Name: Na diferenciação in vitro de pluripotentes humanas Células-tronco em células Trofoblásticas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Aprenda a diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas em células trofoblásticas usando BMP4 e inibidores de vias de sinalização. Este método eficiente permite estudar a formação placentária e realizar manipulações genéticas.

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Este trabalho foi apoiado por um Fundo de Fórmula de Pesquisa em Saúde da Pensilvânia.

NOTA: Para a diferenciação de qualquer hESCs ou hiPSCs em progenitores trofoblásticas, hPSCs cultivadas em fibroblastos de rato embrionárias (MEFs) são a transição para Alimentador livre condições para duas passagens antes de iniciar a diferenciação com BMP4 / A / P. Este processo elimina a contaminação FAE de células diferenciadas. Aqui, nós apresentamos um protocolo para a diferenciação de células estaminais embrionárias humanas, e o mesmo protocolo pode ser aplicado a hiPSCs. 1. Cultura e Recuperação de hESCs em irradiados embrionárias de camundongos Fibroblastos (MEFs) (Preparações) <ol><li> A irradiação gama, de MEFs <ol><li> Adicione 500 ml de meio para a cultura das MEFs: DMEM com 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina, 1x penicilina / estreptomicina (Pen / Strep), e 0,1 mM ácidos não essenciais (NEAA) amino. </li><li> Descongelar um frasco de MEFs primárias e usar o meio MEF para a cultura das células. Expandir as MEFs primárias para 30 placas usando meio de cultura MEF. NOTA: As concentrações de oxigénio não são críticos para este passo, assimqualquer um deles pode ser utilizado condições fisiológicas (4%) ou à temperatura ambiente (20%) dentro da incubadora. </li><li> Colher o MEFS. Use 0,25% de tripsina para remover as MEFs das placas e transferência das células para um tubo cónico. Coloque as MEFs em um instrumento de irradiação e expor as células a 3.500 cinzas. Nota: A quantidade de tempo vai depender da actividade da fonte no interior do aparelho irradiador. </li><li> Ressuspender as MEFs irradiados com meio de cultura MEF e contar o número de células utilizando um hemocitómetro. </li><li> Agregar as MEFs utilizando uma centrifugadora e adicionar 50% de meio de cultura de células MEF e 50% meio de congelação (80% de FBS e meio de cultura MEF 20%). Aliquota de 1 x 10 6 culas por frasco. </li><li> Colocar os tubos MEF irradiada num -80 ° C congelador durante a noite, e depois transferi-los para o nitrogênio líquido para o armazenamento de longo prazo. </li></ol></li><li> Descongelamento MEFs congelados e hESCs para a cultura <ol><li> Adicione 500 ml de meio de células estaminais embrionárias humanas: DMEM / F-12 com 20% de soro subsement, NEAA 0,1 mM, 2 mM de L-glutamina, 10 ng / ml de bFGF, ß-mercaptoetanol mM 0,1, e 1x Pen / Strep. </li><li> Descongelar um frasco de MEFs um dia antes de descongelar os hESCs. Bata de uma placa de 6 poços com 0,1% de gelatina, utilizando-se 1 ml para cada poço. Incuba-se durante pelo menos 20 min à temperatura ambiente, e, em seguida, remover a gelatina. </li><li> Remover um frasco de MEFs do armazenamento em azoto líquido e imerge o frasco num banho de água a 37 ° C. Assista o frasco de forma intermitente até que apenas pequenos cristais de gelo permanecem. transferir rapidamente o conteúdo do frasco a 9 ml de meio de MEF dentro de um tubo de 15 ml. </li><li> Agregar as células por centrifugação a 200 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em meio de MEF. Alíquota da MEFs uniformemente sobre uma placa de 6 poços. Coloque a placa em um 37 ° C com baixo oxigênio (4%) incubadora durante a noite. </li></ol></li><li> Cultura de rotina de hESCs em MEFs <ol><li> Remover um frasco de células estaminais embrionárias humanas a partir de azoto líquido e rapidamente descongelar o frasco utilizando uma 37 ° C banho de água. Pipeta suavemente o hESCs para um tubo cónico de 15 ml contendo 9 ml de meio de células estaminais embrionárias humanas e girar a 200 xg durante 5 min. Remover o meio e ressuspender as células com 1 ml de meio de células estaminais embrionárias humanas. </li><li> Aspirar o meio MEF da placa preparado no passo 1.2.4 e adicionar 1 ml de meio de células estaminais embrionárias humanas. Adicionar inibidor da rocha Y-27632 (10 uM) ao meio de células estaminais embrionárias humanas. Transfira os hESCs em MEFs. </li><li> Colocar as células em uma incubadora a 37 ° C, baixa-oxigénio (4%) durante a noite. Substituir o meio hESC diária. Raspar células diferenciadas com uma pipeta Pasteur, visualizados sob um microscópio vertical em 4x. </li><li> A passagem hESCs a cada 4-6 dias, dependendo da célula de confluência e o tamanho das colónias de células estaminais embrionárias humanas. Prepare um prato de MEFs no dia anterior passaging. Quando as células estão prontas para passagem, remover o meio de células estaminais embrionárias humanas e lavar bem com 1 mL de PBS. </li><li> Adicionar 1 mg / ml de colagenase (pré-aquecido a 37 ° C), incuba-se a 37 ° C durante 5 min, e remover a colagenase. Wash as células com