Um Protocolo de Transdução Lentivirus e Análise de Downstream da Intestinal Organóides
20 de abril de 2015
Neste protocolo de vídeo, damos uma explicação passo a passo da transdução lentiviral em organoides do epitélio intestinal primário e do processamento e análise a jusante dessas culturas por RT-PCR quantitativo, RNA-microarray e imuno-histoquímica.
O objetivo geral deste procedimento é gerar organoides transduzidos de forma estável a partir do epitélio intestinal primário de camundongos para análise a jusante de organoides intestinais. Isso é feito primeiro seccionando células T HEC 2 93 com vetores de empacotamento lentiviral e plasmídeo lentiviral, codificando o gene de interesse para produzir partículas lentivirais de alto título. O segundo passo é pré-tratar organoides intestinais de camundongos cultivados com vários fatores de crescimento para obter criptas hiperproliferativas císticas.
Em seguida, transduza os organoides com o lentivírus de alto título e incube os organoides transduzidos em matrigel. A etapa final é incorporar organoides transduzidos adultos em parafina para análise imuno-histoquímica a jusante. Em última análise, a transdução de organoides lentivirais é usada para gerar alterações genéticas em um modelo in vitro do epitélio intestinal que é confiável, reprodutível e rápido.
A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como as linhagens de células cancerígenas, é que os organoides são uma hierarquia de células-tronco deslocadas não mutadas. Na polarização celular do texto, ele pode se diferenciar em todos os diferentes tipos de células do epitélio do intestino delgado. Além disso, os organoides transduzidos podem ser usados para estudar elementos genéticos específicos, superando assim o uso de camundongos transgênicos e facetas de custo e velocidade.
A produção de partículas lentivirais é um protocolo de cinco dias que começa com a divisão de células T HEC 2 93 para fluência de 60 a 80% de co em um frasco de 162 centímetros quadrados em meio de cultura de células. Incube as células durante a noite em uma incubadora de cultura de células umidificada a 37 graus Celsius no dia seguinte. Preparar a solução de transfecção de ADN e a solução de polietileno amina ou de transfecção de PEI conforme descrito no texto do protocolo.
Adicione a solução de transfecção de DNA ao vórtice de solução PEI ou inverta várias vezes e incube por cinco minutos. À temperatura ambiente. Goteje dois mililitros da solução de DNA TRANSFECTION mais PEI nas células T HEC 2 93 e incube por quatro horas a 37 graus Celsius após quatro horas.
Atualize o meio de cultura. Para remover o PEI, incube as células por dois dias a 37 graus Celsius no quarto dia, colete o sobrenadante em um tubo de 50 mililitros. Adicionar novo meio de cultura às células e voltar a colocar o balão na incubadora, centrifugar o sobrenadante recolhido a 500 Gs durante cinco minutos.
Para remover as células mortas, use uma seringa grande de 60 mililitros para empurrar o SUPERNAT através de um filtro de 0,45 micrômetro. Armazene o supernat filtrado durante a noite a quatro graus Celsius no dia seguinte. Recolha a centrífuga e filtre o segundo lote de sobrenadante, tal como indicado para o primeiro lote.
Agrupar os dois lotes de sobrenadante em tubos de ultracentrífuga. Centrifugar a 50 000 GS durante 90 minutos. Quando a centrifugação estiver concluída, com muito cuidado, remova as cápsulas que contêm os tubos de ultracentrífuga e coloque-os em uma capela de fluxo laminar.
Abra a cápsula que contém o tubo de ultracentrífuga e transvase o meio cuidadosamente com o pellet na parte superior do tubo. É importante lembrar qual lado do tubo de apelação teria se formado, pois os pellets virais podem ser difíceis de visualizar. Em seguida, use uma micropipeta para remover o último pedaço de meio, tomando cuidado para não agitar o pellet marrom opaco que é visível na lateral do fundo do tubo da ultracentrífuga.
Ressuspenda este pellet em 500 microlitros de meio de cultura organoide suplementado com inibidores da nicotinamida quinase e poli brain resus. A suspensão neste meio é importante, pois o vírus de alto título será usado diretamente para transdução de organoides dois dias antes da transdução. Divida um poço completo de 0,95 centímetro quadrado de organoides em um novo poço de uma placa de 48 poços.
Seguindo um protocolo publicado anteriormente. Objetivo de obter aproximadamente 50 pequenos organoides em cultura organoide. Meio suplementado com um inibidor da glicogênio sintase quinase e nicotinamida.
Para obter criptas hiperproliferativas císticas. Incubar os organoides durante dois dias no dia da transdução colher organoides com uma micropipeta P 1000. Pipete o gel e o meio matra para cima e para baixo, interrompendo assim a mistura.
