Name: Dirigido Cellular Automontagem para Fabricar Anéis Cell-Derived Tecido para Análise Biomecânica e Engenharia de Tecidos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Aprenda a criar anéis de tecido derivados de células através da automontagem celular em poços de agarose. Este método permite análise biomecânica rápida de construtos tridimensionais para engenharia de tecidos.

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Os autores agradecem Neil Whitehouse (WPI, Higgins Loja Machine) por sua ajuda com usinagem CNC. Além disso, gostaríamos de agradecer a Adriana Hera (WPI Computing e Communications Center) por sua ajuda com MATLAB programação, bem como bebidas e Kate Cotnoir Joseph (WPI Acadêmica Centro de Tecnologia) para obter assistência com Camtasia. Sophie Burke e Jacleen Becker (WPI Acadêmica Centro de Tecnologia), desde imagens de vídeo suplementar. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (R15 HL097332), o UMass Medical School-WPI Pilot Research Initiative, a American Heart Association (bolsa de pesquisa de graduação para JZH), e Instituto Politécnico de Worcester (Verão Bolsa de Investigação para JZH Graduação e institucionais start-up fundos para MWR).

1. Célula de fabricação de moldes semeadura Começar por uma moagem 02/01 pedaço "de espessura de policarbonato para criar 15, de fundo redondo, poços anular com um diâmetro poste central de 2 mm. Os canais moídos são de 6 mm de profundidade e 3,75 milímetros de largura. Limpe e seque o molde de policarbonato para remover todos os detritos de plástico a partir do processo de moagem. Mix polidimetilsiloxano (PDMS) na proporção 10:1 (w / w) de base para agente de cura, Degas para remover todas as bolhas de ar, e despeje no molde de policarbonato. Degas novamente para remover as bolhas restantes, e cura em estufa a 60 ° C por 4 horas. Uma vez curado, remova cuidadosamente o modelo PDMS por lentamente descascando-lo longe do policarbonato, lave com água e sabão, e autoclave. Autoclave também uma solução de dois por cento agarose (w / v) dissolvido em Dulbecco modificado Eagle (DMEM). Coloque o modelo PDMS sobre uma superfície plana e encher com aga fundido subiu pela primeira pipetagem agarose em cada um dos moldes pós-center, e depois de pipetagem para o espaço em torno dela. Permitir que a agarose para solidificar (cerca de 15 minutos), depois inverta o molde para liberar a agarose do PDMS. Cortar o excesso de agarose em torno de cada um dos poços, e colocar os poços de agarose em 12-lamelas. 2. Cultura de células e semeadura anel Adicionar cultura de células de mídia (DMEM com 10% de SFB e 1% de penicilina-estreptomicina) em torno do exterior do molde agarose, sem cobrir a parte superior dos moldes. Coloque as placas na incubadora e permitir-lhes estabilizar durante cerca de 15 minutos enquanto você prepara as células. Na confluência de 90%, trypsinize rat aorta células musculares lisas (rSMCs) e ressuspender em uma concentração de 5x10 6 células / ml. Pipetar 100 mL da suspensão de células em cada um dos poços de anular agarose, usando um movimento circular para aplicar as células em cada poço. content "&gt; Make prateleiras certeza incubadora são de nível, em seguida, coloque as placas na incubadora e permitir-lhes a sentar-se em repouso por 24 horas. meio de troca a cada dois dias depois, aspirando a mídia de todo o bem, e re-encher bem cada até o agarose bem é completamente submerso. 3. Colheita de tecidos de toque e medidas de espessura Na conclusão da cultura, remover o anel do molde agarose, deslizando-a sobre a parte superior do poste central. Coloque o anel em uma pequena placa de Petri com tampão fosfato (PBS), o centro da amostra, e adquirir uma imagem usando um sistema de imagem digital. Use um programa de análise de imagem para detecção de bordas e medir a espessura do anel em 4 posições (superior, inferior, direita e esquerda) em torno de sua circunferência. Calcular o valor de espessura média (t) para cada anel individual, e usar esse valor para calcular a área da seção transversal(2π (t / 2) 2). 4. Ensaios mecânicos de anéis Configurar a máquina de ensaio de tração (Instron EPS 1000) na posição horizontal. Anexar uma célula de carga 1N ± 1mn e personalizados apertos fio fino (criado por flexão de arame de aço inoxidável). Monte a amostra anel sobre os dois apertos de arame fino. Estender as garras até a 5 mN de carga de tara é aplicada à amostra. Entrar na área transversal (calculado a partir de medições de espessura) e gravar o tamanho calibre. Pré-ciclo dos anéis 8 vezes entre a carga de tara e 50 kPa estresse a uma taxa de 10 mm / min. Após o oitavo pré-ciclo, retire a falha em 10 mm / min. Falha é observada como uma diminuição em vigor em 40% a partir de uma medição para outra. Para cada amostra de anel, medir a tensão de rotura (UTS) e tensão de falha e calcular o máximo tangente módulo (MTM) a partir dos dados adquiridos. 