PBS, adicionar 1 ml de meio por poço células estaminais embrionárias humanas, e raspar manualmente as células em pequenos aglomerados usando a ponta de uma pipeta de 5 mL. Transferir os aglomerados de células em suspensão em um poço novo MEF-revestida (s). </li></ol></li></ol> 2. Transição de hESCs de MEFs para Alimentador livre Condições em placas de Matriz Extracelular revestidas <ol><li> Prepare MEF meio condicionado (CM) <ol><li> Placa os MEFs irradiados em um frasco T75 a 90-100% de confluência; é importante que as MEFs são densamente plaqueadas. Observar as células utilizando um microscópio para determinar se eles ligado ao fundo do frasco (MEFs anexar aproximadamente 6 horas após o plaqueamento ou no dia seguinte). NOTA: células não ligadas flutuar no meio quando observada por um microscópio. No dia seguinte, remova o meio MEF e adicione 25 ml de meio hESC falta B-FGF. </li><li> Recolhe-se o meio condicionado após 24 h de incubação. Substitua por meio fresco diariamente, por um período máximo de 12 dias. </li&gt; <li> Filtra-se o CM recolhidas utilizando um filtro de 0,22 um. Antes da utilização, adicionar fresco B-FGF para a CM. NOTA: CM podem ser congeladas a -80 ° C e armazenada durante até 1 ano. Alternativamente, armazenar o CM a 4 ° C durante 2 semanas. </li></ol></li><li> Transição dos hESCs de cultura sobre os MEFs para Alimentador livre placas revestidas com matriz extracelular. <ol><li> Preparação da matriz extracelular para placas de cultura de tecidos de revestimento <ol><li> Descongelar uma alíquota de matriz extracelular em gelo (cerca de 3-4 h). Utilizando pontas gelada, uma frio, tubo de 50 ml, e meio DMEM / F12, transferência de 2 mg de matriz extracelular em 24 ml de DMEM gelado / F-12 (a diluição depende da concentração da matriz extracelular do fornecedor ). </li><li> transferir imediatamente o tubo de 50 ml de gelo e armazená-lo a 4 ° C. Para placas de cultura de tecidos de revestimento, adicionar a quantidade apropriada de matriz extracelular diluída ao poço (por exemplo, 1 ml por poço numa placa de 6 poços). Agitar para revestir a placa e incubar a temperatura ambiente durante pelo menos 1 h. </li></ol></li><li> hESCs passagem do MEFs (como no passo 1.3), utilizando CM contendo B-FGF (10 ng / mL). <ol><li> Aspirar para remover a matriz extracelular da nova placa e adicionar CM contendo B-FGF. Transferir os aglomerados celulares raspadas da placa utilizando uma pipeta de MEF e aliquotar em que a placa revestida com a matriz extracelular. Incubar no 37 ° C incubadora de baixo oxigênio durante a noite. </li><li> Substitua o CM com meio B-FGF diária; a quantidade de meio dependerá do tamanho do frasco de cultura. Utilizar 2 ml de meio por um de 6 poços bem. Raspar células diferenciadas com uma pipeta Pasteur. </li><li> hESCs passagem a cada 6-7 dias, quando as colónias são brilhantes quando vistas sob o microscópio. NOTA: hES colónias cultivadas em placas revestidas com matriz extracelular crescer mais do que as células MEF-cultivadas. </li><li> Quando as células sem alimentador está pronto para a passagem, remover o meio, lavar por anúncioDing 1 ml de PBS utilizando uma pipeta, aspirado para remover o PBS, adicionar 0,5 mg / ml de dispase (pré-aquecido a 37 ° C) com uma pipeta, e incuba-se a 37 ° C durante 5 min. </li><li> Lavam-se as células com PBS, adicionando 2 ml de PBS por poço e depois aspirar. Adicionar 1 ml de CM por poço e raspar manualmente as células em pequenos aglomerados usando a ponta de uma pipeta de 5 mL. </li><li> Placa os aglomerados de células em suspensão em novas placas revestidas com matriz extracelular; as células devem aderir após 24 horas. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Diferenciação de hESCs Usando BMP4 / A / P <ol><li> Prepara-se o meio de diferenciação. Uso cm (sem B-FGF) e adicionar (fresco) BMP4 (50 ng / ml), A83-01 (1 uM), e PD173074 (0,1 uM). Adicionar estes inibidores para o CM antes da utilização. </li><li> Use hESCs livre de alimentação que crescem em placas revestidas com matriz extracelular por 1 passagem, cultivadas dentro de uma incubadora fixado em 4% de oxigênio. Após a primeira passagem em placas revestidas com matriz extracelular,permitir que as células aderir durante 24 horas. No dia seguinte, iniciar a diferenciação. Remover o CM (contendo B-FGF) e substituí-lo com CM contendo BMP4 / A / P (2 ml por poço numa placa de 6 poços). Continuar a cultura das células, utilizando os níveis de oxigénio de 4%. </li><li> Substituir o CM contendo BMP4 / A / P (2 ml / poço, para uma placa de 6 poços) cada 2 dias. Aspirar para remover o meio velho e adicionar novo CM usando uma pipeta. No segundo dia após a adição e remoção de BMP4 B-FGF (considerado o dia diferenciação 2), a morfologia celular será alterado, aparecendo maior quando observada por um microscópio. NOTA: indiferenciada de células que exibem bordas arredondadas brilhantes, não estará presente. </li><li> Coletar células em pontos de tempo desejados. células diferenciadas vai parar de se dividir após cerca de 2 semanas. células transfectar durante este período de