Name: Um método HPLC Lectin enriquecer Peptídeos seletivamente glicosilada de Complexo Amostras Biológicas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-01T21:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 23 s
Description: Aprenda a enriquecer glicopeptídeos seletivamente glicosilados de plasma humano usando cromatografia de afinidade com lectina e HPLC. Este método facilita a descoberta de biomarcadores em amostras biológicas complexas.

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Este trabalho foi financiado pela Clinical Technologies Proteômica para o cancro da iniciativa, 5U24CA126477-04.

1) Prepare colunas lectina-conjugada POROS <ol><li> Colocar uma máscara para se proteger contra a inalação de POROS-AL contas durante as etapas de 1,1-1,2. Pesar a quantidade desejada de contas POROS (100 mg mL de volume beads/300 final) e transferir para um tubo eppendorf limpo. </li><li> Lavar contas com adição de 1 mL tampão fosfato (PBS). Contas de pelotas por centrifugação em microcentrífuga a velocidade máxima por 3 minutos. Remover o sobrenadante e repetir a lavagem. </li><li> Pesar a quantidade desejada de lectina não conjugada (1-4 mg / 200 mL contas) e transferir para um tubo eppendorf limpo. Adicionar PBS para formar uma 5-20 mg / mL. Reserve 25 mL desta solução. </li><li> Transferir a solução lectina restantes para as contas POROS. Adicionar cyanoborohydride de sódio a uma concentração final de 50 mM. Colocar o tubo em um rocker e reagir durante a noite a temperatura ambiente. (Nota:. Cyanoborohydride de sódio é tóxico e deve ser tratado em um exaustor resíduos contaminados devem ser eliminados de forma adequada.) </li><li> Pellet as contas POROS como no passo 1.2. Remover o sobrenadante e salvar como a solução de pós-conjugação. </li><li> Lavar contas com um buffer Quenching mL (1 M Tris-Cl, pH 7,4). Contas da pelota como no passo 1.2 e segurança descartar o sobrenadante. </li><li> Bloquear os sites restantes reativa nas contas POROS com um buffer Quenching mL. Adicionar cyanoborohydride de sódio a uma concentração final de 50 mM. Colocar o tubo em um rocker e incubar em temperatura ambiente por 30 min. </li><li> Contas da pelota como no passo 1.2 e descartar o sobrenadante. </li><li> Lavar contas com 1 mL 1 M NaCl. Contas de pelotas e descartar o sobrenadante. Repita quatro vezes para um total de cinco lavagens. As contas estão agora prontos para embalar. </li><li> Para determinar a quantidade de proteína que foi conjugado com as contas POROS, realizar um ensaio de concentração de proteínas nas soluções de pré-lectina conjugada e pós-conjugados. A diferença nas concentrações é a quantidade de proteína que foi conjugado com as contas. A quantidade de proteína conjugada por volume de talão é igual a concentração de lectina nas esferas. Concentrações lectina-alvo são entre 2 -20 mg / mL. </li></ol> 2) as contas de embalagem lectina-conjugada POROS em uma coluna PEEK <ol><li> Montar o sistema de embalagem (descrição abaixo) e apoiá-lo em um suporte de anel de metal. O sistema de embalagem consiste em, de baixo para cima, restritor de pressão, coluna final acoplador coluna 1, fritas, (2 x 50 mm), acoplador final coluna 2, conector de coluna, coluna final acoplador 3, coluna (4,5 x 50 mm), final 4 acoplador coluna e montagem final. A coluna superior serve como um reservatório para o material de embalagem. </li><li> Volte a suspender as contas POROS no volume desejado de tampão A. (10 mM Tris, pH 7,4, 150 mM cloreto de sódio, cloreto de cálcio 10 mM, 10 mM de cloreto de magnésio) Se uma coluna de embalagem (~ 200 mL volume do leito), ressuspender em 400 mL de buffer A. </li><li> Transferência de contas conjugado POROS na coluna superior (reservatório). Adicionar tampão A para o reservatório até que o buffer atinge o topo da coluna. Delicadamente, coloque a montagem final para o topo da coluna, tentando evitar as bolhas de ar na coluna. Ligar a montagem final da coluna superior para o sistema de HPLC. </li><li> Encher a coluna pelo fluxo de buffer A através do sistema. Comece com um fluxo de 0,5 mL / min. Aumentar a vazão de 0,5 mL / min a cada minuto até que 4 mL / min ou a pressão máxima (3000 psi) foi atingido. Continue com o caudal máximo possível até, pelo menos, 35 mL de tampão A passaram pela coluna. </li><li> Desligar as bombas e permitir que a pressão sobre a coluna cair para &lt;20 psi. </li><li> Delicadamente, desmontar o sistema de