Summary
Denne protokollen beskriver prosedyren for genomredigering i musbenmargsavledede makrofager ved bruk av Cas9-sgRNA ribonukleoproteinkomplekser samlet in vitro og levert ved elektroporering.
Abstract
Benmargsavledede makrofager (BMDM) fra mus er et sentralt verktøy for å studere den komplekse biologien til vevsmakrofager. Som primære celler modellerer de fysiologien til makrofager in vivo nærmere enn immortaliserte makrofagcellelinjer og kan stamme fra mus som allerede bærer definerte genetiske endringer. Imidlertid er forstyrrende genfunksjon i BMDM fortsatt teknisk utfordrende. Her gir vi en protokoll for effektiv CRISPR/Cas9-genomredigering i BMDM, som muliggjør innføring av små innsettinger og delesjoner (indels) som resulterer i frameshift-mutasjoner som forstyrrer genfunksjonen. Protokollen beskriver hvordan man syntetiserer enkeltguidede RNA (sgRNA-Cas9) og danner rensede sgRNA-Cas9 ribonukleoproteinkomplekser (RNP) som kan leveres ved elektroporering. Det gir også en effektiv metode for å overvåke redigeringseffektivitet ved hjelp av rutinemessig Sanger-sekvensering og et fritt tilgjengelig online analyseprogram. Protokollen kan utføres innen 1 uke og krever ikke plasmidkonstruksjon; Det resulterer vanligvis i 85% til 95% redigeringseffektivitet.
Introduction
Makrofager er medfødte immunceller som spiller kritiske roller i vevsreparasjon og immunitet 1,2. Immortaliserte makrofagcellelinjer, som mus RAW 264.7-celler eller humane THP-1-celler, har flere fordelaktige egenskaper, inkludert robust vekst og enkel genforstyrrelse ved å levere vektorer for RNA-interferens eller CRISPR / Cas9 3,4. Imidlertid endrer onkogen transformasjon dramatisk deres fysiologi, noe som resulterer i avvikende aktivering av noen veier og dempede responser fra andre 5,6. Primære benmargsavledede makrofager (BMDM) rekapituleres nærmere in vivo makrofagfysiologi, men er fortsatt utfordrende å genetisk manipulere på grunn av den lave effektiviteten av både plasmidtransfeksjon og viral transduksjon i disse primære immuncellene 7,8. Dermed er det behov for mer effektive metoder for å forstyrre genfunksjonen.
CRISPR/Cas9 genomredigering er et kraftig verktøy for genetisk manipulering på tvers av en rekke biologiske systemer, inkludert pattedyrceller 9,10,11,12. Streptococcus pyogenes Cas9-proteinet spalter effektivt og spesifikt dobbeltstrenget DNA når det kompleksiseres med et sekvensspesifikt guide-RNA. DNA-reparasjon gjennom den ikke-homologe endesammenføyningen (NHEJ) av det spaltede DNA-et resulterer i små innsettinger eller delesjoner (indels) som skaper frameshift-mutasjoner. I tidlige studier ble Cas9 og sgRNA levert gjennom plasmid- eller lentivirale vektorer, som er effektive leveringsmetoder for mange cellelinjer 9,10. Imidlertid er primære celler og spesielt primære immunceller ofte ildfaste mot disse metodene på grunn av den lave effektiviteten av vektorlevering ved transfeksjon eller transduksjon. Deretter har metoder blitt utviklet for å generere sgRNA-Cas9-komplekser in vitro og å levere dem via elektroporering, og disse metodene har oppnådd høy effektivitet i en rekke celletyper13,14. Resultatene har antydet muligheten for å bruke denne tilnærmingen til å utføre genomredigering i primære makrofager.
Her gir vi en protokoll for bruk av sgRNA-Cas9 ribonukleoproteinkomplekser (RNP) for å utføre genomredigering i primære BMDM. Den inneholder trinn for å redusere aktiveringen av immunsensorene som er tilstede i primære immunceller og resulterer i opptil 95% redigering på målrettede steder med minimal toksisitet. Denne protokollen inkluderer også arbeidsflyter for å evaluere redigeringseffektivitet ved hjelp av rutinemessig polymerasekjedereaksjon (PCR) og Sanger-sekvensering, etterfulgt av i silikoanalyse av Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)15, et godt validert online programvareverktøy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sgRNA-design
MERK: Dette trinnet beskriver valg av målsekvenser og utforming av sgRNAene. Det er nyttig å designe guider som er i det første store kodingseksonet, slik at ethvert oversatt protein blir forstyrret tidlig i den åpne leserammen. Det er også nyttig å velge målsekvenser som ligger innenfor samme ekson, da dette vil effektivisere analysen av redigeringseffektiviteten (trinn 6). Eksemplene på genomredigering som følger med denne protokollen, brukte sgRNA rettet mot den første eksonen av Src-genet og Cblb-genet , så vel som i det ikke-kodende Rosa26-lokuset til musegenomet.