tempo (veja a próxima seção). </li></ol> 4. A transfecção de células trofoblásticas com ARNsi ou DNA de plasmídeo <ol><li> Preparar células trofoblásticas para transfecção </strong&gt; <ol><li> hESCs cultura para duas passagens na matriz extracelular após transferi-los a partir das MEFs (veja o passo 2.2). Use meio hESC contendo B-FGF. </li><li> Dividir os hESCs para uma nova placa de matriz extracelular, um dia antes diferenciação. confluência celular elevada é importante, por isso dividir as células de 1: 1 para uma nova placa / poço, o que vai garantir, pelo menos, 50% de confluência no dia seguinte. Incubar as células durante a noite na incubadora de baixo oxigênio. NOTA: hESCs não precisa ser contado durante este passo. </li><li> No dia seguinte, substituir o meio com o meio de diferenciação (CM contendo BMP4 / A / P e falta B-FGF, utilizando 2 ml / poço de uma placa de 6 poços). Remover o meio antigo por aspiração e transferir o novo meio (2 ml) usando uma pipeta. Colocar as células numa incubadora de baixo oxigénio (4% de oxigénio) durante a noite. </li></ol></li><li> As transfecções usando siRNAs para disrupção do gene ou utilizando ADN plasmídeo <ol><li> Diferenciar as células até que o desejado tempo-ponto (entre os dias 1 e 14). O dia antes da transfecção, as células trypsinize usando 0,05% de tripsina durante 5 min. Placa-los para a confluência desejada (dependendo do protocolo de reagente de transfecção) para uma placa revestida com gelatina (adicionar 0,1% de gelatina a uma placa de cultura de tecidos durante 20 min e aspirado para remover). Adicionar CM contendo BMP4 / A / P (falta B-FGF) e incubar durante a noite. </li><li> No dia seguinte, adicionar meio fresco diferenciação às células. SiRNAs transfectar utilizando um reagente de transfeco de siARN. Para ADN de plasmídeo, usar um reagente de lipofectamina apropriado. </li><li> Seguir o protocolo do produto como se descreveu para cada um dos reagentes de transfecção. Transferir os complexos siRNA-lipofectamina a cada / placa poço de células, misture delicadamente e cultura das células durante a noite em uma incubadora de baixo oxigênio. NOTA: Alguns reagentes de transfecção são inibidos por antibióticos, que exigem CM falta Pen / Strep. </li><li> No dia seguinte, substitua com a mídia diferenciação fresco. </li><li> Colher as células no desejod pontos de tempo (por exemplo, 24 horas, 48 horas e 72 horas) para verificar a eficiência ruptura do gene usando RT-PCR quantitativo. Para as células de colheita, a utilização de 0,05% de tripsina, a adição de 1 ml por poço e incubar durante 5 min a 37 ° C. Adicionar 5 ml de meio de MEF por poço para neutralizar a tripsina. Girar as células a 200 xg durante 5 min e usar o sedimento de células para isolamento de ARN. </li></ol></li></ol> Infecção 5. Pathogen de células trofoblásticas: Infecção viral Sendai <ol><li> Prepare hESCs para a diferenciação <ol><li> hESCs cultura para duas passagens na matriz extracelular, após a transferência das MEFs (veja o passo 2.2). Use meio hESC contendo B-FGF. </li><li> Dividir os hESCs para uma nova placa de matriz extracelular, um dia antes diferenciação. confluência celular é alta células importantes, assim divididas 1: 1 para uma nova placa / poço, o que vai garantir, pelo menos, 50% de confluência no dia seguinte. Incubar as células durante a noite em uma incubadora de baixo oxigênio (4% de oxigénio). &lt;br /&gt; NOTA: hESCs não precisa ser contado durante esta etapa. </li><li> No dia seguinte, substituir o meio com o meio de diferenciação (CM contendo BMP4 / A / P e falta B-FGF) e a cultura durante a noite numa incubadora de baixo oxigénio (4% de oxigénio). </li></ol></li><li> Infecção virai de células trofoblásticas Sendai <ol><li> Um dia antes do dia desejado diferenciação, as células diferenciam trypsinize (para células individuais) usando 0,05% de tripsina durante 5 min e transferi-los para uma placa revestida com gelatina. Adicionar meio de diferenciação e incubar durante a noite em uma incubadora de baixo oxigênio. </li><li> No dia seguinte, adicionar meio de infecção (isto irá variar dependendo do vírus). Uso CM falta de Pen / Strep contendo BMP4 / A / P, utilizando-se 0,5 ml para um poço de uma placa de 6 poços. Adicionar vírus Sendai para MOI = 1. Incubar durante 8 horas numa incubadora de baixo oxigênio. </li><li> Se pontos de tempo adicional é necessário, remover o meio contendo vírus após 4 horas e substituí-la por BMP4 / A / P CM. coletar célulaspara isolamento de RNA usando um raspador de células. </li><li> Determinar a eficiência da infecção virai através da realização de qRT-PCR para genes envolvidos na resposta viral 18. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Rugg-Gunn, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+features+of+the+mouse+trophoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+biomedicine+online%22%5BJournal%5D)">Epigenetic features of the mouse trophoblast.</a> Reproductive biomedicine online. 25 (1), 21-30 (2012).</li>
