Rotulagem de cancro da mama xenoenxertos derivados do paciente com rastreáveis ​​Repórteres para o crescimento de tumores e metástases Estudos

O objetivo geral deste protocolo de transdução é introduzir de forma estável genes repórteres em xenoenxertos derivados de pacientes, ou PDXs, para facilitar seu uso em modelos experimentais e espontâneos de metástase. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na pesquisa do câncer, como a extensão da metástase excutânea de xenoenxertos derivados de pacientes. A principal vantagem dessa técnica é que o PDX marcado pode ser rastreado, usando imagens in vivo, facilitando a avaliação de metástases específicas e organizadas sem a extensa análise histológica post-mortem.

Demonstrando este protocolo estará Jessica Finlay-Schultz, uma pós-doutoranda, que rotineiramente aplica este protocolo para a rotulagem de xenoenxertos derivados de pacientes com câncer de mama. Usando a técnica asséptica, comece usando um bisturi para cortar a pele ao redor do tumor. Em seguida, puxe a pele com uma pinça e use um bisturi limpo para separar a pele do tumor.

Quando o tumor estiver completamente exposto, use um conjunto limpo de pinças e bisturi para transferir o tecido para cinco mililitros de meio de lavagem no gelo. Em seguida, descarte o meio e lave o tumor duas vezes com 10 mililitros de HBSS, suplementado com HEPES. Coloque o tumor lavado em uma placa de cultura de tecidos estéril e pré-pesada de 60 centímetros e pese a placa para estimar a massa do tumor.

Usando um bisturi, corte o tumor ao meio. Em seguida, corte um disco de três milímetros de uma das metades e coloque o disco em formol a 10% por 24 horas. Adicione 200 microlitros de HBSS com HEPES ao resto do tumor e use uma pinça e um bisturi limpo para picar o tecido nos menores pedaços possíveis.

Transfira os fragmentos para um tubo cônico estéril de 50 mililitros e adicione pelo menos um mililitro de tampão de digestão, suplementado com antimicóticos e antibióticos por 100 miligramas de tumor. Após três horas a 30 graus Celsius e rotação de 125 a 200 por minuto, adicione 35 mililitros de meio de lavagem para interromper a digestão e filtre a pasta de tecido resultante através de uma malha de náilon de 70 mícrons em um novo tubo cônico de 50 mililitros, para remover qualquer tecido não digerido. Colete as células por centrifugação e ressuspenda o pellet em um mililitro de tampão de lise de glóbulos vermelhos, por cinco minutos em temperatura ambiente.

No final da lise, restaure a tonicidade com 10 mililitros de tampão de lavagem e coe as células através de um filtro de 40 mícrons para remover quaisquer grumos. Centrifugue as células novamente e ressuspenda o pellet em cinco mililitros de tampão de lavagem no gelo. Em seguida, conte o número de células viáveis pela exclusão do azul de tripano.

Para enriquecer as células cancerígenas epiteliais humanas usando linhagem mais depleção de células Mel, transfira até uma vez dez para as sétimas células em um novo tubo de polipropileno de cinco mililitros e adicione dois mililitros de tampão de enriquecimento epitelial às células. Colete as células por centrifugação e use uma pipeta para remover completamente o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda o pellet em 40 microlitros de tampão de enriquecimento epitelial gelado e adicione 10 microlitros de coquetel de anticorpos de biotina por um vezes dez às sétimas células.

Misturar por pipetagem suave e incubar a solução celular durante 10 minutos a quatro graus Celsius. No final da incubação, misture as células com 30 microlitros de tampão de enriquecimento epitelial por uma vezes dez elevado à sétima célula. Seguido pela adição de 20 microlitros de microesferas de antibiotina com mistura suave.

Após 15 minutos a quatro graus Celsius, lave as células em três mililitros de tampão de enriquecimento epitelial frio e aspire cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em 500 microlitros de tampão de enriquecimento epitelial no gelo e coloque uma coluna em um separador magnético. Enxágue a coluna com 0,5 mililitros de tampão de enriquecimento epitelial.

