Summary
Ce protocole décrit la procédure d’édition du génome dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris à l’aide de complexes ribonucléoprotéiques Cas9-sgRNA assemblés in vitro et délivrés par électroporation.
Abstract
Les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDM) provenant de souris sont un outil clé pour étudier la biologie complexe des macrophages tissulaires. En tant que cellules primaires, elles modélisent la physiologie des macrophages in vivo plus étroitement que les lignées cellulaires de macrophages immortalisées et peuvent être dérivées de souris déjà porteuses de modifications génétiques définies. Cependant, la perturbation de la fonction des gènes dans les BMDM reste techniquement difficile. Ici, nous fournissons un protocole pour l’édition efficace du génome CRISPR/Cas9 dans les BMDM, qui permet l’introduction de petites insertions et délétions (indels) qui entraînent des mutations de décalage de cadre qui perturbent la fonction des gènes. Le protocole décrit comment synthétiser des ARN à guide unique (ARNsg-Cas9) et former des complexes ribonucléoprotéiques (RNP) ARNsg-Cas9 purifiés qui peuvent être délivrés par électroporation. Il fournit également une méthode efficace pour surveiller l’efficacité de l’édition à l’aide du séquençage de routine de Sanger et d’un programme d’analyse en ligne disponible gratuitement. Le protocole peut être effectué en 1 semaine et ne nécessite pas de construction de plasmide ; Il en résulte généralement une efficacité d’édition de 85 % à 95 %.
Introduction
Les macrophages sont des cellules immunitaires innées qui jouent un rôle essentiel dans la réparation des tissus et l’immunité 1,2. Les lignées cellulaires de macrophages immortalisées, telles que les cellules RAW 264.7 de souris ou les cellules humaines THP-1, présentent plusieurs caractéristiques bénéfiques, notamment une croissance robuste et une facilité de perturbation génique en délivrant des vecteurs d’interférence ARN ou CRISPR/Cas9 3,4. Cependant, la transformation oncogénique modifie considérablement leur physiologie, ce qui se traduit par l’activation aberrante de certaines voies et des réponses atténuées d’autres 5,6. Les macrophages primaires dérivés de la moelle osseuse (BMDM) récapitulent plus étroitement la physiologie des macrophages in vivo, mais restent difficiles à manipuler génétiquement en raison de la faible efficacité de la transfection plasmidique et de la transduction virale dans ces cellules immunitaires primaires 7,8. Il est donc nécessaire de mettre au point des méthodes plus efficaces pour perturber la fonction des gènes.
L’édition du génome CRISPR/Cas9 est un outil puissant pour la manipulation génétique dans une gamme de systèmes biologiques, y compris les cellules de mammifères 9,10,11,12. La protéine Cas9 de Streptococcus pyogenes clive efficacement et spécifiquement l’ADN double brin lorsqu’elle est complexée avec un ARN guide spécifique à la séquence. La réparation de l’ADN par la jonction d’extrémité non homologue (NHEJ) de l’ADN clivé entraîne de petites insertions ou délétions (indels) qui créent des mutations de décalage de cadre. Dans les premières études, Cas9 et les ARNsg ont été administrés par des vecteurs plasmides ou lentiviraux, qui sont des méthodes d’administration efficaces pour de nombreuses lignées cellulaires 9,10. Cependant, les cellules primaires et, en particulier, les cellules immunitaires primaires sont souvent réfractaires à ces méthodes en raison de la faible efficacité de l’administration du vecteur par transfection ou transduction. Par la suite, des méthodes ont été développées pour générer des complexes ARNsg-Cas9 in vitro et les délivrer par électroporation, et ces méthodes ont atteint une grande efficacité dans une variété de types de cellules13,14. Les résultats ont suggéré la possibilité d’utiliser cette approche pour effectuer l’édition du génome dans les macrophages primaires.
Ici, nous fournissons un protocole pour l’utilisation des complexes ribonucléoprotéiques (RNP) sgRNA-Cas9 pour effectuer l’édition du génome dans les BMDM primaires. Il contient des mesures pour atténuer l’activation des capteurs immunitaires présents dans les cellules immunitaires primaires et permet d’éditer jusqu’à 95 % des loci ciblés avec une toxicité minimale. Ce protocole comprend également des flux de travail permettant d’évaluer l’efficacité de l’édition à l’aide de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) de routine et du séquençage de Sanger, suivis d’une analyse in silico par Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)15, un outil logiciel en ligne bien validé.
