Um sistema microfluídico com padrões de superfície para investigar bolha de cavitação (s) Interação -cell e os Efeitos Biológicos resultante no nível de célula única

O objetivo geral deste procedimento experimental é investigar os bioefeitos induzidos por cavitação no confinamento microfluídico usando padrões de superfície para controlar com precisão a geração de bolhas em tandem e a localização e forma das células-alvo individuais. Este sistema microfluídico permite a experimentação dessas bolhas e células de cavitação de trânsito que são relevantes para a publicação terapêutica e sonora e operação sonora. A principal vantagem desta técnica vem de melhorar a precisão da padronização da superfície.

Ele nos permite estudar os bioefeitos de células individuais e é uma alta carga de fluxo de interação confiável bolha-bolha. A demonstração visual dos procedimentos é crítica, pois o padrão de superfície e a preparação da célula nas etapas do chip são complexos, envolvendo várias técnicas e dicas. Execute todos os procedimentos de microfabricação em uma sala limpa enquanto estiver vestindo um traje de sala limpa.

Projete a área de cada ponto dourado dentro de 25 a 30 mícrons quadrados, de modo que seja grande o suficiente para absorver a energia do laser para a geração de bolhas, mas pequena o suficiente para evitar que células individuais adiram a ela. Limpe a lâmina de vidro em uma coifa química de acordo com o protocolo de texto e, em seguida, prossiga para a coifa de revestimento giratório. Programe o codificador de rotação para acelerar até 1000 RPM em dois segundos e manter essa velocidade por cinco segundos, depois aumente para 3000 RPM em três segundos e mantenha essa velocidade por 30 segundos.

Em seguida, prenda a lâmina de vidro ao codificador de rotação usando o vácuo. Em seguida, cubra o slide com P20 e inicie o ciclo de centrifugação. Em seguida, aplique a fotorresistência negativa NFR usando o mesmo ciclo.

Agora, asse a lâmina em uma chapa quente a 95 graus Celsius por 60 segundos. Depois de resfriado à temperatura ambiente, execute a fotolitografia. Monte a máscara cromada no alinhador da máscara e certifique-se de que o lado do padrão esteja voltado para baixo em direção ao slide.

Em seguida, defina a receita da fotolitografia para o modo de exposição forte com nove segundos de exposição UV e alinhe o substrato de vidro com a máscara. Após a exposição aos raios UV, asse a lâmina a 95 graus Celsius por um minuto e deixe esfriar como antes. Para desenvolver o padrão na lâmina, coloque-a em solução reveladora por 60 segundos, depois lave a lâmina com água destilada e seque-a com gás nitrogênio.

Depois de confirmar o padrão por inspeção microscópica, asse a lâmina a 120 graus Celsius por cinco minutos e deixe esfriar até a temperatura ambiente. Agora, limpe a lâmina com plasma na máquina de gravação de íons reativos por 90 segundos a 500 tor e 100 watts. Usando um evaporador de feixe E, cole a amostra no suporte da placa.

Programe a máquina para depositar uma camada de titânio de 5 nanômetros, seguida por uma camada de ouro de 15 nanômetros. Quando essa posição estiver concluída, ventile a máquina. Em seguida, mergulhe a lâmina durante a noite em um béquer de solvente removedor de fotorresistente para remover o ouro que repousa sobre a resistência NFR.

No dia seguinte, lave a lâmina com acetona, seguida de IPA e depois seque com nitrogênio. Enxágue a lâmina com água DI e seque-a novamente com nitrogênio. Agora, aqueça a lâmina a 115 graus Celsius por cinco minutos.

Em seguida, limpe a lâmina de padrão de pontos dourados usando um asher de plasma de oxigênio a 100 watts por 90 segundos. Defina a área de cada ilha codificada em fibronectina entre 700 a 900 mícrons quadrados para facilitar a disseminação adequada de células hela em uma região quadrada, minimizando as chances de agregação de várias células na ilha. A fabricação é muito parecida com a do padrão de ouro.

Gire o código do slide como antes usando o fotorresistente positivo S18 e asse na codificação a 115 graus Celsius. Em seguida, faça fotolitografia, alinhando as marcas da máscara com as do substrato. Verifique o padrão na parte central para confirmar o ângulo correto e ajuste a distância do espaçador dos pontos dourados ao padrão H.

Execute a exposição UV por nove segundos sem pós-cozimento. A próxima diferença é que a etapa de desenvolvimento leva apenas 45 segundos. Para o ataque de íons reativos, defina os parímetros para 500 para 100 watts e 90 segundos.

Em seguida, aplique uma gota de solução de passivação de pinos PLLG em um pedaço de filme de parafina e coloque a solução no lado padrão da lâmina. Evite prender bolhas. Após 45 minutos, remova o slide do filme.

