Dirigido Cellular Automontagem para Fabricar Anéis Cell-Derived Tecido para Análise Biomecânica e Engenharia de Tecidos

O objetivo geral deste procedimento é criar construções de tecido 3D a partir de células agregadas e matrizes derivadas de células que podem ser usadas para análise funcional. Isso é feito primeiro moendo um molde de policarbonato para criar poços anulares de fundo redondo. Em seguida, o polidimetil Sloane ou PDMS é fundido no molde de policarbonato para criar um modelo.

Em seguida, o modelo PDMS é usado para formar poços de aro. A etapa final é semear células em poços aros para permitir que elas se agreguem e formem anéis de tecido coesos. Em última análise, este método pode ser usado para alcançar a automontagem celular e a engenharia de tecidos usando diferentes tipos de células e permite a análise da contribuição de células e matriz extracelular derivada de células para a estrutura e função do tecido.

A principal vantagem dessa técnica sobre outras abordagens de engenharia de tecidos é que podemos gerar construções de tecido inteiramente a partir de células e da matriz extracelular que elas produzem mais rapidamente do que o relatado anteriormente, e em um formato propício à análise mecânica, Comece moendo um pedaço de policarbonato de meia polegada de espessura para criar 15 poços anulares de fundo redondo com um diâmetro de poste central de dois milímetros. Limpe o molde de policarbonato para remover quaisquer detritos plásticos gerados pelo processo de fresagem e deixe o molde secar. Em seguida, misture o PDMS em uma proporção de 10 para um de agente de cura de base Desgaseifique a solução para remover todas as bolhas de ar e, em seguida, despeje-a no molde de policarbonato.

Em seguida, desgaseifique a mistura no molde novamente para remover quaisquer bolhas de ar restantes e cure o PDMS em um forno a 60 graus Celsius por quatro horas enquanto o PDMS está curando a dissolução. 2% AROS em DMEM, uma vez curado, remova cuidadosamente o gabarito PDMS retirando-o lentamente do policarbonato, lave o PDMS com água e sabão e autoclave-o junto com a solução DMEM AROS. Agora coloque o gabarito PDMS de autoclave em uma superfície nivelada e preencha-o com aros fundido pipetando aros primeiro em cada um dos moldes do poste central e, em seguida, pipetando aros no espaço ao redor deles.

Deixe o aros solidificar por cerca de 15 minutos. Em seguida, inverta o molde para liberar o aros do PDMS. Corte o excesso de aros ao redor de cada um dos poços e, em seguida, coloque um poço de aros em cada poço de uma placa de 12 poços. Agora.

Adicione meios de cultura de células ao redor da parte externa do poço aros sem cobrir o topo do poço. Em seguida, coloque as placas na incubadora para permitir que elas se equilibrem enquanto as células são preparadas. A 90% de tripsina de confluência, células musculares lisas aórticas de rato e resus.

Suspenda as células em uma concentração de cinco vezes 10 elevado a seis células por mililitro. Em seguida, pipete 100 microlitros da suspensão de células ressuspensas em cada um dos poços aros equilibrados. Usando um movimento circular para aplicar as células em cada um dos poços.

Coloque as placas na incubadora para que não sejam perturbadas por 24 horas. Troque o meio a cada dois dias, aspirando o meio ao redor do poço e, em seguida, reabastecendo cada poço até que o molde aros esteja completamente submerso. E na conclusão da cultura, encha uma pequena placa de Petri com PBS.

Remova cada anel de seu molde aros deslizando-o sobre a parte superior do poste central. Coloque os anéis nas placas de Petri com PBS Center, um anel sob o sistema de imagem digital. Use o software de detecção de borda para medir a espessura do anel em quatro posições, superior, inferior, esquerda e direita em torno de sua circunferência.

Para realizar testes de tração uniaxiais. Monte uma amostra de anel em duas alças de arame fino. Estenda as alças até que uma carga de rasgo de cinco mili Newton seja aplicada ao anel.

Em seguida, insira a área da seção transversal calculada a partir das medições de espessura e registre o comprimento do medidor. Pré-ciclo do anel oito vezes entre a carga lacrimal e 50 quilo pascal. Estresse a uma taxa de 10 milímetros por minuto após o oitavo pré-ciclo puxado para a falha a 10 milímetros por minuto.

Para cada anel, meça a tensão de tração final e a deformação de ruptura e calcule o módulo tangente máximo a partir dos dados adquiridos. Além de estudos funcionais in vitro, esses anéis de células vivas também podem se fundir para formar tubos de tecido. Use uma tesoura cirúrgica para cortar as extremidades dos tubos de silicone em um ângulo para criar bordas chanfradas e, em seguida, autoclave os tubos de silicone enquanto os tubos estão sendo autoclavados.

Encha uma placa de Petri com suportes de tubos de silicone personalizados esterilizados por transferência de mídia em um gabinete de biossegurança e coloque em uma placa de Petri vazia. Em seguida, remova os anéis dos poços de aros e coloque-os na placa de Petri cheia de mídia. Coloque os tubos de silicone na mesma placa de Petri para molhá-los antes de usar.

Use uma pinça para colocar a ponta de um tubo de silicone no centro de um anel e deslize suavemente o anel no tubo de silicone. Deslize os anéis em contato um com o outro, empurrando-os suavemente sucessivamente em ambas as direções ao longo do tubo. Depois que os anéis forem montados, alinhe os tubos de silicone dentro dos suportes de policarbonato e aparafuse as duas partes do suporte.

Adicione 55 mililitros de mídia à placa de Petri. Troque o meio a cada três dias durante a cultura para remover os tubos de tecido. Primeiro, encha uma placa de Petri com PBS.

Em seguida, solte os tubos de silicone do suporte de policarbonato e use uma pinça para deslizar os tubos de tecido para fora do tubo de silicone e para dentro do prato. Quando executadas corretamente, as células se depositam no fundo dos poços de Aros e se contraem dentro de 24 horas após o assentamento para gerar um anel de tecido ao redor do poste central no poço de Agarra, este é um gráfico representativo de uma curva de tensão de deformação obtida a partir de um teste de tração uniaxial de um anel de tecido de dois milímetros gerado a partir de células musculares lisas de ratos. A resistência à tração final, o módulo de tração máximo e os valores de deformação de ruptura são então usados para comparar as propriedades mecânicas de amostras de anéis de tecido cultivadas sob diferentes parâmetros de cultura.

As propriedades mecânicas dos anéis de tecido podem ser controladas alterando os parâmetros de cultura, incluindo o número de assentos celulares, o comprimento da cultura, o meio de cultura e o tipo de célula usado. Além de células musculares lisas de ratos. As células musculares primárias e lisas humanas formam anéis de tecido com resistência à tração semelhante.

As células-tronco mesenquimais humanas também se agregam para formar anéis, mas não eram fortes o suficiente para testes mecânicos. Nosso sistema permite a fabricação de construções de tecidos projetados inteiramente a partir de células simplesmente semeando células em nossos poços aros personalizados. Uma vez que o molde de policarbonato inicial tenha sido usinado, podemos fazer um número ilimitado de modelos PDMS que podem ser usados para fazer os moldes, portanto, nenhum equipamento adicional é necessário.

O sistema é versátil, pois usamos vários tipos de células diferentes no sistema para fazer anéis de tecido e, portanto, esse sistema pode ser usado potencialmente para aplicações de engenharia de tecidos, bem como estudos in vitro das contribuições de células e matriz extracelular para a estrutura e função do tecido.