- Identifiser 20 nukleotidgenomiske sekvenser for å målrette, ved hjelp av ett av flere gratis online designverktøy (tabell 1). Velg fire til fem guider som ikke er overlappende innenfor hvert gen, da Cas9-aktiviteten varierer etter den spesifikke guiden som er valgt, og a priori prediksjon av en svært aktiv guide er ikke mulig.
MERK: Det er viktig å sikre riktig orientering av veiledningen i forhold til sekvensen av det målrettede stedet. Designverktøy gir vanligvis føringssekvensen i en 5 'til 3' orientering, uavhengig av hvilken kromosomstreng som er målrettet. For å verifisere trådretningen, sjekk at det er en protospacer tilstøtende motivsekvens (PAM) for S. pyogenes Cas9 (nGG) umiddelbart 3' av den målrettede genomiske sekvensen. SgRNA-sekvensen inkluderer ikke PAM.
2. sgRNA-syntese
MERK: Dette trinnet beskriver hvordan du syntetiserer sgRNA ved hjelp av PCR for å generere en mal for in vitro-transkripsjon (IVT), og deretter rense sgRNA ved hjelp av spinnkolonner (figur 1A). Tilpassede syntetiske sgRNA er kommersielt tilgjengelige gjennom flere leverandører som et alternativ til PCR / IVT.
- Utfør PCR for å generere IVT-malen for T7 RNA-polymerase. PCR-reaksjonen bruker universelle primere som inneholder en T7 RNA-polymerasepromotor og transaktiverende CRISPR RNA (tracrRNA) sekvens (tabell 2), i tillegg til korte individuelle primere med den genspesifikke styringssekvensen.
- Dette er trinnet for ikke-forsterkende overlappingsforlengelse. Fortynn PCR-bufferen til 1x og tilsett ytterligere 1 mM MgCl2. Deretter tilsettes 0,25 μL DNA-polymerase med høy kvalitet, 0,5 mM deoksynukleotidtrifosfat (dNTP), 0,02 mM guidespesifikk primer og 0,02 mM T7 omvendt lang universell primer (tabell 2) til et totalt volum på 46 μL. Deretter plasserer du røret i termosyklisten og kjører to sykluser på: 95 ° C i 15 s, 37 ° C i 15 s og 72 ° C i 15 s. Avkjøl reaksjonene på is.
- Dette er PCR-forsterkningstrinnet. Til hver reaksjon, tilsett 2 μL av 25 mM fremoverforsterkningsprimer og 2 μL 25 mM primer for omvendt forsterkning. Det endelige reaksjonsvolumet er 50 μL. Denaturering i 30 s ved 95 °C. Kjør deretter 35 sykluser på: 95 °C i 15 s, 65 °C i 20 s og 72 °C i 15 s. Utfør en ekstra forlengelse ved 72 °C i 2 minutter.
- Sjekk PCR-reaksjonsproduktet på en 2% agarosegel. Overlapp-forlengelse PCR resulterer i et 127 bp dsDNA-molekyl med T7-promotoren oppstrøms for den genspesifikke 20 nukleotidguiden og tracrRNA umiddelbart nedstrøms (figur 1B).
- IVT malrensing: Det er mange protokoller og sett som fungerer bra for dette. Denne protokollen bruker fastfase reversibel immobilisering (SPRI) perler. Bland 50 μL av PCR-produktet med 90 μL perler og følg produsentens instruksjoner. Elute DNA ved å tilsette 40 μL buffer (5 mM Tris, 0,1 mM etylendiamintetraeddiksyre [EDTA]) og varme opp ved 65 °C i 5 minutter.
- Mål DNA-konsentrasjonen av IVT-malen ved å bruke absorpsjon ved en bølgelengde på 260 nm. En DNA-konsentrasjon på minst 50 ng / μL er nødvendig for IVT. IVT-malen kan lagres ved -20 °C.
- IVT reaksjon
- Bruk et kommersielt sett designet for å produsere høye utbytter av IVT (se Materialfortegnelse). Følg produsentens anbefalinger for å utføre IVT-reaksjonen. Bruk 250 ng IVT-mal i en 20 μL-reaksjon, inkuber ved 37 °C i 4-16 timer.
- Kontroller IVT sgRNA-produktet ved å kjøre 1 μL av reaksjonen på en 2% agarosegel. Et lyst RNA-bånd bør observeres, som kjører på samme måte som 70 bp dsDNA (figur 1C). Selv om det ikke er obligatorisk, for å oppnå skarpe og mer oppløste bånd, bruk en RNA-prøvebuffer med urea, og denaturer prøven ved 65 ° C i 5 minutter før lasting.
MERK: Svake høyere molekylære vektbånd og små migrasjonsforskjeller kan sees med noen guide-RNA på grunn av forskjeller i RNAs sekundære struktur.
- Defosforylere sgRNA IVT-produktet for å minimere aktiveringen av RIG-I (en fremmed RNA-sensor) og påfølgende celledød etter elektroporering. For hver 20 μL IVT-reaksjon, tilsett 69 μL molekylært vann og 15 U kalventarmfosfatase (CIP) i 1x CIP-buffer. Inkuber i 2 timer ved 37 °C.
- Degrader IVT-malen for å minimere aktiveringen av cellulære DNA-sensorer, som utløser celledød etter elektroporering. Til hver IVT-reaksjon, tilsett 2 U RNase-fri DNase. Inkuber i 15 minutter ved 37 °C. IVT-produktet kan oppbevares ved -20 °C i 1 dag eller -80 °C i flere måneder.
- Rens IVT-produktet ved hjelp av spinnkolonner. For dette trinnet er SPRI-perlerensingssett dårligere.
- Bind RNA til kolonnen ved å tilsette 220 μL bindingsbuffer til IVT-produktet, etterfulgt av 1 ml 100% molekylærbiologisk etanol. Bland godt og last kolonnen. Følg deretter produsentens instruksjoner. Utfør den endelige vasken i et biosikkerhetsskap med laminær strømning for å unngå forurensning av sgRNA.
- Utfør elueringen i avtrekkshetten for laminær luftstrøm for å unngå kontaminering. Elute RNA ved hjelp av 30 μL steril 10 mM Tris-buffer (pH 8,0).
- Mål konsentrasjonen av sgRNA ved å måle absorbansen ved en bølgelengde på 260 nm.
MERK: Typiske sgRNA-utbytter er minst 100 μg. - Oppbevar sgRNA ved -80 °C. Lag alikoter for å unngå mer enn tre fryse-tine sykluser.
3. Forberedelse for elektroporering
MERK: Alle trinn skal utføres i en avtrekkshette for laminær luftstrøm for å unngå kontaminering. Denne protokollen bruker et kommersielt tilgjengelig elektroporeringssystem (se materialtabell) med 10 μL-spisser.
- Tine BMDM-ene 48-72 timer før bruk og utvide dem på ikke-vevskultur (TC) behandlede plater.
MERK: Per reaksjon er 4 x 105 celler nødvendig. - Steriliser PCR-rør for reaksjonsmontering. Forbered ett PCR-rør per reaksjon, og varm dem i en termosyklist i 10 minutter ved 98 °C. Forbered rørene i grupper og lagre dem lukket. Legg de steriliserte PCR-rørene på is når de er klare til bruk.
- Rengjør pipettestasjonen med 70 % etanol og legg den i avtrekksdekselet for laminær luftstrøm. Sett parametrene til 1 900 V, 20 ms og én puls.
- Fjern et transfeksjonsrør fra pakken med forsiktighet for å holde det sterilt og fyll det med 3 ml "E" buffer. Forsikre deg om at E-bufferen har romtemperatur før elektroporering. Sett inn røret i stasjonen og skyv det ned til det klikker.
- For hver reaksjon, aliquot 2,5 μL sgRNA i en konsentrasjon på 1,100 ng / μL. Fortynn sgRNA i kaldt fosfatbufret saltvann (PBS) med 0,9 mM CaCl2 og 0,5 mM MgCl2 (PBS + Ca / Mg). La den ligge på is.
- Forbered to plater: en 12-brønns ubelagt plate for cellene og en ekstra 24-brønnsplate for å holde kulturmediet. Aliquot 1,5 ml antibiotikafritt medium per reaksjon i brønnene på 24-brønnplaten.
- Forbered Cas9 protein. Det finnes flere kommersielle og akademiske leverandører av sterilt renset Cas9-protein. Fortynn Cas9 til en endelig konsentrasjon på 20 μM med kald PBS + Ca/Mg. For hver elektroporeringsreaksjon, alikot 1 μL av 20 μM Cas9 i sterile PCR-rør. La ligge på is.
- Forbered celler for elektroporering.
- Fjern vekstmediet. Vask cellene med PBS uten CaCl2 og MgCl2 (PBS-Ca/Mg) for å fjerne serum og divalente kationer som fremmer vedheft. Tilsett deretter PBS + 1 mM EDTA og inkuber ved romtemperatur i ca. 5 minutter til cellene begynner å løsne.