embalagem, a partir do topo. Quando o fim 2 acoplador coluna é atingido, retire com cuidado. Algum material deve ser embalado de extrusão a partir do topo da coluna. Com uma lâmina de barbear ou borda afiada similar, gentilmente limpe as contas de extrusão, deixando uma superfície das esferas que é mesmo com a parte superior da coluna. Não aplique pressão para as contas ao fazer isto. </li><li> Desengatar a coluna empacotada do suporte do anel. Coloque uma nova fritas em um acoplador novo final e vire a coluna empacotada mais para conectar este com o acoplador fritas / fim na extremidade coluna aberta (antiga topo). </li><li> O título da coluna apropriada. Ele agora está pronto para uso. Quando não em uso, a coluna pode ser armazenada em PBS com azida de sódio 0,02% a 4 ° C por até 6 meses. </li></ol> 3) Programa de método HPLC <ol><li> Os detalhes da programação do seu HPLC irá variar de acordo com as especificidades do software do fabricante. Nós usamos um Paradigma Michrom HPLC MG4. Nesta máquina, os métodos são construídas e acesso no âmbito do &quot;Setup&quot; guia na parte superior da tela. Programa o seguinte método: <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Tempo </td><td> Vazão (mL / min) </td><td> % A </td><td> B% </td></tr><tr><td> 00:00 </td><td> 50 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 09:00 </td><td> 50 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 09:01 </td><td> 500 </td><td> 0 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 13:50 </td><td> 500 </td><td> 0 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 13:51 </td><td> 3000 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 19:50 </td><td> 3000 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table> Um buffer: 10 mM Tris, pH 7,4, 150 mM cloreto de sódio, cloreto de cálcio 10 mM, 10 mM de cloreto de magnésio Tampão B: 0,5 M de ácido acético O detector de UV deve ser programado para leitura a 280 nm 0:00-19:50. O eixo y deve ser ajustado para detectar baixos níveis de absorção, por exemplo, 0 -. 50 UA. </li><li> Se um amostrador automático é um programa, disponível o seguinte calendário para a coleta de fração. Caso contrário, recolha as frações à mão, como indicado na execução cromatografia. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Fração </td><td> Atraso à recolha de injeção de amostra </td><td> Duração da coleta (min) </td></tr><tr><td> Fluxo através </td><td> 2,8 </td><td> 4,1 </td></tr><tr><td> Obrigado </td><td> 9 </td><td> 2,6 </td></tr></tbody></table></li></ol> 4) Prepare amostras para HPLC <ol><li> Antes de usar neste protocolo, plasma humanos devem ser esgotados os 14 proteínas mais abundantes usando uma coluna MARS (Agilent; Santa Clara, CA). Esgotados plasma humano, lactoferrina e invertase de levedura deve ser individualmente tripsina-digerido e dessalgado conforme descrito anteriormente 1. </li><li> Para preparar a lectina específica lactoferrina padrão, execute cromatografia em 50 ug de tripsina-digerida lactoferrina mais tanto o AAL ou a coluna SNA usando o método na Parte 3. A fração ligada conterá glicopeptídeos lectina específica lactoferrina. Neutralize as amostras como na parte 4.4, e dessalinizar como na Parte 6. Ressuspender a amostra em 1 mL tampão A. A amostra obtida está pronta para uso. </li><li> Três réplicas experimentais será realizada. Para preparar amostra para três repetições, adicionar 3 pmol de tripsina-digerida invertase e 1 ml de lectina específica lactoferrina (ou AAL-LAC ou SNA-LAC) a 30 mL MARS-empobrecido, tripsina-digerida equivalentes, plasma (PE). A PE é definido como o volume de plasma non-processed/intact/original a partir do qual uma determinada quantidade de processados ​​plasma (MARS-empobrecido e tripsina digerido) foi derivada. Adicionar tampão A para a amostra para chegar a um volume final de 330 mL. </li><li> Adicionar tampão de neutralização (1 M Tris pH 8,0), para os frascos de amostra que irá recolher eluído. O número eo volume de frascos de você trabalhar com dependerá das limitações de seu amostrador automático. Para a Paradigm MG4, um frasco de coleta do fluxo através e dois recolher o eluato. Vai exigir cerca de 1,5 mL tampão Tris para neutralizar 1 mL de eluato. PH neutralizado é alvo 7,0-8,0; pH teste teste final com papel indicador de pH. </li></ol> 5) Realizar cromatografia <ol><li> Todas as execuções em branco e da amostra que se seguem vai usar o método descrito na Parte 1. A