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Protocol
1. Conception de l’ARNsg
REMARQUE : Cette étape décrit la sélection des séquences cibles et la conception des ARNsg. Il est utile de concevoir des guides qui se trouvent dans le premier grand exon codant, de sorte que toute protéine traduite soit perturbée tôt dans le cadre de lecture ouvert. Il est également utile de sélectionner des séquences cibles qui se trouvent dans le même exon, car cela rationalisera l’analyse de l’efficacité de l’édition (étape 6). Les exemples d’édition génomique fournis avec ce protocole ont utilisé des ARNsg ciblant le premier exon du gène Src et le gène Cblb , ainsi que dans le locus Rosa26 non codant du génome de la souris.
- Identifiez 20 séquences génomiques nucléotidiques à cibler, à l’aide de l’un des nombreux outils de conception en ligne gratuits (tableau 1). Sélectionnez quatre à cinq guides qui ne se chevauchent pas au sein de chaque gène, car l’activité de Cas9 varie selon le guide spécifique choisi, et la prédiction a priori d’un guide très actif n’est pas possible.
REMARQUE : Il est essentiel de s’assurer que le guide est correctement orienté par rapport à la séquence du locus ciblé. Les outils de conception fournissent généralement la séquence guide dans une orientation de 5' à 3', quel que soit le brin chromosomique ciblé. Pour vérifier l’orientation du brin, vérifier qu’il existe une séquence de motif adjacent protospacer (PAM) pour S. pyogenes Cas9 (nGG) immédiatement à 3' de la séquence génomique ciblée. La séquence de l’ARNsg n’inclut pas le PAM.
2. Synthèse de l’ARNsg
REMARQUE : Cette étape décrit comment synthétiser des ARNsg à l’aide de la PCR pour générer un modèle de transcription in vitro (IVT), puis purifier l’ARNsg à l’aide de colonnes de spin (Figure 1A). Les ARNsg synthétiques personnalisés sont disponibles dans le commerce auprès de plusieurs fournisseurs comme alternative à la PCR/IVT.
- Effectuez la PCR pour générer le modèle IVT pour l’ARN polymérase T7. La réaction de PCR utilise des amorces universelles qui contiennent un promoteur de l’ARN polymérase T7 et une séquence d’ARN CRISPR trans-activatrice (ARNtracr) (tableau 2), en plus de courtes amorces individuelles avec la séquence guide spécifique au gène.
- Il s’agit de l’étape d’extension de chevauchement non amplificatrice. Diluer le tampon PCR à 1x et ajouter 1 mM de MgCl2 supplémentaire. Ensuite, ajouter 0,25 μL d’ADN polymérase haute-fidélité, 0,5 mM de désoxynucléotide triphosphate (dNTP), 0,02 mM d’amorce spécifique au guide et 0,02 mM d’amorce universelle longue inversée T7 (tableau 2) jusqu’à un volume total de 46 μL. Ensuite, placez le tube dans le thermocycleur et exécutez deux cycles de : 95 °C pendant 15 s, 37 °C pendant 15 s et 72 °C pendant 15 s. Refroidissez les réactions sur de la glace.
- Il s’agit de l’étape d’amplification par PCR. À chaque réaction, ajouter 2 μL d’amorce d’amplification directe de 25 mM et 2 μL d’amorce d’amplification inverse de 25 mM. Le volume final de réaction est de 50 μL. Dénaturation pendant 30 s à 95 °C. Ensuite, exécutez 35 cycles de : 95 °C pendant 15 s, 65 °C pendant 20 s et 72 °C pendant 15 s. Effectuez une extension supplémentaire à 72 °C pendant 2 min.
- Vérifier le produit de réaction PCR sur un gel d’agarose à 2%. La PCR par chevauchement-extension donne une molécule d’ADNdb de 127 pb avec le promoteur T7 en amont du guide de 20 nucléotides spécifiques au gène et l’ARNtracr immédiatement en aval (Figure 1B).
- Purification du modèle IVT : Il existe de nombreux protocoles et kits qui fonctionnent bien pour cela. Ce protocole utilise des billes d’immobilisation réversible en phase solide (SPRI). Mélangez 50 μL du produit PCR avec 90 μL de billes et suivez les instructions du fabricant. Éluner l’ADN en ajoutant 40 μL de tampon (5 mM de Tris, 0,1 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique [EDTA]) et chauffer à 65 °C pendant 5 min.
- Mesurez la concentration d’ADN de la matrice IVT en utilisant l’absorption à une longueur d’onde de 260 nm. Une concentration d’ADN d’au moins 50 ng/μL est nécessaire pour l’IVT. Le gabarit IVT peut être stocké à -20 °C.
- Réaction IVT
- Utilisez un kit commercial conçu pour produire des rendements élevés de IVT (voir le tableau des matériaux). Suivez les recommandations du fabricant pour effectuer la réaction IVT. À l’aide de 250 ng de matrice IVT dans une réaction de 20 μL, incuber à 37 °C pendant 4 à 16 h.