Coloque a mistura em um tubo de 15 mililitros. Interrompa ainda mais a mistura usando um PEs sua pipeta na qual a abertura distal foi diminuída derretendo Pellet os organoides centrifugando a 100 Gs por cinco minutos. Em seguida, remova o sobrenadante a 500 microlitros de pré-aquecimento de uma x tripsina e ressuspenda os organoides incubados por três minutos.
Em banho-maria a 37 graus Celsius, inative a tripsina adicionando 3,5 mililitros de centrífuga de meio de cultura de linha celular por cinco minutos. A 500 Gs.Retire o super natan para deixar o pellet em aproximadamente 20 microlitros de meio. Transfira os organoides desta última pequena quantidade de meio para um poço.
Em uma placa de 48 poços. Adicione o lentivírus de alto título previamente preparado em meio de transdução aos organoides e ressuspenda. Incube a mistura de vírus organoides por uma hora a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura para permitir a transdução após uma hora, adicione um mililitro de cultura organoide, meio à mistura de vírus organoide, ressuspenda e transfira a mistura para uma centrífuga de tubo de microcentrífuga a 850 GS por cinco minutos.
Para granular os organoides, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet. Em 20 microlitros de gel matra gelado, coloque a gota no meio de um poço. Em uma placa de 48 poços e incubar a 37 graus Celsius por 15 minutos.
Para que a gota solidifique após 15 minutos. Adicione cuidadosamente 250 microlitros de cultura organoide. Meio suplementado com inibidores de nicotinamida e quinase.
Pré-aqueça um bloco de alumínio em uma incubadora a 70 graus Celsius para manter a parafina líquida. Remova o meio de um único poço com organoides adultos, deixando os organoides incorporados intactos e adicione um mililitro de aldeído paraforme 4% em PBS diretamente no poço. Substitua o aldeído paraforme por um mililitro de PBS.
Ressuspenda os organoides fixos no PBS e transfira para um frasco de vidro. Deixe os organoides afundarem por um minuto. Em seguida, pipete o PBS e substitua por etanol a 70%, no qual algumas gotículas de solução de eoína são dissolvidas.
Para permitir a visualização dos organoides durante todo o processo de incorporação, deixe os organoides em etanol a 70% em temperatura ambiente por 30 minutos. Remova o etanol 70% pipetando cuidadosamente. Os organoides podem ser visualizados a olho nu por causa da cor rosada eoin.
Substitua a solução de inclusão por etanol a 96% e deixe em temperatura ambiente por 30 minutos dessa maneira. Posteriormente, passe os organoides por 70% de etanol, 90% de etanol, 96% de etanol, 100% de etanol, 100% de etanol, xileno e xileno. Transvase a última lavagem com xileno e deite a parafina no frasco para injetáveis de vidro.
Coloque o frasco imediatamente no bloco de alumínio pré-aquecido a 70 graus Celsius por 30 minutos. Após 30 minutos, substitua a parafina por uma nova parafina limpa com um pré-aquecimento, PE ou pipeta. Despeje a parafina e use uma praga ou pipeta pré-quente com uma grande abertura para pipetar os organoides no molde do bloco de parafina em uma camada de parafina líquida.
Aqueça uma agulha de dissecção com bico de bunsen e manipule todos os organoides o máximo possível em direção ao centro do molde do bloco de parafina. Quando a localização dos organoides no molde for satisfatória, resfrie levemente o molde para solidificar a camada de parafina. Termine o bloco despejando mais parafina por cima e adicione um de incorporação histológica padrão.
Nesse protocolo, organoides do epitélio intestinal foram transduzidos com lentivírus. Os organoides normais crescem como estruturas vilosas da cripta K com várias criptas que saem de um domínio de vilosidade compartilhado. Após o tratamento desses organoides com o inibidor de três B da GSK, CHIR 9 9 0 21, a proliferação aumenta e as criptas tornam-se císticas após a transdução de organoides.
Usando a superexpressão de EGFP lentiviral, os organoides expressam etapas de realce de transdução de EGFP fluorescente que podem ser realizadas quando a eficácia da transdução é baixa, como inoculação ou incubação viral prolongada não são necessárias, pois essas etapas não aumentarão a eficácia já alta. Posteriormente, esses organoides são processados para técnicas de RNA e imuno-histoquímica. Esta imagem representativa é uma seção de um organoide intestinal de camundongo, corado para BRDU após incubação com BRDU por uma hora antes da fixação.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como transduzir organoides do epitélio intestinal primário usando partículas lentivirais ou retrovirais.
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Visão Geral
Este protocolo em vídeo fornece uma explicação detalhada da transdução lentiviral em organoides derivados do epitélio intestinal primário. Ele descreve o processamento e a análise subsequente dessas culturas utilizando RT-PCR quantitativa, microarranjo de RNA e imunohistoquímica.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Engenharia Genética
Contexto
- A transdução lentiviral é um método utilizado para introduzir material genético em células.
- Organoides são estruturas tridimensionais que imitam a arquitetura e a funcionalidade dos órgãos.
