Summary
Questo protocollo descrive la procedura per l'editing del genoma nei macrofagi derivati dal midollo osseo di topo utilizzando complessi ribonucleoproteici Cas9-sgRNA assemblati in vitro e somministrati mediante elettroporazione.
Abstract
I macrofagi derivati dal midollo osseo (BMDM) dei topi sono uno strumento chiave per studiare la complessa biologia dei macrofagi tissutali. Come cellule primarie, modellano la fisiologia dei macrofagi in vivo più da vicino rispetto alle linee cellulari di macrofagi immortalizzate e possono essere derivate da topi già portatori di cambiamenti genetici definiti. Tuttavia, l'interruzione della funzione genica nei BMDM rimane tecnicamente impegnativa. Qui, forniamo un protocollo per l'editing efficiente del genoma CRISPR/Cas9 nei BMDM, che consente l'introduzione di piccole inserzioni e delezioni (indel) che si traducono in mutazioni frameshift che interrompono la funzione genica. Il protocollo descrive come sintetizzare RNA a guida singola (sgRNA-Cas9) e formare complessi ribonucleoproteici (RNP) sgRNA-Cas9 purificati che possono essere rilasciati mediante elettroporazione. Fornisce inoltre un metodo efficiente per monitorare l'efficienza dell'editing utilizzando il sequenziamento Sanger di routine e un programma di analisi online disponibile gratuitamente. Il protocollo può essere eseguito entro 1 settimana e non richiede la costruzione di plasmidi; In genere si traduce in un'efficienza di editing dall'85% al 95%.
Introduction
I macrofagi sono cellule immunitarie innate che svolgono un ruolo fondamentale nella riparazione dei tessuti e nell'immunità 1,2. Le linee cellulari di macrofagi immortalizzate, come le cellule RAW 264.7 di topo o le cellule THP-1 umane, hanno diverse caratteristiche benefiche, tra cui una crescita robusta e la facilità di distruzione genica fornendo vettori per l'interferenza dell'RNA o CRISPR/Cas9 3,4. Tuttavia, la trasformazione oncogenica altera drammaticamente la loro fisiologia, il che si traduce nell'attivazione aberrante di alcune vie e nelle risposte attenuate di altre 5,6. I macrofagi primari derivati dal midollo osseo (BMDM) ricapitolano più da vicino la fisiologia dei macrofagi in vivo, ma rimangono difficili da manipolare geneticamente a causa della bassa efficienza sia della trasfezione plasmidica che della trasduzione virale in queste cellule immunitarie primarie 7,8. Pertanto, sono necessari metodi più efficienti per interrompere la funzione genica.
L'editing genomico CRISPR/Cas9 è un potente strumento per la manipolazione genetica in una vasta gamma di sistemi biologici, comprese le cellule di mammifero 9,10,11,12. La proteina Cas9 dello Streptococcus pyogenes scinde in modo efficiente e specifico il DNA a doppio filamento quando complessata con un RNA guida specifico per la sequenza. La riparazione del DNA attraverso l'unione non omologa (NHEJ) del DNA scisso provoca piccole inserzioni o delezioni (indel) che creano mutazioni frameshift. Nei primi studi, Cas9 e sgRNA sono stati veicolati attraverso vettori plasmidici o lentivirali, che sono metodi di somministrazione efficaci per molte linee cellulari 9,10. Tuttavia, le cellule primarie e, in particolare, le cellule immunitarie primarie sono spesso refrattarie a questi metodi a causa della bassa efficienza di rilascio del vettore per trasfezione o trasduzione. Successivamente, sono stati sviluppati metodi per generare complessi sgRNA-Cas9 in vitro e per veicolarli tramite elettroporazione, e questi metodi hanno raggiunto un'elevata efficienza in una varietà di tipi cellulari13,14. I risultati hanno suggerito la possibilità di utilizzare questo approccio per effettuare l'editing del genoma nei macrofagi primari.
Qui, forniamo un protocollo per l'utilizzo dei complessi ribonucleoproteici (RNP) sgRNA-Cas9 per effettuare l'editing del genoma nei BMDM primari. Contiene misure per mitigare l'attivazione dei sensori immunitari presenti nelle cellule immunitarie primarie e si traduce in un editing fino al 95% in loci mirati con una tossicità minima. Questo protocollo include anche flussi di lavoro per valutare l'efficienza dell'editing utilizzando la reazione a catena della polimerasi (PCR) di routine e il sequenziamento Sanger, seguiti dall'analisi in silico mediante Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)15, uno strumento software online ben convalidato.
