Na diferenciação in vitro de pluripotentes humanas Células-tronco em células Trofoblásticas

O objetivo geral deste protocolo é diferenciar células-tronco pluripotentes humanas em células trofoblásticas humanas usando morfogênicos ósseos 4 e inibidores das vias de sinalização ativa e nodal para estudar os eventos iniciais da formação e função da placenta humana. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no estudo das funções das células trofoblásticas e como essas células são formadas. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode produzir células trofoblásticas abundantes para uma ampla variedade de aplicações, incluindo genética, e permitir ensaios de função celular.

Para iniciar o experimento, descongele uma alíquota de matriz extracelular no gelo por três a quatro horas. Usando pontas geladas, um tubo cônico frio de 50 mililitros e o meio igual modificado de Dulbecco, ou meio DMEM F12, transfira dois miligramas de matriz extracelular para 24 mililitros de DMEM F12 gelado. Transfira imediatamente o tubo cônico de 50 mililitros para o gelo e armazene-o a quatro graus Celsius.

Para revestir placas de cultura de tecidos, adicione um mililitro de matriz extracelular diluída por poço de uma placa de seis poços. Gire a placa para revestir os poços e incube a placa em temperatura ambiente por pelo menos uma hora. Aspire a matriz extracelular da nova placa e adicione meio condicionado por fibroblastos embrionários de camundongo ou MEFCM contendo bFGF.

Use uma pipeta para transferir os grampos celulares raspados da placa MEF e aliquotá-los para a placa revestida com matriz extracelular. Em seguida, incube a placa. Raspe as células diferenciadas com uma pipeta Pasteur antes de substituir o MEFCM por meio bFGF diariamente usando dois mililitros de meio para um poço.

Quando as colônias parecem grandes e brilhantes ao microscópio, passe as hESCs a cada seis a sete dias. Quando as células sem alimentador estiverem prontas para passar, remova o meio e lave as células adicionando um mililitro de PBS usando uma pipeta. Aspire o PBS e substitua-o por 0,5 miligramas por mililitro de dispase pré-aquecido com uma pipeta.

Incube as células a 37 graus Celsius por cinco minutos. Após a incubação, lave as células com PBS adicionando dois mililitros de PBS por poço e aspire o PBS. Adicione um mililitro de CM por poço e raspe manualmente as células em pequenos aglomerados usando a ponta de uma pipeta de cinco mililitros.

Em seguida, coloque os aglomerados de células suspensas em novas placas revestidas com matriz extracelular. Prepare o meio de diferenciação. Use CM sem bFGF e adicione novos inibidores antes de usar.

Use hESCs sem alimentador crescendo em placas revestidas com matriz extracelular para uma passagem cultivada dentro de uma incubadora ajustada a 5% de oxigênio. Após a primeira passagem para as placas revestidas com matriz extracelular, deixe as células se ligarem por 24 horas. No dia seguinte, inicie a diferenciação removendo o CM contendo bFGF e substituindo-o por CM contendo BMP4 / A / P com dois mililitros por poço em uma placa de seis poços.

Continue cultivando as células usando níveis de oxigênio a 4%. Substitua o CM contendo BMP4 / A / P a cada dois dias, aspirando o meio antigo e adicionando um novo meio contendo BMP4 / A / P. Colete as células nos pontos de tempo desejados.

Cultura de hESCs para duas passagens na matriz extracelular após transferi-las dos MEFs com meio hESC contendo bFGF. A alta confluência celular é importante, portanto, divida os hESCs um a um em uma nova placa que garantirá pelo menos 50% de confluência no dia seguinte. Incube as células durante a noite na incubadora de baixo oxigênio.

No dia seguinte, substitua o meio por dois mililitros por poço de meio de diferenciação. Coloque as células em uma incubadora de baixo oxigênio durante a noite. Antes da transfecção, a gelatina cobre um prato adicionando 0,1% de gelatina a um prato.

Gire o prato para cobrir o prato e deixe-o em temperatura ambiente. Após 20 minutos, retire a gelatina. Diferencie as células até o ponto de tempo desejado.

No dia anterior à transfecção, tripsinizar as células usando 0,05% de tripsina por cinco minutos. Coloque as células na confluência desejada na placa revestida de gelatina. Adicione CM contendo BMP4 / A / P sem bFGF e incube a cultura durante a noite.

No dia seguinte, adicione um novo meio de diferenciação às células. Transfectar siRNAs usando um reagente de transfecção de siRNA. Para o DNA plasmático, use um reagente de lipofectamina apropriado.

Siga o protocolo do produto conforme descrito para cada reagente de transfecção. Transfira os complexos de lipofectamina siRNA para cada poço ou placa de células e misture suavemente. Em seguida, cultive as células durante a noite em uma incubadora com baixo teor de oxigênio.

No dia seguinte, substitua a mídia por uma nova mídia de diferenciação. Colha as células nos pontos de tempo desejados para verificar a eficiência da interrupção do gene usando RT-PCR quantitativo. Finalmente, para colher células, adicione um mililitro de 0,05% de tripsina por poço e incube as células.

Adicione cinco mililitros de meio MEF por poço para neutralizar a tripsina. Gire as células a 200 vezes g por cinco minutos e use o pellet celular para isolamento de RNA. Usando esta técnica, as mudanças morfológicas são vistas claramente.

As células no primeiro dia de diferenciação são maiores do que as células do dia zero. À medida que a diferenciação prossegue, as células se dividem e se expandem a partir do centro da colônia, crescendo em uma direção externa. As colônias individuais se fundem no quinto dia de diferenciação, com as células crescendo umas sobre as outras.

A análise de QRT-PCR revela que os níveis de expressão relativa do marcador C pluripotente NANOG são reduzidos em 75% após um dia de diferenciação quando as células são cultivadas com BMP4 e reduzidos em 90% na presença de BMP4 / A / P. No segundo dia de diferenciação, os níveis de NANOG são muito baixos para células cultivadas em BMP4 sozinho ou em BMP4 / A / P em comparação com aquelas em meio hESC CM contendo beta FGF. As transfecções realizadas usando um plasmídeo GFP e introduzidas em células tratadas com BMP4/A/P no primeiro e terceiro dia de diferenciação obtiveram 30 a 50% de eficiência de transfecção 24 horas após a transfecção.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como diferenciar células pluripotentes humanas em células trofoblásticas in vitro e como introduzir construções de DNA para manipular a expressão gênica.