Enxágue a lâmina com água DI e seque-a com nitrogênio. Em seguida, mergulhe a lâmina consecutivamente no removedor fotorresistente 1165. Em seguida, 50 por cento 1165 em água DI.

Então é só DI água. Durante cada banho, agite a solução em um banho de ultrassom por 90 segundos. Agora, seque a lâmina em uma placa quente, sele-a em um dessecador e guarde-a a 4 graus Celsius.

Monte os slides em um chip de microcanal conforme descrito no protocolo de texto. Preste muita atenção para proteger a área padronizada do substrato de vidro com a pequena placa PDMS antes de usar a gravação de íons reativos para remover o pino PLLG da área periférica. Recupere o vidro estampado da máquina RIE e remova a pequena placa PDMS.

Depois de tratar o PDMS de microcanal com uma dose reduzida de plasma de oxigênio, alinhe-o ao substrato de vidro padronizado sob um estereoscópio. Coloque o PDMS de microcanal e o substrato de vidro estampado em contato conforme. Agora, prossiga para usar o chip.

Primeiro, prepare o chip fluindo PBS pelo microcanal por 30 minutos a um microlitro por minuto. Em seguida, infundir o chip com solução de fibronectina por 45 minutos na mesma taxa de fluxo. Enquanto espera, prepare as células a cinco milhões de células por mililitro.

O estado saudável e a alta confluência são essenciais para este procedimento. Posteriormente, substitua a solução que flui através do chip por PBS e aumente a vazão para dez microlitros por minuto. Deixe o PBS fluir por cinco minutos.

Em seguida, injete as células preparadas no chip com uma seringa. Quando uma gota tiver saído da tubulação, pare a injeção e prenda a saída. Em seguida, coloque o chip em uma incubadora por 30 minutos.

Posteriormente, solte a saída e lave o chip com meio de cultura de células a dez microlitros por minuto por cinco minutos. Após cinco minutos, diminua o fluxo para 0,75 microlitros por minuto e transfira o chip e a bomba para uma incubadora por duas horas. Após duas horas, prossiga com a geração de bolhas em tandem visualizando o chip sob um microscópio invertido com dois lasers NDI pulsados em controles de tempo direcionados ao padrão de pontos dourados e com uma câmera de alta velocidade pronta para capturar os resultados.

Para bolhas de 50 mícrons, defina o atraso entre os dois lasers para 2,5 microssegundos e defina sua potência para dez microjoules. Em seguida, sincronize a gravação da câmera de alta velocidade com os lasers e faça registros a dois milhões de quadros por segundo com exposições de 200 nanossegundos. Assim, a dinâmica da expansão da bolha, a interação bolha-bolha de colapso e a formação de jatos são registradas.

As interações bolha-bolha e uma variedade de bioefeitos induzidos por cavitação foram estudados no nível de célula única usando a técnica descrita, como as interações transitórias de bolhas em tandem com a formação do jato, a visualização do campo de fluxo resultante e o cálculo da velocidade do jato. O fluxo de jato direcional ao redor da bolha tandem é de cerca de dez metros por segundo, tem cerca de dez mícrons de largura e, portanto, é capaz de produzir um gradiente de estresse e estresse impulsivo e localizado nas células-alvo próximas. A deformação da membrana celular induzida por bolhas em tandem também foi estudada.

A deformação e a recuperação da membrana são destacadas pelo deslocamento de grânulos funcionalizados presos à borda dianteira da membrana celular. A partir das coordenadas de uma tríade de contas adjacentes, a deformação da área local foi calculada. Este esquema mostra a mudança máxima de área em diferentes locais na superfície da célula.

A borda de ataque é principalmente esticada, enquanto a borda de fuga ou os lados laterais da célula são comprimidos, indicando heterogeneidade e deformação celular produzida pelo fluxo de jato induzido por bolha em tandem. A variação temporal da deformação da área na borda de ataque da célula é composta por algumas oscilações rápidas seguidas por um alongamento grande e sustentado por cerca de 100 microssegundos e uma recuperação gradual subsequente em uma escala de tempo de vários milissegundos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fazer uma interação bolha controlável para estudar os bioefeitos de células individuais com forma e localização controladas a partir do padrão de superfície.

Após este procedimento, outras medidas, como o afinamento do citoesqueleto e a imagem conjugal, podem ser realizadas para estudar o rearranjo do citoesqueleto celular do tratamento com bolhas em tandem. Após seu desenvolvimento, essa técnica abrirá caminho para pesquisadores no campo do ultrassom subprótico explorarem os bioefeitos induzidos por captação no nível de célula única. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter uma boa confluência celular e condição para o sucesso durante o padrão celular.

Não se esqueça de que trabalhar com produtos químicos e lasers para salas limpas pode ser extremamente perigoso e precauções como o uso de luvas e óculos de laser devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.