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Protocol
1. Progettazione dell'sgRNA
NOTA: Questo passaggio descrive la selezione delle sequenze bersaglio e la progettazione degli sgRNA. È utile progettare guide che si trovino nel primo grande esone codificante, in modo che qualsiasi proteina tradotta venga interrotta all'inizio del frame di lettura aperto. È anche utile selezionare sequenze target che si trovano all'interno dello stesso esone, in quanto ciò semplificherà l'analisi dell'efficienza di editing (fase 6). Gli esempi di editing genomico forniti con questo protocollo hanno utilizzato sgRNA mirati al primo esone del gene Src e al gene Cblb , nonché nel locus Rosa26 non codificante del genoma del topo.
- Identifica 20 sequenze genomiche nucleotidiche da colpire, utilizzando uno dei numerosi strumenti di progettazione online gratuiti (Tabella 1). Selezionare da quattro a cinque guide che non si sovrappongono all'interno di ciascun gene, poiché l'attività di Cas9 varia in base alla guida specifica scelta e non è possibile prevedere a priori una guida altamente attiva.
NOTA: È fondamentale garantire il corretto orientamento della guida rispetto alla sequenza del locus mirato. Gli strumenti di progettazione in genere forniscono la sequenza guida con un orientamento compreso tra 5' e 3', indipendentemente dal filamento cromosomico bersaglio. Per verificare l'orientamento del filamento, verificare che vi sia una sequenza di motivo adiacente protospacer (PAM) per S. pyogenes Cas9 (nGG) immediatamente 3' della sequenza genomica bersaglio. La sequenza di sgRNA non include il PAM.
2. Sintesi di sgRNA
NOTA: Questo passaggio descrive come sintetizzare gli sgRNA utilizzando la PCR per generare un modello per la trascrizione in vitro (IVT) e quindi purificare l'sgRNA utilizzando colonne di rotazione (Figura 1A). Gli sgRNA sintetici personalizzati sono disponibili in commercio attraverso diversi fornitori come alternativa alla PCR/IVT.
- Eseguire la PCR per generare il modello IVT per la RNA polimerasi T7. La reazione PCR utilizza primer universali che contengono un promotore della RNA polimerasi T7 e una sequenza di RNA trans-attivante CRISPR (tracrRNA) (Tabella 2), oltre a brevi primer individuali con la sequenza guida gene-specifica.
- Questo è il passaggio di estensione della sovrapposizione non amplificante. Diluire il tampone PCR a 1x e aggiungere altri 1 mM di MgCl2. Quindi, aggiungere 0,25 μL di DNA polimerasi ad alta fedeltà, 0,5 mM di deossinucleotide trifosfato (dNTP), 0,02 mM primer specifico per guida e 0,02 mM T7 reverse long universal primer (Tabella 2) a un volume totale di 46 μL. Quindi, posizionare il tubo nel termociclatore ed eseguire due cicli di: 95 °C per 15 s, 37 °C per 15 s e 72 °C per 15 s. Raffreddare le reazioni sul ghiaccio.
- Questa è la fase di amplificazione della PCR. A ciascuna reazione, aggiungere 2 μL di primer di amplificazione diretta da 25 mM e 2 μL di primer di amplificazione inversa da 25 mM. Il volume di reazione finale è di 50 μL. Denaturare per 30 s a 95 °C. Quindi, eseguire 35 cicli di: 95 °C per 15 s, 65 °C per 20 s e 72 °C per 15 s. Eseguire un'ulteriore estensione a 72 °C per 2 min.
- Controllare il prodotto della reazione PCR su un gel di agarosio al 2%. La PCR a sovrapposizione si traduce in una molecola di dsDNA di 127 bp con il promotore T7 a monte della guida a 20 nucleotidi gene-specifica e il tracrRNA immediatamente a valle (Figura 1B).
- Purificazione del modello IVT: Esistono numerosi protocolli e kit che funzionano bene per questo. Questo protocollo utilizza perline di immobilizzazione reversibile in fase solida (SPRI). Miscelare 50 μL di prodotto PCR con 90 μL di perline e seguire le istruzioni del produttore. Eluire il DNA aggiungendo 40 μL di tampone (5 mM Tris, 0,1 mM di acido etilendiamminotetraacetico [EDTA]) e riscaldare a 65 °C per 5 min.
- Misurare la concentrazione di DNA del modello IVT utilizzando l'assorbimento a una lunghezza d'onda di 260 nm. Per la IVT è necessaria una concentrazione di DNA di almeno 50 ng/μL. Il modello IVT può essere conservato a -20 °C.