<li>Rossant, J., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+development%3A+lessons+from+mouse+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Placental development: lessons from mouse mutants.</a> Nature reviews. Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).</li>
<li>Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C., Menkin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thirty-four+fertilized+human+ova%2C+good%2C+bad+and+indifferent%2C+recovered+from+210+women+of+known+fertility%3B+a+study+of+biologic+wastage+in+early+human+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Thirty-four fertilized human ova, good, bad and indifferent, recovered from 210 women of known fertility; a study of biologic wastage in early human pregnancy.</a> Pediatrics. 23 (1 Part 2), 202-211 (1959).</li>
<li>Steptoe, P. C., Edwards, R. G., Purdy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nature/journal/v229/n5280/abs/229132a0.html">Human blastocysts grown in culture.</a> Nature. 229 (5280), 132-133 (1971).</li>
<li>Delorme-Axford, E., Sadovsky, Y., Coyne, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+placenta+as+a+barrier+to+viral+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The placenta as a barrier to viral infections.</a> Annual Review of Virology. 1, 133-146 (2014).</li>
<li>Ji, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+trophoblast+cell+differentiation%3A+physiological+regulation+and+pathological+relevance+to+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+aspects+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Placental trophoblast cell differentiation: physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia.</a> Molecular aspects of medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).</li>
<li>Bilban, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+trophoblast+invasion-related+genes%3A+heme+oxygenase-1+controls+motility+via+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Identification of novel trophoblast invasion-related genes: heme oxygenase-1 controls motility via peroxisome proliferator-activated receptor gamma.</a> Endocrinology. 150 (2), 1000-1013 (2009).</li>
<li>Xu, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP4+initiates+human+embryonic+stem+cell+differentiation+to+trophoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast.</a> Nature biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).</li>
<li>Amita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+and+unidirectional+conversion+of+human+embryonic+stem+cells+to+trophoblast+by+BMP4%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), E1212-E1221 (2013).</li>
<li>Genbacev, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+trophoblast+progenitor+cell+lines+from+the+chorion%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Establishment of human trophoblast progenitor cell lines from the chorion.</a> Stem Cells. 29 (9), 1427-1436 (2011).</li>
<li>Marchand, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+signature+of+trophoblast+differentiation+in+a+human+embryonic+stem+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+reproduction%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic signature of trophoblast differentiation in a human embryonic stem cell model.</a> Biology of reproduction. 84 (6), 1258-1271 (2011).</li>
<li>Hyslop, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+NANOG+induces+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+extraembryonic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Downregulation of NANOG induces differentiation of human embryonic stem cells to extraembryonic lineages.</a> Stem cells. 23 (8), 1035-1043 (2005).</li>
<li>Harun, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotrophoblast+stem+cell+lines+derived+from+human+embryonic+stem+cells+and+their+capacity+to+mimic+invasive+implantation+events%5BTitle%5D)+AND+%22Human+reproduction%22%5BJournal%5D)">Cytotrophoblast stem cell lines derived from human embryonic stem cells and their capacity to mimic invasive implantation events.</a> Human reproduction. 21 (6), 1349-1358 (2006).</li>
<li>Lichtner, B., Knaus, P., Lehrach, H., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP10+as+a+potent+inducer+of+trophoblast+differentiation+in+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">BMP10 as a potent inducer of trophoblast differentiation in human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 34 (38), 9789-9802 (2013).</li>
<li>Chen, Y., Wang, K., Chandramouli, G. V., Knott, J. G., Leach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trophoblast+lineage+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Trophoblast lineage cells derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Biochemical and biophysical research communications. , (2013).</li>
<li>Roberts, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+trophoblast+cells+from+human+embryonic+stem+cells%3A+to+be+or+not+to+be%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Differentiation of trophoblast cells from human embryonic stem cells: to be or not to be?</a> Reproduction. 147 (5), D1-D12 (2014).</li>