5. Anel de tecido comoassembléia para fabricar tubos de tecido Suportes para tubos personalizadas são usinadas a partir de discos round 5 centímetros de policarbonato com recortes retangulares (2 cm x 3 cm). Faça furos com rosca através destes discos para permitir que dois titulares para ser aparafusada. Autoclave titulares tubo de costume, e depois transferir para o gabinete de biossegurança e colocar em uma placa de Petri vazia. Use uma tesoura cirúrgica para cortar as extremidades dos tubos de silicone 1,9 milímetros de diâmetro em um ângulo para criar bordas chanfradas, e depois autoclave os tubos de silicone. Enquanto os tubos estão sendo autoclavado, preencher uma placa de Petri com meios de comunicação. Remova os anéis dos poços agarose e colocá-los na placa de Petri com meios de comunicação. Coloque autoclavado tubos de silicone na mesma placa de Petri para molhar-los antes de usar. Use uma pinça para colocar um fim chanfrado de um tubo de silicone para o centro de um anel e deslize o anel para o tubo de silicone. Repita com o número desejado de rings. Deslize os anéis em contato um com o outro delicadamente empurrá-los sucessivamente em ambas as direções ao longo do tubo. Este método pode ser usado para anéis colhidos depois de apenas um dia de cultura. Uma vez que os anéis são montados, alinhar tubos de silicone dentro do parafuso titulares policarbonato e as duas partes do titular juntos. Coloque o suporte em 100 milímetros prato Petri e adicionar 55 mL de mídia. Troca de mídia a cada 3 dias para a duração da cultura. Para remover os tubos de tecido, solte os tubos de silicone do detentor de policarbonato e utilize uma pinça para deslizar os tubos de tecido fora do tubo de silicone e em uma placa de Petri cheia de PBS. 6. Resultados representativos: Quando o protocolo é realizado corretamente, as células agregadas para formar anéis de tecido com um diâmetro interno igual ao diâmetro do pino molde correspondente no prazo de 24 horas. As bordas do anel são geralmente liso na aparência e (se cultured em uma superfície plana), são uniformes em espessura em torno de toda a circunferência. Os anéis de tecido são de fácil manuseio e podem ser removidos de seus poços para análise mecânica e histológica subseqüente (ver na Gwyther et al., 2011 8). Morfologia do tecido de toque, composição da matriz, e propriedades mecânicas variam de acordo com o número eo tipo de células inoculadas. Resultados representativos dos anéis de tecido feito de diferentes tipos de células, semeando as condições e duração da cultura são apresentados na Tabela 1. Dois anéis mm de diâmetro criados a partir de 5x10 5 rSMCs exibiu uma UTS superior anéis criados a partir de nosso previamente publicados dois anéis mm (feita a partir de 6.6x10 5 rSMCs) 8. Similares às células de rato, células do músculo liso (hSMC) prontamente agregadas para formar tecidos anéis, que continham uma grande quantidade de colágeno após apenas 14 dias em cultura (dados não mostrados). Células-tronco mesenquimais (hMSC) também agregados e anéis formados coesa, mas laforça cked mecânica e quebrou durante as fases iniciais de precycling testes de tração uniaxial. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> n </td><td> Número de células </td><td> Espessura (mm) </td><td> Comprimento da cultura (dias) </td><td> UTS (kPa) </td><td> MTM (kPa) </td><td> Tensão de falha (mm / mm) </td></tr><tr><td> RSMC anéis </td><td> 6 </td><td> 660000 </td><td> 0,94 ± 0,12 </td><td> 14 </td><td> 97 ± 30 </td><td> 497 ± 91 </td><td> 0,50 ± 0,08 </td></tr><tr><td> RSMC anéis </td><td> 4 </td><td> 500000 </td><td> 0,53 ± 0,02 </td><td> 7 </td><td> 113 ± 8 </td><td> 189 ± 15 </td><td> 0,88 ± 0,05 </td></tr><tr><td> hSMC anéis </td><td> 3 </td><td> 750000 </td><td> 0,51 ± 0,05 </td><td> 14 </td><td> 160 ± 30 </td><td> 270 ± 20 </td><td> 0,92 ± 0,08 </td></tr><tr><td> hMSC anéis </td><td> 3 </td><td> 750000 </td><td> 0,40 ± 0,07 </td><td> 14 </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Tabela mostrando os parâmetros da cultura e propriedades mecânicas de dois anéis milímetros gerados a partir de diferentes tipos de células, as concentrações de semeadura, e durações cultura. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3366/3366fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. (A) Esquema do processo de geração de tecido do anel. (B) Custom molde de policarbonato com fresado poços anular. Diâmetros pós Central são 2 mm. (C) modelo PDMS depois de ter sido desfeito, a partir do molde de policarbonato. (D) anel de tecido agregados cultivadas em um molde de agarose com um posto de 2 mm. (E) anel de tecido Dois mm de diâmetro na PBS. Barra de escala = mm 6 mm (B, C) e 2 (D, E). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3366/3366fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Enredo Representante da curva de tensão-produced do ensaio de tração uniaxial.