Summary
פרוטוקול זה מתאר את הליך עריכת הגנום במקרופאגים שמקורם במח עצם עכבר באמצעות קומפלקסים של Cas9-sgRNA ribonucleoprotein המורכבים במבחנה ומועברים על ידי אלקטרופורציה.
Abstract
מקרופאגים שמקורם במח עצם (BMDM) מעכברים הם כלי מפתח לחקר הביולוגיה המורכבת של מקרופאגים ברקמות. כתאים ראשוניים, הם מדגימים את הפיזיולוגיה של מקרופאגים in vivo באופן הדוק יותר מאשר שורות תאי מקרופאגים אימורטליים, וניתן לגזור אותם מעכברים שכבר נושאים שינויים גנטיים מוגדרים. עם זאת, שיבוש תפקוד הגנים ב- BMDM נותר מאתגר מבחינה טכנית. כאן, אנו מספקים פרוטוקול לעריכת גנום CRISPR/Cas9 יעילה ב- BMDM, המאפשר החדרה של החדרות ומחיקות קטנות (indels) הגורמות למוטציות frameshift המשבשות את תפקוד הגנים. הפרוטוקול מתאר כיצד לסנתז RNA מדריך יחיד (sgRNA-Cas9) וליצור קומפלקסים מטוהרים של ריבונוקלאו פרוטאין sgRNA-Cas9 (RNPs) שניתן להעביר באמצעות אלקטרופורציה. הוא גם מספק שיטה יעילה לניטור יעילות העריכה באמצעות ריצוף Sanger שגרתי ותוכנית ניתוח מקוונת זמינה באופן חופשי. הפרוטוקול יכול להתבצע בתוך שבוע ואינו דורש בניית פלסמיד; התוצאה היא בדרך כלל יעילות עריכה של 85% עד 95%.
Introduction
מקרופאגים הם תאי חיסון מולדים הממלאים תפקידים קריטיים בתיקון רקמות ובמערכת החיסון 1,2. לקווי תאי מקרופאגים אימורטליים, כגון תאי עכבר RAW 264.7 או תאי THP-1 אנושיים, יש מספר מאפיינים מועילים, כולל צמיחה חזקה וקלות של שיבוש גנים על ידי העברת וקטורים להפרעות RNA או CRISPR/Cas9 3,4. עם זאת, טרנספורמציה אונקוגנית משנה באופן דרמטי את הפיזיולוגיה שלהם, מה שמביא להפעלה חריגה של מסלולים מסוימים ותגובות מושתקות של אחרים 5,6. מקרופאגים ראשוניים שמקורם במח עצם (BMDMs) דומים יותר לפיזיולוגיה של מקרופאגים in vivo, אך עדיין מאתגרים למניפולציה גנטית בשל היעילות הנמוכה הן של טרנספקציית פלסמיד והן של התמרה נגיפית בתאי חיסון ראשוניים אלה 7,8. לפיכך, יש צורך בשיטות יעילות יותר לשיבוש תפקוד הגנים.
עריכת גנום CRISPR/Cas9 היא כלי רב עוצמה למניפולציה גנטית במגוון מערכות ביולוגיות, כולל תאי יונקים 9,10,11,12. חלבון Streptococcus pyogenes Cas9 קוטע ביעילות ובאופן ספציפי DNA דו-גדילי כאשר הוא מורכב עם RNA מנחה ספציפי לרצף. תיקון DNA באמצעות חיבור קצה לא הומולוגי (NHEJ) של הדנ"א השסוע גורם להחדרות או מחיקות קטנות (indels) היוצרות מוטציות frameshift. במחקרים מוקדמים, Cas9 ו-sgRNA הועברו באמצעות וקטורים פלסמידים או לנטי-ויראליים, שהם שיטות העברה יעילות עבור קווי תאים רבים 9,10. עם זאת, תאים ראשוניים, ובמיוחד תאים חיסוניים ראשוניים, הם לעתים קרובות עקשנים לשיטות אלה בשל היעילות הנמוכה של העברת וקטורים על ידי טרנספקציה או טרנסדוקציה. לאחר מכן, פותחו שיטות ליצירת קומפלקסים sgRNA-Cas9 במבחנה ולהעברתם באמצעות אלקטרופורציה, ושיטות אלה השיגו יעילות גבוהה במגוון סוגי תאים13,14. התוצאות הצביעו על האפשרות להשתמש בגישה זו לביצוע עריכת גנום במקרופאגים ראשוניים.
כאן, אנו מספקים פרוטוקול לשימוש בקומפלקסים של ריבונוקלאו פרוטאין sgRNA-Cas9 (RNPs) לביצוע עריכת גנום ב- BMDM ראשוניים. הוא מכיל צעדים להפחתת ההפעלה של חיישני החיסון הנמצאים בתאי חיסון ראשוניים ומביא לעריכה של עד 95% באתרים ממוקדים עם רעילות מינימלית. פרוטוקול זה כולל גם זרימות עבודה להערכת יעילות העריכה באמצעות תגובת שרשרת שגרתית של פולימראז (PCR) וריצוף Sanger, ולאחר מכן ניתוח סיליקו על ידי Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)15, כלי תוכנה מקוון מאומת היטב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תכנון sgRNA
הערה: שלב זה מתאר בחירה של רצפי היעד ועיצוב של sgRNAs. כדאי לתכנן מדריכים שנמצאים באקסון הקידוד הגדול הראשון, כך שכל חלבון מתורגם משתבש בשלב מוקדם במסגרת הקריאה הפתוחה. כדאי גם לבחור רצפי יעד שנמצאים באותו אקסון, מכיוון שזה ייעל את ניתוח יעילות העריכה (שלב 6). הדוגמאות לעריכת גנום שסופקו עם פרוטוקול זה השתמשו ב- sgRNA המכוון לאקסון הראשון של הגן Src ולגן Cblb , כמו גם במיקום Rosa26 שאינו מקודד של גנום העכבר.