- Vérifiez le produit d’ARNsg IVT en exécutant 1 μL de la réaction sur un gel d’agarose à 2 %. Une bande d’ARN brillante doit être observée, similaire à celle de l’ADNdb à 70 pb (Figure 1C). Bien que cela ne soit pas obligatoire, pour obtenir des bandes nettes et plus résolues, utilisez un tampon d’échantillon d’ARN avec de l’urée et dénaturez l’échantillon à 65 °C pendant 5 minutes avant le chargement.
REMARQUE : De faibles bandes de poids moléculaire plus élevé et de légères différences de migration peuvent être observées avec certains ARN guides en raison de différences dans la structure secondaire de l’ARN.
- Déphosphoryler le produit IVT de l’ARNsg pour minimiser l’activation de RIG-I (un capteur d’ARN étranger) et la mort cellulaire subséquente après l’électroporation. Pour chaque réaction IVT de 20 μL, ajouter 69 μL d’eau de qualité moléculaire et 15 U de phosphatase intestinale (NEP) de veau dans 1x tampon CIP. Incuber pendant 2 h à 37 °C.
- Dégrader le modèle IVT pour minimiser l’activation des capteurs d’ADN cellulaire, qui déclenchent la mort cellulaire après l’électroporation. À chaque réaction IVT, ajoutez 2 U de DNase sans RNase. Incuber pendant 15 min à 37 °C. Le produit IVT peut être conservé à -20 °C pendant 1 jour ou à -80 °C pendant plusieurs mois.
- Purifier le produit IVT à l’aide de colonnes de centrifugation. Pour cette étape, les kits de purification de billes SPRI sont inférieurs.
- Lier l’ARN à la colonne en ajoutant 220 μL de tampon de liaison au produit IVT, suivi de 1 mL d’éthanol 100 % de biologie moléculaire. Bien mélanger et charger la colonne. Par la suite, suivez les instructions du fabricant. Effectuer le lavage final dans une enceinte de sécurité biologique à flux laminaire pour éviter la contamination de l’ARNsg.
- Effectuez l’élution dans la hotte à flux laminaire pour éviter toute contamination. Éluer l’ARN à l’aide de 30 μL de tampon Tris stérile de 10 mM (pH 8,0).
- Mesurez la concentration d’ARNsg en mesurant l’absorbance à une longueur d’onde de 260 nm.
REMARQUE : Les rendements typiques de l’ARNsg sont d’au moins 100 μg. - Conservez l’ARNsg à -80 °C. Préparez des aliquotes pour éviter plus de trois cycles de gel-dégel.
3. Préparation à l’électroporation
REMARQUE : Toutes les étapes doivent être effectuées dans une hotte à flux laminaire pour éviter la contamination. Ce protocole utilise un système d’électroporation disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) avec des pointes de 10 μL.
- Décongeler les BMDM 48 à 72 h avant utilisation et les étendre sur des plaques non traitées à la culture tissulaire (TC).
REMARQUE : Par réaction, 4 x 105 cellules sont nécessaires. - Stériliser les tubes PCR pour l’assemblage de la réaction. Préparez un tube PCR par réaction, et chauffez-les dans un thermocycleur pendant 10 min à 98 °C. Préparez les tubes par lots et conservez-les fermés. Placez les tubes PCR stérilisés sur de la glace lorsqu’ils sont prêts à être utilisés.
- Nettoyez la station de pipette avec de l’éthanol à 70 % et placez-la dans la hotte à flux laminaire. Réglez les paramètres sur 1 900 V, 20 ms et une impulsion.
- Retirez un tube de transfection de l’emballage en prenant soin de le garder stérile et remplissez-le de 3 mL de tampon « E ». Assurez-vous que le tampon E est à température ambiante avant l’électroporation. Insérez le tube dans la station et poussez-le vers le bas jusqu’à ce qu’il s’enclenche.
- Pour chaque réaction, aliquote 2,5 μL d’ARNsg à une concentration de 1 100 ng/μL. Diluer l’ARNsg dans une solution saline tamponnée au phosphate froid (PBS) avec 0,9 mM de CaCl2 et 0,5 mM de MgCl2 (PBS + Ca/Mg). Laissez-le sur de la glace.
- Préparez deux plaques : une plaque non revêtue à 12 puits pour les cellules et une plaque supplémentaire à 24 puits pour contenir le milieu de culture. Aliquote 1,5 mL de milieu sans antibiotique par réaction dans les puits de la plaque à 24 puits.
