Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
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Certos órgãos produzem fatores solúveis e se tornam locais preferenciais para metástase do câncer de mama. Um meio condicionado preparado a partir dessas células de órgãos colhidos pode ajudar a identificar e estudar tais fatores.
Comece colocando um órgão colhido, como um fígado em um tubo contendo PBS frio e virando o tubo para cima e para baixo para remover o sangue residual do órgão. Coloque o órgão em uma placa de Petri. E usando um bisturi, pique o órgão em pequenos pedaços.
Resuspenda esses pedaços em um tubo contendo um meio basal suplementado com um antibiótico para apoiar o crescimento celular e evitar a contaminação. Agora, despeje a suspensão celular em uma placa de cultura e incubar a 37 graus Celsius com um suprimento contínuo de dióxido de carbono durante a duração necessária.
Durante a incubação, essas células liberam metabólitos, fatores de crescimento, proteínas de matriz extracelular no meio. Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga e adicione meio fresco para diluí-lo. Centrifugar o tubo e filtrar o supernascido, que é o meio condicionado, em um tubo fresco.
No protocolo a seguir, prepararemos a mídia condicionada dos pulmões do camundongo e o cérebro para estudar o comportamento metastático das células cancerígenas de mama.
Para gerar o meio de condição pulmonar, inverta os tubos do tecido pulmonar três vezes para remover qualquer sangue residual dos órgãos. Em seguida, substitua a lavagem por PBS fresco e repita até que a solução salina esteja livre de sangue.
Em seguida, transfira os pulmões para uma placa de Petri de vidro de 60 milímetros quadrados por rato e use duas lâminas estéreis de bisturi para picar os tecidos com repetidos cortes de ida e volta.
Quando os fragmentos de tecido são aproximadamente 1 milímetro cúbicos em tamanho, resuspenque as peças no volume apropriado de média DMEM/F-12 complementada com antibióticos e incuba os tecidos em um poço de uma placa de 6 poços por rato a 37 graus Celsius e 5% de CO2.
Após 24 horas, transfira todo o conteúdo de cada poço para tubos cônicos individuais de 50 mililitros e dilua a mídia condicionada com três volumes equivalentes de médio DMEM/F-12 fresco por tubo.
Centrifugar os tubos para remover quaisquer grandes pedaços de detritos teciduais. Em seguida, acumule a mídia condicionada através de um coador de seringa de 0,22 mícrons em um único tubo cônico de 50 mililitros.