- זהה 20 רצפים גנומיים של נוקלאוטידים למטרה, באמצעות אחד מכמה כלי עיצוב מקוונים חינמיים (טבלה 1). בחר ארבעה עד חמישה מדריכים שאינם חופפים בתוך כל גן, מכיוון שפעילות Cas9 משתנה בהתאם למדריך הספציפי שנבחר, וחיזוי מראש של מדריך פעיל מאוד אינו אפשרי.
הערה: חשוב לוודא את הכיוון הנכון של המדריך ביחס לרצף הלוקוס הממוקד. כלי תכנון מספקים בדרך כלל את הרצף המנחה בכיוון 5' עד 3 אינץ', ללא קשר לגדיל הכרומוזומלי הממוקד. כדי לוודא את כיוון הגדיל, בדוק שקיים רצף מוטיב סמוך פרוטוספייסר (PAM) עבור S. pyogenes Cas9 (nGG) מיד 3' של הרצף הגנומי הממוקד. רצף sgRNA אינו כולל את PAM.
2. סינתזת sgRNA
הערה: שלב זה מתאר כיצד לסנתז sgRNA באמצעות PCR כדי ליצור תבנית עבור שעתוק חוץ גופי (IVT), ולאחר מכן לטהר את sgRNA באמצעות עמודות ספין (איור 1A). sgRNA סינתטי מותאם אישית זמין באופן מסחרי דרך מספר ספקים כחלופה ל- PCR/IVT.
- בצע PCR כדי ליצור תבנית IVT עבור T7 RNA פולימראז. תגובת PCR משתמשת בפריימרים אוניברסליים המכילים מקדם RNA פולימראז T7 ורצף CRISPR RNA (tracrRNA) מפעיל טרנס (טבלה 2), בנוסף לפריימרים בודדים קצרים עם רצף מדריך ספציפי לגן.
- זהו שלב הרחבת החפיפה שאינו הגברה. דלל את מאגר ה- PCR ל- 1x והוסף 1 mM MgCl2 נוסף. לאחר מכן, הוסף 0.25 μL של DNA פולימראז באיכות גבוהה, 0.5 mM deoxynucleotide triphosphate (dNTP), 0.02 mM פריימר ספציפי למדריך ופריימר אוניברסלי ארוך הפוך 0.02 mM T7 (טבלה 2) לנפח כולל של 46 μL. לאחר מכן, הניחו את הצינור בתרמוסייקלר והפעילו שני מחזורים של: 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 37 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ו-72 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות. מצננים את התגובות על קרח.
- זהו שלב הגברת ה-PCR. לכל תגובה, הוסף 2 μL של פריימר הגברה קדמית של 25 mM ו- 2 μL של פריימר הגברה הפוכה של 25 mM. נפח התגובה הסופי הוא 50 μL. Denature עבור 30 s ב 95 ° C. לאחר מכן, הפעל 35 מחזורים של: 95 ° C עבור 15 שניות, 65 ° C עבור 20 שניות, ו 72 ° C עבור 15 שניות. בצע הארכה נוספת ב-72°C למשך 2 דקות.
- בדוק את המוצר תגובת PCR על ג'ל אגרוז 2%. PCR חופף-מאריך יוצר מולקולת dsDNA של 127 bp עם מקדם T7 במעלה הזרם של מדריך הנוקלאוטידים 20 הספציפי לגן וה-tracrRNA מיד במורד הזרם (איור 1B).
- טיהור תבנית IVT: ישנם פרוטוקולים וערכות רבים שעובדים היטב עבור זה. פרוטוקול זה משתמש בחרוזי אימוביליזציה הפיכה בשלב מוצק (SPRI). מערבבים 50 μL של מוצר PCR עם 90 μL של חרוזים ופעל לפי הוראות היצרן. יש לחדד את הדנ"א על ידי הוספת 40 μL של חיץ (5 mM Tris, 0.1 mM ethylenediaminetetraacetic acid [EDTA]) ולחמם ב-65°C למשך 5 דקות.
- למדוד את ריכוז הדנ"א של תבנית IVT באמצעות בליעה באורך גל של 260 ננומטר. ריכוז DNA של לפחות 50 ng/μL נדרש עבור IVT. ניתן לאחסן את תבנית IVT ב -20 °C.
- תגובת IVT
- השתמש בערכה מסחרית שנועדה להפיק תפוקות גבוהות של IVT (ראה טבלת חומרים). עקוב אחר המלצות היצרן לביצוע תגובת IVT. שימוש בתבנית IVT של 250 ננוגרם בתגובה של 20 μL, דוגרים בטמפרטורה של 37°C למשך 4-16 שעות.