- Préparez la protéine Cas9. Il existe plusieurs fournisseurs commerciaux et universitaires de protéines Cas9 purifiées par voie stérile. Diluer Cas9 à une concentration finale de 20 μM avec du PBS à froid + Ca/Mg. Pour chaque réaction d’électroporation, aliquote 1 μL de 20 μM Cas9 dans des tubes PCR stériles. Laisser sur glace.
- Préparer les cellules pour l’électroporation.
- Retirez le milieu de culture. Lavez les cellules avec du PBS sans CaCl2 et MgCl2 (PBS-Ca/Mg) pour éliminer le sérum et les cations divalents qui favorisent l’adhérence. Ensuite, ajoutez PBS + 1 mM EDTA et incubez à température ambiante pendant environ 5 min jusqu’à ce que les cellules commencent à se détacher.
- Pipetez doucement de haut en bas pour détacher les cellules. Transférez les cellules dans un tube de 15 ml à faible liaison aux protéines. Pelleter les cellules à 500 x g pendant 5 min.
REMARQUE : Les macrophages adhèrent à la vaisselle en plastique. L’utilisation de tubes à centrifuger à faible liaison protéique améliore considérablement le rendement cellulaire. - Travaillez rapidement pour éviter l’incubation prolongée des cellules dans le PBS + EDTA. Retirer la majeure partie du surnageant, en laissant environ 1 mL de surnageant dans le tube. Remettre les cellules en suspension dans le surnageant restant, puis les transférer dans un tube de microfuge de 1,5 ml à faible liaison protéique.
- Retirez une petite aliquote de cellules à compter. Pelleter les cellules restantes en centrifugeant à 500 x g à température ambiante pendant 5 min.
- Pendant la centrifugation, comptez les cellules et réchauffez les tubes Cas9 et ARNsg à température ambiante.
- Retirez tout le surnageant de la pastille cellulaire. Remettre les cellules en suspension dans du PBS + Ca/Mg à une concentration de 4 x 107 cellules/mL (4 x 105 cellules par réaction de 10 μL).
REMARQUE : Chaque kit est fourni avec une quantité limitée de tampon d’électroporation (tampon R, tampon T). Cependant, nous constatons que l’efficacité de l’électroporation à l’aide de PBS + Ca/Mg est équivalente à celle des tampons propriétaires. - Lors de l’électroporation d’ARNsg pour différents gènes, aliquote les cellules dans différents tubes à faible liaison protéique pour chaque gène afin d’éviter la contamination croisée entre les ARNsg. Conservez les cellules à température ambiante jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour l’électroporation.
4. Assemblage RNP
- Conservez l’ARNsg et le Cas9 à température ambiante afin d’éviter les précipitations. Ajouter 2,5 μL d’ARNsg à 1 μL de Cas9 dilué dans des tubes PCR stérilisés. Distribuez l’ARNsg lentement pendant 15 s en mélangeant pour éviter les précipitations.
- Incuber pendant 5 min à température ambiante pour permettre la formation d’un complexe RNP.
5. Livraison de RNP par électroporation
- Préparez l’embout d’électroporation (cuvette). Appuyez sur le piston pour étendre la tige. Insérez la tige dans la pointe.
REMARQUE : Assurez-vous que l’embout est bien fixé et que le piston glisse en douceur et s’étend au-delà de la gaine de l’embout. Si l’embout n’est pas correctement positionné, des bulles d’air peuvent être introduites dans l’embout, provoquant une défaillance de l’embout. - Remettez les cellules en suspension en pipetant de haut en bas, puis chargez la pointe d’électroporation avec les cellules. Retirez la totalité de la capacité volumique de 10 μL de l’embout, en évitant les bulles.
- En commençant par l’ARNsg témoin négatif, transférez 10 μL de cellules dans l’embout d’électroporation vers le tube d’échantillon contenant 3,5 μL de RNP à partir de l’étape 4. Pipeter trois fois vers le haut et vers le bas pour bien mélanger. Ramassez 10 μL du mélange dans l’embout, en vous assurant qu’il n’y a pas de bulles.
- Placez l’embout dans la station d’électroporation, en l’abaissant dans le tampon. Évitez d’entrer en contact avec les surfaces en plastique avec l’embout pour maintenir la stérilité. Appuyez sur Start sur l’écran tactile.
- Une fois l’opération terminée, l’écran indiquera une impulsion réussie. Retirez la pipette de l’appareil et placez les cellules dans un puits sec de la plaque à 12 puits étiquetée et non revêtue.
- Rincez l’embout en pipetant deux fois de haut en bas dans 15 mL de PBS + Ca/Mg. Mettez la pipette de côté avec l’embout toujours attaché. Assurez-vous que l’embout ne touche rien et reste stérile.