coluna e os amortecedores estão em temperatura ambiente durante o uso. As colunas são armazenadas a 4 ° C, enquanto que os amortecedores são armazenados em temperatura ambiente. </li><li> Acople a AAL ou a coluna lectina SNA para o sistema de HPLC e executar dois métodos em branco (injeção de tampão de apenas A). Garantir que a coluna lectina corresponde à lactoferrina lectina específica (Parte 2). </li><li> Cromatógrafo a três amostras de plasma, injetando uma em branco entre cada amostra injetado, para um total de 7 é executado HPLC. Frações de corridas em branco não precisam ser recolhidos. </li></ol> 6) dessalinizar coletadas frações Para cada fração de usar um 1 mL Waters Oasis HLB SPE cartucho da seguinte forma: <ol><li> Anexar o número de cartuchos necessários para múltiplas vácuo. </li><li> Wet cada cartucho com 1 mL ACN 80% em 1% de ácido fórmico (vacuômetro em múltiplas deve ler 5-20 lnHg). </li><li> Equilibrar cartuchos com 1,5 mL de ácido fórmico 0,1% (vacuômetro em múltiplas deve ler 5-20 lnHg) </li><li> Volume total de carga de uma amostra em um cartucho (Vacuômetro em múltiplas deve ler 2 -. LnHg 2,5, ea taxa de fluxo não deve exceder 1 mL / min) </li><li> Lavar com 3 cartuchos de 1 mL x ácido fórmico 0,1% (Vacuômetro em múltiplas deve ler 5-20 lnHg) </li><li> Peptídeos eluir / glicopeptídeos em tubos eppendorf rotulados com 1 x 1 mL de acetonitrila 80% em 0,1% de ácido fórmico. (Vacuômetro em múltiplas deve ler 2-2,5 lnHg, ea taxa de fluxo não deve exceder 1 mL / min.) Um tubo de coleta única deve ser usado para cada cartucho. </li><li> Neutralize eluído pela adição de 60 mL 0,5 M de bicarbonato de amónio para cada tubo de coleta. Alvo neutrpH é desmineralizada é 7,0-8,0; pH teste final com papel indicador de pH. </li><li> Concentre-se peptídeos eluídos / glicopeptídeos para ~ 50 mL por executá-los em uma centrífuga a vácuo (por exemplo, a Thermo Savant SpeedVac) por aproximadamente 2 horas @ 35 ° C. </li></ol> 7) PNGase F-digestão <ol><li> PH da amostra de teste para garantir que ele está entre 7,0-8,0. Se necessário, adicione bicarbonato de amônio 50 mM para aumentar o pH. Se o volume da amostra final é&gt; 100 da amostra, mL speedvac até que esteja entre 50-100 mL. </li><li> Adicionar 0,5 mL (250 U) de glicerol livre F PNGase a cada tubo de amostra e incubar a 37 ° C durante a noite. </li></ol> 8) amostras Dica Zip <ol><li> Começando com PNGase F-digerida amostras, ziptip cada um como se segue. </li><li> Ziptip molhado com 10 mL de acetonitrila 100%, seguido por 10 mL de acetonitrila 80%, 0,1% de ácido fórmico. </li><li> Equilibrar ziptip com 20 mL de ácido fórmico 0,1%. </li><li> Carga da amostra para a ziptip pipetando cima e para baixo através da matriz ziptip 10 vezes. </li><li> Lave o ziptip pipetando 10 mL de ácido fórmico 0,1%, 5 vezes. </li><li> Eluir a amostra em um tubo eppendorf limpo com 10 mL de acetonitrila 80%, 0,1% de ácido fórmico. </li><li> Repita a eluição e adicione o mL 10 segundo para o mesmo tubo. </li><li> Speedvac as amostras a um volume de &lt;mL 2. </li><li> Amostras ressuspender em 20 mL de ácido fórmico 0,1%. As amostras estão prontas para análise por LC-MS/MS. </li></ol> 9) Resultados Representante: A conjugação POROS tipicamente rendimentos on-bead lectina concentrações na faixa de 2-20 mg / mL. Isso é ótimo para cromatografia de afinidade. Cromatografia lectina de tripsina-digerida MARS com depleção de plasma humano normalmente enriquece glicopeptídeos na fração ligada. Como a glicopeptídeos são PNGase F-tratados antes de LC-MS/MS, elas são identificadas como peptídeos com a seqüência consenso N-ligados, NXS / T (onde X é qualquer resíduo, mas prolina), em que a asparagina foi convertido para um ácido aspártico através da ação de Peptídeos PNGase F. com essas características são consideradas como peptídeos deglycosylated (ou &quot;deglycopeptides&quot;). Em média o fluxo-through (FT), fração de AAL ou cromatografia SNA contém deglycopeptides 2-4%, enquanto que 30-50% dos peptídeos recuperada na fração ligada são deglycopeptides. Normalmente, usando uma Elite QStar, 1000-1300 peptídeos serão identificados na fração FT, e 200-400 peptídeos serão identificados na fração ligada. Dois ou mais deglycopeptides invertase distintas devem ser observados na fração de FT e dois ou mais deglycopeptides distintas lactoferrina na fração ligada (Tabela 1). <img src="/files/ftp_upload/1398/1398table.jpg" alt="Tabela 1" /> Tabela 1.