- Reazione IVT
- Utilizzare un kit commerciale progettato per produrre alte rese di IVT (vedi Tabella dei materiali). Seguire le raccomandazioni del produttore per eseguire la reazione IVT. Utilizzando 250 ng di stampo IVT in una reazione di 20 μL, incubare a 37 °C per 4-16 ore.
- Controllare il prodotto sgRNA IVT eseguendo 1 μL della reazione su un gel di agarosio al 2%. Dovrebbe essere osservata una banda di RNA brillante, che funziona in modo simile al dsDNA a 70 bp (Figura 1C). Sebbene non sia obbligatorio, per ottenere bande nette e più risolte, utilizzare un tampone per campioni di RNA con urea e denaturare il campione a 65 °C per 5 minuti prima del caricamento.
NOTA: Deboli bande di peso molecolare più elevato e lievi differenze di migrazione possono essere osservate con alcuni RNA guida a causa di differenze nella struttura secondaria dell'RNA.
- Defosforilare il prodotto sgRNA IVT per ridurre al minimo l'attivazione di RIG-I (un sensore di RNA estraneo) e la successiva morte cellulare dopo l'elettroporazione. Per ogni reazione IVT da 20 μL, aggiungere 69 μL di acqua di grado molecolare e 15 U di fosfatasi intestinale di vitello (CIP) in 1x tampone CIP. Incubare per 2 ore a 37 °C.
- Degradare il modello IVT per ridurre al minimo l'attivazione dei sensori del DNA cellulare, che innescano la morte cellulare dopo l'elettroporazione. Ad ogni reazione IVT, aggiungere 2 U di DNasi priva di RNasi. Incubare per 15 minuti a 37 °C. Il prodotto IVT può essere conservato a -20 °C per 1 giorno o a -80 °C per diversi mesi.
- Purificare il prodotto IVT utilizzando colonne rotanti. Per questo passaggio, i kit di purificazione delle microsfere SPRI sono inferiori.
- Legare l'RNA alla colonna aggiungendo 220 μL di tampone legante al prodotto IVT, seguito da 1 mL di etanolo di grado biologico molecolare al 100%. Mescolare bene e caricare la colonna. Successivamente, seguire le istruzioni del produttore. Eseguire il lavaggio finale in una cabina di biosicurezza a flusso laminare per evitare la contaminazione dell'sgRNA.
- Eseguire l'eluizione nella cappa a flusso laminare per evitare contaminazioni. Eluire l'RNA utilizzando 30 μL di tampone Tris sterile da 10 mM (pH 8,0).
- Misurare la concentrazione di sgRNA misurando l'assorbanza a una lunghezza d'onda di 260 nm.
NOTA: Le rese tipiche di sgRNA sono di almeno 100 μg. - Conservare l'sgRNA a -80 °C. Fare aliquote per evitare più di tre cicli di gelo-disgelo.
3. Preparazione per l'elettroporazione
NOTA: Tutti i passaggi devono essere eseguiti in una cappa a flusso laminare per evitare contaminazioni. Questo protocollo utilizza un sistema di elettroporazione disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali) con punte da 10 μL.
- Scongelare i BMDM 48-72 h prima dell'uso ed espanderli su piastre trattate con colture non tissutali (TC).
NOTA: Per ogni reazione, sono necessarie 4 x 105 cellule. - Sterilizzare le provette PCR per l'assemblaggio della reazione. Preparare una provetta PCR per reazione e riscaldarla in un termociclatore per 10 minuti a 98 °C. Preparare le provette in lotti e conservarle chiuse. Posizionare le provette PCR sterilizzate sul ghiaccio quando sono pronte per l'uso.
- Pulire la stazione pipetta con etanolo al 70% e posizionarla nella cappa a flusso laminare. Impostare i parametri su 1.900 V, 20 ms e un impulso.
- Rimuovere con cura una provetta di trasfezione dalla confezione per mantenerla sterile e riempirla con 3 mL di tampone "E". Assicurarsi che il tampone E sia a temperatura ambiente prima dell'elettroporazione. Inserire il tubo nella stazione e spingerlo verso il basso finché non scatta.
- Per ogni reazione, aliquota di 2,5 μL di sgRNA ad una concentrazione di 1.100 ng/μL. Diluire l'sgRNA in soluzione salina tamponata con fosfato freddo (PBS) con 0,9 mM CaCl2 e 0,5 mM MgCl2 (PBS + Ca/Mg). Lascialo sul ghiaccio.
- Preparare due piastre: una piastra non rivestita a 12 pozzetti per le cellule e una piastra aggiuntiva a 24 pozzetti per contenere i terreni di coltura. Aliquotare 1,5 mL di terreno privo di antibiotici per reazione nei pozzetti della piastra a 24 pozzetti.
