Summary
Este protocolo describe el procedimiento para la edición del genoma en macrófagos derivados de la médula ósea de ratón utilizando complejos de ribonucleoproteínas Cas9-sgRNA ensamblados in vitro y administrados por electroporación.
Abstract
Los macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM) de ratones son una herramienta clave para estudiar la compleja biología de los macrófagos tisulares. Como células primarias, modelan la fisiología de los macrófagos in vivo más de cerca que las líneas celulares de macrófagos inmortalizados y pueden derivarse de ratones que ya portan cambios genéticos definidos. Sin embargo, la alteración de la función génica en los BMDM sigue siendo un reto técnico. Aquí, proporcionamos un protocolo para la edición eficiente del genoma CRISPR/Cas9 en BMDM, que permite la introducción de pequeñas inserciones y deleciones (indels) que dan lugar a mutaciones de cambio de marco que interrumpen la función génica. El protocolo describe cómo sintetizar ARN de una sola guía (sgRNA-Cas9) y formar complejos de ribonucleoproteínas (RNP) sgRNA-Cas9 purificados que pueden administrarse por electroporación. También proporciona un método eficiente para monitorear la eficiencia de la edición utilizando la secuenciación rutinaria de Sanger y un programa de análisis en línea disponible gratuitamente. El protocolo se puede realizar en 1 semana y no requiere la construcción de plásmidos; Por lo general, da como resultado una eficiencia de edición del 85% al 95%.
Introduction
Los macrófagos son células inmunitarias innatas que desempeñan un papel fundamental en la reparación de tejidos y la inmunidad 1,2. Las líneas celulares de macrófagos inmortalizadas, como las células RAW 264.7 de ratón o las células THP-1 humanas, tienen varias características beneficiosas, incluido el crecimiento robusto y la facilidad de disrupción génica mediante la administración de vectores de interferencia de ARN o CRISPR/Cas9 3,4. Sin embargo, la transformación oncogénica altera drásticamente su fisiología, lo que resulta en la activación aberrante de algunas vías y respuestas silenciadas de otras 5,6. Los macrófagos primarios derivados de la médula ósea (DMO) recapitulan más fielmente la fisiología de los macrófagos in vivo, pero siguen siendo difíciles de manipular genéticamente debido a la baja eficiencia tanto de la transfección de plásmidos como de la transducción viral en estas células inmunitarias primarias 7,8. Por lo tanto, se necesitan métodos más eficientes para interrumpir la función de los genes.
La edición del genoma CRISPR/Cas9 es una poderosa herramienta para la manipulación genética en una variedad de sistemas biológicos, incluidas las células de mamíferos 9,10,11,12. La proteína Cas9 de Streptococcus pyogenes escinde de manera eficiente y específica el ADN bicatenario cuando se compleja con un ARN guía específico de secuencia. La reparación del ADN a través de la unión de extremos no homólogos (NHEJ) del ADN escindido da lugar a pequeñas inserciones o deleciones (indels) que crean mutaciones de cambio de marco. En los primeros estudios, Cas9 y sgRNAs se administraron a través de plásmidos o vectores lentivirales, que son métodos de administración efectivos para muchas líneas celulares 9,10. Sin embargo, las células primarias y, en particular, las células inmunitarias primarias suelen ser refractarias a estos métodos debido a la baja eficacia de la administración del vector por transfección o transducción. Posteriormente, se han desarrollado métodos para generar complejos sgRNA-Cas9 in vitro y administrarlos por electroporación, y estos métodos han logrado una alta eficiencia en una variedad de tipos celulares13,14. Los resultados han sugerido la posibilidad de utilizar este enfoque para llevar a cabo la edición genómica en macrófagos primarios.
Aquí, proporcionamos un protocolo para el uso de complejos de ribonucleoproteínas (RNP) sgRNA-Cas9 para llevar a cabo la edición del genoma en BMDM primarios. Contiene medidas para mitigar la activación de los sensores inmunitarios presentes en las células inmunitarias primarias y da como resultado una edición de hasta el 95% en loci específicos con una toxicidad mínima. Este protocolo también incluye flujos de trabajo para evaluar la eficiencia de la edición mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) rutinaria y la secuenciación de Sanger, seguida de un análisis in silico mediante el seguimiento de Indels por descomposición (TIDE)15, una herramienta de software en línea bien validada.