<ol><li>Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((multiplexed+assays+for+low+abundance+proteins+in+plasma+by+targeted+mass+spectrometry+and+stable+isotope+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 2212-2229 (2007).</li>
</ol>

Este protocolo fornece um método rápido para isolar e identificar glicopeptídeos de forma glicano específico. Como glicosilação varia amplamente dentro de um organismo, particularmente durante o desenvolvimento e patogênese, esta técnica pode ser aplicável para tratar uma grande variedade de perguntas. Em particular, estamos usando o método para seletivamente enriquecer glicopeptídeos que foram modificados com câncer associado epítopos como um primeiro passo para a descoberta de biomarcadores.

<table><tbody><tr><td>Plasma humano</td><td></td><td></td><td>Fabricamos internamente</td></tr><tr><td>Lactoferrina humana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0520</td><td>Digestão com tripsina antes do uso</td></tr><tr><td>Invertase de levedura</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0408</td><td>Digestão com tripsina antes do uso</td></tr><tr><td>Cartuchos SPE Oass HLB</td><td>Waters</td><td>WAT094225</td><td>Volume de 1 cc</td></tr><tr><td>Pontas de pipeta ZipTip</td><td>Fisher Scientific</td><td>ZTC1 8M0 96</td><td>Millipore, C18 para pipeta de 10 ml</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-1</td><td>99%</td></tr><tr><td>Bicarbonato de amônio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6141</td><td>99%</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td>96%</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>98%</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242853</td><td>99,7%</td></tr><tr><td>Papel indicador de pH</td><td>Fisher Scientific</td><td>M95903</td><td>Faixa de 0-14</td></tr><tr><td>Aetonitrila</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998</td><td>99,9%</td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>28905</td><td>99%</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Invitrogen</td><td>14190-136</td><td>Sem cálcio e magnésio</td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71289</td><td>99,5%</td></tr><tr><td>PNGase F</td><td>New England Biolabs</td><td>P0705L</td><td>Sem glicerol</td></tr><tr><td>Frascos de filtração a vácuo</td><td>Fisher Scientific</td><td>SCGVU05RE</td><td>Poros de 0,2 mm</td></tr><tr><td>Perlas POROS-AL</td><td>Applied Biosystems</td><td>1-6028-02</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Aleuria aurantia&lt;/em&gt; lectina</td><td>Vector Laboratories</td><td>L-1390</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Sambucus nigra&lt;/em&gt; aglutinina</td><td>Vector Laboratories</td><td>L-1300</td><td></td></tr><tr><td>Cianoborohidreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296945</td><td>Solução 5,0 M</td></tr></tbody></table>

um método hplc lectin enriquecer peptídeos seletivamente glicosilada de complexo amostras biológicas

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

Glicanos são uma classe importante de modificações pós-translacionais. Tipicamente encontradas em moléculas secretadas e extracelular, as estruturas glicano sinal de estatuto interno da célula. Glicanos em células tumorais tendem a ter ácido siálico abundante e metades fucose. Propomos que essas variantes associadas ao câncer glicano ser explorada para o desenvolvimento de biomarcadores visa diagnosticar doença em estágio inicial. Assim, desenvolvemos uma espectrometria de massa com base em fluxo de trabalho que incorpora cromatografia de afinidade em matrizes formadas a partir de lectinas, proteínas que se ligam glicano estruturas específicas. As lectinas Sambucus nigra (SNA) e Aleuria aurantia (AAL), que se ligam ácido siálico e fucose, respectivamente, foram covalentemente acoplado a contas POROS (Applied Biosystems) e embalados em colunas PEEK para cromatografia líquida de alta pressão (HPLC). Resumidamente, o plasma foi esgotada dos quatorze proteínas mais abundantes usando um sistema de remoção de múltiplos afinidade (MARS-14; Agilent). Esgotados plasma foi tripsina-digerida e separados em flow-through e frações vinculado por SNA ou HPLC AAL. As frações foram tratados com PNGaseF para remover