Name: Liberação de dopamina no Individual Terminais Pré-Sinápticas visualizado com FFNs (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-31T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Aprenda a visualizar a liberação de dopamina em terminais pré-sinápticos individuais usando FFN 511 em fatias cerebrais de camundongos. Este método de imagem multifotônica permite estudar a neurotransmissão dopaminérgica em tempo real.

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D. Sames graças A Harold G. &amp; Leila Y. Mathers Fundação de Caridade e Iniciativas da Universidade de Columbia em Ciência e Engenharia. D. Sames e D. Sulzer agradecer à Fundação McKnight para as inovações tecnológicas em McKnight Prêmio Neuroscience D. Sulzer graças NIDA, NIMH, e os Picower e Fundações da doença de Parkinson. Graças H. Zhang NARSAD. RH Edwards graças a Michael J. Fox Foundation, a National Parkinson Foundation, NIDA e NIMH. Agradecemos a Robert Burke por 6-OHDA injeções e conselho, Mark Sonders para discussão útil, Merek Siu para imagens de análise, programação e Schmoranzer Jan de apoio técnico com a configuração de microscopia TIRF.

Este método foi utilizado na pesquisa, publicada na <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/full/324/5933/1441">Gubernator et al. Ciência 324 (5933). 1441-1444 (2009)</a> . 1. Preparando aguda fatias estriatais <ol><li> Antes de preparar fatias estriatal aguda, deve-se oxigenar o líquido cefalorraquidiano artificial (ASCF) e chill-lo com gelo por pelo menos 15 minutos antes da extração de cérebro. Manter o frio do gelo ACSF e oxigenado durante a dissecção. ACSF (em mM): NaCl 125, KCl 2.5, NaHCO 3 26, CaCl 2 2,4, MgSO4 1,3, KH 2 PO 4 0,3, glicose 10, HEPES 5; pH 7,3-7,4, 290-295 mOsm. </li><li> Decapitar rato macho sem anestesia. </li><li> Extrair todo o cérebro do rato, e montá-la na bandeja vibratome colocados no vibratome usando Krazy Glue ®. Extração de cérebro e de montagem deve ser feita dentro de 2 minutos. Durante este tempo, certifique-se para manter o frio do gelo ACSF e oxigenado para manter os tecidos saudáveis. </li><li> Corte coronal fatias do cérebro estriado na espessura 250μm bregma entre 1,54-0,62 1. Três fatias inteiras serão obtidos que podem então ser cortada em 6 fatias meia com uma agulha. </li><li> Incubar as fatias de cérebro em ACSF oxigenada em temperatura ambiente por pelo menos 1 hora antes de carregá-sonda. Fatias de mostrar o carregamento FFN511 bom e permanecer ativo para geração de imagens de até 4 horas após a preparação fatia. </li></ol> 2. Carregando FFN511 <ol><li> Prepare FFN511 solução de carga (10μM FFN511 em ACSF); também preparar 100μM ADVASEP-7 em ACSF. Todas as soluções devem ser preparadas de fresco e oxigenado pelo menos 15 minutos antes do embarque para as fatias. </li><li> Individualmente incubar fatia com FFN511 solução de carga por 30 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Em seguida, retire o corante ligado ao tecido extracelular incubando a fatia carregada em oxigenado 100μM ADVASEP-7 ACSF por 30 minutos em temperatura ambiente 2. Fatias estão agora prontos para a imagem latente. </li></ol> 3. Imagem FFN511 no fatias de cérebro Imagem de FFN511 nos cortes é realizada utilizando multifotônica microscópio de varredura a laser. Estamos usando um Prairie Ultima multifotônica microscópio de varredura por laser (Estávamos usando uma Zeiss LSM 510 NLO multifotônica microscópio de varredura a laser antes e alguns resultados foram obtidos com o microscópio Zeiss). <ol><li> Coloque a fatia FFN511-carregado na câmara de gravação (RC-27L, Warner) e superfuse com ACSF oxigenado a um fluxo de 1-2 ml por minuto. Em seguida, coloque uma harpa de platina com cordas de nylon em cima da fatia para minimizar o movimento durante o experimento. Para minimizar ainda mais o movimento, permitir que a fatia para estabilizar por pelo menos 10 minutos na câmara antes da imagem. </li><li> Visualizar e localizar o striatum dorsal, com luminescência campo brilhante sob a objetiva de 10x imersão em água. </li><li> Lugar e posição do bipolar torcida eléctrodos de tungsténio na região se realizar um experimento de estimulação. A área de imagem ideal está localizado dentro de 300 mm entre as duas pontas do eléctrodo bipolar estimulante. Coloque esta região no centro do campo visual. </li><li> Imagem FFN511 marcado terminais estriatal em um (0,9 NA) O objectivo da água por ultravioleta 63x de imersão. FFN511 está animado com 760 nm com um laser de Mai Tai Física Spectral e fluorescência ideal de terminais estriatal é visto através de um filtro passa-banda (480-520 nm). As imagens são capturadas no formato de 12-bit com 75 x 75 mM regiões de interesse em 512 pixels de resolução x 512. Estimulado para experimentos de descoloração, para compensar a mudança do eixo z, z uma série de imagens 07/05, separados por 1 mícron no plano z, é obtido para cada período de tempo. </li></ol> 4. FFN511 Descoloração A etiqueta pode ser descorados FFN511 quer por alta concentração de KCl (70 mM usamos KCl), (+)-anfetamina sulfato (AMPH, 20 mM), ou estimulação elétrica. No experimento de descoloração KCl, quando uma solução ACSF alta de potássio é aplicado à fatia do cérebro, o FFN511 destains label dentro de 2 minutos. Registro xyz-t imagens para acompanhar FFN511 descoloração ao longo do tempo. A seguir descreve estimulação elétrica dependente de descoloração terminal dopamina: <ol><li> Para acompanhar FFN511 descoloração ao longo do tempo, xyz-t as imagens são gravadas. Para garantir movimento mínimo da fatia (menos do que 4 mm no eixo z) e não fotobranqueamento pelo laser, controle de imagens de séries temporais do z-stack deve ser obtido por pelo menos 5 minutos antes da estimulação. Caso contrário, ajustar a potência do laser. </li><li> Após essas imagens de controle, continuam a imagem xyz-t, enquanto começam a estimulação nas freqüências de 1, 4 ou 20 Hz. Estímulos em 1, 4 ou 20 Hz (300 mS x 1 mA) são aplicados para o estriado localmente por um isolador de estímulo Iso-Flex acionada por um gerador de Mestre-8 de pulso (Ampi, Jerusalém, Israel) através de eletrodos bipolares. Para minimizara variação da despolarização dos locais de lançamento, temos usado um protocolo de estimulação aplicando 150% da intensidade de estimulação máxima determinada por voltametria cíclica. </li><li> Usar o software adequado para análise de imagem. Em nosso laboratório, usamos Image J (Wayne Rosband, National Institutes of Health, Rockville, MD) e custom-written software em IDL (Research Systems, Boulder, CO) para quantificar a fluorescência puncta e as mudanças com Time3. </li></ol> Resultados Represenative A Figura 1 mostra o carregamento na FFN511 fatia estriatal está concluída. Imagens representativas utilizando objetiva de 10x e 60x são mostrados na Fig.1. A rotulagem seletiva de terminais de dopamina pode ser descorados por 20 mM de anfetamina. A Figura 2 mostra de descoloração de rotulagem FFN511 por KCl elevado. A Figura 3 mostra descoloração de rotulagem FFN511 por estimulação elétrica local. <img src="/files/ftp_upload/1562/1562fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 FFN511 rótulos terminais de dopamina no estriato-cortical viver fatias aguda (A) de rotulagem, pela FFN511 em aguda córtico-estriatal fatia ao vivo:.. Rotulagem abundante no corpo estriado (STR), rotulagem esparsa no córtex (CTX), e sem rótulo no corpo caloso (CC). Barra de escala:. 100 mm (B) Descoloração de FFN511 do striatum por anfetamina. Painéis da esquerda: antes de anfetaminas; painéis direita: após 20 minutos de 20 de anfetamina mM. Barra de escala: 10 mM. <img src="/files/ftp_upload/1562/1562fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Descoloração de FFN511 rotulagem por KCl elevado. Rotulagem FFN511 é descorados dentro de 2 min de aplicação de 70 mM KCl em ACSF. Barra de escala: 10μm. <img src="/files/ftp_upload/1562/1562fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Dependente da freqüência de descoloração de rotulagem em FFN511 striatum. (A) estimulação local em 4 Hz resultou na descoloração dos terminais. Estimulação começou em t = 0. Barra de escala: 5 mm (B) Descoloração de FFN511 a 4 Hz é Ca 2 + - e dependente da freqüência.. Controles não receberam estimulação (153 puncta de 3 fatias). Descoloração com cloreto de cádmio (200 mM) foi idêntico aos controles não estimuladas (475 puncta de 5 fatias). As curvas de descoloração para cada freqüência de estimulação foram ajustados por uma função de decaimento exponencial simples e meia-vida (t 1 / 2) valores calculados como τ x 0,693 (1 Hz: 765 puncta de 9 fatias, 4 Hz: 410 puncta de 7 fatias, 20 Hz: 416 puncta de 6 fatias). Consulte a micrografia de vídeo de dois fótons de microscopia de FFN511 descoloração durante exocitose numa preparação estriado cerebral fatia.

<ol><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxi coordinators. , Academic Press. San Diego. (1997).</li>
<li>Kay, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+synaptic+activity+in+intact+brain+and+slices+with+FM1-43+in+C.+elegans%2C+lamprey%2C+and+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat.</a> Neuron. 24, 8098-8117 (1999).</li>
<li>Bamford, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterosynaptic+dopamine+neurotransmission+selects+sets+of+corticostriatal+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Heterosynaptic dopamine neurotransmission selects sets of corticostriatal terminals.</a> Neuron. 42, 653-653 (2004).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

Neste vídeo, demonstramos um método de visualizar usando análogos opticamente neurotransmissão da dopamina fluorescente. FFN511 é a primeira geração de FFNs temos desenvolvido. Embora tenha sido projetado visando o transportador vesicular neuronal monoamina (VMAT2), que transporta neurotransmissores monoamina do citoplasma em vesículas sinápticas e, especificamente, etiquetas terminais de dopamina no estriado e catecolaminas presumido e / ou terminais de serotonina no córtex (como mostrado na Ciência papel), um período de carga adequado é fundamental para a especificidade desde FFN511 é relativamente hidrofóbica. Descobrimos que a incubação por mais de 40 minutos irá resultar em coloração inespecífica extensa em fatias estriatais. A especificidade pode ser diretamente determinada pela descoloração usando uma alta concentração de KCl, o que deve provocar a libertação de FFN funcional dentro de vesículas sinápticas. Exposição da fatia para FFN511 para menos de 15 minutos irá resultar em sinal fluorescente fraco devido à carga insuficiente do corante nos terminais. Neste protocolo, usamos 100μM ADVASEP-7 para remover o corante ligado ao tecido extracelular. Este passo não é necessário, mas se ele for omitido, o tempo de washout em ACSF precisa ser prolongada. Em resumo, dependendo da preparação que você escolheu, você precisará modificar o período de concentração e de carga para determinar rotulagem ideal.

<table><tbody><tr><td>FFN511 (8-(2-Amino-ethyl)-2,3,5,6-tetrahydro-1H,4H-11-oxa-3a-aza-benzo[de]anthracen-10-one)</td><td>Universidade Columbia - Laboratório Dalibor Sames</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ADVASEP-7 </td><td>CyDex</td><td>AR-OA7-005</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de gravação RC-27L</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0375</td><td></td></tr><tr><td>Suporte PELCO PrepEze com 6 poços</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>36157-1</td><td>Para incubação de fatias</td></tr><tr><td>Estimulador de pulso Master-8 e isolador de estímulo Iso-Flex</td><td>AMPI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

liberação de dopamina no individual terminais pré-sinápticas visualizado com ffns

Dopamine Release at Individual Presynaptic Terminals Visualized with FFNs

O sistema nervoso transmite sinais entre neurônios através de liberação de neurotransmissores durante a fusão das vesículas sinápticas. Para observar a absorção e liberação de neurotransmissores a partir de terminais pré-sinápticos individuais diretamente, nós projetamos fluorescentes neurotransmissores falsa como substratos para o transportador das vesículas sinápticas monoamina. Usando estas sondas para liberar imagem de dopamina no estriado, fizemos várias observações pertinentes a plasticidade sináptica. Descobrimos que a fração de vesículas sinápticas liberando o neurotransmissor por estímulo foi dependente da freqüência de estímulo. A cineticamente distintas &quot;reserva&quot; da população das vesículas sinápticas não foi observada nessas condições experimentais. A heterogeneidade dependente da freqüência de terminais pré-sinápticos foi revelado que era dependente, em parte, os receptores de dopamina D2, indicando um mecanismo para dependente da freqüência de codificação da seleção pré-sináptica. Hui Zhang e Niko Gubernator G. contribuíram igualmente para este trabalho.

Um novo meio de medir a neurotransmissão opticamente usando análogos de dopamina fluorescente.

Liberação de dopamina no Individual Terminais Pré-Sinápticas visualizado com FFNs

O sistema nervoso transmite sinais entre neurônios por meio da liberação de neurotransmissores durante a fusão de vesículas sinápticas. Para observar a captação de neurotransmissores e ...

O neurotransmissor fluorescente falso. O FFN 511 é a monoamina fluorescente que pode atuar como substrato para o transportador físico de monoamina sináptico quando aplicada a fatias cerebrais. O FN 511 é captado por vesículas sinápticas dopaminérgicas por meio do transportador de monoamina e pode ser usado para visualizar diretamente a liberação de transmissores a partir de terminais pré-sinápticos de neurônios monoaminérgicos, como os presentes na camada estrato. A liberação de transmissor a partir dos terminais é visível na fatia como uma redução nos sinais fluorescentes pontuados.Neste vídeo, cortes coronais de sal com 250 micrômetros de espessura são preparados usando um vibrátomo, corados com FFN 511 e analisados em um microscópio a laser de múltiplos fótons. São apresentados experimentos de detenção que revelam uma heterogeneidade dependente da frequência na liberação de iCal. Olá, sou HU do Laboratório de David do Departamento de Neurologia da Universidade Columbia.Olá, eu sou Minerva, também do Soldier Lab. Hoje vamos mostrar um procedimento para marcar terminais dopaminérgicos em fatias cerebrais com neurotransmissores falsos fluorescentes. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a liberação de dopamina.Então vamos começar. Antes de preparar fatias agudas de sal, é necessário oxigenar o líquido cefalorraquidiano artificial (A CSF) e resfriá-lo com gelo por pelo menos 15 minutos antes da extração cerebral. Mantenha o A CSF gelado e oxigenado durante todo o procedimento. Durante a dissecação, extraia todo o cérebro do camundongo e fixe-o na bandeja do vibrosserrote, utilizando cola instantânea. A extração e fixação do cérebro devem ser realizadas em até dois minutos.Encha a bandeja com A CSF oxigenada e resfriada, cortando fatias coronais retas do cérebro com espessura de 250 micrômetros entre +1,54 e +0,623. Serão obtidas fatias de tecido, que podem ser divididas em seis meias fatias com uma agulha. Incube as fatias cerebrais em A CSF oxigenada à temperatura ambiente por pelo menos uma hora enquanto as fatias cerebrais estão sendo incubadas.No LCR A oxigenado, prepare a solução de carregamento de FFN 511 a 10 micromolar adicionando a solução estoque de FFN 511 a 10 milimolar ao LCR A. Em seguida, prepare uma solução de A-D-V-A-S-E-P sete a cem micromolar no LCR A oxigenado. Oxigene ambas as soluções por pelo menos 15 minutos antes de carregá-las nos cortes individualmente. Incube cada corte cerebral com a solução de carregamento de FFN 511 por 30 minutos à temperatura ambiente.Em seguida, remova o di ligado aos tecidos extracelulares incubando a fatia carregada em 100 micromolar de advers, sete A CSF oxigenado por 30 minutos à temperatura ambiente. As fatias estão agora prontas para a aquisição de imagens. A marcação com FFN 511 será visualizada nas fatias utilizando um microscópio de varredura a laser multiphoton Prairie Ultima. Coloque a fatia carregada com FFN 511 na câmara de registro e suprafluxione com A CSF oxigenado a uma taxa de fluxo de um a dois mililitros por minuto. Em seguida, coloque uma harpa de platina com fios de náilon sobre a fatia para minimizar movimentos.Durante o experimento, para minimizar ainda mais o movimento, deixe as fatias se estabilizarem por pelo menos 10 minutos na câmara antes da aquisição de imagens. Visualize e localize o estriado dorsal AUM com luminiscência de campo claro sob uma objetiva de imersão em água de 10 x, e posicione os eletrodos de tungstênio bipolares trançados nesta região para realizar um experimento de estimulação. A área de aquisição de imagens ociosa está