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Recentemente, tem havido um crescente interesse na célula-base ou &quot;scaffold-less&quot; métodos de engenharia de tecidos para tratar de algumas das limitações do andaime abordagens baseadas em engenharia de tecidos. Uma vez que células derivadas de tecidos são criados a partir de células e da matriz que produzem, eles inerentemente contêm densidades celulares muito maior, não contêm materiais exógenos, e pode ser feita inteiramente a partir de células humanas e proteínas. Enxertos vasculares feita a partir de células humanas podem atingir resistência mecânica substanciais na ausência de andaimes exógenas (por exemplo, pressões de ruptura 3400 mmHg em comparação a 1600 mmHg para veias safenas humanas) 12. Embora baseada em células de tecido vascular apresentam densidade celular melhorada e resistência mecânica, métodos de fabricação mais atuais (como &quot;folha-base engenharia&quot; 3,4,12 ou &quot;bioprinting&quot; 5,13) requerem períodos cultura extensa (&gt; 3 meses) ou equipamentos especializados para a construção do tecido 3D. O anel de tecido derivadas de células-method descrito aqui permite rápida celulares auto-montagem para formar robusto constrói tecido 3D dentro de um curto período de tempo e sem o uso de equipamentos especializados. Este protocolo detalha o procedimento foi desenvolvido para criar dois milímetros de diâmetro interior de ratos células derivadas do tecido do músculo liso anéis. No presente exemplo, os anéis de tecido foram cultivados por 7 dias (então cultivadas por mais sete dias para a fusão de anel e formação do tubo). No entanto, dois ratos mm (e humanos) anéis de células musculares lisas podem ser removidas dos poços e coesa o suficiente para o tratamento (por exemplo, transferir para tubos de silicone) tão cedo como um dia após a semeadura de células. Além disso, os anéis de tecido robusto com diferentes diâmetros internos (2, 4 e 6 mm) podem ser criadas com este método, simplesmente alterando o diâmetro post do molde de policarbonato original. 8 Nós também recentemente modificado o projeto de moldes de policarbonato para habilitar cinco dois milímetros poços semeadura para ser lançado em um único multi-câmara de agarose bem, o queusa menos PDMS e agarose, e se encaixa em um poço de uma placa de 6 poços (dados não mostrados). Alterações no diâmetro post, a largura da semeadura bem, o raio de curvatura da parte inferior arredondada, o número de poços de semeadura, ou a profundidade dos poços semeadura podem ser modificadas simplesmente mudando as especificações no arquivo CAD para CNC usinagem do molde de policarbonato. Finalmente, um molde de policarbonato único pode ser usado para fabricar um número ilimitado de modelos PDMS, e cada modelo PDMS podem ser limpos, autoclavados e reutilizados dezenas de vezes. Além de alterar o tamanho dos anéis de tecido, fizemos anéis de muitos tipos de células diferentes, incluindo: SMCs rato primária (Applications Cell, R354-05), humanos primários SMCs arterial coronariana (Lonza, CC-2583), humanas primárias fibroblastos dérmicos 11 (dom generoso de Pinos Dr. George, WPI Departamento de Engenharia Biomédica), fibroblastos de pulmão de rato (RFL-6, ATCC CCL-192), e as células-tronco mesenquimais (Lonza, PT-2501). Cada um dos tipos de célula destes agregados e contratos em todo o posts centro para formar anéis de tecido, embora a organização celular, composição ECM, e propriedades mecânicas das construções variam para cada tipo de célula. Os parâmetros de semeadura para cada tipo de célula deve ser empiricamente determinada com base no tamanho das células e sua capacidade de agregar. Portanto, enquanto este sistema de criação de anéis de células derivadas de tecido é extremamente versátil, o protocolo pode precisar de pequenos ajustes para a formação de tecido ideal com diferentes tipos de células. Geometria do anel de tecido facilita o carregamento fácil e avaliação das propriedades do material tecido por testes de tração uniaxial, conforme descrito. Há também precedentes substancial para o uso segmentos sangue anel navio para medir a contração vascular e função fisiológica. Estudos preliminares indicam que os anéis de células derivadas de tecido pode ser montado em um dispositivo myograph fio para a medição da capacidade de resposta farmacológica egeração de força contrátil (dados não mostrados). Ao todo, a capacidade de rapidamente fabricar anéis de auto-montagem de células para análise histológica, mecânicos, fisiológicos, bioquímicos e sugere uma nova e poderosa ferramenta que pode ser útil para a modelagem de estrutura do tecido vascular e função na saúde e na doença.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente / equipamentos </th><th> Companhia </th><th> Catalogo </th></tr><tr><td> Polidimetilsiloxano (PDMS) </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Lonza </td><td> 50000 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Mediatech </td><td> 15-017-CV </td></tr><tr><td> De soro fetal bovino (FBS) </td><td> PAA </td><td> A05-201 </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Mediatech </td><td> 30-002-CI </td></tr><tr><td> Sistema de imagem digital </td><td> TVP Corporação </td><td> Modelo 630 </td></tr><tr><td> Máquina de ensaio uniaxial </td><td> Instron </td><td> ElectroPuls E1000 </td></tr><tr><td> Software de detecção de borda </td><td> TVP Corporação </td><td> Quadro 2.4.6 </td></tr></tbody></table>