N-glicanos ligados, e analisados ​​por LC-MS/MS em um Elite QStar. Os dados foram analisados ​​usando o software da mascote. O delineamento experimental incluídos controles positivos e-fucosylated sialylated glicopeptídeos e lactoferrina humana negativa controles de alta manose glicopeptídeos de Saccharomyces cerevisiae, que foram utilizados para monitorar a especificidade da captura de lectina. As principais características deste fluxo de trabalho incluem a reprodutibilidade derivado do formato de HPLC, a identificação positiva dos glicopeptídeos capturados e tratados com PNGaseF de seus motivos Asn-Xxx-Ser/Thr desamidados, e avaliação da qualidade usando padrões glicoproteína. Protocolo de otimização também incluiu determinação da relação adequada de matéria-prima para a capacidade da coluna, identificando a captura mais eficiente e buffers de eluição, e monitorar a PNGaseF tratamento para garantir deglycosylation completo. Direções futuras incluem o uso deste fluxo de trabalho para realizar experimentos de espectrometria de massa baseada na descoberta de plasma de pacientes com câncer de mama e indivíduos controle.

Contas lectina-conjugada POROS foram empregadas para HPLC. Padrões glicopeptídeo serviram como controle positivo e negativo. MARS-14 empobrecido, tripsina-digerida plasma humano foi cromatografada e flow-through (FT) e frações ligado coletadas para análises ESI-LC-MS/MS. Glicopeptídeos foram enriquecidos na fração ligada quando comparado com FT.

Um método HPLC Lectin enriquecer Peptídeos seletivamente glicosilada de Complexo Amostras Biológicas

Os glicanos são uma classe importante de modificações pós-traducionais. Tipicamente encontrados em moléculas secretadas e extracelulares, as estruturas dos glicanos sinalizam o...

Este procedimento isola especificamente glicopeptídeos glicosilados a partir de plasma humano. O plasma é digerido com tripsina para gerar uma mistura de peptídeos e glicopeptídeos, juntamente com padrões de glicopeptídeos. Controles positivos e negativos para cromatografia com lectina são adicionados ao plasma.A amostra é submetida à cromatografia de afinidade por lectina com base em cromatografia líquida de alta pressão. As lectinas utilizadas ligam-se ao difuco e ao ácido siálico, respectivamente; peptídeos e glicopeptídeos irrelevantes são eluídos da coluna na fração de fluxo contínuo. O ácido acético é usado para eluir a fração ligada da coluna.Isto é enriquecido com glicopeptídeos modificados especificamente. Olá, sou Penny Drake do laboratório de Susan Fisher do Departamento de Obstetrícia, Ginecologia e Ciências Reprodutivas e da infraestrutura central de espectrometria de massas San Lamore na Universidade da Califórnia, São Francisco. E eu sou Eric Johansen, também da infraestrutura central de espectrometria de massas Sandler Moore e do Laboratório Fisher.Hoje vamos mostrar um procedimento para realizar cromatografia com lectina com o objetivo de enriquecer glicopeptídeos provenientes de plasma humano e outras misturas complexas. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório como uma ferramenta geral com diversas aplicações. Por exemplo, desempenha um papel importante em nosso fluxo de trabalho de descoberta de biomarcadores para câncer de mama.Então vamos começar. Para iniciar este procedimento, use uma máscara para se proteger contra a inalação das microesferas. Em seguida, pese 100 miligramas de microesferas porro e transfira para um tubo einor limpo.São necessários aproximadamente 300 microlitros de esferas para preencher uma coluna. Além disso, pese a lectina não conjugada e transfira para um tubo einor limpo. As lectinas SNA e AAL são utilizadas.Prossiga adicionando PBS à lectina para formar uma solução de cinco a vinte miligramas por mililitro. Reserve 25 microlitros dessa solução pré-conjugada. Em seguida, lave as porro speeds adicionando um mililitro de PBS e centrifugando em uma microcentrífuga na velocidade máxima.Por três minutos, remova o sobrenatante e repita a lavagem. Agora, trabalhe na capela e transfira a solução de lectina remanescente para as porro speeds lavadas. Em seguida, adicione borohidreto de sódio até uma concentração final de 50 milimolares.Observe que o borohidreto de sódio é tóxico e os