<li>Sarkar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin%2Fnodal+signaling+switches+the+terminal+fate+of+human+embryonic+stem+cell-derived+trophoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Activin/nodal signaling switches the terminal fate of human embryonic stem cell-derived trophoblasts.</a> The Journal of biological chemistry. 290 (14), 8834-8848 (2015).</li>
<li>Penkala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lncRHOXF1%2C+a+Long+Noncoding+RNA+from+the+X+Chromosome+That+Suppresses+Viral+Response+Genes+during+Development+of+the+Early+Human+Placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta.</a> Mol Cell Biol. 36 (12), 1764-1775 (2016).</li>
<li>Penkala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lncRHOXF1%2C+a+Long+Noncoding+RNA+from+the+X+Chromosome+That+Suppresses+Viral+Response+Genes+during+Development+of+the+Early+Human+Placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta.</a> Molecular and cellular biology. 36 (12), 1764-1775 (2016).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nature biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).</li>
<li>Bernardo, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRACHYURY+and+CDX2+mediate+BMP-induced+differentiation+of+human+and+mouse+pluripotent+stem+cells+into+embryonic+and+extraembryonic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages.</a> Cell stem cell. 9 (2), 144-155 (2011).</li>
<li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+BMP-4+treatment+initiates+mesoderm+induction+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Short-term BMP-4 treatment initiates mesoderm induction in human embryonic stem cells.</a> Blood. 111 (4), 1933-1941 (2008).</li>
<li>Vallier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cell+fate+decisions+of+human+embryonic+stem+cells+and+mouse+epiblast+stem+cells+are+controlled+by+the+same+signalling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Early cell fate decisions of human embryonic stem cells and mouse epiblast stem cells are controlled by the same signalling pathways.</a> PloS one. 4 (6), e6082(2009).</li>
<li>Arman, E., Haffner-Krausz, R., Chen, Y., Heath, J. K., Lonai, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+fibroblast+growth+factor+%28FGF%29+receptor+2+suggests+a+role+for+FGF+signaling+in+pregastrulation+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of fibroblast growth factor (FGF) receptor 2 suggests a role for FGF signaling in pregastrulation mammalian development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 5082-5087 (1998).</li>
<li>Yu, P., Pan, G., Yu, J., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF2+sustains+NANOG+and+switches+the+outcome+of+BMP4-induced+human+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">FGF2 sustains NANOG and switches the outcome of BMP4-induced human embryonic stem cell differentiation.</a> Cell stem cell. 8 (3), 326-334 (2011).</li>
<li>Sudheer, S., Bhushan, R., Fauler, B., Lehrach, H., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+inhibition+directs+BMP4-mediated+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+syncytiotrophoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+and+development%22%5BJournal%5D)">FGF inhibition directs BMP4-mediated differentiation of human embryonic stem cells to syncytiotrophoblast.</a> Stem cells and development. 21 (16), 2987-3000 (2012).</li>
<li>Bischof, P., Irminger-Finger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+cytotrophoblastic+cell%2C+a+mononuclear+chameleon%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+biochemistry+%26+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The human cytotrophoblastic cell, a mononuclear chameleon.</a> The international journal of biochemistry & cell biology. 37 (1), 1-16 (2005).</li>
<li>Cole, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycosylated+hCG%2C+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Hyperglycosylated hCG, a review.</a> Placenta. 31 (8), 653-664 (2010).</li>
<li>Apps, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+leucocyte+antigen+%28HLA%29+expression+of+primary+trophoblast+cells+and+placental+cell+lines%2C+determined+using+single+antigen+beads+to+characterize+allotype+specificities+of+anti-HLA+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Human leucocyte antigen (HLA) expression of primary trophoblast cells and placental cell lines, determined using single antigen beads to characterize allotype specificities of anti-HLA antibodies.</a> Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Nós apresentamos os passos básicos para a diferenciação de hESCs em progenitores trofoblastos. Este protocolo foi optimizado recentemente para diferenciar rapidamente hESCs com a adição de inibidores da Activina / Nodal sinalização, aumentar a diferenciação de células trofoblásticas e evitando a geração de células progenitoras da mesoderme, que são tipicamente observadas com o tratamento BMP4 sozinho. O sistema modelo BMP4 permite a análise das primeiras fases de especificação trophoblast linhagem humana e expansão. Alé...