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Protocol
1. Diseño de sgRNA
NOTA: Este paso describe la selección de las secuencias diana y el diseño de los sgRNAs. Es útil diseñar guías que se encuentren en el primer exón codificante grande, de modo que cualquier proteína traducida se interrumpa temprano en el marco de lectura abierto. También es útil seleccionar secuencias objetivo que se encuentren dentro del mismo exón, ya que esto agilizará el análisis de la eficiencia de la edición (paso 6). Los ejemplos de edición genómica proporcionados con este protocolo utilizaron sgRNAs dirigidos al primer exón del gen Src y al gen Cblb , así como en el locus no codificante Rosa26 del genoma del ratón.
- Identificar 20 secuencias genómicas de nucleótidos a las que dirigirse, utilizando una de las varias herramientas gratuitas de diseño en línea (Tabla 1). Seleccione cuatro o cinco guías que no se superpongan dentro de cada gen, ya que la actividad de Cas9 varía según la guía específica elegida, y no es posible predecir a priori una guía altamente activa.
NOTA: Es fundamental asegurar la orientación adecuada de la guía en relación con la secuencia del lugar geométrico objetivo. Las herramientas de diseño suelen proporcionar la secuencia guía en una orientación de 5' a 3', independientemente de la hebra cromosómica a la que se dirija. Para verificar la orientación de la hebra, verifique que haya una secuencia de motivo adyacente protoespaciador (PAM) para S. pyogenes Cas9 (nGG) inmediatamente a 3' de la secuencia genómica objetivo. La secuencia de sgRNA no incluye el PAM.
2. Síntesis de sgRNA
NOTA: Este paso describe cómo sintetizar sgRNAs usando PCR para generar una plantilla para la transcripción in vitro (IVT) y luego purificar el sgRNA usando columnas de centrifugación (Figura 1A). Los sgRNAs sintéticos personalizados están disponibles comercialmente a través de varios proveedores como alternativa a la PCR/IVT.
- Realice la PCR para generar la plantilla IVT para la ARN polimerasa T7. La reacción de PCR utiliza cebadores universales que contienen un promotor de ARN polimerasa T7 y una secuencia de ARN CRISPR transactivador (tracrRNA) (Tabla 2), además de cebadores individuales cortos con la secuencia guía específica del gen.
- Este es el paso de extensión de superposición sin amplificación. Diluir el tampón de PCR a 1x y añadir 1 mM de MgCl2 adicional. A continuación, se añadan 0,25 μL de ADN polimerasa de alta fidelidad, 0,5 mM de trifosfato de desoxinucleótido (dNTP), 0,02 mM de cebador específico de guía y 0,02 mM de cebador universal largo inverso T7 (Tabla 2) hasta un volumen total de 46 μL. A continuación, coloque el tubo en el termociclador y ejecute dos ciclos de: 95 °C durante 15 s, 37 °C durante 15 s y 72 °C durante 15 s. Enfríe las reacciones en hielo.
- Este es el paso de amplificación por PCR. A cada reacción, agregue 2 μL de cebador de amplificación directa de 25 mM y 2 μL de cebador de amplificación inversa de 25 mM. El volumen final de reacción es de 50 μL. Desnaturalizar durante 30 s a 95 °C. A continuación, ejecute 35 ciclos de: 95 °C durante 15 s, 65 °C durante 20 s y 72 °C durante 15 s. Realice una extensión adicional a 72 °C durante 2 min.
- Comprobar el producto de la reacción de PCR en un gel de agarosa al 2%. La PCR de superposición y extensión da como resultado una molécula de ADNd de 127 pb con el promotor T7 aguas arriba de la guía de 20 nucleótidos específica del gen y el ARNtrac inmediatamente aguas abajo (Figura 1B).
- Purificación de plantillas IVT: Existen numerosos protocolos y kits que funcionan bien para esto. Este protocolo utiliza perlas de inmovilización reversible en fase sólida (SPRI). Mezcle 50 μL del producto de PCR con 90 μL de perlas y siga las instrucciones del fabricante. Eluir el ADN añadiendo 40 μL de tampón (5 mM de Tris, 0,1 mM de ácido etilendiaminotetraacético [EDTA]) y calentar a 65 °C durante 5 min.
- Mida la concentración de ADN de la plantilla IVT utilizando la absorción a una longitud de onda de 260 nm. Se necesita una concentración de ADN de al menos 50 ng/μL para la IVT. La plantilla IVT se puede almacenar a -20 °C.