- Preparare la proteina Cas9. Esistono diversi fornitori commerciali e accademici di proteina Cas9 purificata in modo sterile. Diluire Cas9 ad una concentrazione finale di 20 μM con PBS + Ca/Mg a freddo. Per ogni reazione di elettroporazione, aliquotare 1 μL di 20 μM Cas9 in provette PCR sterili. Lasciare in ghiaccio.
- Preparare le cellule per l'elettroporazione.
- Rimuovere il terreno di coltura. Lavare le cellule utilizzando PBS senza CaCl2 e MgCl2 (PBS-Ca/Mg) per rimuovere il siero e i cationi bivalenti che promuovono l'adesione. Quindi, aggiungere PBS + 1 mM EDTA e incubare a temperatura ambiente per circa 5 minuti fino a quando le cellule iniziano a staccarsi.
- Pipettare delicatamente su e giù per staccare le cellule. Trasferire le cellule in una provetta da 15 mL a basso legame proteico. Pellettare le cellule a 500 x g per 5 min.
NOTA: I macrofagi sono aderenti alla plastica. L'uso di provette da centrifuga a basso legame proteico migliora significativamente la resa cellulare. - Lavorare rapidamente per evitare l'incubazione prolungata delle cellule in PBS + EDTA. Rimuovere la maggior parte del surnatante, lasciando circa 1 mL di surnatante nella provetta. Risospendere le cellule nel surnatante rimanente, quindi trasferirle in una provetta da 1,5 ml di microfuge a basso legame con le proteine.
- Rimuovere una piccola aliquota di cellule da contare. Pellet le cellule rimanenti centrifugando a 500 x g a temperatura ambiente per 5 min.
- Durante la centrifugazione, contare le cellule e riscaldare le provette Cas9 e sgRNA a temperatura ambiente.
- Rimuovere tutto il surnatante dal pellet cellulare. Risospendere le cellule in PBS + Ca/Mg ad una concentrazione di 4 x 107 cellule/mL (4 x 105 cellule per reazione da 10 μL).
NOTA: Ogni kit viene fornito con una quantità limitata di tampone per elettroporazione (Tampone R, Tampone T). Tuttavia, troviamo che l'efficienza dell'elettroporazione utilizzando PBS + Ca/Mg è equivalente ai tamponi proprietari. - Quando si elettropolizzano gli sgRNA per geni diversi, aliquotare le cellule in diversi tubi a basso legame proteico per ciascun gene per evitare la contaminazione incrociata tra gli sgRNA. Tenere le cellule a temperatura ambiente fino al momento dell'elettroporazione.
4. Assemblaggio RNP
- Mantenere l'sgRNA e Cas9 a temperatura ambiente per evitare precipitazioni. Aggiungere 2,5 μL di sgRNA a 1 μL di Cas9 diluito in provette PCR sterilizzate. Erogare lentamente l'sgRNA per 15 secondi con miscelazione per evitare precipitazioni.
- Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente per consentire la formazione del complesso RNP.
5. Somministrazione di RNP per elettroporazione
- Preparare la punta per l'elettroporazione (cuvetta). Premere lo stantuffo per estendere lo stelo. Inserire il gambo nella punta.
NOTA: Assicurarsi che la punta sia sicura e che lo stantuffo scorra senza intoppi e si estenda oltre la guaina della punta. Se la punta non è posizionata correttamente, potrebbero essere introdotte bolle d'aria nella punta, causando il guasto della punta. - Risospendere le cellule pipettando su e giù, quindi caricare la punta di elettroporazione con le cellule. Prelevare l'intera capacità volumetrica di 10 μL della punta, evitando la formazione di bolle.
- Partendo dall'sgRNA di controllo negativo, trasferire 10 μL di cellule nella punta dell'elettroporazione alla provetta contenente 3,5 μL di RNP dal passaggio 4. Pipettare su e giù tre volte per mescolare bene. Aspirare 10 μL di miscela nella punta, assicurandosi che non siano presenti bolle.
- Posizionare la punta nella stazione di elettroporazione, abbassandola nel tampone. Evitare il contatto con le superfici in plastica con la punta per mantenere la sterilità. Premere Start sul display touchscreen.
- Al termine, il display indicherà un impulso riuscito. Rimuovere la pipetta dal dispositivo e posizionare le cellule in un pozzetto asciutto della piastra a 12 pozzetti etichettata e non rivestita.
- Sciacquare il puntale pipettando su e giù due volte in 15 mL di PBS + Ca/Mg. Mettere da parte la pipetta con il puntale ancora attaccato. Assicurarsi che la punta non tocchi nulla e rimanga sterile.
