Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
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Il lentivirus è un retrovirus che contiene materiale genetico RNA. Questo virus fornisce un metodo efficiente e stabile per introdurre i transgeni nelle linee cellulari tumorali. Inizia aggiungendo neuraminidasi a un tubo contenente Lentivirus che esprime proteine fluorescenti verdi, o GFP. Mantenere il tubo a 37 gradi Celsius per un'ora per aumentare l'efficienza di legame del virus.
Quindi, centrifugare un tubo contenente sospensione delle cellule tumorali per formare un pellet. Aggiungere mezzi mammosfera contenenti polibreno per rimorsi le cellule. Il policrolo è un polimero cationico che aumenta l'efficienza delle infezioni lentivirali. Ora placca il numero ottimale di cellule tumorali per pozzo in una piastra di coltura tissutale a sei pozzi. Aggiungere la quantità richiesta di Lentivirus in ogni pozzo della piastra di coltura.
Ruotare la piastra per mescolare il contenuto e mantenere a 37 gradi Celsius per 96 ore con una fornitura continua di anidride carbonica. Il Lentivirus entra nella cellula e rilascia RNA. La transcriptasi inversa virale converte l'RNA in DNA a doppio filamento che si integra nel genoma ospite. Posizionare la piastra sotto un microscopio fluorescente e monitorare le celle per una trasduzione riuscita. Le cellule trasdutite fluoresce a causa dell'espressione GFP.
Nel protocollo di esempio, eseguiremo la trasduzione di cellule tumorali dissociate da PDX con vettori lentivirali.
Per trasdurre le cellule tumorali, centrifugare le cellule isolate per la resuspensione in due millilitri di mezzo mammosfera. Dopo il conteggio, centrifugare nuovamente le cellule e rimorsi il pellet in due millilitri di mezzo mammosfera, integrati con 20 microlitri di polibrene. Successivamente, placca 2 per 10 alla quinta cellule tumorali vitali per pozzo in una piastra di coltura tissutale ultra bassa e particelle lentivirali alle cellule a una molteplicità di infezione di 10.
Ruotare la piastra per mescolare il virus con le cellule e incubare le co-colture a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per un massimo di 96 ore, aggiungendo 500 microlitri di mezzo mammosfera fresco dopo le prime 24 ore. Quando almeno il 10% delle cellule è positivo alla GFP, trasferire le cellule trasdotte da almeno un pozzo in un tubo conico da 15 millilitri su ghiaccio e lavare il pozzo con un millilitro di mezzo mammosfera.
Mettere in comune il lavaggio con le cellule e centrifugare le cellule tumorali in 10 millilitri di HBSS più HEPES. Infine, rimostrare le cellule in 50 microlitri di estratto di matrice basale sul ghiaccio e caricare le cellule incorporate in una siringa per insulina da 0,5 millilitri per la reimpianto.