REMARQUE : Dans de nombreuses expériences, il est possible de réutiliser l’embout pour plusieurs échantillons, par exemple après l’échantillon d’ARNsg témoin négatif inactif, ou lors des évaluations initiales de l’activité guide lorsque quatre à cinq ARNsg sont testés par gène et que la seule lecture est l’efficacité de l’édition. Cependant, lors de l’analyse fonctionnelle sur des cellules modifiées, une nouvelle pointe est recommandée pour chaque gène, car de petites quantités d’ARNsg ou de transfert cellulaire pourraient avoir un impact sur les résultats expérimentaux. - Ajouter immédiatement 1 mL de milieu sans antibiotiques (aliquote à l’étape 3.6) aux cellules et agiter doucement la plaque pour mélanger.
- Répétez les étapes 5.2 à 5.6 pour les autres réactions.
- Remettez les cellules dans l’incubateur.
- Vérifier la viabilité des cellules 1 à 2 h après l’électroporation. Les cellules doivent adhérer à >90 %. Facultatif : Ajouter de la gentamicine (5 μg/mL) aux cellules 1 à 2 h après l’électroporation pour aider à prévenir la contamination si cela n’interfère pas avec les expériences en aval.
6. Évaluation de l’efficacité de l’édition
REMARQUE : La plupart des modifications sont terminées après 48 h.
- Vérifiez la monocouche de cellule 48 h après l’électroporation. Si les cellules sont confluentes à plus de 50 %, poursuivre. Si les cellules sont confluentes à <50 %, attendez 1 à 2 jours supplémentaires. L’analyse de l’ADN génomique pour déterminer l’efficacité de l’édition nécessite 1 x 105 cellules, en plus des cellules nécessaires à l’expérience en aval.
- Préparer l’ADN génomique (ADNg).
- Lavez les cellules avec du PBS (-Ca/Mg). Ajouter 1 mL de PBS + 1 mM d’EDTA. Incuber à température ambiante pendant environ 5 minutes jusqu’à ce que les cellules commencent à se détacher de la plaque.
- Détacher les cellules par pipetage. Transférer dans un tube de microfuge à faible liaison aux protéines.
- Comptez les cellules et retirez une aliquote de 1 x 105 cellules. Les cellules restantes peuvent être replaquées pour être utilisées dans d’autres expériences. Généralement, les expériences sont menées 5 jours après l’électroporation afin de permettre la désintégration de la protéine.
- Pelleter les cellules pour l’analyse de l’ADNg pendant 15 s à la vitesse maximale dans un tube de microfuge.
- Remettre la pastille en suspension dans 50 μL de tampon de lyse. Vortex pour détacher les cellules collées aux parois du tube, et chauffer à 98 °C pendant 10 min pour lyser les cellules et inactiver la DNase endogène.
- Placez les tubes sur de la glace.
- Ajouter 1 μL de protéinase K (20 mg/mL). Incuber pendant au moins 1 h à 37 °C ; Il peut être laissé toute la nuit pour plus de commodité.
- Chauffer à 98 °C pendant 10 min pour inactiver la protéinase K.
- Centrifuger à température ambiante pendant 5 min à vitesse maximale. Retirez le surnageant, qui contient l’ADN. Cette préparation brute sans purification supplémentaire fonctionne bien pour la plupart des réactions PCR.
- Évaluez l’efficacité de l’édition avec le séquençage Sanger.
- Concevoir des amorces PCR de 200 à 300 pb en amont de la plupart des sites de guidage de 5 pi et de 200 à 300 pb en aval de la plupart des sites de guidage de 3 pi. La taille typique de l’amplicon est de ~500 pb. Concevoir une amorce de séquençage imbriquée à au moins 125 pb du site de guidage le plus proche (Figure 2A).
- Effectuez une PCR à l’aide de 2 μL d’ADNg.
- Préparez le produit PCR pour le séquençage. Ce protocole utilise un traitement à l’exonucléase I/phosphatase alcaline de crevette (ExoI/SAP). Les kits commerciaux de purification de l’ADN fonctionnent également, mais nécessitent plus de temps de manipulation.
- Préparez 15 μL du produit PCR. Ajoutez 7,5 μL d’eau, 1 μL de tampon 10x ExoI, 10 U d’ExoI et 1 U de SAP pour dégrader les dNTP et les amorces qui interfèrent avec le séquençage de Sanger.
- Incuber à 37 °C pendant 30 min, puis à 85 °C pendant 20 min pour désactiver les enzymes.