- בדוק את מוצר sgRNA IVT על ידי הפעלת 1 μL של התגובה על ג'ל אגרוז 2%. יש לצפות ברצועת רנ"א בהירה, הפועלת בדומה ל-dsDNA של 70 bp (איור 1C). למרות שהדבר אינו חובה, כדי להשיג רצועות חדות ופתורות יותר, השתמשו במאגר דגימת RNA עם אוריאה, ונטרלו את הדגימה בטמפרטורה של 65°C למשך 5 דקות לפני הטעינה.
הערה: ניתן לראות פסים קלושים בעלי משקל מולקולרי גבוה יותר והבדלי נדידה קלים עם כמה רנ"א מנחה עקב הבדלים במבנה המשני של הרנ"א.
- Dephosphorylate מוצר sgRNA IVT כדי למזער את ההפעלה של RIG-I (חיישן RNA זר) ואת המוות התא לאחר מכן לאחר אלקטרופורציה. עבור כל תגובת IVT של 20 μL, הוסף 69 μL של מים ברמה מולקולרית ו- 15 U של פוספטאז מעיים של עגל (CIP) במאגר CIP אחד. לדגור במשך 2 שעות ב 37 ° C.
- יש להשפיל את תבנית ה-IVT כדי למזער את ההפעלה של חיישני דנ"א תאי, הגורמים למוות תאי בעקבות התחשמלות. לכל תגובת IVT, הוסף 2 U של DNase ללא RNase. יש לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37°C. מוצר IVT ניתן לאחסן ב -20 ° C ליום אחד או -80 ° C במשך מספר חודשים.
- לטהר את מוצר IVT באמצעות עמודות ספין. עבור שלב זה, ערכות טיהור חרוזים SPRI נחותות.
- קשרו את הרנ"א לעמודה על ידי הוספת 220 מיקרוליטר של חיץ קשירה למוצר IVT, ואחריו 1 מ"ל של אתנול 100% ברמה ביולוגית מולקולרית. מערבבים היטב וטוענים את העמודה. לאחר מכן, בצע את הוראות היצרן. בצע את השטיפה הסופית בארון בטיחות ביולוגית של זרימה למינרית כדי למנוע זיהום של sgRNA.
- בצע את elution במכסה המנוע זרימה למינרית כדי למנוע זיהום. יש להקפיד על הרנ"א באמצעות 30 μL של חיץ טריס סטרילי של 10 mM (pH 8.0).
- למדוד את ריכוז sgRNA על ידי מדידת הבליעה באורך גל של 260 ננומטר.
הערה: תפוקות sgRNA טיפוסיות הן לפחות 100 מיקרוגרם. - אחסנו את ה-sgRNA בטמפרטורה של -80°C. בצע aliquots כדי למנוע יותר משלושה מחזורי הקפאה-הפשרה.
3. הכנה לאלקטרופורציה
הערה: יש לבצע את כל השלבים במכסה מנוע זרימה למינרית כדי למנוע זיהום. פרוטוקול זה משתמש במערכת אלקטרופורציה זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים) עם קצוות של 10 μL.
- הפשירו את ה-BMDMs 48-72 שעות לפני השימוש והרחיבו אותם על צלחות שאינן מטופלות בתרבית רקמות (TC).
הערה: לכל תגובה, 4 x 105 תאים נדרשים. - לעקר צינורות PCR להרכבת תגובה. הכינו צינור PCR אחד לכל תגובה, וחממו אותם בתרמוסייקר למשך 10 דקות ב 98 מעלות צלזיוס. הכינו את הצינורות בקבוצות ואחסנו אותם סגורים. הניחו את צינורות ה-PCR המעוקרים על קרח כשהם מוכנים לשימוש.
- נקו את תחנת פיפטה עם 70% אתנול והניחו אותה במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית. הגדר את הפרמטרים ל- 1,900 V, 20 אלפיות השנייה ופעימה אחת.
- הסר צינור transfection מן החבילה בזהירות לשמור אותו סטרילי ולמלא אותו עם 3 מ"ל של "E" חיץ. ודא שמאגר E נמצא בטמפרטורת החדר לפני ההתחשמלות. הכנס את הצינור לתחנה ודחוף אותו למטה עד שהוא לוחץ.
- עבור כל תגובה, aliquot 2.5 μL של sgRNA בריכוז של 1,100 ng/μL. לדלל את sgRNA במי מלח חוצצים פוספט קר (PBS) עם 0.9 mM CaCl2 ו 0.5 mM MgCl2 (PBS + Ca / Mg). השאירו אותו על קרח.
- הכינו שתי צלחות: צלחת לא מצופה 12 בארות לתאים וצלחת נוספת בת 24 בארות לאחיזת מצע התרבית. Aliquot 1.5 מ"ל של מדיום ללא אנטיביוטיקה לכל תגובה לתוך הבארות של צלחת 24 בארות.
- הכינו חלבון Cas9. ישנם מספר ספקים מסחריים ואקדמיים של חלבון Cas9 מטוהר סטרילי. לדלל Cas9 לריכוז סופי של 20 מיקרומטר עם PBS קר + Ca / Mg. עבור כל תגובת אלקטרופורציה, aliquot 1 μL של 20 μM Cas9 לתוך צינורות PCR סטריליים. השאירו על קרח.
- הכינו תאים להתחשמלות.