E coloque um novo tubo de coleta de polipropileno sob a coluna. Em seguida, adicione lentamente as células rotuladas sobre a coluna. Coleta do enriquecimento, não marcado, linhagem negativa, afluente da fração de células tumorais, seguido de três enxágues de coluna com 500 microlitros de tampão de enriquecimento epitelial fresco.

Para transduzir as células tumorais, centrifugue as células isoladas para ressuspensão em dois mililitros de meio de mamosfera. Após a contagem, centrifugue as células novamente e ressuspenda o pellet em 2 mililitros de meio de mamosfera, suplementado com 20 microlitros de polibreno. Em seguida, coloque duas vezes dez elevado a cinco células tumorais viáveis por poço em uma placa de cultura de tecidos de seis poços de adesão ultrabaixa e adicione partículas lentivirais às células em uma multiplicidade de infecção de 10.

Gire a placa para misturar o vírus com as células. E incube as co-culturas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por até 96 horas. Adição de 500 microlitros de meio fresco da mamosfera após as primeiras 24 horas.

Quando pelo menos 10% das células forem positivas para GFP, transfira as células transduzidas de pelo menos um poço para um tubo cônico de 15 mililitros no gelo e lave o poço com um mililitro de meio de mamosfera. Junte a lavagem com as células e centrifugue as células tumorais em 10 mililitros de HBSS mais HEPES. Finalmente, ressuspenda as células em 50 microlitros de extrato de matriz basal no gelo.

E carregue as células embutidas em uma seringa de insulina de 0,5 mililitro para reimplantação. Alguns vetores de frascos de alto título expressam um marcador fluorescente que permite estimar a eficiência da transdução in vitro, já 24 horas após a infecção. Para a maioria dos PDXs, a expressão de GFP será atrasada até 72 horas após a infecção.

Nesse ponto, a formação de agregados celulares é comumente observada. Após a suspensão da matriz extracelular e reimplantação, as células tumorais marcadas regeneram tumores que podem ser rastreados usando bioluminescência ou fluorescência. Um PDX marcado com sucesso será quase 100% positivo para GFP na primeira geração após a transdução e permanecerá assim nas passagens subsequentes.

No entanto, alguns PDXs exibirão uma distribuição irregular de células positivas para GFP, indicando uma transdução in vitro abaixo do ideal. A coloração imuno-histoquímica do tecido tumoral revela que a expressão de marcadores críticos, como o receptor do fator de crescimento epidérmico e as pan-citoqueratinas, são conservadas mesmo após várias passagens e reimplantes. Modelos experimentais de metástase fornecem uma alternativa para estudar o tropismo de órgãos e as etapas de colonização de órgãos na cascata metastática.

De fato, um PDX transduzido injetado em 2,5 vezes dez para a quinta células por camundongo, forma metástases no fígado que são facilmente identificadas com imagens de luciferase in vivo. E nos pulmões que podem ser visualizados por microscopia de fluorescência ex vivo. Uma vez dominado, a dissociação e rotulagem dos PDXs leva cerca de 4 horas.

A expansão real do tumor pode levar de 8 a 12 semanas, dependendo do tumor e do sistema usado. Ao tentar este procedimento, é importante usar um vírus de alto título com um gene repórter, para que você possa monitorar a eficiência da transfecção e o crescimento do tumor in vivo. Após este procedimento, outros métodos, como estudos de metástase in vivo, podem ser realizados para responder a outras perguntas sobre progressão tumoral, metástase e resposta aos tratamentos.

Essa técnica abre caminho para os pesquisadores de câncer de mama explorarem vários aspectos da progressão do tumor, usando novos modelos PDX que representam melhor a heterogeneidade do tumor. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como rotular células tumorais dissociadas com partículas lentivirais de alto título. O que permitirá rastrear células tumorais in vivo e potencialmente manipular a expressão de genes de interesse.

Não se esqueça de que trabalhar com partículas lentivirais pode ser extremamente perigoso e você deve sempre tomar as devidas precauções ao realizar este procedimento.