cowan, S. W., et al. Crystal structures explain functional properties of two E. coli porins. Nature. 358 (6389), 727-733 (1992).
  32. Bieligmeyer, M., et al. Reconstitution of the membrane protein OmpF into biomimetic block copolymer-phospholipid hybrid membranes. Beilstein Journal of Nanotechnology. 7, 881-892 (2016).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  34. Vicente, N. B., Zamboni, J. E. D., Adur, J. F., Paravani, E. V., Casco, V. H. Photobleaching correction in fluorescence microscopy images. Journal of Physics: Conference Series. 90 (1), 012068 (2007).
  35. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  36. Ershov, D., et al. TrackMate 7: integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines. Nature Methods. 19 (7), 829-832 (2022).
  37. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  38. Hirsch, M., Wareham, R. J., Martin-Fernandez, M. L., Hobson, M. P., Rolfe, D. J. A stochastic model for electron multiplication charge-coupled devices - From theory to practice. PLoS One. 8 (1), 53671 (2013).
  39. Bausewein, T., Naveed, H., Liang, J., Nussberger, S. The structure of the TOM core complex in the mitochondrial outer membrane. Biological Chemistry. 401 (6-7), 687-697 (2020).
  40. Lindsey, H., Petersen, N. O., Chan, S. I. Physicochemical characterization of 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine in model membrane systems. Biochimica et Biophysica Acta. 555 (1), 147-167 (1979).
  41. Manafirad, A. Single ion-channel analysis in droplet interface bilayer. Methods in Molecular Biology. 2186, 187-195 (2021).
  42. Rosholm, K. R., et al. Activation of the mechanosensitive ion channel MscL by mechanical stimulation of supported Droplet-Hydrogel bilayers. Scientific Reports. 7 (1), 45180 (2017).
  43. Wang, Y., et al. Electrode-free nanopore sensing by DiffusiOptoPhysiology. Science Advances. 5 (9), (2019).
  44. Ahting, U., et al. the pore-forming component of the protein-conducting TOM channel in the outer membrane of mitochondria. The Journal of Cell Biology. 153 (6), 1151-1160 (2001).
  45. Romero-Ruiz, M., Mahendran, K. R., Eckert, R., Winterhalter, M., Nussberger, S. Interactions of mitochondrial presequence peptides with the mitochondrial outer membrane preprotein translocase TOM. Biophysical Journal. 99 (3), 774-781 (2010).
  46. Kuszak, A. J., et al. Evidence of distinct channel conformations and substrate binding affinities for the mitochondrial outer membrane protein translocase pore Tom40. The Journal of Biological Chemistry. 290 (43), 26204-26217 (2015).
  47. Yanagisawa, M., Iwamoto, M., Kato, A., Yoshikawa, K., Oiki, S. Oriented reconstitution of a membrane protein in a giant unilamellar vesicle: Experimental verification with the potassium channel KcsA. Journal of the American Chemical Society. 133 (30), 11774-11779 (2011).
  48. Goers, R., et al. Optimized reconstitution of membrane proteins into synthetic membranes. Communications Chemistry. 1, 35 (2018).
  49. Castell, O. K., Dijkman, P. M., Wiseman, D. N., Goddard, A. D. Single molecule fluorescence for membrane proteins. Methods. 147, 221-228 (2018).
  50. Thompson, J. R., Cronin, B., Bayley, H., Wallace, M. I. Rapid assembly of a multimeric membrane protein pore. Biophysical Journal. 101 (11), 2679-2683 (2011).
  51. Senior, M. J. T., et al. Single-molecule tracking of perfringolysin O assembly and membrane insertion uncoupling. The FEBS Journal. , (2022).
  52. Weatherill, E. E., et al. Fast slow folding of an outer membrane porin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (20), 2121487119 (2022).
  53. Kefauver, J. M., Ward, A. B., Patapoutian, A. Discoveries in structure and physiology of mechanically activated ion channels. Nature. 587 (7835), 567-576 (2020).
  54. Yan, Z., et al. Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation. Nature. 493 (7431), 221-225 (2013).
  55. Wang, Y., et al. The push-to-open mechanism of the tethered mechanosensitive ion channel NompC. eLife. 10, 58388 (2021).

Tags

Биохимия выпуск 192
Одномолекулярная визуализация латеральной подвижности и активности ионных каналов в липидных бислоях с использованием флуоресцентной микроскопии с полным внутренним отражением (TIRF)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, S., Nussberger, S.… More

Wang, S., Nussberger, S. Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy. J. Vis. Exp. (192), e64970, doi:10.3791/64970 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter