Liberação de dopamina no Individual Terminais Pré-Sinápticas visualizado com FFNs

O neurotransmissor falso fluorescente. O FFN 511 é o monoaminofluorescente que pode atuar como substrato para o transportador físico de monoaminas sináptico quando aplicado em fatias cerebrais. O FN 511 é captado por vesículas sinápticas dopaminérgicas por meio do transportador de monoaminas e pode ser usado para visualizar diretamente a liberação de transmissores a partir de terminais pré-sinápticos de neurônios monoaminérgicos, como os presentes na substância negra. A liberação de transmissor a partir dos terminais é visível na fatia como uma redução nos sinais fluorescentes pontuados.

Neste vídeo, cortes coronais de sal com 250 micrômetros de espessura são preparados usando um vibrátomo, corados com FFN 511 e analisados em um microscópio a laser de múltiplos fótons. São apresentados experimentos de detenção que revelam uma heterogeneidade dependente da frequência na liberação de iCal. Olá, sou HU do Laboratório de David, do Departamento de Neurologia da Universidade Columbia.

Olá, eu sou Minerva, também do Soldier Lab. Hoje vamos mostrar um procedimento para marcar terminais dopaminérgicos em fatias cerebrais com neurotransmissores falsos fluorescentes. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a liberação de dopamina.

Então vamos começar. Antes de preparar fatias agudas de sal, é necessário oxigenar o fluido cerebroespinhal artificial (A CSF) e resfriá-lo com gelo por pelo menos 15 minutos antes da extração do cérebro. Mantenha o A CSF gelado e oxigenado durante a dissecação. Extraia todo o cérebro do camundongo e fixe-o na bandeja do vibrosserrote, utilizando cola instantânea. A extração e fixação do cérebro devem ser realizadas em até dois minutos.

Encha a bandeja com A CSF oxigenada e resfriada, cortando fatias coronais retas do cérebro com espessura de 250 micrômetros entre +1,54 e +0,623. Serão obtidas fatias de tecido, que podem ser divididas em seis meias fatias com uma agulha. Incube as fatias cerebrais em A CSF oxigenada à temperatura ambiente por pelo menos uma hora enquanto as fatias cerebrais estão sendo incubadas.

Em LCR A oxigenado, prepare a solução de carregamento de FFN 511 a 10 micromolar adicionando a solução estoque de FFN 511 a 10 milimolar ao LCR A. Em seguida, prepare uma solução de A-D-V-A-S-E-P sete a cem micromolar em LCR A oxigenado. Oxigene ambas as soluções por pelo menos 15 minutos antes de carregá-las nos cortes individualmente. Incube cada corte cerebral com a solução de carregamento de FFN 511 por 30 minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, remova o di ligado aos tecidos extracelulares incubando a fatia carregada em 100 micromolar de advers, sete A CSF oxigenado por 30 minutos à temperatura ambiente. As fatias estão agora prontas para a aquisição de imagens. A coloração com FFN 511 será visualizada nas fatias utilizando um microscópio de varredura a laser multiphoton Prairie Ultima. Coloque a fatia carregada com FFN 511 na câmara de registro e suprafluxione com A CSF oxigenado a uma taxa de fluxo de um a dois mililitros por minuto. Em seguida, coloque uma harpa de platina com fios de náilon sobre a fatia para minimizar movimentos.

Durante o experimento, para minimizar ainda mais o movimento, deixe as fatias se estabilizarem por pelo menos 10 minutos na câmara antes da aquisição de imagens. Visualize e localize o estriado dorsal AUM com luminiscência de campo claro sob uma objetiva de imersão em água de 10 x, e posicione os eletrodos de tungstênio bipolares trançados nesta região para realizar um experimento de estimulação. A área de aquisição de imagens ociosa está localizada dentro de 300 micrômetros.

Entre as duas pontas do eletrodo bipolar estimulante, posicione esta região no centro da imagem do campo visual com terminais Sal marcados com FFN 511, utilizando um objetivo de imersão em água de 63x ultravioleta. O FFN 511 é excitado em 760 nanômetros com um laser mi tai da Spectral Physics. A fluorescência ideal dos terminais SAL é observada por meio de um filtro de passagem de banda. Capture imagens em formato de 12 bits, com regiões de interesse de 75 por 75 micrômetros e resolução de 512 por 512 pixels. Um exemplo de imagem com terminais de dopamina Sal marcados com FFN 511 é mostrado aqui.

O marcador FFN 511 pode ser eliminado por altas concentrações de cloreto de potássio, sulfato de anfetamina ou por estimulação elétrica no experimento de retenção com cloreto de potássio, quando uma solução de CSF com alto teor de potássio é aplicada ao corte cerebral, o marcador FFN 511 é eliminado em até quatro minutos. Registre imagens XYZT para acompanhar ao longo do tempo a eliminação do FFN 511 na coloração por estimulação elétrica. Obtenha uma série temporal de controle da região de interesse antes da estimulação, por pelo menos cinco minutos, para garantir movimento mínimo do corte e ausência de fotoesbranqueamento pelo laser. Após a aquisição das imagens de controle.

Continue a aquisição de imagens XYZT enquanto inicia a estimulação em frequências de um, quatro ou 20 hertz; estímulos são aplicados localmente ao estriado por meio de um isolador de estímulo isoflex acionado por um gerador de pulsos mestre oito, utilizando eletrodos bipolares. Este vídeo mostra a liberação do FFN 511 durante a exocitose em um corte cerebral SAL. Quando a carga do FFN 511 no SAL está completa, observa-se rotulagem abundante no estriado, rotulagem esparsa na córtex e ausência de rotulagem no corpo caloso.

A marcação seletiva de terminações dopaminérgicas pode ser despolarizada por cloreto de potássio em alta concentração, conforme mostrado nestas imagens representativas antes do cloreto de potássio e dois minutos após a aplicação de cloreto de potássio 70 milimolar. Uma liberação de marcação de FFN 511 no LCR também pode ser realizada pela anfetamina. E esta imagem mostra a marcação de FFN 511 no estriado antes da administração de anfetamina.

Embora esta imagem mostre o estriado 20 minutos após a retenção com anfetamina de 20 micromolar, a retenção da marcação com FFN 511 por estimulação elétrica local é ilustrada nestas imagens, que mostram a marcação com FFN 511 no estriado antes da estimulação e aos 217 segundos e 514 segundos após o início da estimulação em quatro hertz. Este gráfico da intensidade de fluorescência normalizada ao longo do tempo mostra que a retenção do FFN 511 é dependente de cálcio e de frequência; os controles, representados pelos triângulos vazios, não receberam estimulação. A retenção com cloreto de cádmio, representada por círculos vazios, foi idêntica aos controles não estimulados.

As curvas de decaimento para cada frequência de estimulação, representadas pelos círculos coloridos, foram ajustadas por uma função de decaimento exponencial simples e os valores de meia-vida foram calculados como tau pela fórmula 0,693 dividido por Naut. Acabamos de mostrar como carregar um neurotransmissor fluorescente de força FFN cinco 11 nos terminais dopaminérgicos em um fatia aguda de cérebro e como liberá-lo por meio de potássio elevado e estimulação evocada. Esta é a primeira técnica desenvolvida para examinar a liberação de neurotransmissores de forma óptica ao nível de terminais sinápticos individuais.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manter as fatias muito saudáveis e estar atento ao tempo de carregamento, ao branqueamento do fundo e aos artefatos de movimento; as fatias devem apresentar boa captação de FFN cinco 11 e ser adequadas para imageamento até quatro horas após a preparação. É isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.