- Pipett forsiktig opp og ned for å løsne cellene. Overfør cellene til et lavt proteinbindende 15 ml rør. Pellet cellene ved 500 x g i 5 minutter.
MERK: Makrofager er festet til plastvarer. Bruken av lavproteinbindende sentrifugerør forbedrer celleutbyttet betydelig. - Arbeid raskt for å unngå langvarig inkubasjon av celler i PBS + EDTA. Fjern det meste av supernatanten, og etterlat ca. 1 ml supernatant i slangen. Resuspender cellene i den gjenværende supernatanten, og overfør deretter til et lavt proteinbindende 1,5 ml mikrofugerør.
- Fjern en liten aliquot av celler for å telle. Pellet de resterende cellene ved å sentrifugere ved 500 x g ved romtemperatur i 5 minutter.
- Under sentrifugering, tell cellene og varm Cas9- og sgRNA-rørene til romtemperatur.
- Fjern all supernatanten fra cellepelleten. Resuspender cellene i PBS + Ca/Mg i en konsentrasjon på 4 x 107 celler/ml (4 x 105 celler per 10 μL reaksjon).
MERK: Hvert sett leveres med en begrenset mengde elektroporeringsbuffer (buffer R, buffer T). Imidlertid finner vi at elektroporasjonseffektiviteten ved bruk av PBS + Ca / Mg tilsvarer de proprietære bufferne. - Ved elektroporering av sgRNA for forskjellige gener, alikot cellene i forskjellige lavproteinbindende rør for hvert gen for å unngå krysskontaminering mellom sgRNAene. Hold cellene ved romtemperatur til de er klare for elektroporering.
4. RNP-montering
- Hold sgRNA og Cas9 ved romtemperatur for å unngå nedbør. Tilsett 2,5 μL sgRNA til 1 μL av det fortynnede Cas9 i steriliserte PCR-rør. Dispenser sgRNA sakte over 15 s med blanding for å forhindre nedbør.
- Inkuber i 5 minutter ved romtemperatur for å tillate dannelse av RNP-kompleks.
5. RNP-levering ved elektroporering
- Forbered elektroporasjonsspissen (kuvetten). Trykk inn stempelet for å forlenge stammen. Sett stammen inn i spissen.
NOTAT: Forsikre deg om at spissen sitter godt fast og at stempelet glir jevnt og strekker seg utover spisskappen. Hvis spissen ikke er riktig plassert, kan luftbobler føres inn i spissen og forårsake spissfeil. - Resuspender cellene ved å pipettere opp og ned, og last deretter elektroporasjonsspissen med cellene. Trekk opp spissens fulle volumkapasitet på 10 μL, unngå bobler.
- Fra og med det negative kontroll-sgRNA, overfør 10 μL celler i elektroporasjonsspissen til prøverøret som inneholder 3,5 μL RNP fra trinn 4. Pipett opp og ned tre ganger for å blande godt. Trekk 10 μL av blandingen tilbake i spissen, slik at det ikke er bobler.
- Plasser spissen i elektroporeringsstasjonen, senk den ned i bufferen. Unngå å komme i kontakt med plastoverflater med tuppen for å opprettholde steriliteten. Trykk på Start på berøringsskjermen.
- Etter ferdigstillelse vil displayet indikere en vellykket puls. Fjern pipetten fra enheten og plasser cellene i en tørr brønn på den merkede, ubelagte 12-brønnplaten.
- Skyll spissen ved å pipettere opp og ned to ganger i 15 ml PBS + Ca/Mg. Sett pipetten til side med spissen fortsatt festet. Forsikre deg om at spissen ikke berører noe og forblir steril.
MERK: I mange eksperimenter er det mulig å gjenbruke spissen for flere prøver, for eksempel etter den inaktive negative kontroll-sgRNA-prøven, eller under de første evalueringene av guideaktiviteten når fire til fem sgRNA testes per gen og den eneste avlesningen er redigeringseffektiviteten. Under funksjonell analyse på redigerte celler anbefales imidlertid et nytt tips for hvert gen, da små mengder sgRNA eller celleoverføring kan påvirke de eksperimentelle resultatene. - Tilsett umiddelbart 1 ml antibiotikafritt medium (alisitert i trinn 3.6) til cellene og rist platen forsiktig for å blande.
- Gjenta trinn 5.2-5.6 for de resterende reaksjonene.
- Returner cellene til inkubatoren.
