Dirigido Cellular Automontagem para Fabricar Anéis Cell-Derived Tecido para Análise Biomecânica e Engenharia de Tecidos

O objetivo geral deste procedimento é criar construtos teciduais tridimensionais a partir de células agregadas e matriz derivada de células, que podem ser utilizados para análise funcional. Isso é realizado inicialmente mediante usinagem de um molde de policarbonato para criar poços anulares com fundo arredondado. Em seguida, o poli(dimetilsiloxano) ou PDMS é vazado sobre o molde de policarbonato para criar um molde-modelo.

Em seguida, o molde de PDMS é utilizado para formar poços aros. O passo final é semear células nos poços aros para permitir que se agreguem e formem anéis teciduais coesos. Em última análise, este método pode ser usado para alcançar a auto-organização celular e a engenharia de tecidos utilizando diferentes tipos celulares, e permite a análise da contribuição das células e da matriz extracelular derivada das células para a estrutura e função do tecido.

A principal vantagem desta técnica em relação a outras abordagens de engenharia de tecidos é que podemos gerar construtos teciduais inteiramente a partir de células e da matriz extracelular que elas produzem de forma mais rápida do que a relatada anteriormente, e em um formato propício à análise mecânica. Comece usinando um pedaço de policarbonato com meio centímetro de espessura para criar 15 poços anulares com fundo arredondado e um diâmetro de pino central de dois milímetros. Limpe o molde de policarbonato para remover qualquer resíduo plástico gerado no processo de usinagem e deixe o molde secar. Em seguida, misture PDMS numa proporção de 10 para 1 de base agente de cura. Dessarve a solução para remover todas as bolhas de ar e, então, despeje-a no molde de policarbonato.

Em seguida, desgaseifique a mistura novamente no molde para remover quaisquer bolhas de ar remanescentes e cure o PDMS em uma estufa a 60 graus Celsius por quatro horas. Enquanto o PDMS estiver curando, dissolva 2%AROS em DMEM. Após a cura, remova cuidadosamente o molde de PDMS desprendendo-o lentamente do policarbonato, lave o PDMS com sabão e água e autóclave-o juntamente com a solução de DMEM e AROS. Agora, coloque o molde de PDMS autóclavado sobre uma superfície nivelada e preencha-o com AROS fundido, pipetando primeiro o AROS nos moldes dos postes centrais e, em seguida, pipetando o AROS no espaço ao redor deles.

Deixe os aros solidificarem por cerca de 15 minutos. Em seguida, vire o molde para soltar os aros do PDMS. Corte os aros excedentes ao redor de cada poço e, depois, coloque um poço de aros em cada poço de uma placa de 12 poços. Agora.

Adicione meio de cultura celular ao redor da parte externa do poço aros sem cobrir o topo do poço. Em seguida, coloque as placas no incubador para permitir a equilibração enquanto as células são preparadas. Em 90% de confluência, tripsina, células musculares lisas aórticas de rato e ressus.

Suspenda as células em uma concentração de cinco vezes 10 elevado a seis células por mililitro. Em seguida, pipete 100 microlitros da suspensão celular re-suspensa em cada poço dos aros equilibrados. Utilize um movimento circular para aplicar as células em cada um dos poços.

Coloque as placas no incubador para repousarem sem perturbação durante 24 horas. Troque o meio a cada dois dias aspirando o meio ao redor do poço e, em seguida, repondo cada poço até que o molde de aros fique completamente submerso. Ao final do cultivo, preencha uma pequena placa de Petri com PBS.

Remova cada anel de seu molde de aros deslizando-o sobre o topo do pino central. Coloque os anéis nas placas de Petri com PBS Center, com um anel sob o sistema de imagem digital. Utilize um software de detecção de bordas para medir a espessura do anel em quatro posições: superior, inferior, esquerda e direita ao longo de sua circunferência.