- Reacción IVT
- Utilice un kit comercial diseñado para producir altos rendimientos de IVT (consulte la Tabla de materiales). Siga las recomendaciones del fabricante para realizar la reacción IVT. Utilizando 250 ng de molde IVT en una reacción de 20 μL, incubar a 37 °C durante 4-16 h.
- Compruebe el producto de ARNg IVT ejecutando 1 μL de la reacción en un gel de agarosa al 2%. Se debe observar una banda de ARN brillante, que funciona de manera similar a 70 pb dsDNA (Figura 1C). Aunque no es obligatorio, para obtener bandas nítidas y más resueltas, utilice un tampón de muestra de ARN con urea y desnaturalice la muestra a 65 °C durante 5 minutos antes de la carga.
NOTA: Es posible que se observen bandas débiles de mayor peso molecular y ligeras diferencias de migración con algunos ARN guía debido a las diferencias en la estructura secundaria del ARN.
- Desfosforilar el producto IVT de sgRNA para minimizar la activación de RIG-I (un sensor de ARN extraño) y la posterior muerte celular después de la electroporación. Por cada reacción de 20 μL de IVT, agregue 69 μL de agua de grado molecular y 15 U de fosfatasa intestinal de ternera (CIP) en 1x tampón CIP. Incubar durante 2 h a 37 °C.
- Degradar la plantilla IVT para minimizar la activación de los sensores de ADN celular, que desencadenan la muerte celular después de la electroporación. A cada reacción de IVT, agregue 2 U de DNasa libre de RNasa. Incubar durante 15 min a 37 °C. El producto IVT puede almacenarse a -20 °C durante 1 día o a -80 °C durante varios meses.
- Purifique el producto IVT utilizando columnas de centrifugación. Para este paso, los kits de purificación de perlas SPRI son inferiores.
- Unir el ARN a la columna añadiendo 220 μL de tampón de unión al producto IVT, seguido de 1 mL de etanol 100% de grado de biología molecular. Mezcle bien y cargue la columna. A partir de entonces, siga las instrucciones del fabricante. Realizar el lavado final en una cabina de bioseguridad de flujo laminar para evitar la contaminación del sgRNA.
- Realizar la elución en la campana de flujo laminar para evitar la contaminación. Eluir el ARN con 30 μL de tampón Tris estéril de 10 mM (pH 8,0).
- Mida la concentración de sgRNA midiendo la absorbancia a una longitud de onda de 260 nm.
NOTA: Los rendimientos típicos de sgRNA son de al menos 100 μg. - Almacene el sgRNA a -80 °C. Haga alícuotas para evitar más de tres ciclos de congelación y descongelación.
3. Preparación para la electroporación
NOTA: Todos los pasos deben realizarse en una campana de flujo laminar para evitar la contaminación. Este protocolo utiliza un sistema de electroporación disponible en el mercado (ver Tabla de Materiales) con puntas de 10 μL.
- Descongele los BMDM 48-72 h antes de su uso y amplíelos en placas tratadas con no cultivo de tejidos (TC).
NOTA: Por reacción, se necesitan 4 x 105 células. - Esterilizar los tubos de PCR para el montaje de la reacción. Prepare un tubo de PCR por reacción y caliéntelos en un termociclador durante 10 min a 98 °C. Prepare los tubos en tandas y guárdelos cerrados. Coloque los tubos de PCR esterilizados en hielo cuando estén listos para usar.
- Limpie la estación de pipetas con etanol al 70% y colóquela en la campana de flujo laminar. Ajuste los parámetros a 1.900 V, 20 ms y un pulso.
- Retire un tubo de transfección del envase con cuidado para mantenerlo estéril y llénelo con 3 ml de tampón "E". Asegúrese de que el tampón E esté a temperatura ambiente antes de la electroporación. Inserte el tubo en la estación y empújelo hacia abajo hasta que haga clic.
- Para cada reacción, alícuota 2,5 μL de sgRNA a una concentración de 1.100 ng/μL. Diluir el sgRNA en solución salina fría tamponada con fosfato (PBS) con 0,9 mM de CaCl2 y 0,5 mM de MgCl2 (PBS + Ca/Mg). Déjalo en hielo.
- Prepare dos placas: una placa de 12 pocillos sin recubrimiento para las células y una placa adicional de 24 pocillos para contener los medios de cultivo. Alícuota 1,5 mL de medio libre de antibióticos por reacción en los pocillos de la placa de 24 pocillos.