localizada a até 300 micrômetros.Entre as duas pontas do eletrodo bipolar estimulante, posicione esta região no centro da imagem do campo visual com terminais Sal marcados com FFN 511, utilizando um objetivo de imersão em água de 63x ultravioleta. O FFN 511 é excitado em 760 nanômetros com um laser mi tai da Spectral Physics. A fluorescência ideal dos terminais SAL é observada por meio de um filtro de passagem de banda. Capture imagens no formato de 12 bits, com regiões de interesse de 75 por 75 micrômetros e resolução de 512 por 512 pixels. Uma imagem exemplo com terminais de dopamina Sal marcados com FFN 511 é mostrada aqui.O marcador FFN 511 pode ser descorado por altas concentrações de sulfato de anfetamina em cloreto de potássio ou por estimulação elétrica no experimento de retenção com cloreto de potássio, quando uma solução de CSF com alto teor de potássio é aplicada ao corte cerebral, o marcador FFN 511 descora em até quatro minutos. Registre imagens XYZT para acompanhar ao longo do tempo a liberação do FFN 511 na coloração por estimulação elétrica. Obtenha uma série temporal de controle da região de interesse antes da estimulação, por pelo menos cinco minutos, para garantir movimento mínimo do corte e ausência de fotoesbranqueamento provocado pelo laser. Após a aquisição das imagens de controle,Continue a aquisição de imagens XYZT enquanto inicia a estimulação em frequências de um, quatro ou 20 hertz; estímulos são aplicados localmente ao estriado por meio de um isolador de estímulos isoflex acionado por um gerador de pulsos mestre oito, utilizando eletrodos bipolares. Este vídeo mostra a liberação do FFN 511 durante a exocitose em um corte cerebral SAL. Após a carga completa do FFN 511 no SAL, observa-se rotulagem abundante no estriado, rotulagem esparsa na córtex e ausência de rotulagem no corpo caloso.A marcação seletiva dos terminais dopaminérgicos pode ser observada com cloreto de potássio elevado, conforme mostrado nestas imagens representativas antes do cloreto de potássio e dois minutos após a aplicação de cloreto de potássio 70 milimolar. Uma liberação de marcação de FFN 511 no LCR também pode ser realizada pela anfetamina. E esta imagem mostra a marcação de FFN 511 no estriado antes da anfetamina.Embora esta imagem mostre o estriado 20 minutos após a retenção com 20 micromolares de anfetamina, a retenção da marcação com FFN 511 por estimulação elétrica local é ilustrada nestas imagens, que mostram a marcação com FFN 511 no estriado antes da estimulação e aos 217 segundos e 514 segundos após o início da estimulação a quatro hertz. Este gráfico da intensidade de fluorescência normalizada ao longo do tempo mostra que a retenção do FFN 511 é dependente de cálcio e de frequência; os controles, representados pelos triângulos vazios, não receberam estimulação. A retenção com cloreto de cádmio, representada por círculos vazios, foi idêntica aos controles não estimulados.As curvas de despolarização para cada frequência de estimulação, representadas pelos círculos coloridos, foram ajustadas por uma função de decaimento exponencial simples e os valores de meia-vida foram calculados como tau pela fórmula ln(2). Acabamos de mostrar como carregar um neurotransmissor fluorescente de força FFN cinco 11 nos terminais dopaminérgicos em fatias agudas de cérebro e como liberá-lo por meio de potássio elevado e estimulação elétrica. Este é o primeiro método desenvolvido para examinar a liberação de neurotransmissores de forma óptica ao nível de terminais sinápticos individuais.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manter as fatias muito saudáveis e estar atento ao tempo de carregamento, ao branqueamento do fundo e aos artefatos de movimento. As fatias devem apresentar boa carga de FFN cinco 11 e ser adequadas para imageamento até quatro horas após a preparação. É isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Biologia

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