dirigido cellular automontagem para fabricar anéis cell-derived tecido para análise biomecânica e engenharia de tecidos

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Cada ano, centenas de milhares de pacientes submetidos a cirurgia de revascularização do miocárdio nos Estados Unidos 1. Aproximadamente um terço destes pacientes não têm adequado navios dadores autólogo devido à progressão da doença ou safra anterior. O objetivo da engenharia de tecidos vasculares é desenvolver uma fonte alternativa adequada para estas pontes. Além disso, o tecido vascular engenharia pode revelar-se útil como modelos vivos vascular para estudar doenças cardiovasculares. Várias abordagens promissoras para os vasos sanguíneos de engenharia têm sido exploradas, com muitos estudos recentes com foco no desenvolvimento e análise de métodos baseados em células. 2-5 Aqui, apresentamos um método para rapidamente auto-montar células em anéis de tecido 3D que pode ser usado em vitro para modelar os tecidos vasculares. Para fazer isso, suspensões de células musculares lisas são semeados no fundo redondo de anular agarose poços. As propriedades não-adesivo do agarose permitem ªcélulas e para resolver, agregar e contrato em torno de um posto no centro do poço para formar um anel de tecido coeso. 6,7 Estes anéis podem ser cultivadas por vários dias antes da colheita para a mecânica, análise fisiológica, bioquímica ou histológica. Nós mostramos que estes anéis de células derivadas de tecidos de rendimentos na resistência à tração 100-500 kPa final 8, que excede o valor reportado para outras construções de tecido vascular engenharia cultivadas por períodos semelhantes (&lt;kPa 30). 9,10 Nossos resultados demonstram que a célula robusta derivados de geração de anel vascular do tecido pode ser alcançada dentro de um curto período de tempo, e oferece a oportunidade para avaliação direta e quantitativa das contribuições de células e de células derivadas de matriz (MDL) para a estrutura do tecido vascular e função.