- Prepara la proteína Cas9. Existen varios proveedores comerciales y académicos de proteína Cas9 purificada estérilmente. Diluir Cas9 hasta una concentración final de 20 μM con PBS frío + Ca/Mg. Para cada reacción de electroporación, alícuota 1 μL de 20 μM Cas9 en tubos de PCR estériles. Dejar en hielo.
- Preparar las celdas para la electroporación.
- Retire el medio de crecimiento. Lavar las células con PBS sin CaCl2 y MgCl2 (PBS-Ca/Mg) para eliminar el suero y los cationes divalentes que promueven la adhesión. Luego, agregue PBS + 1 mM de EDTA e incube a temperatura ambiente durante unos 5 minutos hasta que las células comiencen a desprenderse.
- Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para separar las células. Transfiera las células a un tubo de 15 ml de baja unión a proteínas. Gellet las células a 500 x g durante 5 min.
NOTA: Los macrófagos son adherentes a los artículos de plástico. El uso de tubos centrífugos de baja unión a proteínas mejora significativamente el rendimiento celular. - Trabaje rápidamente para evitar la incubación prolongada de células en PBS + EDTA. Retire la mayor parte del sobrenadante, dejando aproximadamente 1 ml de sobrenadante en el tubo. Vuelva a suspender las células en el sobrenadante restante y luego transfiéralas a un tubo de microfuga de 1,5 ml de baja unión a proteínas.
- Retire una pequeña alícuota de celdas para contar. Pulverizar las células restantes centrifugando a 500 x g a temperatura ambiente durante 5 min.
- Durante la centrifugación, cuente las células y caliente los tubos de Cas9 y sgRNA a temperatura ambiente.
- Retire todo el sobrenadante del gránulo de la celda. Resuspender las células en PBS + Ca/Mg a una concentración de 4 x 107 células/ml (4 x 105 células por reacción de 10 μL).
NOTA: Cada kit se suministra con una cantidad limitada de tampón de electroporación (tampón R, tampón T). Sin embargo, encontramos que la eficiencia de electroporación utilizando PBS + Ca/Mg es equivalente a la de los tampones patentados. - Al electroporar sgRNAs para diferentes genes, aliquota las células en diferentes tubos de baja unión a proteínas para cada gen para evitar la contaminación cruzada entre los sgRNAs. Mantenga las celdas a temperatura ambiente hasta que estén listas para la electroporación.
4. Montaje RNP
- Mantenga el sgRNA y Cas9 a temperatura ambiente para evitar precipitaciones. Añadir 2,5 μL de sgRNA a 1 μL de Cas9 diluido en tubos de PCR esterilizados. Dispense el sgRNA lentamente durante 15 s con mezcla para evitar la precipitación.
- Incubar durante 5 min a temperatura ambiente para permitir la formación del complejo RNP.
5. Entrega RNP por electroporación
- Prepare la punta de electroporación (cubeta). Presione el émbolo para extender el vástago. Inserte el vástago en la punta.
NOTA: Asegúrese de que la punta esté segura y de que el émbolo se deslice suavemente y se extienda más allá de la vaina de la punta. Si la punta no está colocada correctamente, se pueden introducir burbujas de aire en la punta, lo que provoca la falla de la punta. - Vuelva a suspender las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo y, a continuación, cargue la punta de electroporación con las células. Retire toda la capacidad de volumen de 10 μL de la punta, evitando burbujas.
- Comenzando con el sgRNA de control negativo, transfiera 10 μL de células en la punta de electroporación al tubo de muestra que contiene 3,5 μL de RNP del paso 4. Pipetea hacia arriba y hacia abajo tres veces para mezclar bien. Vuelva a introducir 10 μl de la mezcla en la punta, asegurándose de que no haya burbujas.
- Coloque la punta en la estación de electroporación, bajándola al tampón. Evite el contacto con superficies de plástico con la punta para mantener la esterilidad. Presione Inicio en la pantalla táctil.
- Una vez completado, la pantalla indicará un pulso exitoso. Retire la pipeta del dispositivo y coloque las células en un pocillo seco de la placa de 12 pocillos etiquetada y sin recubrimiento.
- Enjuague la punta pipeteando hacia arriba y hacia abajo dos veces en 15 ml de PBS + Ca/Mg. Deje a un lado la pipeta con la punta aún colocada. Asegúrese de que la punta no toque nada y permanezca estéril.