- Kontroller levedyktigheten til cellene 1-2 timer etter elektroporering. Cellene skal være >90% tilhenger. Valgfritt: Legg gentamicin (5 μg / ml) til cellene 1-2 timer etter elektroporering for å forhindre forurensning hvis dette ikke vil forstyrre nedstrøms eksperimenter.
6. Vurdering av redigeringseffektiviteten
MERK: De fleste redigeringer er fullført etter 48 timer.
- Kontroller cellemonolaget 48 timer etter elektroporering. Hvis cellene er over 50% sammenflytende, fortsett videre. Hvis cellene er <50% sammenflytende, vent ytterligere 1-2 dager. Den genomiske DNA-analysen for å bestemme redigeringseffektiviteten krever 1 x 105 celler, i tillegg til cellene som trengs for nedstrømseksperimentet.
- Forbered genomisk DNA (gDNA).
- Vask cellene med PBS (-Ca / Mg). Tilsett 1 ml PBS + 1 mM EDTA. Inkuber ved romtemperatur i ca. 5 minutter til cellene begynner å løsne fra platen.
- Løsne cellene ved pipettering. Overfør til et lite proteinbindende mikrofugerør.
- Tell cellene og fjern en aligot på 1 x 105 celler. De gjenværende cellene kan bli re-plated for bruk i videre eksperimenter. Vanligvis utføres forsøkene 5 dager etter elektroporering for å tillate forfall av proteinet.
- Pellet cellene for gDNA-analyse i 15 s ved maksimal hastighet i et mikrofugerør.
- Resuspender pelleten i 50 μL lysisbuffer. Vortex for å løsne celler som sitter fast på rørets vegger, og varme ved 98 ° C i 10 minutter for å lyse cellene og inaktivere endogen DNase.
- Legg rørene på is.
- Tilsett 1 μL proteinase K (20 mg/ml). Inkuber i minst 1 time ved 37 °C; Den kan stå over natten for enkelhets skyld.
- Varm opp til 98 °C i 10 minutter for å inaktivere proteinasen K.
- Sentrifuge ved romtemperatur i 5 min ved maksimal hastighet. Fjern supernatanten, som inneholder DNA. Dette grove preparatet uten ytterligere rensing fungerer bra for de fleste PCR-reaksjoner.
- Evaluer redigeringseffektiviteten med Sanger-sekvensering.
- Design PCR-primere 200-300 bp oppstrøms for de fleste 5-tommers guidesider og 200-300 bp nedstrøms for de fleste 3-tommers guidesider. Den typiske amplikonstørrelsen er ~ 500 bp. Design en nestet sekvenseringsprimer minst 125 bp unna nærmeste føringssted (figur 2A).
- Utfør PCR ved hjelp av 2 μL gDNA.
- Forbered PCR-produktet for sekvensering. Denne protokollen bruker en eksonuklease I / reker alkalisk fosfatase (ExoI / SAP) behandling. Kommersielle DNA-rensesett fungerer også, men krever mer praktisk tid.
- Forbered 15 μL av PCR-produktet. Tilsett 7,5 μL vann, 1 μL 10x ExoI-buffer, 10 U ExoI og 1 U SAP for å nedbryte dNTP-ene og primerne som forstyrrer Sanger-sekvensering.
- Inkuber ved 37 °C i 30 minutter, etterfulgt av 85 °C i 20 minutter for å deaktivere enzymene.
- Utfør Sanger-sekvensering på Exo / SAP-behandlet PCR-produkt; bruk en kjent mengde DNA-størrelsesmarkør for å estimere størrelsen på PCR-produktet som er tilstede i prøven. Sekvenseringsreaksjonene kan kreve optimalisering, da TIDE-programvaren trenger sekvenskromatogrammer av høy kvalitet for å estimere redigeringseffektiviteten nøyaktig. Sekvenskromatogrammet for det uredigerte lokuset skal gi tydelige topper med minimal bakgrunn (figur 2B, C).
- For å estimere redigeringseffektiviteten, bruk TIDE til å analysere Sanger-sekvenseringskromatogramfilene ved hjelp av det redigerte gDNA og den uredigerte kontroll-gDNA. (Tabell 1, figur 2). Last opp Sanger-sekvenseringsfilene og kjør programvaren med standardinnstillingene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
IVT-malen er et 127 bp PCR-produkt (figur 1B). IVT-produktet i full lengde er et 98 nt RNA, som migrerer på samme måte som et 70 bp dobbeltstrenget DNA-fragment (figur 1C).
Etter elektroporering skal cellene være >90% levedyktige, med et totalt celletall på >70% av startcellenummeret. Det resulterende bassenget av mutante celler bør ha et mangfoldig sett med indels, som starter nær Cas9-spaltningsstedet. Analysen av de målrettede genene ved PCR- og Sanger-sekvensering skal vise multiple nukleotider i hver posisjon nedstrøms Cas9-spaltningsstedet (figur 2).