- Effectuer le séquençage de Sanger sur le produit PCR traité Exo/SAP ; utiliser une quantité connue de marqueur de taille d’ADN pour estimer la taille du produit PCR présent dans l’échantillon. Les réactions de séquençage peuvent nécessiter une optimisation, car le logiciel TIDE a besoin de chromatogrammes séquentiels de haute qualité pour estimer avec précision l’efficacité du montage. Le chromatogramme séquentiel du locus non édité doit fournir des pics clairs avec un bruit de fond minimal (Figure 2B, C).
- Pour estimer l’efficacité de l’édition, utilisez TIDE pour analyser les fichiers de chromatogramme de séquençage de Sanger à l’aide de l’ADNg édité et de l’ADNg témoin non édité. (Tableau 1, Figure 2). Téléchargez les fichiers de séquençage Sanger et exécutez le logiciel avec les paramètres par défaut.
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Representative Results
Le modèle IVT est un produit PCR de 127 pb (Figure 1B). Le produit IVT pleine longueur est un ARN de 98 nt, qui migre de la même manière qu’un fragment d’ADN double brin de 70 pb (Figure 1C).
Après électroporation, les cellules doivent être viables à >90 %, avec un nombre total de cellules de >70 % du nombre de cellules de départ. Le pool de cellules mutantes résultant devrait avoir un ensemble diversifié d’indels, commençant près du site de clivage de Cas9. L’analyse des gènes ciblés par PCR et séquençage de Sanger devrait montrer plusieurs nucléotides à chaque position en aval du site de clivage de Cas9 (Figure 2).
Figure 1 : Vue d’ensemble du processus d’édition de l’ARNsg-Cas9. (A) Schéma pour la conception du guide, la génération de l’ARNsg et l’administration de l’ARNsg-Cas9. (B) Le produit de PCR de l’IVT pour les ARNsg Src 1, 2 et 3 a été résolu sur un gel d’agarose à 2 %. La flèche indique les produits PCR corrects à 127 pb. (C) Les produits d’ARN après IVT pour les ARNsg Src 1, 2 et 3 se sont résolus sur un gel d’agarose à 2 %. Les parenthèses indiquent les produits d’ARNsg corrects. La migration variable de l’ARNsg est due à la structure secondaire de l’ARN. Cette figure est une reproduite à partir du mémoire de maîtrise16 du premier auteur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Efficacité d’édition élevée obtenue pour plusieurs gènes ciblés. (A) Schéma des amorces de séquençage PCR et Sanger. (B) Schéma du flux de travail pour TIDE afin d’évaluer l’efficacité de l’édition. (C) Chromatogramme de séquençage représentatif de Sanger du locus ROSA26 à partir de BMDM électroporés avec un RNP sgRNA-Cas9 non ciblé de contrôle (en haut) et un ARNsg spécifique de ROSA26 (en bas) ; le site de clivage de Cas9 est mis en évidence. La sortie TIDE (à droite) avec l’efficacité d’édition calculée et le pourcentage de séquences contenant le nombre d’indels indiqué. (D,E) Chromatogrammes de séquençage de Sanger des gènes (D) Src et Cblb dans les BMDM édités. Cette figure est une reproduite à partir du mémoire de maîtrise16 du premier auteur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Augmentation modérée de l’efficacité de l’édition grâce à l’amplificateur d’électroporation commercial. Les BMDM ont été électroporés à l’aide de guides à faible efficacité afin d’évaluer l’effet d’un rehausseur d’édition commercial. Avant l’électroporation, 1 μL de l’amplificateur a été ajouté aux RNP assemblés jusqu’à une concentration finale de 4 μM. L’efficacité de l’édition de l’ARNsg Src indiqué a été évaluée à l’aide de TIDE. Cette figure est une reproduite à partir du mémoire de maîtrise16 du premier auteur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Nom de l’outil | URL | ||
| Synthego - Outil de conception CRISPR | https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-design-tool | ||
| L’Institut Broad - CRISPick | https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public | ||
| Suivi des Indels par décomposition (TIDE) | http://shinyapps.datacurators.nl/tide/ | ||
Tableau 1 : URL des outils en ligne.