- הסר את מדיום הגידול. שטפו את התאים באמצעות PBS ללא CaCl2 ו-MgCl2 (PBS-Ca/Mg) כדי להסיר את הסרום ואת הקטיונים הדו-ערכיים המקדמים הידבקות. לאחר מכן, להוסיף PBS + 1 mM EDTA ולדגור בטמפרטורת החדר במשך כ 5 דקות עד התאים מתחילים להתנתק.
- פיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי לנתק את התאים. מעבירים את התאים לצינור 15 מ"ל דל חלבון. גלולה את התאים ב 500 x גרם במשך 5 דקות.
הערה: מקרופאגים נצמדים לכלי פלסטיק. השימוש בצינורות צנטריפוגות דלות חלבון משפר באופן משמעותי את תפוקת התא. - עבוד במהירות כדי למנוע דגירה ממושכת של תאים ב- PBS + EDTA. הסר את רוב supernatant, משאיר כ 1 מ"ל של supernatant בצינור. משעים מחדש את התאים בסופרנטנט הנותר, ולאחר מכן מעבירים לצינור מיקרופוגה דל חלבון בנפח 1.5 מ"ל.
- הסר aliquot קטן של תאים כדי לספור. משחררים את התאים הנותרים על ידי צנטריפוגה ב 500 x גרם בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
- במהלך הצנטריפוגה, ספרו את התאים וחממו את צינורות Cas9 ו-sgRNA לטמפרטורת החדר.
- מוציאים את כל הסופרנאטנט מכדורית התא. להשהות מחדש את התאים PBS + Ca / Mg בריכוז של 4 x 107 תאים / מ"ל (4 x 105 תאים לכל 10 μL תגובה).
הערה: כל ערכה מסופקת עם כמות מוגבלת של מאגר אלקטרופורציה (Buffer R, Buffer T). עם זאת, אנו מוצאים כי יעילות אלקטרופורציה באמצעות PBS + Ca / Mg שווה ערך למאגרים הקנייניים. - בעת אלקטרופורציה של sgRNA עבור גנים שונים, יש לחבר את התאים לצינורות שונים בעלי קישור חלבון נמוך עבור כל גן כדי למנוע זיהום צולב בין sgRNAs. שמרו את התאים בטמפרטורת החדר עד שיהיו מוכנים להתחשמלות.
4. הרכבת RNP
- שמור את sgRNA ו Cas9 בטמפרטורת החדר על מנת למנוע משקעים. הוסף 2.5 μL של sgRNA ל 1 μL של Cas9 מדולל בצינורות PCR מעוקרים. יש לפזר את ה-sgRNA באיטיות מעל 15 שניות עם ערבוב כדי למנוע משקעים.
- יש לדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר היווצרות קומפלקס RNP.
5. משלוח RNP על ידי אלקטרופורציה
- הכינו את קצה האלקטרופורציה (קובטה). לחץ על הבוכנה כדי להאריך את הגבעול. הכניסו את הגבעול לקצה.
הערה: ודא שהקצה מאובטח ושהבוכנה מחליקה בצורה חלקה ונמשכת מעבר לנדן הקצה. אם הקצה אינו ממוקם כראוי, בועות אוויר עלולות להיות מוחדרות לקצה, מה שגורם לכשל בקצה. - השהה מחדש את התאים על ידי צנרת למעלה ולמטה, ולאחר מכן טען את קצה האלקטרופורציה עם התאים. משכו את מלוא קיבולת הנפח של 10 μL של הקצה, והימנעו מבועות.
- החל מבקרת sgRNA שלילית, העבר 10 μL של תאים בקצה האלקטרופורציה לצינור הדגימה המכיל 3.5 μL של RNP משלב 4. פיפטה למעלה ולמטה שלוש פעמים כדי לערבב היטב. משכו 10 μL מהתערובת בחזרה לקצה, כדי לוודא שאין בועות.
- הכניסו את הקצה לתחנת האלקטרופורציה, והורידו אותו לתוך החיץ. הימנע ממגע עם משטחי פלסטיק עם קצה כדי לשמור על סטריליות. לחץ על Start (התחל ) בתצוגת מסך המגע.
- לאחר השלמתה, התצוגה תציין דופק מוצלח. הסר את פיפטה מהמכשיר ומניחים את התאים בבאר יבשה של צלחת 12 בארות מסומנת, לא מצופה.
- שטפו את הקצה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה פעמיים ב-15 מ"ל של PBS + Ca/Mg. הניחו בצד את הפיפטה כשהקצה עדיין מחובר. ודאו שהקצה לא נוגע בשום דבר ונשאר סטרילי.
הערה: בניסויים רבים, ניתן לעשות שימוש חוזר בקצה עבור דגימות מרובות, כגון לאחר דגימת sgRNA שלילי שלילי לא פעיל, או במהלך ההערכות הראשוניות של פעילות המדריך כאשר ארבעה עד חמישה sgRNA נבדקים לכל גן והקריאה היחידה היא יעילות העריכה. עם זאת, במהלך ניתוח פונקציונלי של תאים ערוכים, מומלץ טיפ חדש לכל גן, שכן כמויות קטנות של sgRNA או נשיאת תאים עלולות להשפיע על תוצאות הניסוי. - מיד להוסיף 1 מ"ל של מדיום ללא אנטיביוטיקה (aliquoted בשלב 3.6) לתאים ולנער בעדינות את הצלחת כדי לערבב.