resíduos devem ser descartados adequadamente. Feche o tubo com perfil e coloque em um agitador para reagir durante a noite à temperatura ambiente. Após a incubação noturna da lectina com as porro speeds, centrifugue as porro speeds novamente. Remova o sobrenadante e guarde-o como a solução pós-conjugação para bloquear os sítios reativos remanescentes nas microesferas.Primeiro, lave as esferas por centrifugação com um mililitro de tampão de quenching composto de um molar CL em pH 7,4. Em seguida, adicione um mililitro de tampão de quenching e hidreto de sódio a uma concentração final de 50 milimolar. Coloque o tubo em um agitador rotativo e incube à temperatura ambiente por 30 minutos.A etapa de quenching está agora concluída. Centrifugue as microesferas. Da mesma forma que antes.Remova o sobrenadante e prossiga para lavar as esferas cinco vezes com um mililitro de cloreto de sódio um molar a cada vez, descartando o sobrenadante. Realize um ensaio de concentração proteica nas soluções de lectina pré e pós-conjugadas e utilize a diferença para determinar a quantidade de proteína que foi conjugada às esferas de porro. As concentrações-alvo de lectina estão entre dois e 20 miligramas por mililitro, calculadas como a quantidade de proteína conjugada por volume de esfera.As microesferas conjugadas porro estão agora prontas para serem acondicionadas em uma coluna. Para acondicionar as microesferas em uma coluna, monte o sistema de acondicionamento composto por duas colunas apoiadas em um suporte de anel metálico. A coluna superior serve como reservatório para o material de acondicionamento.O sistema de empacotamento consiste, de baixo para cima, do restringidor de pressão, acoplador final da coluna um para a coluna alvo, acoplador final da coluna, conector de coluna dois, acoplador final da coluna três, a coluna reservatório, acoplador final da coluna quatro e o acessório final. Em seguida, ressuspenda os 300 microlitros de porro speeds em 600.Microlitros de tampão A Para acondicionar uma coluna, transfira as esferas para a coluna do reservatório superior. Adicione o tampão A até que atinja o topo da coluna. Coloque suavemente o adaptador na extremidade superior da coluna.Tente evitar bolhas de ar na coluna. Conecte o adaptador da extremidade superior da coluna ao sistema de CLAE. Empacote a coluna fazendo passar tampão A ou PBS pelo sistema.Inicie com uma taxa de fluxo de 0,5 mililitros por minuto. Aumente a taxa de fluxo em 0,5 mililitros por minuto a cada minuto até atingir quatro mililitros por minuto ou a pressão máxima. Prossiga na taxa de fluxo máxima possível até que pelo menos 35 mililitros de tampão tenham passado pela coluna.Quando terminar, desligue as bombas e permita que a pressão na coluna caia abaixo de 20 PSI. Agora que a coluna está empacotada, desmonte cuidadosamente o sistema de empacotamento começando pelo topo. Ao chegar no segundo acoplador da coluna, remova-o com cuidado.Com uma lâmina de barbear, remova suavemente o material compactado que sobressai na parte superior da coluna. Não aplique pressão sobre as esferas ao fazer isso. Desprenda a coluna compactada do suporte com anel.Coloque um novo frit em um novo acoplador de extremidade e vire a coluna empacotada para conectá-la ao acoplador de extremidade FR na extremidade aberta da coluna. A coluna está agora pronta para a corrida de HPLC. Quando não estiver em uso, a coluna pode ser armazenada em PBS com 0,5% de azida de sódio a quatro graus Celsius por até seis meses.Os detalhes da programação do seu CLAE variarão de acordo com a sua configuração e com as especificidades do software do fabricante. Aqui, utilizamos um CLAE microme paradigm MG four nesta máquina. Os métodos são criados e acessados na guia de configuração na parte superior do programa da tela.O método apresentado, que também é descrito em detalhes no protocolo escrito acompanhante. Se estiver usando um programa de amostragem automática, siga também o protocolo escrito. Utilize o tampão A como antes e o tampão B para a execução da CLAE, mantendo os tampões e as colunas à temperatura ambiente.Configure o detector UV para ler a dois e 80 nanômetros de zero a 19 minutos e 50 segundos. Ajuste o eixo Y para detectar níveis baixos de absorbância na faixa