| Nom de l’amorce | Séquence | ||
| Apprêt spécifique au guide | ggatcctaatacgactcactatag[N20]gttttagagctagaa | ||
| Apprêt spécifique au guide - Cbl-b Guide 3 | ggatcctaatacgactcactatagAAAATATCAAGTATATACGGgttttagagctagaa | ||
| Apprêt spécifique au guide - Cbl-b Guide 4 | ggatcctaatacgactcactatagGGTAAAATATCAAGTATATAgttttagagctagaa | ||
| Apprêt spécifique au guide - Rosa | ggatcctaatacgactcactatagCTCCAGTCTTTCTAGAAGATgttttagagctagaa | ||
| Apprêt spécifique au guide - Scramble | ggatcctaatacgactcactatagGCACTACCAGAGCTAACTCAgttttagagctagaa | ||
| Abécédaire spécifique au guide - Src Guide 2 | ggatcctaatacgactcactatagTCACTAGACGGGAATCAGAGgttttagagctagaa | ||
| Abécédaire spécifique au guide - Src Guide 5 | ggatcctaatacgactcactatagCAGCAACAAGAGCAAGCCCAgttttagagctagaa | ||
| Abécédaire spécifique aux guides - Src Guide 6 | ggatcctaatacgactcactatagAGCCCAAGGACGCCAGCCAGgttttagagctagaa | ||
| T7 Reverse Apprêt Universel Long | aaaaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagcctttttaacttgctatttctagctctaaaac | ||
| Amorce universelle d’amplification directe | ggatcctaatacgactcactatag | ||
| Amorce universelle d’amplification inverse | aaaaaagcaccgactcgg | ||
Tableau 2 : Oligonucléotides utilisés dans la PCR pour générer la matrice de l’IVT de l’ARNsg. Les 20 séquences cibles nucléotidiques pour les amorces spécifiques aux gènes sont en majuscules.
| BMDM Substrats de croissance. Conserver à 4 °C. | |||
| DMEM (en anglais seulement) | |||
| Sérum de veau fœtal | 0.1 | ||
| L-glutamine | 0,2 M | ||
| Surnageant MCSF à partir de cellules 3T3-MCSF** | 0.1 | ||
| Pyruvate de sodium | 11 mg/mL | ||
| Tampon de lyse. Conserver à 4 °C. | |||
| 2-mercaptoéthanol (ajouter immédiatement avant utilisation) | 0.01 | ||
| MgCl2 | 5 mM | ||
| Tris | 20 mM | ||
| Triton-X 100 | 0.005 | ||
| **Les cellules 3T3-MCSF sont cultivées dans DMEM+10% FCS. Le surnageant avec MCSF est récolté le 5e jour après avoir atteint 100 % de confluence. Comme alternative, le MCSF recombinant de 10 ng/ml peut être utilisé à la place des milieux conditionnés | |||
Tableau 3 : Composition des milieux et des tampons.
Fichier supplémentaire 1 : Fichier de séquençage brut pour ROSA_ Mock Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 2 : Fichier de séquençage brut pour ROSA_TargettingGuide Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 3 : Fichier de séquençage brut pour ScrambleGuide Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 4 : Fichier de séquençage brut pour SrcG5+SrcG6 Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 5 : Fichier de séquençage brut pour CBLB_Mock Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 6 : Fichier de séquençage brut pour CBLB_TargetingGuide Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 7 : Fichier de séquençage brut pour Mock_Guide2Locus Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 8 : Fichier de séquençage brut pour Mock_Guide6Locus Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 9 : Fichier de séquençage brut pour SrcGuide2_Enhancer Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 10 : Fichier de séquençage brut pour SrcGuide2_NoEnhance Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 11 : Fichier de séquençage brut pour SrcGuide6_Enhancer Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 12 : Fichier de séquençage brut pour SrcGuide6_NoEnhancer Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
L’édition du génome à l’aide de complexes d’ARNsg Cas9 électroporés permet de perturber efficacement la fonction des gènes dans les BMDM. L’efficacité de l’édition varie en fonction de la séquence cible et du gène. En règle générale, quatre à cinq ARNsg sont généralement criblés pour en identifier un qui est très actif. Certains loci ont une efficacité d’édition plus faible, probablement en raison de la structure de la chromatine. Dans ces cas, plusieurs modifications peuvent être apportées pour augmenter l’efficacité de l’édition. La co-livraison de deux ARNsg actifs au même exon permet d’améliorer l’édition de certains gènes. Cependant, lorsque deux guides sont co-transfectés, nous avons observé que TIDE peut perdre en précision. Par conséquent, d’autres techniques d’évaluation de l’édition, telles que le transfert Western, peuvent être nécessaires. De plus, l’inclusion d’un amplificateur NHEJ disponible dans le commerce augmente souvent l’efficacité de l’édition de ~20 % (Figure 3).