NOTA: In molti esperimenti, è possibile riutilizzare la punta per più campioni, ad esempio dopo il campione di sgRNA di controllo negativo inattivo, o durante le valutazioni iniziali dell'attività guida quando vengono testati da quattro a cinque sgRNA per gene e l'unica lettura è l'efficienza di editing. Tuttavia, durante l'analisi funzionale sulle cellule modificate, si raccomanda una nuova punta per ciascun gene, poiché piccole quantità di sgRNA o di carryover cellulare potrebbero influire sui risultati sperimentali. - Aggiungere immediatamente 1 mL di terreno privo di antibiotici (aliquotato al punto 3.6) alle cellule e agitare delicatamente la piastra per mescolare.
- Ripetere i passaggi 5.2-5.6 per le restanti reazioni.
- Rimettere le cellule nell'incubatrice.
- Verificare la vitalità delle cellule 1-2 ore dopo l'elettroporazione. Le cellule dovrebbero essere aderenti al >90%. Facoltativo: aggiungere gentamicina (5 μg/mL) alle cellule 1-2 ore dopo l'elettroporazione per aiutare a prevenire la contaminazione se ciò non interferisce con gli esperimenti a valle.
6. Valutare l'efficienza dell'editing
NOTA: La maggior parte delle modifiche viene completata dopo 48 ore.
- Controllare il monostrato cellulare 48 ore dopo l'elettroporazione. Se le cellule sono confluenti per oltre il 50%, procedere ulteriormente. Se le cellule sono confluenti al <50%, attendere altri 1-2 giorni. L'analisi genomica del DNA per determinare l'efficienza dell'editing richiede 1 x 105 cellule, oltre alle cellule necessarie per l'esperimento a valle.
- Preparare il DNA genomico (gDNA).
- Lavare le cellule con PBS(-Ca/Mg). Aggiungere 1 mL di PBS + 1 mM di EDTA. Incubare a temperatura ambiente per circa 5 minuti fino a quando le cellule iniziano a staccarsi dalla piastra.
- Staccare le cellule mediante pipettaggio. Trasferire in una provetta microfuge a basso legame proteico.
- Contare le cellule e rimuovere un'aliquota di 1 x 105 celle. Le cellule rimanenti possono essere riplaccate per essere utilizzate in ulteriori esperimenti. Generalmente, gli esperimenti vengono condotti 5 giorni dopo l'elettroporazione per consentire il decadimento della proteina.
- Pellet le cellule per l'analisi del gDNA per 15 s alla massima velocità in una provetta di microfuga.
- Risospendere il pellet in 50 μL di tampone di lisi. Vortice per staccare eventuali cellule attaccate alle pareti del tubo e riscaldare a 98 °C per 10 minuti per lisare le cellule e inattivare la DNasi endogena.
- Metti i tubi sul ghiaccio.
- Aggiungere 1 μL di proteinasi K (20 mg/mL). Incubare per almeno 1 ora a 37 °C; Può essere lasciato durante la notte per comodità.
- Riscaldare a 98 °C per 10 minuti per inattivare la proteinasi K.
- Centrifugare a temperatura ambiente per 5 minuti alla massima velocità. Rimuovere il surnatante, che contiene il DNA. Questo preparato grezzo senza ulteriore purificazione funziona bene per la maggior parte delle reazioni PCR.
- Valuta l'efficienza dell'editing con il sequenziamento Sanger.
- Primer PCR di progettazione 200-300 bp a monte della maggior parte dei siti guida da 5' e 200-300 bp a valle della maggior parte dei siti guida da 3'. La dimensione tipica dell'amplicone è ~500 bp. Progettare un primer per il sequenziamento annidato ad almeno 125 bp di distanza dal sito guida più vicino (Figura 2A).
- Eseguire la PCR utilizzando 2 μL di gDNA.
- Preparare il prodotto PCR per il sequenziamento. Questo protocollo utilizza un trattamento con esonucleasi I/fosfatasi alcalina dei gamberetti (ExoI/SAP). Anche i kit commerciali per la purificazione del DNA funzionano, ma richiedono più tempo per le prove.
- Preparare 15 μL del prodotto PCR. Aggiungere 7,5 μL di acqua, 1 μL di tampone ExoI 10x, 10 U di ExoI e 1 U di SAP per degradare i dNTP e i primer che interferiscono con il sequenziamento Sanger.
- Incubare a 37 °C per 30 minuti, seguiti da 85 °C per 20 minuti per disattivare gli enzimi.