de zero a 50 unidades de absorbância. Em seguida, prepare as amostras.As amostras de teste são derivadas de plasma humano esgotado das 14 proteínas mais abundantes utilizando uma coluna Mars. As amostras de plasma esgotado e dois padrões, lactoferrina humana e invertase de levedura, são individualmente digeridos com tripsina e dessalinizados conforme descrito anteriormente.Para neutralizar as amostras, tenha o tampão de neutralização preparado nos vials de amostra que coletarão o EIT para o paradigma MG quatro: um vial coleta o fluxo passante e três coletam o eluato. Serão necessários aproximadamente 1,5 mililitros de tampão para neutralizar um mililitro de EIT. O pH alvo neutralizado é de 7,0 a 8,0.Certifique-se de testar o pH final com papel indicador de pH. Dessaline as amostras conforme descrito posteriormente neste protocolo. E ressuspenda a amostra em um mililitro do tampão A para obter os melhores resultados.Realize três réplicas experimentais para que os dados possam ser comparados e combinados. Para preparar amostras para três réplicas, adicione três picomols de tripsina, invertase digerida e um microlitro de lectina purificada por CLAE específica para lactoferrina a 30 microlitros de equivalentes de plasma digeridos por tripsina esgotados de Mars ou pe. Isso corresponde a aproximadamente 50 microgramas de proteína plasmática utilizada para cada réplica; adicione o tampão A à amostra para atingir um volume final de 330 microlitros ou 110 microlitros por réplica experimental, utilizando primeiro a coluna de lectina AaL ou SNA. Execute dois métodos em branco, injetando apenas o tampão A. Certifique-se de que a coluna de lectina corresponda à lectina específica para lactoferrina utilizada como padrão e previamente purificada por cromatografia.Os três amostras de plasma injetadas, com uma amostra em branco entre cada amostra injetada, perfazendo um total de sete corridas de HPLC. As frações das corridas em branco não precisam ser coletadas. Novamente, certifique-se de neutralizar as amostras colocando tampão de neutralização nos frascos que coletam o eluato após a dessalinização e digestão com P-N-G-A-F; as amostras estarão prontas para análise por espectrometria de massas.Use um cartucho de águas oasis H-L-B-S-P-E de um mililitro para cada uma das frações HBLC do padrão de lactoferrina e das amostras experimentais para dessalinizar. Comece fixando o número necessário de cartuchos a um manifold a vácuo. Umedeça cada cartucho com um mililitro de acetonitrila 80% em ácido fórmico 1%.O manômetro de vácuo no manifold deve indicar de cinco a vinte polegadas. Equilibre os cartuchos com 1,5 mililitros de ácido fórmico 0,1%. Novamente, o manômetro de vácuo no manifold deve indicar de cinco a vinte polegadas.Mercury carregue todo o volume de uma amostra em uma cartucho. Agora, o manômetro de vácuo no manifold deve indicar de dois a 2,5 polegadas. O mercúrio e a taxa de fluxo não devem exceder um mililitro por minuto.Lave as cartuchas três vezes com um mililitro de ácido fórmico 0,1%, utilizando um tubo de coleta individualizado para cada cartuca. Elua os glicopeptídeos com um mililitro de acetonitrila 80% em ácido fórmico 0,1% e neutralize o EIT adicionando 60 microlitros de bicarbonato de amônio 0,5 molar a cada tubo de coleta. O pH neutralizado alvo é de 7,0 a 8,0.Certifique-se de testar o pH final com papel indicador de pH. Concentre os peptídeos eluídos até aproximadamente 50 microlitros utilizando uma centrífuga a vácuo, como a Thermo Savant Speed Vac, por cerca de duas horas a 35 graus Celsius. Novamente, teste o pH da amostra após a concentração para garantir que esteja entre 7,0 e 8,0. Se necessário, adicione bicarbonato de amônio 50 milimolar para aumentar o pH.Se o volume final da amostra for maior que 100 microlitros, concentre a amostra por centrifugação a vácuo até que fique entre 50 e 100 microlitros. Por fim, remova os carboidratos ligados por N dos peptídeos adicionando 250 unidades de peptídeo n-glicosidase F livre de glicerol ou P-N-G-A-F a cada tubo de amostra e incube a 37 graus Celsius durante a noite. Após a incubação noturna com P-N-G-S-F, utilize ponteiras zip tip contendo uma matriz de fase reversa C 18 para dessaltar as amostras antes de iniciar.Prepare