NOTA: En muchos experimentos, es posible reutilizar la punta para múltiples muestras, como después de la muestra de sgRNA de control negativo inactivo, o durante las evaluaciones iniciales de la actividad guía cuando se prueban de cuatro a cinco sgRNAs por gen y la única lectura es la eficiencia de edición. Sin embargo, durante el análisis funcional en células editadas, se recomienda una nueva punta para cada gen, ya que pequeñas cantidades de sgRNA o arrastre celular podrían afectar los resultados experimentales. - Agregue inmediatamente 1 ml de medio libre de antibióticos (alícuota en el paso 3.6) a las células y agite suavemente la placa para mezclar.
- Repita los pasos 5.2-5.6 para las reacciones restantes.
- Regrese las células a la incubadora.
- Comprobar la viabilidad de las células 1-2 h después de la electroporación. Las células deben tener una adherencia del >90%. Opcional: Añadir gentamicina (5 μg/mL) a las células 1-2 h después de la electroporación para ayudar a prevenir la contaminación si esto no interfiere con los experimentos posteriores.
6. Evaluación de la eficiencia de la edición
NOTA: La mayor parte de la edición se completa después de 48 h.
- Comprobar la monocapa celular 48 h después de la electroporación. Si las celdas tienen más del 50% de confluentes, continúe con el proceso. Si las células son <50% confluentes, espere 1-2 días más. El análisis genómico de ADN para determinar la eficiencia de edición requiere 1 x 105 células, además de las células necesarias para el experimento posterior.
- Preparar ADN genómico (ADNg).
- Lavar las células con PBS (-Ca/Mg). Agregue 1 mL de PBS + 1 mM de EDTA. Incubar a temperatura ambiente durante unos 5 minutos hasta que las células comiencen a desprenderse de la placa.
- Separe las células mediante pipeteo. Transfiera a un tubo de microfuga de baja unión a proteínas.
- Cuente las celdas y elimine una alícuota de 1 x 105 celdas. Las células restantes se pueden volver a colocar para su uso en experimentos posteriores. Generalmente, los experimentos se llevan a cabo 5 días después de la electroporación para permitir la descomposición de la proteína.
- Granular las células para el análisis de ADNg durante 15 s a velocidad máxima en un tubo de microfuga.
- Vuelva a suspender el gránulo en 50 μL de tampón de lisis. Vórtice para separar las células adheridas a las paredes del tubo, y calentar a 98 °C durante 10 min para lisar las células e inactivar la DNasa endógena.
- Coloque los tubos sobre hielo.
- Añadir 1 μL de proteinasa K (20 mg/mL). Incubar durante al menos 1 h a 37 °C; Se puede dejar toda la noche para mayor comodidad.
- Calentar a 98 °C durante 10 min para inactivar la proteinasa K.
- Centrifugar a temperatura ambiente durante 5 min a máxima velocidad. Retire el sobrenadante, que contiene el ADN. Esta preparación cruda sin más purificación funciona bien para la mayoría de las reacciones de PCR.
- Evalúe la eficiencia de la edición con la secuenciación de Sanger.
- Diseñe cebadores de PCR de 200 a 300 pb aguas arriba de los sitios de guía de 5' y de 200 a 300 pb aguas abajo de los sitios de guía de 3 pies. El tamaño típico del amplicón es de ~500 pb. Diseñe un cebador de secuenciación anidado al menos a 125 pb del sitio guía más cercano (Figura 2A).
- Realice la PCR con 2 μL de ADNg.
- Prepare el producto de PCR para la secuenciación. Este protocolo utiliza un tratamiento con exonucleasa I/fosfatasa alcalina de camarón (ExoI/SAP). Los kits comerciales de purificación de ADN también funcionan, pero requieren más tiempo de manipulación.
- Preparar 15 μL del producto de PCR. Agregue 7,5 μL de agua, 1 μL de tampón ExoI 10x, 10 U de ExoI y 1 U de SAP para degradar los dNTP y los cebadores que interfieren con la secuenciación de Sanger.
- Incubar a 37 °C durante 30 min, seguido de 85 °C durante 20 min para desactivar las enzimas.
- Llevar a cabo la secuenciación Sanger en el producto de PCR tratado con Exo/SAP; utilizar una cantidad conocida de marcador de tamaño de ADN para estimar el tamaño del producto de PCR presente en la muestra. Las reacciones de secuenciación pueden requerir optimización, ya que el software TIDE necesita cromatogramas de secuencia de alta calidad para estimar con precisión la eficiencia de la edición. El cromatograma de secuencia para el locus no editado debe proporcionar picos claros con un fondo mínimo (Figura 2B, C).