Figur 1: Oversikt over sgRNA-Cas9-redigeringsprosessen. (A) Skjematisk for guidedesign, sgRNA-generering og Cas9-sgRNA-levering. (B) PCR-produktet fra IVT for Src sgRNA 1, 2 og 3 løste seg på en 2% agarosegel. Pilen indikerer de riktige 127 bp PCR-produktene. (C) RNA-produktene etter IVT for Src sgRNA 1, 2 og 3 løste seg på en 2% agarosegel. Brakettene indikerer de riktige sgRNA-produktene. Den variable migrasjonen av sgRNA skyldes RNA sekundær struktur. Denne figuren er gjengitt fra førsteforfatterens masteroppgave16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Høy redigeringseffektivitet oppnådd for flere målrettede gener. (A) Skjematisk fremstilling av PCR og Sanger sekvenseringsprimere. (B) Skjematisk fremstilling av arbeidsflyten for TIDE for å vurdere effektiviteten av redigeringen. (C) Representativt Sanger-sekvenseringskromatogram for ROSA26-lokuset fra BMDM-er elektroporert med et kontrollikke-målrettende sgRNA-Cas9 RNP (øverst) og ROSA26-spesifikt sgRNA (nederst); Cas9-spaltningsstedet er uthevet. TIDE-utgangen (høyre) med beregnet redigeringseffektivitet og prosentandelen av sekvenser som inneholder det angitte antallet indels. (D,E) Sanger-sekvensering av kromatogrammer av (D) Src - og Cblb-genene i de redigerte BMDM-ene. Denne figuren er gjengitt fra førsteforfatterens masteroppgave16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Moderat økning i redigeringseffektivitet på grunn av den kommersielle elektroporeringsforsterkeren. BMDM-ene ble elektroporert med laveffektive guider for å evaluere effekten av en kommersiell redigeringsforsterker. Før elektroporering ble 1 μL av forsterkeren tilsatt til de monterte RNP-ene til en endelig konsentrasjon på 4 μM. Redigeringseffektiviteten til det angitte Src sgRNA ble evaluert ved bruk av TIDE. Denne figuren er gjengitt fra førsteforfatterens masteroppgave16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Navn på verktøy | URL | ||
| Synthego - Designverktøy for CRISPR | https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-design-tool | ||
| Det brede institutt - CRISPick | https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public | ||
| Sporing av Indels ved dekomponering (TIDE) | http://shinyapps.datacurators.nl/tide/ | ||
Tabell 1: URL-adresser til elektroniske verktøy.
| Primer Navn | Sekvens | ||
| Guide-spesifikk primer | ggatcctaatacgactcactatag[N20]gttttagagctagaa | ||
| Guide-spesifikk Primer - Cbl-b Guide 3 | ggatcctaatacgactcactatagAAAATATCAAGTATATACGGgttttagagctagaa | ||
| Guide-spesifikk Primer - Cbl-b Guide 4 | ggatcctaatacgactcactatagGGTAAATATCAAGTATATAgttttagagctagaa | ||
| Guide-spesifikk Primer - Rosa | ggatcctaatacgactcactatagCTCCAGTCTTTCTAGAAGATgttttagagctagaa | ||
| Guide-spesifikk Primer - Scramble | ggatcctaatacgactcactatagGCACTACCAGAGCTAACTCAgttttagagctagaa | ||
| Guide-spesifikk Primer - Src Guide 2 | ggatcctaatacgactcactatagTCACTAGACGGGAATCAGAGgttttagagctagaa | ||
| Guide-spesifikk Primer - Src Guide 5 | ggatcctaatacgactcactatagCAGCAACAAGCAAGCCCAgttttagagctagaa | ||
| Guide-spesifikk Primer - Src Guide 6 | ggatcctaatacgactcactatagAGCCCAAGGACGCCAGCCAGgttttagagctagaa | ||
| T7 omvendt lang universalprimer | aaaaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaacttgctatttctagctctaaaac | ||
| Universell forsterkningsprimer fremover | ggatcctaatacgactcactatag | ||
| Universell primer for omvendt forsterkning | aaaaaagcaccgactcgg | ||
Tabell 2: Oligonukleotider brukt i PCR for å generere malen for IVT av sgRNA. De 20 nukleotidmålsekvensene for genspesifikke primere er kapitalisert.