- חזור על שלבים 5.2-5.6 עבור שאר התגובות.
- מחזירים את התאים לאינקובטור.
- בדוק את הכדאיות של התאים 1-2 שעות לאחר אלקטרופורציה. התאים צריכים להיות >90% דבקים. אופציונלי: הוסף גנטמיצין (5 מיקרוגרם/מ"ל) לתאים 1-2 שעות לאחר האלקטרופורציה כדי לסייע במניעת זיהום אם זה לא יפריע לניסויים במורד הזרם.
6. הערכת יעילות העריכה
הערה: רוב העריכה מסתיימת לאחר 48 שעות.
- בדוק את monolayer התא 48 שעות לאחר electroporation. אם התאים הם מעל 50% confluent, ואז להמשיך הלאה. אם התאים <50% נפגשים, המתן 1-2 ימים נוספים. ניתוח הדנ"א הגנומי כדי לקבוע את יעילות העריכה דורש 1 x 105 תאים, בנוסף לתאים הדרושים לניסוי במורד הזרם.
- הכנת DNA גנומי (gDNA).
- לשטוף את התאים עם PBS (-Ca / Mg). הוסף 1 מ"ל של PBS + 1 mM EDTA. דוגרים בטמפרטורת החדר כ-5 דקות עד שהתאים מתחילים להתנתק מהצלחת.
- נתק את התאים על ידי pipetting. מעבירים לצינור מיקרופוגה דל חלבון.
- ספור את התאים והסר aliquot של 1 x 105 תאים. התאים הנותרים יכולים להיות מצופים מחדש לשימוש בניסויים נוספים. בדרך כלל, הניסויים נערכים 5 ימים לאחר אלקטרופורציה על מנת לאפשר ריקבון של החלבון.
- גלולה את התאים לניתוח gDNA במשך 15 שניות במהירות מקסימלית בצינור מיקרופוגה.
- להשהות את הגלולה ב 50 μL של חיץ ליזיס. מערבולת כדי לנתק את כל התאים הדבוקים לדפנות הצינור, ולחמם ב 98 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי ליזה את התאים ולהשבית DNase אנדוגני.
- מניחים את הצינורות על קרח.
- הוסף 1 μL proteinase K (20 מ"ג / מ"ל). לדגור לפחות 1 שעה ב 37 °C (77 °F); ניתן להשאיר אותו למשך הלילה לנוחיותכם.
- מחממים ל-98°C למשך 10 דקות כדי להשבית את הפרוטאינאז K.
- צנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות במהירות מרבית. הסר את הסופרנטנט, המכיל את הדנ"א. תכשיר גס זה ללא טיהור נוסף עובד היטב עבור רוב תגובות ה- PCR.
- הערך את יעילות העריכה באמצעות רצף Sanger.
- עצבו פריימרים PCR 200-300 bp במעלה הזרם של רוב אתרי מדריך 5' ו 200-300 bp במורד הזרם של אתרי מדריך 3' ביותר. גודל האמפליקון הטיפוסי הוא ~ 500 bp. עצבו פריימר ריצוף מקונן במרחק של לפחות 125 bp מאתר המדריך הקרוב ביותר (איור 2A).
- בצע PCR באמצעות 2 μL של gDNA.
- הכינו את מוצר ה-PCR לריצוף. פרוטוקול זה משתמש בטיפול exonuclease I/shrimp alkaline phosphatase (ExoI/SAP). ערכות טיהור DNA מסחריות עובדות גם הן, אך דורשות זמן רב יותר.
- הכן 15 μL של מוצר PCR. הוסף 7.5 μL מים, 1 μL של 10x ExoI buffer, 10 U של ExoI ו-1 U של SAP כדי לפגוע ב-dNTPs ובפריימרים שמפריעים לריצוף Sanger.
- יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות, ולאחר מכן בטמפרטורה של 85°C למשך 20 דקות כדי להשבית את האנזימים.
- לבצע ריצוף Sanger במוצר PCR המטופל ב- Exo/SAP; השתמש בכמות ידועה של סמן גודל DNA כדי להעריך את גודל מוצר ה- PCR הקיים בדגימה. תגובות הרצף עשויות לדרוש אופטימיזציה, מכיוון שתוכנת TIDE זקוקה לכרומטוגרמות רצף באיכות גבוהה כדי להעריך במדויק את יעילות העריכה. כרומטוגרמת הרצף של הלוקוס הלא ערוך אמורה לספק פסגות ברורות עם רקע מינימלי (איור 2B, C).
- כדי להעריך את יעילות העריכה, השתמש ב- TIDE כדי לנתח את קבצי הכרומטוגרמה של ריצוף Sanger באמצעות gDNA הערוך ו- gDNA הבקרה הלא ערוך. (טבלה 1, איור 2). העלה את קבצי רצף Sanger והפעל את התוכנה עם הגדרות ברירת המחדל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תבנית IVT היא מוצר PCR של 127 bp (איור 1B). תוצר ה-IVT באורך מלא הוא רנ"א של 98 ננוגרם, אשר נודד באופן דומה למקטע דנ"א דו-גדילי של 70 bp (איור 1C).