Este artigo descreve um método versátil para criar anéis de células derivadas do tecido celular por auto-montagem. Células musculares lisas semeadas em forma de anel-agarose agregado poços e contrato de forma robusta em três dimensões (3D) tecidos dentro de 7 dias. Anéis milímetro escala de tecido são conducentes a testes mecânicos e servem como blocos de construção para a montagem dos tecidos.

Dirigido Cellular Automontagem para Fabricar Anéis Cell-Derived Tecido para Análise Biomecânica e Engenharia de Tecidos

Todos os anos, centenas de milhares de pacientes são submetidos à cirurgia de revascularização do miocárdio nos Estados Unidos.1 Aproximadamente um terço desses pacientes apresenta...

O objetivo geral deste procedimento é criar construtos tridimensionais de tecidos a partir de células agregadas e matriz derivada de células, que podem ser utilizados para análise funcional. Isso é realizado primeiramente usinando um molde de policarbonato para criar poços anulares com fundo arredondado. Em seguida, o poli(dimetilsiloxano) ou PDMS é vazado sobre o molde de policarbonato para criar um molde-modelo.Em seguida, o molde de PDMS é utilizado para formar poços aros. O passo final é semear células nos poços aros para permitir que se agreguem e formem anéis teciduais coesos. Em última análise, este método pode ser empregado para alcançar a auto-organização celular e a engenharia de tecidos utilizando diferentes tipos celulares, e permite a análise da contribuição das células e da matriz extracelular derivada das células para a estrutura e função tecidual.A principal vantagem desta técnica em relação a outras abordagens de engenharia de tecidos é que podemos gerar construtos teciduais inteiramente a partir de células e da matriz extracelular que elas produzem de forma mais rápida do que a relatada anteriormente, e em um formato propício à análise mecânica. Comece usinando um pedaço de policarbonato com meio centímetro de espessura para criar 15 poços anulares com fundo arredondado e um diâmetro de pino central de dois milímetros. Limpe o molde de policarbonato para remover qualquer resíduo plástico gerado no processo de usinagem e deixe o molde secar. Em seguida, misture PDMS numa proporção de 10 para 1 de base agente de cura. Dessarve a solução para remover todas as bolhas de ar e, então, despeje-a no molde de policarbonato.Em seguida, desgaseifique a mistura sobre o molde novamente para remover quaisquer bolhas de ar remanescentes e cure o PDMS em uma estufa a 60 graus Celsius por quatro horas. Enquanto o PDMS estiver curando, dissolva 2%AROS em DMEM. Após a cura, remova cuidadosamente o molde de PDMS desprendendo-o lentamente do policarbonato, lave o PDMS com sabão e água e autóclave-o juntamente com a solução de DMEM e AROS. Agora, coloque o molde de PDMS autoclavado sobre uma superfície nivelada e preencha-o com AROS fundido, pipetando primeiro o AROS nos moldes dos postes centrais e, em seguida, pipetando o AROS no espaço ao redor deles.Deixe os aros solidificarem por cerca de 15 minutos. Em seguida, vire o molde para soltar os aros do PDMS. Corte os aros excedentes ao redor de cada poço e, então, coloque um poço com aro em cada poço de uma placa de 12 poços. Agora.Adicione meio de cultura celular ao redor da parte externa do poço aros sem cobrir o topo do poço. Em seguida, coloque as placas no incubador para permitir a equilibração enquanto as células são preparadas. Em 90% de confluência, tripsina, células musculares lisas aórticas de rato e ressus.Suspenda as células numa concentração de cinco vezes 10 elevado a seis células por mililitro. Em seguida, pipete 100 microlitros da suspensão celular re-suspensa em cada poço dos aros equilibrados. Utilize um movimento circular para aplicar as células em cada um dos poços.Coloque as placas no incubador para repousar sem perturbação durante 24 horas. Troque o meio a cada dois dias aspirando o meio ao redor do poço e, em seguida, repondo cada poço até que o molde de aros fique completamente submerso. Ao final do cultivo, preencha uma pequena placa de Petri com PBS.Remova cada anel de seu molde de aros deslizando-o sobre o topo do pino central. Coloque os anéis nas placas de Petri com PBS Center, com um anel sob o sistema de imagem digital. Utilize um software de detecção de bordas para medir a espessura do anel em quatro posições: superior, inferior, esquerda e direita ao longo de sua circunferência.Para realizar o ensaio de tração uniaxial. Monte