| BMDM Vekst medier. Oppbevares ved 4 °C. | |||
| DMEM | |||
| Foster bovint serum | 0.1 | ||
| L-glutamin | 0,2 M | ||
| MCSF-supernatant fra 3T3-MCSF-celler** | 0.1 | ||
| Natriumpyruvat | 11 mg/ml | ||
| Lysis Buffer. Oppbevares ved 4 °C. | |||
| 2-merkaptoetanol (tilsettes umiddelbart før bruk) | 0.01 | ||
| MgCl2 | 5 mM | ||
| Tris | 20 mM | ||
| Triton-X 100 | 0.005 | ||
| **3T3-MCSF-celler dyrkes i DMEM+10 % FCS. Supernatent med MCSF høstes den 5. dagen etter å ha nådd 100% samløp. Som et alternativ kan 10ng/ml rekombinant MCSF brukes i stedet for betingede medier | |||
Tabell 3: Mediesammensetninger og buffere.
Tilleggsfil 1: Rå sekvenseringsfil for ROSA_ Mock Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2: Rå sekvenseringsfil for ROSA_TargettingGuide Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 3: Rå sekvenseringsfil for ScrambleGuide Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 4: Råsekvenseringsfil for SrcG5+SrcG6 Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 5: Rå sekvenseringsfil for CBLB_Mock Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 6: Rå sekvenseringsfil for CBLB_TargetingGuide Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 7: Rå sekvenseringsfil for Mock_Guide2Locus Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 8: Rå sekvenseringsfil for Mock_Guide6Locus Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 9: Rå sekvenseringsfil for SrcGuide2_Enhancer Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 10: Rå sekvenseringsfil for SrcGuide2_NoEnhance Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 11: Rå sekvenseringsfil for SrcGuide6_Enhancer Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 12: Rå sekvenseringsfil for SrcGuide6_NoEnhancer Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genomredigering ved hjelp av elektroporerte Cas9-sgRNA-komplekser tillater effektiv forstyrrelse av genfunksjonen i BMDM. Redigeringseffektiviteten varierer etter målsekvens og gen. Vanligvis blir fire til fem sgRNA generelt screenet for å identifisere en som er svært aktiv. Noen loci har lavere redigeringseffektivitet, mest sannsynlig på grunn av kromatinstrukturen. I disse tilfellene kan flere modifikasjoner gjøres for å øke redigeringseffektiviteten. Samlevering av to aktive sgRNA til samme ekson resulterer i forbedret redigering for noen gener. Men når to guider transfekteres samtidig, har vi observert at TIDE kan miste nøyaktighet. Derfor kan det være nødvendig med alternative teknikker for å vurdere redigering, for eksempel vestlig blotting. I tillegg øker inkluderingen av en kommersielt tilgjengelig NHEJ-forsterker ofte redigeringseffektiviteten med ~ 20% (figur 3).
Denne tilnærmingen har flere fordeler. Direkte levering av sgRNA-Cas9 til celler krever ikke de tidkrevende trinnene med plasmidkonstruksjon eller lentiviral vektorproduksjon for å transdusere BMDM. Prosessen med å syntetisere sgRNA, elektroporering og generere mutante celler kan fullføres på 1 uke. Denne teknikken kan også brukes med BMDM avledet fra genetisk modifiserte mus for å lage dobbeltmutante celler. Selv om det finnes kjemiske metoder for å transfektere primære immunceller med siRNA eller mRNA17, er disse kjemiske metodene betydelig mindre effektive enn elektroporering ved å levere Cas9-sgRNA-komplekser til immunceller18. Det finnes flere typer elektroporasjonsenheter tilgjengelig kommersielt. Disse enhetene forventes å fungere på samme måte for levering av Cas9-sgRNA-komplekser, selv om spenningsparametrene sannsynligvis må optimaliseres for hver enkelt enhet. Selv om denne protokollen hovedsakelig har blitt brukt på mus-BMDM, har lignende resultater blitt oppnådd med BMDM for rotter (upubliserte data) i begrensede eksperimenter. Det er mulig at andre typer primære makrofager, som musperitoneale makrofager eller alveolære makrofager, også kan være mottagelige for denne tilnærmingen, selv om dette ennå ikke er testet.
Denne metoden har noen begrensninger. Antall celler produsert av denne protokollen er noe begrenset; Våre standardbetingelser genererer 4 x 105 celler per elektroporering. Det kan imidlertid være mulig å skalere opp utbyttet betydelig, da effektiviteten er uforminsket i en 10 μL-reaksjon med opptil 2,4 x 106 celler med samme mengde RNP (upubliserte data). I tillegg er 100 μL elektroporasjonsspisser tilgjengelige. En annen ulempe med denne metoden er bekostningen; Kostnadene for både elektroporatoren og elektroporasjonsforbruksmateriellet er betydelige. Disse utgiftene kan reduseres betydelig ved å gjenbruke tipsene når du bruker forskjellige sgRNAer rettet mot det samme genet og ved å bruke PBS i stedet for de proprietære bufferne. Mens sammensetningene av de proprietære bufferne ikke er kjent, tilnærmer antagelig elektrolyttsammensetningen av PBS med 0,9 mMCaCl2 og 0,5 mMMgCl2 den elektriske konduktansen til den proprietære bufferen. Disse endringene reduserer kostnadene for forbruksvarer med omtrent 80 % i denne protokollen.