- Para estimar la eficiencia de la edición, utilice TIDE para analizar los archivos de cromatograma de secuenciación de Sanger utilizando el ADNg editado y el ADNg de control sin editar. (Tabla 1, Figura 2). Cargue los archivos de secuenciación de Sanger y ejecute el software con la configuración predeterminada.
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Representative Results
La plantilla IVT es un producto de PCR de 127 pb (Figura 1B). El producto IVT de longitud completa es un ARN de 98 nt, que migra de manera similar a un fragmento de ADN bicatenario de 70 pb (Figura 1C).
Después de la electroporación, las células deben ser >90% viables, con un recuento total de células del >70% del número de células inicial. El grupo resultante de células mutantes debería tener un conjunto diverso de indels, comenzando cerca del sitio de escisión de Cas9. El análisis de los genes diana mediante PCR y secuenciación de Sanger debería mostrar múltiples nucleótidos en cada posición aguas abajo del sitio de escisión de Cas9 (Figura 2).
Figura 1: Descripción general del proceso de edición de sgRNA-Cas9. (A) Esquema para el diseño de la guía, la generación de sgRNA y la administración de Cas9-sgRNA. (B) El producto de PCR de IVT para los sgRNAs 1, 2 y 3 de Src se resolvió en un gel de agarosa al 2%. La flecha indica los productos de PCR de 127 pb correctos. (C) Los productos de ARN después de la IVT para los sgRNAs 1, 2 y 3 de Src se resolvieron en un gel de agarosa al 2%. Los corchetes indican los productos de sgRNA correctos. La migración variable del sgRNA se debe a la estructura secundaria del ARN. Esta figura es una reimpresión de la tesis de maestría del primer autor16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Alta eficiencia de edición lograda para múltiples genes diana. (A) Esquema de los cebadores de secuenciación de PCR y Sanger. (B) Esquema del flujo de trabajo de TIDE para evaluar la eficiencia de la edición. (C) Cromatograma de secuenciación Sanger representativo del locus ROSA26 de BMDM electroporados con un control no dirigido sgRNA-Cas9 RNP (arriba) y sgRNA específico de ROSA26 (abajo); se resalta el sitio de escisión de Cas9. La salida TIDE (derecha) con la eficiencia de edición calculada y el porcentaje de secuencias que albergan el número indicado de indels. (D,E) Cromatogramas de secuenciación Sanger de los genes (D) Src y Cblb en los BMDM editados. Esta figura es una reimpresión de la tesis de maestría del primer autor16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Aumento moderado en la eficiencia de edición debido al potenciador de electroporación comercial. Los BMDM se electroporaron con guías de baja eficiencia para evaluar el efecto de un potenciador de edición comercial. Antes de la electroporación, se añadió 1 μL del potenciador a los RNPs ensamblados hasta una concentración final de 4 μM. La eficiencia de edición del sgRNA Src indicado se evaluó mediante TIDE. Esta figura es una reimpresión de la tesis de maestría del primer autor16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre de la herramienta | URL | ||
| Synthego - Herramienta de diseño CRISPR | https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-design-tool | ||
| El Instituto Broad - CRISPick | https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public | ||
| Seguimiento de Indels por descomposición (TIDE) | http://shinyapps.datacurators.nl/tide/ | ||
Tabla 1: URL de las herramientas en línea.
| Nombre del cebador | Secuencia | ||
| Imprimación específica de la guía | ggatcctaatacgactcactatag[N20]gttttagagctagaa | ||
| Imprimación específica para guías - Cbl-b Guía 3 | ggatcctaatacgactcactatagAAAATATCAAGTATATACGGgttttagagctagaa | ||
| Imprimación específica para guías - Cbl-b Guía 4 | ggatcctaatacgactcactatagGGTAAAATATCAAGTATATAgttttagagctagaa | ||
| Imprimación específica para guías - Rosa | ggatcctaatacgactcactatagCTCCAGTCTTTCTAGAAGATgttttagagctagaa | ||
| Imprimación específica de la guía - Scramble | ggatcctaatacgactcactatagGCACTACCAGAGCTAACTCAgttttagagctagaa | ||
| Cartilla específica de la guía - Guía Src 2 | ggatcctaatacgactcactatagTCACTAGACGGGAATCAGAGgttttagagctagaa | ||
| Cartilla específica de la guía - Guía Src 5 | ggatcctaatacgactcactatagCAGCAACAAGAGCAAGCCCAgttttagagctagaa | ||
| Cartilla específica de la guía - Guía Src 6 | ggatcctaatacgactcactatagAGCCCAAGGACGCCAGCCAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGCAG | ||
| T7 Imprimación universal larga inversa | aaaaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaacttgctatttctagctctctaaaac | ||
| Imprimación universal de amplificación directa | ggatcctaatacgactcactatag | ||
| Imprimación universal de amplificación inversa | aaaaaagcaccgactcgg | ||
Tabla 2: Oligonucleótidos utilizados en la PCR para generar el molde para la IVT del sgRNA. Las secuencias diana de 20 nucleótidos para los cebadores específicos de genes se escriben en mayúsculas.