A placenta é necessário para o crescimento e sobrevivência do feto durante a gravidez e facilita a troca de gases, nutrientes, produtos residuais e hormônios entre a circulação materna e fetal. O primeiro órgão formado durante a embriogênese dos mamíferos é a placenta, que começa a desenvolver 6-7 dias pós-concepção em humanos e 3,5-4,5 dias em ratos 1, 2, 3, 4. células trofoblásticas são as células mais importantes da placenta, e estas células representam um dos primeiros eventos de diferenciação linhagem de embrião de mamífero. Eles surgem a partir de células trofectoderma extra-embrionárias exteriores do blastocisto de pré-implantação. Nosso conhecimento dos estágios iniciais do desenvolvimento da placenta é limitado por restrições éticas e logísticas sobre a modelagem de desenvolvimento humano precoce. Durante implantação embrionária, trofoblastosinvadem o epitélio materno e diferenciam-se em células progenitoras especializados 5. Citotrofoblastos (CTBS) são mononucleated, progenitores indiferenciadas que se fundem e se diferenciam em sinciciotrofoblastos (SYNs) e trofoblastos invasivos extravilosas (EVTS), que escora a placenta ao útero. SYNs são multinucleadas, células terminalmente diferenciadas que sintetizam os hormônios necessários para sustentar a gravidez. Os eventos diferenciação precoce que geram TEVs e SYNs são essenciais para a formação da placenta, como deficiências em células trofoblásticas resultar em aborto espontâneo, pré-eclampsia, e intra-uterino restrição de crescimento 1. Os tipos de linhas de células trofoblásticas humanas que foram desenvolvidas incluem imortalizado CTBs e Coriocarcinomas, que produzem hormônios da placenta e exibição propriedades invasivas 6. As células trofoblásticas primárias de placentas primeiro trimestre humanos podem ser isolados, mas as células rapidamente DIFferentiate e parar de proliferar in vitro. Importante, transformada e linhas de células primárias têm diferentes perfis de expressão genética, indicando que linhas de células trofoblásticas tumorigênicos e imortalizadas podem não representar fielmente trofoblastos primários 7. Além disso, essas linhas não são susceptíveis de se assemelham a células progenitoras de células-tronco do trofoblasto da placenta, porque eles são derivados a partir de fases ulteriores primeiro através terceiro trimestres. Existe uma necessidade de um sistema robusto em cultura in vitro em fase inicial de trofoblastos humanos, a fim de estudar os eventos iniciais da formação e função da placenta. células estaminais embrionárias humanas (hESCs), que compartilham propriedades, com a massa celular interna do embrião pré-implantação, são frequentemente usados ​​para modelar o desenvolvimento humano precoce, incluindo a formação do início placenta. Ambas as células humanas pluripotentes induzidas estaminais (hiPSCs) e hESCs podem ser diferenciados em trofoblastos in vitro utilizando osso MorProteína phogenic 4 (BMP4) 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. Esta conversão de células pluripotentes para células trofoblásticas usando BMP4 é específico para células humanas e é amplamente utilizada para estudar o desenvolvimento da placenta humana cedo porque não exige o acesso a embriões humanos 9, 16. Recentemente, descobriu-se que a adição dos inibidores A83-01 (A) e PD173074 (P), que bloqueiam as vias de sinalização Smad2 / 3 e MEK1 / 2, aumenta a eficiência da diferenciação em células progenitoras HPSC trofectoderma-like, principalmente SYNs e TEVs, sem a ampla geração de mesoderme, endoderme, ou células ectoderma 9, 17 </sup&gt;. Usando estas condições médias, hESCs diferenciados por 12 dias têm perfis de expressão gênica similares como células trofectoderma isoladas de embriões blastocisto em estágio humanos e secretam vários hormônios de crescimento específico da placenta, apoiando a validade deste sistema modelo in vitro 9, 11. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a diferenciação in vitro de hPSCs em progenitores trofoblastos humanos utilizando meio de cultura BMP4 / A / P. Estas condições produzem número abundante de células de uma ampla variedade de aplicações, incluindo a sequência de ARN, interrupção de genes utilizando os siRNAs, infecções de agentes patogénicos, e a modificação genética utilizando transfecção mediada por lipofecção.