Det er flere kritiske trinn i protokollen, avvik som kan dramatisk påvirke effektiviteten av genredigering. En av de potensielle fallgruvene er at standard IVT-sett, som ikke er designet for høye utbytter, ofte produserer utilstrekkelig IVT-produkt. I tillegg kan bruk av standard polypropylenmikrofugerør i stedet for lavbindende rør forårsake betydelig celletap ved vedheft. Den ufullstendige defosforyleringen av IVT-produktet og tilstedeværelsen av gjenværende DNA i sgRNA-preparatet kan resultere i aktivering av makrofagimmunsensorer og påfølgende toksisitet. Høyere eller lengre spenningspulser kan også føre til økt celledød.
Oppsummert er denne genomredigeringsprotokollen, som bruker elektroporering for å levere Cas9-sgRNA RNP, en effektiv metode for å forstyrre gener i musens BMDM. Dette gjør at brukerne raskt kan screene for fenotyper i primære celler som nærmere rekapitulerer den komplekse biologien til makrofager in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av NIH-stipendet 5R01AI144149. De skjematiske figurene ble laget med BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3T3-MCSF Cell Line | Gift from Russell Vance | not applicable | |
| Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer | IDT | 1075915 | |
| Ampure XP Reagent Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | NEB | M0525S | |
| DNase | NEB | M0303S | |
| DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2) | Thermo Fisher | 14040-133 | |
| DPBS -Ca/Mg | Thermo Fisher | 14190-144 | |
| ExoI | NEB | M0293S | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Corning | 35-015-CV | |
| Herculase DNA polymerase & buffer | Agilent | 600677 | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | NEB | E2040S | |
| LoBind conical tubes 15 mL | Eppendorf | 30122216 | |
| LoBind Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf | 22431102 | |
| NEBuffer r2.1 | NEB | B6002S | |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher | MPK5000, MPP100, MPS100 | |
| Neon Transfection System 10 uL Tips | Thermo Fisher | MPK1025 or MPK1096 | |
| PBS + 1mM EDTA | Lonza | BE02017F | |
| Proteinase K | Thermo Fisher | EO0491 | |
| rCutSmart Buffer for ExoI | NEB | B6004S | |
| Ribolock | Thermo Fisher | EO0384 | |
| RNA loading dye | NEB | B0363S | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| S. pyogenes Cas9-NLS | University of California Macro Lab | not applicable | Available to non-UC investigators through https://qb3.berkeley.edu |
| S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation | IDT | 1081059 | |
| SAP | NEB | M0371S |
References
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis, and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Paddison, P. J., Caudy, A. A., Hannon, G. J. Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (3), 1443-1448 (2002).
- Laugel, B., et al. Engineering of isogenic cells deficient for MR1 with a CRISPR/Cas9 lentiviral system: Tools to study microbial antigen processing and presentation to human MR1-restricted T cells. The Journal of Immunology. 197 (3), 971-982 (2016).
- Andreu, N., et al. Primary macrophages and J774 cells respond differently to infection with Mycobacterium tuberculosis. Scientific Reports. 7, 42225 (2017).
- Roberts, A. W., et al. Cas9+ conditionally-immortalized macrophages as a tool for bacterial pathogenesis and beyond. eLife. 8, e45957 (2019).
- Oberdoerffer, P., et al. Efficiency of RNA interference in the mouse hematopoietic system varies between cell types and developmental stages. Molecular and Cellular Biology. 25 (10), 3896-3905 (2005).
- Ma, S., et al. YTHDF2 orchestrates tumor-associated macrophage reprogramming and controls antitumor immunity through CD8+ T cells. Nature Immunology. 24 (2), 255-266 (2023).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, e00471 (2013).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).
- Craft, J. CRISPR-Cas9-mediated genome editing in primary murine bone marrow-derived macrophages. University of California, Davis. , Master's thesis (2022).
- Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Krönke, M., Schramm, M. Highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mRNA. Journal of Visualized Experiments. (153), e60143 (2019).
- Yu, X., et al. Improved delivery of Cas9 protein/gRNA complexes using lipofectamine CRISPRMAX. Biotechnology Letters. 38 (6), 919-929 (2016).