| BMDM Medios de crecimiento. Conservar a 4 C. | |||
| DMEM | |||
| Suero fetal bovino | 0.1 | ||
| L-glutamina | 0,2 M | ||
| Sobrenadante MCSF de células 3T3-MCSF** | 0.1 | ||
| Piruvato de sodio | 11 mg/mL | ||
| Tampón de lisis. Conservar a 4 C. | |||
| 2-mercaptoetanol (añadir inmediatamente antes de su uso) | 0.01 | ||
| MgCl2 | 5 mM | ||
| Tris | 20 mM | ||
| Tritón-X 100 | 0.005 | ||
| **Las células 3T3-MCSF se cultivan en DMEM+10% FCS. El sobrenadante con MCSF se cosecha el 5º día después de alcanzar el 100% de confluencia. Como alternativa, se puede utilizar MCSF recombinante de 10 ng/ml en lugar de medios acondicionados | |||
Tabla 3: Composiciones de los medios y búferes.
Archivo complementario 1: Archivo de secuenciación sin procesar para ROSA_ simulacro Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo complementario 2: Archivo de secuenciación sin procesar para ROSA_TargettingGuide Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo complementario 3: Archivo de secuenciación sin procesar para ScrambleGuide Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo suplementario 4: Archivo de secuenciación sin procesar para SrcG5 + SrcG6 Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo complementario 5: Archivo de secuenciación sin procesar para CBLB_Mock Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo suplementario 6: Archivo de secuenciación sin procesar para CBLB_TargetingGuide Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo complementario 7: Archivo de secuenciación sin procesar para Mock_Guide2Locus Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo suplementario 8: Archivo de secuenciación sin procesar para Mock_Guide6Locus Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo suplementario 9: Archivo de secuenciación sin procesar para SrcGuide2_Enhancer Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo complementario 10: Archivo de secuenciación sin procesar para SrcGuide2_NoEnhance Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo complementario 11: Archivo de secuenciación sin procesar para SrcGuide6_Enhancer Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo complementario 12: Archivo de secuenciación sin procesar para SrcGuide6_NoEnhancer Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
La edición del genoma mediante complejos Cas9-sgRNA electroporados permite una interrupción eficaz de la función génica en los BMDM. La eficiencia de edición varía según la secuencia diana y el gen. Por lo general, se analizan de cuatro a cinco sgRNAs para identificar uno que es altamente activo. Algunos loci tienen eficiencias de edición más bajas, muy probablemente debido a la estructura de la cromatina. En estos casos, se pueden realizar varias modificaciones para aumentar la eficiencia de la edición. La entrega conjunta de dos sgRNAs activos al mismo exón da como resultado una mejor edición para algunos genes. Sin embargo, cuando dos guías se transfetan conjuntamente, hemos observado que TIDE puede perder precisión. Por lo tanto, es posible que se requieran técnicas alternativas para evaluar la edición, como Western blot. Además, la inclusión de un potenciador NHEJ disponible comercialmente a menudo aumenta la eficiencia de edición en ~20% (Figura 3).