uma amostra em forma de anel em dois grampos de fio fino. Estenda os grampos até que uma carga de ruptura de cinco milinewtons seja aplicada ao anel.Em seguida, insira a área da seção transversal calculada a partir das medições de espessura e registre o comprimento de referência. Realize oito ciclos prévios no anel entre a carga de ruptura e 50 quilopascal. Aplique tensão a uma taxa de 10 milímetros por minuto após o oitavo ciclo prévio, puxando até a falha a 10 milímetros por minuto.Para cada anel, meça a tensão máxima de tração e a deformação na ruptura e calcule o módulo tangente máximo a partir dos dados adquiridos. Além de estudos funcionais in vitro, esses anéis de células vivas também podem se fundir para formar tubos de tecido. Use tesoura cirúrgica para cortar as extremidades dos tubos de silicone em um ângulo, criando bordas biseladas, e depois autoclave os tubos de silicone enquanto os tubos estão sendo autoclavados.Encha uma placa de Petri com meio, transfira os suportes esterilizados de tubos de silicone personalizados para uma cabine de segurança biológica e coloque-os em uma placa de Petri vazia. Em seguida, remova os anéis dos poços de aros e coloque-os na placa de Petri cheia de meio. Coloque os tubos de silicone na mesma placa de Petri para umedecê-los antes do uso.Use uma pin&ccedil;a para colocar a ponta de um tubo de silicone no centro de um anel e deslize suavemente o anel para dentro do tubo de silicone. Deslize os an&eacute;is at&eacute; que entrem em contato uns com os outros, empurrando-os sucessivamente em ambas as dire&ccedil;&otilde;es ao longo do tubo. Uma vez montados os an&eacute;is, alinhe os tubos de silicone dentro dos suportes de policarbonato e parafuse as duas partes do suporte juntas.Adicione 55 mililitros de meio ao recipiente de Petri. Troque o meio a cada três dias durante todo o período de cultivo para remover os tubos de tecido. Primeiro, encha um recipiente de Petri com PBS.Em seguida, solte os tubos de silicone do suporte de policarbonato e use pinça para deslizar os tubos de tecido para fora do tubo de silicone e colocá-los na placa. Quando realizado corretamente, as células sedimentam no fundo das cavidades da placa AgraRO e contraem-se dentro de 24 horas após a semeadura, formando um anel de tecido ao redor do pino central na cavidade da placa AgraRO. Este é um gráfico representativo de uma curva tensão-deformação obtida a partir de um ensaio de tração uniaxial de um anel de tecido de dois milímetros gerado a partir de células musculares lisas de rato. A resistência máxima à tração, o módulo máximo de tração e os valores de deformação na ruptura são então utilizados para comparar as propriedades mecânicas de amostras de anéis de tecido cultivadas sob diferentes parâmetros de cultura.As propriedades mecânicas de anéis de tecido podem ser controladas mediante a alteração de parâmetros de cultura, incluindo o número de células semeadas, a duração da cultura, o meio de cultura e o tipo celular utilizado. Além das células musculares lisas de rato, células humanas primárias do músculo liso formam anéis de tecido com resistência à tração semelhante.As células-tronco mesenquimais humanas também se agregam para formar anéis, mas não eram suficientemente resistentes para testes mecânicos. Nosso sistema permite a fabricação de construtos de tecido engenheirado inteiramente a partir de células, bastando semear as células em nossas placas aros personalizadas. Uma vez que o molde inicial de policarbonato tenha sido usinado, podemos produzir um número ilimitado de moldes de PDMS, que então podem ser utilizados para fabricar os moldes, não sendo necessário nenhum equipamento adicional.O sistema é versátil, pois já utilizamos diversos tipos celulares diferentes no sistema para produzir anéis de tecido, e assim este sistema poderia ser potencialmente usado tanto para aplicações de engenharia de tecidos quanto para estudos in vitro das contribuições das células e da matriz extracelular para a estrutura e função tecidual.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Para a criação de estruturas altamente organizadas de tecidos complexos, deve-se montar vários tipos de materiais e células em um composto integrado.  Este projeto combinatório incorpora folhas de células em camadas específicas de órgãos com dois materiais distintos derivados biologicamente contendo uma forte base de matriz fibrosa e células endoteliais para aumentar a formação de novos vasos.