לאחר אלקטרופורציה, התאים צריכים להיות >90% קיימא, עם ספירת תאים כוללת של >70% ממספר התא ההתחלתי. מאגר התאים המוטנטיים המתקבל צריך לכלול קבוצה מגוונת של אינדלים, החל ליד אתר המחשוף Cas9. ניתוח הגנים הממוקדים על-ידי ריצוף PCR ו-Sanger אמור להראות נוקלאוטידים מרובים בכל מיקום במורד הזרם של אתר המחשוף Cas9 (איור 2).
איור 1: סקירה כללית של תהליך העריכה של sgRNA-Cas9. (A) סכמטי עבור תכנון המדריך, יצירת sgRNA ואספקת Cas9-sgRNA. (B) מוצר PCR של IVT עבור Src sgRNAs 1, 2 ו-3 נפתר על ג'ל אגרוז 2%. החץ מציין את מוצרי ה- PCR הנכונים של 127 bp. (C) מוצרי ה-RNA לאחר IVT עבור Src sgRNA 1, 2 ו-3 נפתרו על ג'ל אגרוז 2%. הסוגריים מציינים את מוצרי sgRNA הנכונים. נדידת המשתנה של sgRNA נובעת ממבנה משני של RNA. איור זה נדפס מחדש מתוך עבודת המאסטר של המחבר הראשון16. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: יעילות עריכה גבוהה שהושגה עבור גנים ממוקדים מרובים. (A) סכמטי של פריימרים לריצוף PCR ו-Sanger. (B) סכמה של זרימת העבודה עבור TIDE כדי להעריך את יעילות העריכה. (C) כרומטוגרמה של ריצוף סנגר מייצג של מוקד ROSA26 מ-BMDMs שהתחשמלו עם sgRNA-Cas9 RNP (למעלה) ו-sgRNA ספציפי ל-ROSA26 (למטה); אתר המחשוף Cas9 מודגש. פלט TIDE (מימין) עם יעילות העריכה המחושבת ואחוז הרצפים המכילים את מספר האינדלים שצוין. (ד,ה) סנגר ריצוף כרומטוגרמות של הגנים (D) Src ו - Cblb ב- BMDM הערוכים. איור זה נדפס מחדש מתוך עבודת המאסטר של המחבר הראשון16. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: עלייה מתונה ביעילות העריכה עקב משפר האלקטרופורציה המסחרי. ה- BMDMs חושמלו עם מדריכים בעלי יעילות נמוכה כדי להעריך את ההשפעה של משפר עריכה מסחרי. לפני ההתחשמלות, 1 μL של המשפר נוסף ל- RNPs שהורכבו לריכוז סופי של 4 מיקרומטר. יעילות העריכה של sgRNA Src המצוין הוערכה באמצעות TIDE. איור זה נדפס מחדש מתוך עבודת המאסטר של המחבר הראשון16. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| שם הכלי | כתובת URL | ||
| Synthego - כלי עיצוב CRISPR | https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-design-tool | ||
| מכון ברוד - CRISPick | https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public | ||
| מעקב אחר Indels על ידי פירוק (TIDE) | http://shinyapps.datacurators.nl/tide/ | ||
טבלה 1: כתובות URL של כלים מקוונים.
| שם פריימר | רצף | ||
| פריימר ספציפי למדריך | ggatcctaatacgactcactatag[N20]gttttagagctagaa | ||
| פריימר ספציפי למדריך - Cbl-b מדריך 3 | ggatcctaatacgactcactatagAAAATATCAAGTATATACGGgttttagagctagaa | ||
| פריימר ספציפי למדריך - Cbl-b מדריך 4 | ggatcctaatacgactcactatagGGTAAAATATCAAGTATATAgttttagagctagaa | ||
| פריימר ספציפי למדריך - Rosa | ggatcctaatacgactcactatagCTCCAGTCTTTCTAGATgttttagagctagaa | ||
| פריימר ספציפי למדריך - ערבול | ggatcctaatacgactcactatagGCACTACCAGAGCTAACTCAgttttagagctagaa | ||
| פריימר ספציפי למדריך - Src Guide 2 | ggatcctaatacgactcactatagTCACTAGACGGGAATCAGAGgttttagagctagaa | ||
| פריימר ספציפי למדריך - Src Guide 5 | ggatcctaatacgactcactatagCAGCAACAAGAGCAAGCCCAgttttagagctagaa | ||
| פריימר ספציפי למדריך - Src Guide 6 | ggatcctaatacgactcactatagAGCCCAAGGACGCCAGgttttagagctagaa | ||
| T7 פריימר אוניברסלי ארוך הפוך | aaaaaaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgaacggactagccttttttaacttgctatttctagctctaaaac | ||
| פריימר הגברה אוניברסלי קדימה | ggatcctaatacgactcactatag | ||
| פריימר הגברה הפוכה אוניברסלי | daaagcaccgactcgg | ||
טבלה 2: אוליגונוקלאוטידים המשמשים ב-PCR ליצירת תבנית עבור IVT של sgRNA. 20 רצפי המטרה של הנוקלאוטידים עבור פריימרים ספציפיים לגן הם מהוונים.