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>Knock Out Substituição do soro</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>Isso é chamado de "reposição de soro" neste protocolo.</td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-155</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>B-FGF</td><td>Millipore</td><td>GF-003</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase Tipo IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de rocha Y27632</td><td>Calbiochem</td><td>688000</td><td></td></tr><tr><td>Irradiado CF1 MEFs</td><td>GlobalStem</td><td>6001G</td><td>MEFs podem ser gerados a partir de embios embrionários de dia 13,5 e irradiados.</td></tr><tr><td>0,22 &micro; m</td><td></td> incubadora <td>SLGS033SS de</td><td></td></tr><tr><td>baixa oxigenação Heracell</td><td>/VWR</td><td>89187-192</td> Qualquer <td>incubadora de cultura de tecidos com capacidade para regular as concentrações de oxigénio é suficiente.</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R& D Systems</td><td>314-BP-01M</td><td></td></tr><tr><td>A 83-01</td><td>R& D Systems</td><td>2939/10</td><td></td></tr><tr><td>PD173074</td><td>R& D Systems</td><td>3044/10</td><td></td></tr><tr><td>RNAiMax</td><td>Invitrogen</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>ThermoFisher</td><td>15596026</td><td>Trizol é usado para isolar o RNA total.</td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365779001</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Isso é chamado de "matriz extracelular" neste protocolo.</td></tr></tbody></table>

na diferenciação in vitro de pluripotentes humanas células-tronco em células trofoblásticas

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

A placenta é o primeiro órgão a desenvolver-se durante a embriogénese e é necessária para a sobrevivência do embrião em desenvolvimento. A placenta é composto por várias células trofoblásticas que diferenciam a partir de células trofectoderma extra-embrionárias do blastocisto de pré-implantação. Como tal, a nossa compreensão dos eventos diferenciação precoce da placenta humana é limitada por causa das restrições éticas e legais sobre o isolamento e manipulação de embriogênese humana. As células estaminais pluripotentes humanas (hPSCs) são um sistema modelo robusto para investigar o desenvolvimento humano e também podem ser diferenciadas in vitro em células trofoblásticas que expressam marcadores de vários tipos de células trofoblásticas. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para diferenciar hPSCs em células trofoblásticas usando proteína morfogénica do osso 4 e inibidores das vias de sinalização / nodais Activina. Este protocolo gera vários tipos de células de trofoblasto que podem ser transfectadas com ARNsipara investigar fenótipos de perda de função ou podem ser infectados com patógenos. Além disso, hPSCs pode ser geneticamente modificado e, em seguida, diferenciaram em progenitores trofoblásticas de ganho-de-função análises. Este método in vitro de diferenciação para geração de trofoblastos humanos a partir de hPSCs supera as restrições éticas e legais de trabalhar com embriões humanos, e este sistema pode ser usado para uma variedade de aplicações, incluindo a descoberta da droga e pesquisa da célula estaminal.

Visão geral de diferenciação in vitro de hPSCs Este protocolo de diferenciação in vitro começa com hESCs indiferenciadas cultivadas em MEFs que estão a transição para Alimentador livre condições para uma passagem (Figura 1A). Enquanto nós descrevemos a diferenciação de hESCs neste protocolo, usamos esse protocolo para diferenciar com sucesso hiPSCs em células trofoblásticas. A transição para a m...

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar eficientemente células trofoblásticas humanas a partir de células-tronco pluripotentes humanas usando proteína morfogênica óssea 4 e inibidores das vias Activina/Nodal. Este método é adequado para a diferenciação eficiente de células-tronco pluripotentes humanas e pode gerar grandes quantidades de células para manipulação genética.