- Eseguire il sequenziamento Sanger sul prodotto PCR trattato con Exo/SAP; utilizzare una quantità nota di marcatore di dimensione del DNA per stimare la dimensione del prodotto PCR presente nel campione. Le reazioni di sequenziamento possono richiedere un'ottimizzazione, poiché il software TIDE necessita di cromatogrammi di sequenza di alta qualità per stimare con precisione l'efficienza dell'editing. Il cromatogramma di sequenza per il locus non modificato dovrebbe fornire picchi chiari con uno sfondo minimo (Figura 2B, C).
- Per stimare l'efficienza dell'editing, utilizzare TIDE per analizzare i file del cromatogramma di sequenziamento Sanger utilizzando il gDNA modificato e il gDNA di controllo non modificato. (Tabella 1, Figura 2). Caricare i file di sequenziamento Sanger ed eseguire il software con le impostazioni predefinite.
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Representative Results
Il modello IVT è un prodotto di PCR a 127 bp (Figura 1B). Il prodotto IVT completo è un RNA di 98 nt, che migra in modo simile a un frammento di DNA a doppio filamento di 70 bp (Figura 1C).
Dopo l'elettroporazione, le cellule dovrebbero essere vitali al >90%, con un numero totale di cellule del >70% del numero di cellule di partenza. Il pool risultante di cellule mutanti dovrebbe avere un insieme diversificato di indel, a partire dal sito di scissione di Cas9. L'analisi dei geni bersaglio mediante PCR e sequenziamento Sanger dovrebbe mostrare più nucleotidi in ogni posizione a valle del sito di scissione di Cas9 (Figura 2).
Figura 1: Panoramica del processo di editing sgRNA-Cas9. (A) Schema per la progettazione della guida, la generazione di sgRNA e il rilascio di Cas9-sgRNA. (B) Il prodotto PCR da IVT per gli sgRNA Src 1, 2 e 3 si è risolto su un gel di agarosio al 2%. La freccia indica i prodotti PCR corretti a 127 bp. (C) I prodotti a base di RNA dopo IVT per gli sgRNA Src 1, 2 e 3 si sono risolti su un gel di agarosio al 2%. Le parentesi indicano i prodotti sgRNA corretti. La migrazione variabile dell'sgRNA è dovuta alla struttura secondaria dell'RNA. Questa figura è ristampata dalla tesi di laurea magistrale16 del primo autore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Elevata efficienza di editing raggiunta per più geni mirati. (A) Schema dei primer per il sequenziamento di PCR e Sanger. (B) Schema del flusso di lavoro per TIDE per valutare l'efficienza dell'editing. (C) Cromatogramma rappresentativo di sequenziamento Sanger del locus ROSA26 da BMDM elettroporati con un RNP di controllo non mirato a sgRNA-Cas9 (in alto) e sgRNA specifico per ROSA26 (in basso); il sito di sfaldatura Cas9 è evidenziato. L'output TIDE (a destra) con l'efficienza di editing calcolata e la percentuale di sequenze che ospitano il numero indicato di indel. (D,E) Cromatogrammi di sequenziamento con metodo Sanger dei geni (D) Src e Cblb nei BMDM modificati. Questa figura è ristampata dalla tesi di laurea magistrale16 del primo autore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Moderato aumento dell'efficienza di editing grazie all'enhancer di elettroporazione commerciale. I BMDM sono stati elettroporati con guide a bassa efficienza per valutare l'effetto di un potenziatore di editing commerciale. Prima dell'elettroporazione, 1 μL dell'enhancer è stato aggiunto agli RNP assemblati a una concentrazione finale di 4 μM. L'efficienza di editing dell'sgRNA Src indicato è stata valutata utilizzando TIDE. Questa figura è ristampata dalla tesi di laurea magistrale16 del primo autore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Nome dell'utensile | URL | ||
| Synthego - Strumento di progettazione CRISPR | https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-design-tool | ||
| Il Broad Institute - CRISPick | https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public | ||
| Tracciamento degli Indel per decomposizione (TIDE) | http://shinyapps.datacurators.nl/tide/ | ||
Tabella 1: URL degli strumenti online.