| BMDM מדיה צמיחה. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. | |||
| DMEM | |||
| סרום בקר עוברי | 0.1 | ||
| ל-גלוטמין | 0.2 מטר | ||
| MCSF supernatant מתאי 3T3-MCSF** | 0.1 | ||
| נתרן פירובט | 11 מ"ג/מ"ל | ||
| ליזיס חיץ. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. | |||
| 2-מרקפטואתנול (יש להוסיף מיד לפני השימוש) | 0.01 | ||
| MgCl2 | 5 מ"מ | ||
| טריס | 20 מ"מ | ||
| טריטון-X 100 | 0.005 | ||
| **תאי 3T3-MCSF גדלים ב-DMEM + 10% FCS. Supernatent עם MCSF נקטף ביום החמישי לאחר שהגיע 100% מפגש. כחלופה, ניתן להשתמש ב-MCSF רקומביננטי 10ng/ml במקום מדיה מותנית | |||
טבלה 3: הרכבי המדיה והחוצצים.
קובץ משלים 1: קובץ רצף גולמי עבור ROSA_ מוק אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
קובץ משלים 2: קובץ רצף גולמי עבור ROSA_TargettingGuide אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
קובץ משלים 3: קובץ רצף גולמי עבור ScrambleGuide אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
קובץ משלים 4: קובץ רצף גולמי עבור SrcG5+SrcG6 אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
קובץ משלים 5: קובץ רצף גולמי עבור CBLB_Mock אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
קובץ משלים 6: קובץ רצף גולמי עבור CBLB_TargetingGuide אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
קובץ משלים 7: קובץ רצף גולמי עבור Mock_Guide2Locus אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
קובץ משלים 8: קובץ רצף גולמי עבור Mock_Guide6Locus אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
קובץ משלים 9: קובץ רצף גולמי עבור SrcGuide2_Enhancer אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
קובץ משלים 10: קובץ רצף גולמי עבור SrcGuide2_NoEnhance אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
קובץ משלים 11: קובץ רצף גולמי עבור SrcGuide6_Enhancer אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
קובץ משלים 12: קובץ רצף גולמי עבור SrcGuide6_NoEnhancer אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עריכת גנום באמצעות קומפלקסים חשמליים של Cas9-sgRNA מאפשרת שיבוש יעיל של תפקוד הגנים ב-BMDM. יעילות העריכה משתנה בהתאם לרצף היעד ולגן היעד. בדרך כלל, ארבעה עד חמישה sgRNA נבדקים בדרך כלל כדי לזהות אחד פעיל מאוד. לאתרים מסוימים יעילות עריכה נמוכה יותר, ככל הנראה בשל מבנה הכרומטין. במקרים אלה, ניתן לבצע מספר שינויים כדי להגביר את יעילות העריכה. העברה משותפת של שני sgRNA פעילים לאותו אקסון מביאה לשיפור העריכה עבור גנים מסוימים. עם זאת, כאשר שני מדריכים מודבקים זה לצד זה, ראינו כי TIDE עלול לאבד את הדיוק. לכן, ייתכן שיהיה צורך בטכניקות חלופיות להערכת עריכה, כגון כתם מערבי. בנוסף, הכללת משפר NHEJ זמין מסחרית מגדילה לעתים קרובות את יעילות העריכה ב~20% (איור 3).
לגישה זו מספר יתרונות. ההעברה הישירה של sgRNA-Cas9 לתאים אינה דורשת את השלבים הגוזלים זמן רב של בניית פלסמיד או ייצור וקטורים לנטי-ויראליים כדי להתמיר BMDM. תהליך הסינתזה של sgRNA, אלקטרופורציה ויצירת תאים מוטנטיים יכול להסתיים בשבוע אחד. טכניקה זו יכולה לשמש גם עם BMDMs שמקורם בעכברים מהונדסים גנטית כדי ליצור תאים בעלי מוטציה כפולה. למרות שקיימות שיטות כימיות להדבקת תאי חיסון ראשוניים עם siRNA או mRNA17, שיטות כימיות אלה יעילות פחות באופן משמעותי מאלקטרופורציה בהעברת קומפלקסים Cas9-sgRNA לתאי מערכת החיסון18. ישנם מספר סוגים של מכשירי אלקטרופורציה הזמינים באופן מסחרי. התקנים אלה צפויים לעבוד באופן דומה עבור אספקת מתחמי Cas9-sgRNA, אם כי סביר להניח שיש לבצע אופטימיזציה של פרמטרי המתח עבור כל מכשיר בנפרד. בעוד פרוטוקול זה שימש בעיקר על BMDM עכבר, בניסויים מוגבלים, תוצאות דומות התקבלו עם BMDM חולדות (נתונים שלא פורסמו). ייתכן שגם סוגים אחרים של מקרופאגים ראשוניים, כגון מקרופאגים פריטוניאליים של עכברים או מקרופאגים בנאדיות, עשויים להיות מקובלים על גישה זו, אם כי זו טרם נבדקה.