Este enfoque tiene varias ventajas. La administración directa de sgRNA-Cas9 a las células no requiere los pasos lentos de la construcción de plásmidos o la producción de vectores lentivirales para transducir BMDM. El proceso de síntesis de sgRNA, electroporación y generación de células mutantes se puede completar en 1 semana. Esta técnica también se puede utilizar con BMDM derivados de ratones modificados genéticamente para crear células doblemente mutantes. Aunque existen métodos químicos para transfecar células inmunitarias primarias con siRNA o ARNm17, estos métodos químicos son significativamente menos eficaces que la electroporación para administrar complejos Cas9-sgRNA a las células inmunitarias18. Hay varios tipos de dispositivos de electroporación disponibles comercialmente. Se prevé que estos dispositivos funcionen de manera similar para la administración de complejos Cas9-sgRNA, aunque es probable que los parámetros de voltaje deban optimizarse para cada dispositivo individual. Si bien este protocolo se ha utilizado principalmente en BMDM de ratón, en experimentos limitados, se han obtenido resultados similares con BMDM de rata (datos no publicados). Es posible que otros tipos de macrófagos primarios, como los macrófagos peritoneales de ratón o los macrófagos alveolares, también puedan ser susceptibles a este enfoque, aunque esto aún no se ha probado.
Este método tiene algunas limitaciones. El número de células producidas por este protocolo es algo limitado; Nuestras condiciones estándar generan 4 x 105 celdas por electroporación. Sin embargo, puede ser posible aumentar significativamente el rendimiento, ya que la eficiencia no disminuye en una reacción de 10 μL con hasta 2,4 x 106 células utilizando la misma cantidad de RNP (datos no publicados). Además, hay disponibles puntas de electroporación de 100 μL. Otro inconveniente de este método es el gasto; Los costos tanto del electroporador como de los consumibles de electroporación son sustanciales. Estos gastos pueden mitigarse significativamente mediante la reutilización de las puntas cuando se utilizan diferentes sgRNAs dirigidos al mismo gen y mediante el uso de PBS en lugar de los tampones patentados. Si bien no se conocen las composiciones de los tampones patentados, presumiblemente la composición electrolítica del PBS con 0,9 mM CaCl2 y 0,5 mM MgCl2 se aproxima a la conductancia eléctrica del tampón patentado. Estos cambios reducen el costo de los consumibles en aproximadamente un 80% en este protocolo.
Hay varios pasos críticos en el protocolo, cuyas desviaciones podrían afectar drásticamente la eficiencia de la edición de genes. Uno de los posibles escollos es que los kits de IVT estándar, que no están diseñados para altos rendimientos, a menudo producen un producto IVT insuficiente. Además, el uso de tubos de microfuga de polipropileno estándar en lugar de tubos de baja unión puede causar una pérdida celular significativa por adhesión. La desfosforilación incompleta del producto IVT y la presencia de ADN residual en la preparación del sgRNA pueden dar lugar a la activación de los sensores inmunitarios de macrófagos y a la consiguiente toxicidad. Los pulsos de voltaje más altos o más largos también pueden resultar en un aumento de la muerte celular.
En resumen, este protocolo de edición del genoma, que utiliza la electroporación para administrar RNPs Cas9-sgRNA, es un método eficiente para alterar genes en BMDM de ratón. Esto permite a los usuarios detectar rápidamente fenotipos en células primarias que recapitulan más de cerca la compleja biología de los macrófagos in vivo.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por la subvención 5R01AI144149 de los NIH. Las figuras esquemáticas fueron creadas con BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3T3-MCSF Cell Line | Gift from Russell Vance | not applicable | |
| Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer | IDT | 1075915 | |
| Ampure XP Reagent Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | NEB | M0525S | |
| DNase | NEB | M0303S | |
| DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2) | Thermo Fisher | 14040-133 | |
| DPBS -Ca/Mg | Thermo Fisher | 14190-144 | |
| ExoI | NEB | M0293S | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Corning | 35-015-CV | |
| Herculase DNA polymerase & buffer | Agilent | 600677 | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | NEB | E2040S | |
| LoBind conical tubes 15 mL | Eppendorf | 30122216 | |
| LoBind Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf | 22431102 | |
| NEBuffer r2.1 | NEB | B6002S | |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher | MPK5000, MPP100, MPS100 | |
| Neon Transfection System 10 uL Tips | Thermo Fisher | MPK1025 or MPK1096 | |
| PBS + 1mM EDTA | Lonza | BE02017F | |
| Proteinase K | Thermo Fisher | EO0491 | |
| rCutSmart Buffer for ExoI | NEB | B6004S | |
| Ribolock | Thermo Fisher | EO0384 | |
| RNA loading dye | NEB | B0363S | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| S. pyogenes Cas9-NLS | University of California Macro Lab | not applicable | Available to non-UC investigators through https://qb3.berkeley.edu |
| S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation | IDT | 1081059 | |
| SAP | NEB | M0371S |
References
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