| Nome primer | Sequenza | ||
| Primer specifico per la guida | ggatcctaatacgactcactatag[N20]gttttagagctagaa | ||
| Primer specifico per guida - Cbl-b Guide 3 | ggatcctaatacgactcactatagAAAATATCAAGTATATACGGgttttagagctagaa | ||
| Primer specifico per guida - Cbl-b Guide 4 | ggatcctaatacgactcactatagGGTAAAATATCAAGTATATAgttttagagctagaa | ||
| Primer specifico per la guida - Rosa | ggatcctaatacgactcactatagCTCCAGTCTCTCTAGAAGATgttttagagctagaa | ||
| Primer specifico per guida - Scramble | ggatcctaatacgactcactatagGCACTACCAGAGCTAACTCAgttttagagctagaa | ||
| Primer specifico per la guida - Src Guide 2 | ggatcctaatacgactcactatagTCACTAGACGGGAATCAGAGgttttagagctagaa | ||
| Primer specifico per la guida - Src Guide 5 | ggatcctaatacgactcactatagCAGCAACAAGAGCAAGCCCAgttttagagctagaa | ||
| Primer specifico per la guida - Src Guide 6 | ggatcctaatacgactcactatagAGCCCAAGGACGCCAGCCAGgttttagagctagaa | ||
| T7 Reverse Primer Universale Lungo | aaaaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattettaacttgctatttctagctctaaaac | ||
| Primer universale per amplificazione diretta | ggatcctaatacgactcactatag | ||
| Primer universale per amplificazione inversa | aaaaaagaccgactcgg | ||
Tabella 2: Oligonucleotidi utilizzati nella PCR per generare il modello per l'IVT dell'sgRNA. Le 20 sequenze nucleotidiche bersaglio per i primer gene-specifici sono in maiuscolo.
| BMDM Terreni di crescita. Conservare a 4 C. | |||
| DMEM (Protocollo d'energia | |||
| Siero fetale bovino | 0.1 | ||
| L-glutammina | 0,2 Mio: | ||
| Surnatante MCSF da cellule 3T3-MCSF** | 0.1 | ||
| Piruvato di sodio | 11 mg/mL | ||
| Tampone di lisi. Conservare a 4 C. | |||
| 2-mercaptoetanolo (aggiungere immediatamente prima dell'uso) | 0.01 | ||
| MgCl2 | 5 milioni di metri | ||
| Tris | 20 millimetri | ||
| Triton-X 100 | 0.005 | ||
| **Le cellule 3T3-MCSF sono coltivate in DMEM+10% FCS. Il supernatent con MCSF viene raccolto il 5° giorno dopo aver raggiunto il 100% di confluenza. In alternativa, è possibile utilizzare MCSF ricombinante da 10 ng/ml al posto dei terreni condizionati | |||
Tabella 3: Composizioni dei mezzi e dei tamponi.
File supplementare 1: File di sequenziamento grezzo per ROSA_ Mock Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 2: File di sequenziamento grezzo per ROSA_TargettingGuide Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 3: File di sequenziamento grezzo per ScrambleGuide Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 4: File di sequenziamento grezzo per SrcG5+SrcG6 Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 5: File di sequenziamento grezzo per CBLB_Mock Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 6: File di sequenziamento grezzo per CBLB_TargetingGuide Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 7: File di sequenziamento grezzo per Mock_Guide2Locus Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 8: File di sequenziamento grezzo per Mock_Guide6Locus Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 9: File di sequenziamento grezzo per SrcGuide2_Enhancer Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 10: File di sequenziamento grezzo per SrcGuide2_NoEnhance Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 11: File di sequenziamento grezzo per SrcGuide6_Enhancer Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 12: File di sequenziamento grezzo per SrcGuide6_NoEnhancer Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
L'editing del genoma utilizzando complessi Cas9-sgRNA elettroporati consente un'efficace interruzione della funzione genica nei BMDM. L'efficienza di editing varia in base alla sequenza e al gene target. In genere, quattro o cinque sgRNA vengono generalmente sottoposti a screening per identificarne uno altamente attivo. Alcuni loci hanno un'efficienza di editing inferiore, molto probabilmente a causa della struttura della cromatina. In questi casi, è possibile apportare diverse modifiche per aumentare l'efficienza dell'editing. La co-somministrazione di due sgRNA attivi allo stesso esone si traduce in un miglioramento dell'editing per alcuni geni. Tuttavia, quando due guide sono co-trasfettate, abbiamo osservato che TIDE può perdere accuratezza. Pertanto, potrebbero essere necessarie tecniche alternative per valutare l'editing, come il Western blotting. Inoltre, l'inclusione di un potenziatore NHEJ disponibile in commercio spesso aumenta l'efficienza di editing di ~20% (Figura 3).