לשיטה זו יש כמה מגבלות. מספר התאים המיוצרים על ידי פרוטוקול זה מוגבל במקצת; התנאים הסטנדרטיים שלנו מייצרים 4 x 105 תאים לכל אלקטרופורציה. עם זאת, ייתכן שניתן יהיה להגדיל את התשואה באופן משמעותי, שכן היעילות אינה פוחתת בתגובה של 10 μL עם עד 2.4 x 106 תאים המשתמשים באותה כמות של RNP (נתונים שלא פורסמו). בנוסף, 100 μL electroporation טיפים זמינים. חסרון נוסף של שיטה זו הוא ההוצאה; העלויות הן של האלקטרופורטור והן של החומרים המתכלים אלקטרופורציה הן משמעותיות. ניתן להפחית הוצאות אלה באופן משמעותי על ידי שימוש חוזר בטיפים בעת שימוש ב- sgRNA שונים המכוונים לאותו גן ועל ידי שימוש ב- PBS במקום במאגרים הקנייניים. בעוד שהרכבים של המאגרים הקנייניים אינם ידועים, יש להניח שהרכב האלקטרוליטים של PBS עם 0.9 mM CaCl2 ו- 0.5 mM MgCl2 מקורב למוליכות החשמלית של המאגר הקנייני. שינויים אלה מפחיתים את עלות החומרים המתכלים בכ-80% בפרוטוקול זה.
ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול, שחריגות מהם עלולות להשפיע באופן דרמטי על יעילות עריכת הגנים. אחת המלכודות האפשריות היא שערכות IVT סטנדרטיות, שאינן מיועדות לתפוקות גבוהות, מייצרות לעתים קרובות מוצר IVT לא מספיק. בנוסף, השימוש בצינורות מיקרופוגה סטנדרטיים מפוליפרופילן במקום צינורות בעלי קשירה נמוכה עלול לגרום לאובדן תאים משמעותי על ידי הידבקות. דה-פוספורילציה חלקית של מוצר IVT ונוכחות של DNA שיורי בהכנת sgRNA עלולים לגרום להפעלה של חיישני חיסון מקרופאגים ורעילות לאחר מכן. פולסים במתח גבוה או ארוך יותר עלולים גם לגרום למוות מוגבר של תאים.
לסיכום, פרוטוקול עריכת גנום זה, המשתמש באלקטרופורציה כדי לספק Cas9-sgRNA RNPs, הוא שיטה יעילה לשיבוש גנים ב- BMDM של עכברים. זה מאפשר למשתמשים לסנן במהירות פנוטיפים בתאים ראשוניים שמשחזרים באופן הדוק יותר את הביולוגיה המורכבת של מקרופאגים in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי מענק NIH 5R01AI144149. הדמויות הסכמטיות נוצרו באמצעות BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3T3-MCSF Cell Line | Gift from Russell Vance | not applicable | |
| Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer | IDT | 1075915 | |
| Ampure XP Reagent Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | NEB | M0525S | |
| DNase | NEB | M0303S | |
| DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2) | Thermo Fisher | 14040-133 | |
| DPBS -Ca/Mg | Thermo Fisher | 14190-144 | |
| ExoI | NEB | M0293S | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Corning | 35-015-CV | |
| Herculase DNA polymerase & buffer | Agilent | 600677 | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | NEB | E2040S | |
| LoBind conical tubes 15 mL | Eppendorf | 30122216 | |
| LoBind Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf | 22431102 | |
| NEBuffer r2.1 | NEB | B6002S | |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher | MPK5000, MPP100, MPS100 | |
| Neon Transfection System 10 uL Tips | Thermo Fisher | MPK1025 or MPK1096 | |
| PBS + 1mM EDTA | Lonza | BE02017F | |
| Proteinase K | Thermo Fisher | EO0491 | |
| rCutSmart Buffer for ExoI | NEB | B6004S | |
| Ribolock | Thermo Fisher | EO0384 | |
| RNA loading dye | NEB | B0363S | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| S. pyogenes Cas9-NLS | University of California Macro Lab | not applicable | Available to non-UC investigators through https://qb3.berkeley.edu |
| S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation | IDT | 1081059 | |
| SAP | NEB | M0371S |
References
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis, and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Paddison, P. J., Caudy, A. A., Hannon, G. J. Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (3), 1443-1448 (2002).
- Laugel, B., et al. Engineering of isogenic cells deficient for MR1 with a CRISPR/Cas9 lentiviral system: Tools to study microbial antigen processing and presentation to human MR1-restricted T cells. The Journal of Immunology. 197 (3), 971-982 (2016).
- Andreu, N., et al. Primary macrophages and J774 cells respond differently to infection with Mycobacterium tuberculosis. Scientific Reports. 7, 42225 (2017).
- Roberts, A. W., et al. Cas9+ conditionally-immortalized macrophages as a tool for bacterial pathogenesis and beyond. eLife. 8, e45957 (2019).
- Oberdoerffer, P., et al. Efficiency of RNA interference in the mouse hematopoietic system varies between cell types and developmental stages. Molecular and Cellular Biology. 25 (10), 3896-3905 (2005).
- Ma, S., et al. YTHDF2 orchestrates tumor-associated macrophage reprogramming and controls antitumor immunity through CD8+ T cells. Nature Immunology. 24 (2), 255-266 (2023).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, e00471 (2013).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).
- Craft, J. CRISPR-Cas9-mediated genome editing in primary murine bone marrow-derived macrophages. University of California, Davis. , Master's thesis (2022).
- Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Krönke, M., Schramm, M. Highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mRNA. Journal of Visualized Experiments. (153), e60143 (2019).
- Yu, X., et al. Improved delivery of Cas9 protein/gRNA complexes using lipofectamine CRISPRMAX. Biotechnology Letters. 38 (6), 919-929 (2016).