Engenharia de Tecidos: Construção de um multicelular 3D andaime para a entrega de camadas celulares Sheets

Neste trabalho, apresentamos uma técnica para a fabricação rápida de tecidos vasculares vivos por cultura direta de colágeno, células musculares lisas e células endoteliais. Além disso, um novo protocolo para a caracterização mecânica de tecidos vasculares projetados é descrito.

Engenharia 3D celularizados Colágeno Gel para Vascular Regeneração Tecidual

Este manuscrito descreve a criação de tecidos cardíacos projetados definidos usando expressão de marcadores de superfície e classificação celular. Os tecidos definidos podem então ser usados em um biorreator multitecido para investigar os mecanismos da terapia com células cardíacas, a fim de fornecer um sistema modelo funcional, mas controlado, do coração humano.

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Este protocolo descreve uma metodologia de bioimpressão usando um sistema de depósito robótico automatizado que incorpora pistas de orientação topográfica gravadas com a deposição precisa de uma biotinta de hidrogel contendo células. As células impressas são entregues diretamente aos recursos gravados e são capazes de sentir e orientar com eles.

Técnica Automated Robotic dispensação de Orientação da superfície e bioprinting de Células

vasos sanguíneos engenharia escaláveis ​​iria melhorar a aplicabilidade clínica. Usando guias impresso-3D facilmente consideráveis, anéis de músculo liso vascular foram criados e empilhados para uma forma tubular, formando um enxerto vascular. Enxertos podem ser dimensionados para atender toda a gama de dimensões das artérias coronárias humanas, simplesmente mudando o tamanho guia impresso-3D.

A escala do Engineered enxertos vasculares Usando 3D Impresso Guides and the Ring método de empilhamento

Este protocolo descreve uma plataforma para a fabricação de anéis de tecido Self montado em tamanhos variáveis, usando um molde de plástico personalizado 3D-impresso. PDMS negativos são curados em molde 3D-impresso; Então a agarose é convertido nos negativos PDMS curados. As células são semeadas em poços de agarose resultante onde eles agregam em anéis de tecido.

Fabricação de poços de Agarose personalizado para a propagação de células e tecido anel Self-assembly usando moldes 3D-impresso

Aqui apresentamos um método rápido, fácil e baixo custo para a fabricação de moldes de polidimetilsiloxano personalizado que podem ser usados para a produção de tecidos de engenharia baseada em hidrogel com geometrias complexas. Adicionalmente descrevemos os resultados de avaliações mecânicas e histológicos realizados na engenharia tecidos cardíacos produzidos utilizando esta técnica.

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Manipulando células vivas para construir estável montagem celular 3D sem andaime Artificial

Apresentado aqui é um protocolo para gerar tecidos conjuntivos projetados para uma cultura paralela de 48 tecidos em uma placa multi-bem com polos duplos, adequado para estudos mecanísticos, modelagem de doenças e aplicações de rastreamento. O protocolo é compatível com fibroblastos de diferentes órgãos e espécies e é exemplificado aqui com fibroblastos cardíacos primários humanos.

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Aqui, demonstramos um modelo organoide de três etapas (expansão bidimensional [2D], estimulação 2D, maturação tridimensional [3D]) oferecendo uma ferramenta promissora para pesquisa fundamental de tendões e um potencial método livre de andaimes para engenharia de tecidos tendinosos.

Demonstração de Cultura de Folha de Células Auto-Montadas e Geração Manual de um Organoide 3D Semelhante a Tendão/Ligamento usando Fibroblastos Dérmicos Humanos

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