duas gotas, uma de ácido fórmico 0,1% e outra de acetonitrila 80% mais ácido fórmico 0,1%, sobre um pedaço de paraform para lavagem e eluição. As gotas são usadas para prevenir contaminação cruzada de peptídeos entre amostras, e novas gotas são preparadas para cada amostra que passa pela ponta zip. Comece umedecendo a ponta zip com solução de acetonitrila. Equilibre a ponta zip pipetando para cima e para baixo três vezes com 10 microlitros de ácido fórmico 0,1%.Carregue a amostra pipetando para cima e para baixo 10 vezes. Em seguida, lave a ponteira com 10 microlitros de ácido fórmico 0,1% cinco vezes. Por fim, elua a amostra duas vezes com acetonitrila 80% em ácido fórmico 1%, coletando os peptídeos eluídos em um tubo Eppendorf.Reduza o volume da amostra para menos de dois microlitros por concentração em um centrifugador a vácuo e finalize ressuspendendo as amostras em 20 microlitros de ácido fórmico 0,1%. As amostras estão agora prontas para análise por L-C-M-S-M-S. A conjugação porro geralmente produz concentrações de lectina em bead na faixa de dois a 20 miligramas por mililitro, o que é ideal para cromatografia de afinidade.A cromatografia de lectina de plasma humano esgotado de Mars digerido por tripsina normalmente enriquece glicopeptídeos na fração ligada. O nosso fluxo de trabalho identifica glicopeptídeos N-ligados, que contêm a sequência de consenso NXS ou NXT, onde X é qualquer resíduo exceto prolina. O tratamento com PNGF remove os glicanos ligados e desamina o resíduo de asparagina ao qual os glicanos estavam ligados.A dation resulta em uma mudança de massa de um Dalton no peptídeo desglicosilado ou no deglicopeptídeo em relação ao peptídeo não modificado. Assim, os deglicopeptídeos DEG são identificados como peptídeos contendo a sequência consenso de ligação N, onde o resíduo de asparagina dentro da sequência consenso é desamidado, observado como uma diferença de massa de mais um em comparação com um resíduo de asparagina não modificado. Aqui, dois espectros exemplares ilustram este conceito.O espectro superior mostra a fragmentação de um peptídeo não modificado contendo a sequência consenso EnLink. O espectro inferior mostra a fragmentação do mesmo peptídeo com o resíduo de asparagina desaminado dentro da sequência consenso EnLink. Os íons moleculares circulados dos fragmentos Y sete, Y oito e B três do peptídeo desaminado apresentam aumento de massa de um Dalton em comparação com seus equivalentes no peptídeo não modificado.Esse deslocamento de massa indica que o peptídeo no espectro inferior contém um resíduo de asparagina desaminado. Normalmente, utilizando um QStar elite, de 1000 a 1300 peptídeos totais serão identificados na fração de fluxo livre e de 200 a 400 peptídeos serão identificados na fração ligada. Em média, a fração de fluxo livre proveniente de uma cromatografia a l ou SNA contém de 2 a 4% de peptídeos desglicilados, enquanto 30 a 50% dos peptídeos recuperados na fração ligada são peptídeos desglicilados.Utilizamos o termo deg glicopeptídeos em vez de glicopeptídeos, pois as moléculas desglicosiladas e desaminadas são observadas durante a análise por espectrometria de massas. No entanto, propomos que a maioria dos glicopeptídeos DEG em nossas amostras eram previamente glicopeptídeos não ligados que foram desglicosilados e desaminados pelo tratamento com PN GF. O enriquecimento de desglicopeptídeos em nossa amostra ligada apoia essa hipótese e nos permite utilizar a detecção de glicopeptídeos D como um indicador indireto dos glicopeptídeos capturados pelo nosso protocolo de cromatografia de afinidade com lectina.Devem ser observados dois ou mais glicopeptídeos distintos de invertase d na fração que passa e dois ou mais glicopeptídeos distintos de lactoferrina desglicosilada na fração retida. Acabamos de mostrar como preparar colunas de lectina e realizar cromatografia de afinidade por lectina em formato HPLC. Ao realizar este procedimento, é importante começar com amostras de glicopeptídeos de alta qualidade, monitorar o pH das suas amostras durante todo o experimento e confirmar a qualidade da sua cromatografia com padrões de glicopeptídeos.É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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