- Organoides de epitélio intestinal primário são valiosos para o estudo da biologia intestinal.
- As técnicas de análise downstream são essenciais para validar modificações genéticas.
Objetivo do Estudo
- Gerar organoides estavelmente transduzidos para pesquisas sobre o epitélio intestinal.
- Permitir alterações genéticas em um modelo in vitro.
- Facilitar estudos confiáveis e reprodutíveis da biologia intestinal.
Métodos Utilizados
- Transfecção de células HEC 293T com vetores de empacotamento lentivirais.
- Produção de partículas lentivirais com alto título.
- Pré-tratamento de organoides com fatores de crescimento.
- Transdução de organoides com lentivírus e incubação em matrigel.
- Inclusão de organoides em parafina para imuno-histoquímica.
Resultados Principais
- Geração bem-sucedida de organoides intestinais geneticamente modificados.
- Validação da eficiência de transdução por meio de RT-PCR quantitativo.
- Análise da expressão gênica utilizando microarranjo de RNA.
- Caracterização imuno-histoquímica das estruturas dos organoides.
Conclusões
- A transdução lentiviral é um método eficaz para modificar organoides intestinais.
- Essa abordagem fornece um modelo confiável para o estudo da biologia do epitélio intestinal.
- Os métodos descritos podem ser aplicados a diversos estudos genéticos em organoides.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A transdução lentiviral de organoides intestinais permite genômica funcional rápida e econômica em um modelo in vitro fisiologicamente relevante, reduzindo a dependência de modelos de camundongos transgênicos. Esta abordagem apoia a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas, permitindo manipulação genética precisa em um sistema que mantém a hierarquia de células-tronco intestinais, polaridade e tipos celulares diferenciados. O protocolo fornece um fluxo de trabalho escalonável para gerar alterações genéticas estáveis adequadas para análise quantitativa posterior, acelerando descobertas na biologia gastrointestinal e áreas terapêuticas relacionadas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da expressão induzível de transgenes ou silenciamento mediado por shRNA em organoides intestinais.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos ao modelar perturbações genéticas em uma arquitetura epitelial semelhante à nativa.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiança nos resultados da modulação de alvos ao preservar a diferenciação homeostática e a polaridade celular.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Produz populações de organoides transduzidos adequadas para leituras de RT-PCR quantitativa, microarranjos de RNA e imuno-histoquímica.
- Valor Operacional: Padroniza o preparo de organoides por meio de pré-tratamento com fatores de crescimento para gerar criptas císticas hiperproliferativas para transdução consistente.
- Prontidão para Ensaios: Permite plataformas confiáveis de triagem de compostos ou genética usando repórteres fluorescentes ou imuno-histoquímicos como EGFP.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Mantém a biologia do epitélio intestinal relevante para doenças, apoiando a extrapolação para modelos in vivo.
- Utilidade Pré-clínica: Facilita a análise alinhada a biomarcadores por meio de processamento posterior para detecção de proteínas e ácidos nucleicos.
- Avanço Ajustado ao Risco: Permite ciclos iterativos de modificação genética para reduzir riscos em alvos antes da validação in vivo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao permitir estudos de perturbação genética que orientam a seleção de alvos e a otimização de compostos ativos, com os resultados alimentando a validação pré-clínica por meio de perfis moleculares e histológicos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses por meio da superexpressão induzível ou silenciamento de genes de interesse em um sistema epitelial polarizado.
- Triagem: Oferece eficiência de transdução adequada para leituras escaláveis utilizando qPCR, microarranjos ou IHC, sem necessidade de marcadores de seleção.
- Análises: Gera dados quantitativos de expressão de ácidos nucleicos e proteínas para comparar condições genéticas e avaliar o impacto fenotípico.
- Pesquisa Translacional: Conecta modificações genéticas a leituras funcionais em um contexto semelhante ao tecidual, apoiando a correlação de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para modulação mediada por lentivírus em múltiplos alvos em modelos de doenças intestinais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao modelar efeitos genéticos em um sistema epitelial não transformado e fisiologicamente preciso.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de etapas padronizadas de produção de lentivírus e pré-tratamento de organoides.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao acelerar os prazos de validação de alvos em comparação com abordagens transgênicas.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base em resultados funcionais em um substituto tecidual relevante para humanos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência na produção de vetores lentivirais, cultivo de organoides e processamento histológico.
- Depende do acesso a infraestrutura de ultracentrifugação, microscopia de fluorescência e inclusão em parafina.
- Necessita padronização entre equipes nos setores de virologia, cultivo celular e histologia para resultados consistentes.
- Envolve considerações de adaptação ao estender o método a organoides colônicos ou sistemas derivados de modelos de doença.
- Limitado pelo rendimento de organoides e pela sensibilidade aos passos de dissociação enzimática durante o processamento.