Para realizar o ensaio de tração uniaxial, monte uma amostra em forma de anel em dois grampos de arame fino. Estenda os grampos até que uma carga de ruptura de cinco milinewtons seja aplicada ao anel.

Em seguida, insira a área da seção transversal calculada a partir das medições de espessura e registre o comprimento de referência. Realize oito ciclos prévios no anel entre a carga de ruptura e 50 quilopascal. Aplique tensão a uma taxa de 10 milímetros por minuto após o oitavo ciclo prévio, puxando até a falha a 10 milímetros por minuto.

Para cada anel, meça a tensão máxima de tração e a deformação na ruptura e calcule o módulo tangente máximo a partir dos dados adquiridos. Além de estudos funcionais in vitro, esses anéis de células vivas também podem se fundir para formar tubos de tecido. Use tesoura cirúrgica para cortar as extremidades dos tubos de silicone em um ângulo, criando bordas biseladas, e então autoclave os tubos de silicone enquanto os tubos estão sendo autoclavados.

Encha uma placa de Petri com meio, transfira os suportes esterilizados de tubos de silicone personalizados para uma cabine de segurança biológica e coloque-os em uma placa de Petri vazia. Em seguida, remova os anéis dos poços de aros e coloque-os na placa de Petri cheia de meio. Coloque os tubos de silicone na mesma placa de Petri para umedecê-los antes do uso.

Use uma pinça para colocar a ponta de um tubo de silicone no centro de um anel e deslize suavemente o anel para dentro do tubo de silicone. Deslize os anéis até que entrem em contato uns com os outros, empurrando-os suavemente sucessivamente em ambas as direções ao longo do tubo. Depois que os anéis forem montados, alinhe os tubos de silicone dentro dos suportes de policarbonato e parafuse as duas partes do suporte juntas.

Adicione 55 mililitros de meio ao disco de Petri. Troque o meio a cada três dias durante todo o período de cultura para remover os tubos de tecido. Primeiro, encha um disco de Petri com PBS.

Em seguida, solte os tubos de silicone do suporte de policarbonato e use pinças para deslizar os tubos de tecido para fora do tubo de silicone e colocá-los na placa. Quando realizado corretamente, as células se depositam no fundo das cavidades do aros e contraem-se no prazo de 24 horas após a colocação, formando um anel de tecido ao redor do pino central na cavidade do Agarro. Este é um gráfico representativo de uma curva tensão-deformação obtida a partir de um ensaio de tração uniaxial de um anel de tecido de dois milímetros gerado a partir de células musculares lisas de rato. A resistência máxima à tração, o módulo máximo de tração e os valores de deformação na ruptura são então utilizados para comparar as propriedades mecânicas de amostras de anéis de tecido cultivadas sob diferentes parâmetros de cultura.

As propriedades mecânicas de anéis de tecido podem ser controladas mediante a alteração de parâmetros de cultura, incluindo o número de células semeadas, a duração da cultura, o meio de cultura e o tipo celular utilizado. Além das células musculares lisas de rato, células humanas primárias do músculo liso formam anéis de tecido com resistência à tração semelhante.

As células-tronco mesenquimais humanas também se agregam para formar anéis, mas não foram suficientemente resistentes para testes mecânicos. Nosso sistema permite a fabricação de construtos de tecido engenheirado inteiramente a partir de células, bastando semear as células em nossas placas aros personalizadas. Uma vez que o molde inicial de policarbonato tenha sido usinado, podemos produzir um número ilimitado de moldes de PDMS que, então, podem ser utilizados para fabricar os moldes, não sendo necessário nenhum equipamento adicional.

O sistema é versátil, pois utilizamos diversos tipos celulares diferentes no sistema para produzir anéis de tecido, e assim este sistema poderia ser potencialmente usado tanto para aplicações em engenharia de tecidos quanto para estudos in vitro das contribuições das células e da matriz extracelular para a estrutura e função tecidual.