Cette approche présente plusieurs avantages. L’administration directe de l’ARNsg-Cas9 aux cellules ne nécessite pas les étapes fastidieuses de la construction du plasmide ou de la production de vecteurs lentiviraux pour transduire les BMDM. Le processus de synthèse de l’ARNsg, d’électroporation et de génération de cellules mutantes peut être terminé en 1 semaine. Cette technique peut également être utilisée avec des BMDM dérivés de souris génétiquement modifiées pour créer des cellules doublement mutantes. Bien qu’il existe des méthodes chimiques pour transfecter les cellules immunitaires primaires avec l’ARNsi ou l’ARNm17, ces méthodes chimiques sont nettement moins efficaces que l’électroporation pour délivrer des complexes Cas9-sgRNA aux cellules immunitaires18. Il existe plusieurs types d’appareils d’électroporation disponibles dans le commerce. On s’attend à ce que ces dispositifs fonctionnent de la même manière pour l’administration de complexes Cas9-sgRNA, bien que les paramètres de tension doivent probablement être optimisés pour chaque dispositif individuel. Bien que ce protocole ait été utilisé principalement sur des BMDM de souris, dans des expériences limitées, des résultats similaires ont été obtenus avec des BMDM de rat (données non publiées). Il est possible que d’autres types de macrophages primaires, tels que les macrophages péritonéaux de souris ou les macrophages alvéolaires, se prêtent également à cette approche, bien que cela n’ait pas encore été testé.
Cette méthode présente certaines limites. Le nombre de cellules produites par ce protocole est quelque peu limité ; Nos conditions standard génèrent 4 x 105 cellules par électroporation. Cependant, il peut être possible d’augmenter considérablement le rendement, car l’efficacité n’est pas diminuée dans une réaction de 10 μL avec jusqu’à 2,4 x 106 cellules utilisant la même quantité de RNP (données non publiées). De plus, des embouts d’électroporation de 100 μL sont disponibles. Un autre inconvénient de cette méthode est la dépense ; Les coûts de l’électroporateur et des consommables d’électroporation sont considérables. Ces dépenses peuvent être considérablement réduites en réutilisant les pointes lors de l’utilisation de différents ARNsg ciblant le même gène et en utilisant PBS au lieu des tampons propriétaires. Bien que la composition des tampons brevetés ne soit pas connue, on peut supposer que la composition électrolytique du PBS avec 0,9 mM de CaCl2 et 0,5 mM de MgCl2 se rapproche de la conductance électrique du tampon exclusif. Ces changements réduisent le coût des consommables d’environ 80 % dans ce protocole.
Il y a plusieurs étapes critiques dans le protocole, dont les écarts pourraient affecter considérablement l’efficacité de l’édition de gènes. L’un des pièges potentiels est que les kits IVT standard, qui ne sont pas conçus pour des rendements élevés, produisent souvent un produit IVT insuffisant. De plus, l’utilisation de tubes de microfuges en polypropylène standard au lieu de tubes à faible liaison peut entraîner une perte cellulaire importante par adhérence. La déphosphorylation incomplète du produit IVT et la présence d’ADN résiduel dans la préparation d’ARNsg peuvent entraîner l’activation de capteurs immunitaires des macrophages et une toxicité subséquente. Des impulsions de tension plus élevées ou plus longues peuvent également entraîner une augmentation de la mort cellulaire.
En résumé, ce protocole d’édition du génome, qui utilise l’électroporation pour délivrer des RNP Cas9-sgRNA, est une méthode efficace pour perturber les gènes dans les BMDM de souris. Cela permet aux utilisateurs de dépister rapidement les phénotypes dans les cellules primaires qui récapitulent plus étroitement la biologie complexe des macrophages in vivo.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par la subvention 5R01AI144149 du NIH. Les figures schématiques ont été créées avec BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3T3-MCSF Cell Line | Gift from Russell Vance | not applicable | |
| Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer | IDT | 1075915 | |
| Ampure XP Reagent Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | NEB | M0525S | |
| DNase | NEB | M0303S | |
| DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2) | Thermo Fisher | 14040-133 | |
| DPBS -Ca/Mg | Thermo Fisher | 14190-144 | |
| ExoI | NEB | M0293S | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Corning | 35-015-CV | |
| Herculase DNA polymerase & buffer | Agilent | 600677 | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | NEB | E2040S | |
| LoBind conical tubes 15 mL | Eppendorf | 30122216 | |
| LoBind Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf | 22431102 | |
| NEBuffer r2.1 | NEB | B6002S | |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher | MPK5000, MPP100, MPS100 | |
| Neon Transfection System 10 uL Tips | Thermo Fisher | MPK1025 or MPK1096 | |
| PBS + 1mM EDTA | Lonza | BE02017F | |
| Proteinase K | Thermo Fisher | EO0491 | |
| rCutSmart Buffer for ExoI | NEB | B6004S | |
| Ribolock | Thermo Fisher | EO0384 | |
| RNA loading dye | NEB | B0363S | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| S. pyogenes Cas9-NLS | University of California Macro Lab | not applicable | Available to non-UC investigators through https://qb3.berkeley.edu |
| S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation | IDT | 1081059 | |
| SAP | NEB | M0371S |
References
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