Questo approccio presenta diversi vantaggi. La somministrazione diretta di sgRNA-Cas9 alle cellule non richiede le lunghe fasi di costruzione del plasmide o di produzione di vettori lentivirali per trasdurre i BMDM. Il processo di sintesi dell'sgRNA, dell'elettroporazione e della generazione di cellule mutanti può essere completato in 1 settimana. Questa tecnica può essere utilizzata anche con BMDM derivati da topi geneticamente modificati per creare cellule a doppio mutante. Sebbene esistano metodi chimici per la trasfezione di cellule immunitarie primarie con siRNA o mRNA17, questi metodi chimici sono significativamente meno efficaci dell'elettroporazione nel fornire complessi Cas9-sgRNA alle cellule immunitarie18. Esistono diversi tipi di dispositivi per elettroporazione disponibili in commercio. Si prevede che questi dispositivi funzionino in modo simile per la somministrazione di complessi Cas9-sgRNA, anche se i parametri di tensione devono probabilmente essere ottimizzati per ogni singolo dispositivo. Sebbene questo protocollo sia stato utilizzato principalmente su BMDM di topo, in esperimenti limitati sono stati ottenuti risultati simili con BMDM di ratto (dati non pubblicati). È possibile che anche altri tipi di macrofagi primari, come i macrofagi peritoneali di topo o i macrofagi alveolari, possano essere suscettibili di questo approccio, sebbene questo non sia ancora stato testato.
Questo metodo presenta alcune limitazioni. Il numero di cellule prodotte da questo protocollo è alquanto limitato; Le nostre condizioni standard generano 4 x 105 cellule per elettroporazione. Tuttavia, potrebbe essere possibile aumentare significativamente la resa, poiché l'efficienza non diminuisce in una reazione di 10 μL con un massimo di 2,4 x 106 cellule utilizzando la stessa quantità di RNP (dati non pubblicati). Inoltre, sono disponibili puntali per elettroporazione da 100 μL. Un altro inconveniente di questo metodo è la spesa; I costi sia dell'elettroporatore che dei materiali di consumo per l'elettroporazione sono notevoli. Queste spese possono essere significativamente mitigate riutilizzando le punte quando si utilizzano diversi sgRNA che mirano allo stesso gene e utilizzando PBS invece dei tamponi proprietari. Sebbene le composizioni dei tamponi proprietari non siano note, presumibilmente la composizione elettrolitica del PBS con 0,9 mM CaCl2 e 0,5 mM MgCl2 approssima la conduttanza elettrica del tampone proprietario. Queste modifiche riducono il costo dei materiali di consumo di circa l'80% in questo protocollo.
Ci sono diversi passaggi critici nel protocollo, le cui deviazioni potrebbero influenzare notevolmente l'efficienza dell'editing genetico. Una delle potenziali insidie è che i kit IVT standard, che non sono progettati per rese elevate, spesso producono un prodotto IVT insufficiente. Inoltre, l'uso di provette microfuge in polipropilene standard al posto di provette a basso legame può causare una significativa perdita di cellule per adesione. La defosforilazione incompleta del prodotto IVT e la presenza di DNA residuo nella preparazione di sgRNA possono provocare l'attivazione dei sensori immunitari dei macrofagi e la conseguente tossicità. Impulsi di tensione più alti o più lunghi possono anche provocare un aumento della morte cellulare.
In sintesi, questo protocollo di editing del genoma, che utilizza l'elettroporazione per fornire RNP Cas9-sgRNA, è un metodo efficiente per interrompere i geni nei BMDM di topo. Ciò consente agli utenti di eseguire rapidamente lo screening dei fenotipi nelle cellule primarie che ricapitolano più da vicino la complessa biologia dei macrofagi in vivo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione NIH 5R01AI144149. Le figure schematiche sono state create con BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3T3-MCSF Cell Line | Gift from Russell Vance | not applicable | |
| Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer | IDT | 1075915 | |
| Ampure XP Reagent Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | NEB | M0525S | |
| DNase | NEB | M0303S | |
| DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2) | Thermo Fisher | 14040-133 | |
| DPBS -Ca/Mg | Thermo Fisher | 14190-144 | |
| ExoI | NEB | M0293S | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Corning | 35-015-CV | |
| Herculase DNA polymerase & buffer | Agilent | 600677 | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | NEB | E2040S | |
| LoBind conical tubes 15 mL | Eppendorf | 30122216 | |
| LoBind Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf | 22431102 | |
| NEBuffer r2.1 | NEB | B6002S | |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher | MPK5000, MPP100, MPS100 | |
| Neon Transfection System 10 uL Tips | Thermo Fisher | MPK1025 or MPK1096 | |
| PBS + 1mM EDTA | Lonza | BE02017F | |
| Proteinase K | Thermo Fisher | EO0491 | |
| rCutSmart Buffer for ExoI | NEB | B6004S | |
| Ribolock | Thermo Fisher | EO0384 | |
| RNA loading dye | NEB | B0363S | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| S. pyogenes Cas9-NLS | University of California Macro Lab | not applicable | Available to non-UC investigators through https://qb3.berkeley.edu |
| S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation | IDT | 1081059 | |
| SAP | NEB | M0371S |
References
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