Aórtica Assay Anel

O objetivo geral do ensaio do anel aórtico é fornecer um sistema experimental flexível no qual os vasos sanguíneos são germinados a partir de pedaços inteiros de aorta de camundongo dentro de uma matriz 3D. Isso é conseguido primeiro dissecando a aorta torácica de um camundongo e, em seguida, limpando-a cuidadosamente de qualquer tecido circundante restante. Fatias da aorta limpa ou anéis aórticos são colocadas em poços individuais de uma placa de 48 poços, cada um contendo extrato de matriz basal ou BME moldado em cúpulas.

Uma gota extra de BME envolve o anel em uma estrutura 3D. A matriz pode conter qualquer reagente experimental de sua escolha. Após incubação por vários dias, os vasos podem ser observados brotando dos anéis aórticos e o potencial angiogênico dos compostos de teste pode ser avaliado.

Olá, sou Karen Bein, do laboratório do Dr.E Lewis no Departamento de Bioquímica Clínica da Universidade Beon do Negativo em Be Sheva Israel. Hoje mostraremos um procedimento para o ensaio do anel aórtico do camundongo. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar os efeitos de vários materiais na formação de vasos sanguíneos.

Então vamos começar. Para iniciar este procedimento, deixe o extrato da matriz basal ou BME descongelar no gelo ou a quatro graus Celsius. Depois de descongelado, continue a manter o BME frio para evitar que ele se solidifique novamente.

No dia do experimento, eutanasiar um camundongo de seis a sete semanas de idade por uma injeção padrão de cetamina e xilazina sangrar rapidamente pelas artérias do pescoço, seguido de luxação cervical. Comece o procedimento limpando o animal com etanol 70% em uma capela de fluxo laminar estéril. Em seguida, enquanto trabalha sob um escopo de dissecação, use uma pinça estéril e uma tesoura de dissecção para realizar uma incisão vertical da pele e abrir a parede peritoneal.

A incisão deve ser feita para expor o esterno superior, onde a caixa torácica também é cortada e o diafragma removido. Prossiga para empurrar cuidadosamente todos os órgãos para o lado, expondo completamente a aorta torácica localizada ao lado da coluna com a aorta exposta, insira uma pinça fina e estéril entre a aorta e a coluna. Abra a pinça e levante gradualmente a aorta de seu leito, separando o segmento torácico do resto da aorta.

Agora que a aorta está separada, use uma tesoura afiada para cortá-la do camundongo, começando na extremidade, que está próxima aos vasos renais e terminando perto do coração. Coloque a aorta torácica excisada em uma placa de Petri cheia de PBS estéril frio. Agora que a aorta foi removida, os anéis aórticos podem ser preparados usando duas pinças estéreis e trabalhando sob um binóculo.

Limpe a aorta torácica do tecido adiposo circundante. Certifique-se de não danificar a aorta e segure-a apenas nas bordas. A aorta deve ser repetidamente imersa na placa de Petri contendo PBS para evitar a desidratação até que seja finalmente limpa.

Agora que a aorta torácica está limpa, use uma lâmina cirúrgica e trabalhe sob o binóculo para cortar a aorta uniformemente em anéis de um milímetro. Usando uma régua colocada abaixo da superfície de corte como guia, certifique-se de usar uma nova lâmina e substituí-la de tempos em tempos para manter a nitidez. As extremidades da aorta não são usadas Depois de cortar cada anel, use uma pinça para transferi-lo suavemente para um novo prato contendo PBS frio.

Coloque todos os anéis na mesma placa contendo PBS para garantir que o ensaio seja randomizado. Como cada segmento da aorta tem um potencial angiogênico um pouco diferente, mantenha os anéis no gelo. Em seguida, prepare a placa de ensaio usando pontas de pipeta pré-resfriadas.

Adicione a cada poço em uma placa de 48 poços em torno de uma gota de 150 microlitros de BME frio, a gota solidifica em um movimento médio de cúpula. O BME permite o transporte de substâncias, quimiotaxia de células e, o mais importante, diferenciação e migração celular que leva à formação de neo vasos Os poços perimetrais são preenchidos com PBS Para evitar a desidratação do BME, permita que a queda do BME se solidifique a 37 graus Celsius por 20 a 30 minutos. Uma vez que o BME tenha solidificado cuidadosamente levante um anel aórtico da placa de Petri usando uma pinça para evitar danos, o anel deve ser transferido para dentro da gota de lipídio que se forma entre as pontas da pinça Como resultado da tensão superficial do líquido, coloque um único anel aórtico no centro superior de cada cúpula e incube por 10 minutos a 37 graus Celsius no topo de cada anel, adicione mais 150 microlitros de BME e incube por 20 a 30 minutos.

A 37 graus Celsius, o anel agora está envolto em BME e ensaio. Os materiais podem ser adicionados à placa para iniciar o ensaio. Suplemento Pres previamente preparado como meio livre de soro endotelial humano com material experimental ou suplemento de crescimento de células endoteliais como controle positivo para controle negativo.

Use apenas o meio. Adicione 500 microlitros do meio de suplemento pré-comprimido a cada poço e incube a 37 graus Celsius por seis a 12 dias. Durante este período de incubação, examine a placa ao microscópio e procure vasos brotando da aorta e vasos maduros avançados identificados por outros vasos ramificados.

Deve se estender a partir do tecido do anel tridimensionalmente fotografar os anéis entre o sexto e o 12º dia sob estereoscópio de contraste de fase padrão. Além disso, colete sobrenadantes em vários dias entre o sexto e o 12º dia e armazene a quatro graus para uso dentro de um dia ou Eloqua e armazene a menos 20 ou menos 80 para uso futuro. Os sobrenadantes podem ser analisados por várias técnicas, como Eliza para vgf ou ensaio de graxa para níveis de óxido nítrico.

Essas imagens foram coletadas 12 dias após a colocação dos anéis nos poços e incubação com cultura, meio visto na linha superior de imagens ou ECGS usado como controle positivo para a brotação do vaso. No painel inferior. Cada imagem é um instantâneo representativo de quatro dos 12 anéis, que normalmente é usado no ensaio por condição.

O canto de cada anel aórtico em cada poço separado é preto. Quando fotografados dessa maneira, os anéis aórticos que foram expostos ao ECGS exibem crescimento de vasos e as setas apontam para vários dos muitos vasos que se formaram. Cada vaso é caracterizado como cadeias de células endoteliais com ramificações ocasionais, indicando que estão maduras.

Nenhum vaso de brotação pode ser observado na cultura. Poços médios no painel superior, acabamos de mostrar como realizar o ensaio de cor aórtica ao fazer este procedimento. É importante lembrar de trabalhar com precisão e entender suas condições.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.