Na diferenciação in vitro de pluripotentes humanas Células-tronco em células Trofoblásticas

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

O objetivo geral deste protocolo é diferenciar células-tronco pluripotentes humanas em células trofoblásticas humanas utilizando morfogenética óssea 4 e inibidores das vias de sinalização ativa e nodal para estudar os eventos iniciais da formação e função placentária humana. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no estudo das funções das células trofoblásticas e na compreensão de como essas células são formadas. A principal vantagem desta técnica é que ela pode produzir um grande número de células trofoblásticas para uma ampla variedade de aplicações, incluindo genética, além de permitir ensaios de função celular.Para iniciar o experimento, descongele uma alíquota de matriz extracelular em gelo por três a quatro horas. Usando ponteiras geladas, um tubo cônico frio de 50 mililitros e meio de cultura modificado por Dulbecco, ou meio DMEM F12, transfira dois miligramas de matriz extracelular para 24 mililitros de DMEM F12 gelado. Transfira imediatamente o tubo cônico de 50 mililitros para o gelo e armazene a quatro graus Celsius.Para revestir placas de cultura de tecidos, adicione um mililitro de matriz extracelular diluída por poço de uma placa de seis poços. Agite suavemente a placa para cobrir os poços e incube a placa à temperatura ambiente por pelo menos uma hora. Aspire a matriz extracelular da nova placa e adicione meio condicionado por fibroblastos embrionários de camundongo ou MEFCM contendo bFGF.Use uma pipeta para transferir as pin&ccedil;as celulares raspadas da placa de MEF e distribua-as em al&iacute;quotas na placa revestida com matriz extracelular. Em seguida, incube a placa. Remova as c&eacute;lulas diferenciadas com uma pipeta de Pasteur antes de substituir o MEFCM diariamente por meio de bFGF, utilizando dois mililitros de meio por po&ccedil;o.Quando as colônias aparecerem grandes e brilhantes ao microscópio, realize a passagem de hESC a cada seis a sete dias. Quando as células livres de camada de alimentação estiverem prontas para a passagem, remova o meio e lave as células adicionando um mililitro de PBS usando uma pipeta. Aspire o PBS e substitua por 0,5 miligramas por mililitro de dispase pré-aquecida com uma pipeta.Incube as células a 37 graus Celsius por cinco minutos. Após a incubação, lave as células com PBS adicionando dois mililitros de PBS por poço e aspire o PBS. Adicione um mililitro de CM por poço e desprenda manualmente as células em pequenos agregados utilizando a ponta de uma pipeta de cinco mililitros.Em seguida, plaque os agregados celulares suspensos em novas placas revestidas com matriz extracelular. Prepare o meio de diferenciação. Utilize CM sem bFGF e adicione inibidores frescos antes do uso.Utilize hESC livres de células de alimentação crescendo em placas revestidas com matriz extracelular por um período de cultivo dentro de uma incubadora ajustada a 5% de oxigênio. Após a primeira passagem para as placas revestidas com matriz extracelular, deixe as células aderirem por 24 horas. No dia seguinte, inicie a diferenciação removendo o meio CM contendo bFGF e substituindo-o por meio CM contendo BMP4/A/P, com dois mililitros por poço em uma placa de seis poços.Continue o cultivo das células utilizando níveis de oxigênio a 4%. Substitua o meio condicionado contendo BMP4/A/P a cada dois dias, aspirando o meio antigo e adicionando meio novo contendo BMP4/A/P. Colete as células nos pontos de tempo desejados.Cultive os hESCs por duas passagens em matriz extracelular após transferi-los dos MEFs com meio hESC contendo bFGF. A alta confluência celular é importante, portanto, divida os hESCs em uma proporção de um para um em uma nova placa, o que garantirá pelo menos 50% de confluência no dia seguinte. Incube as células durante a noite no incubador com baixa concentração de oxigênio.No dia seguinte, substitua o meio por dois mililitros por poço de meio de diferenciação. Incube as células durante a noite em um incubador com baixa concentração de oxigênio. Antes da transfeção, recubra um recipiente com gelatina adicionando 0,1% de gelatina a um recipiente.Agite o recipiente para cobrir a placa, depois deixe a placa em temperatura ambiente. Após 20 minutos, remova a gelatina. Diferencie as células até o ponto temporal desejado.No dia anterior à transfeção, faça a tripsinização das células usando tripsina a 0,05% por cinco minutos. Plaque as células na confluência desejada em uma placa revestida com gelatina. Adicione o meio condicionado contendo BMP4/A/P sem bFGF e incube a cultura durante a noite.No dia seguinte, adicione meio de diferenciação fresco às células. Transfete os siRNAs utilizando um reagente de transfeção de siRNA. Para o DNA plasmático, utilize um reagente de lipofectamina apropriado.Siga o protocolo do produto conforme descrito para cada reagente de transfeção. Transfira os complexos de siRNA com lipofectamina para cada poço ou placa de células e misture suavemente. Em seguida, cultive as células durante a noite em uma incubadora com baixo teor de oxigênio.No dia seguinte, substitua o meio por meio de diferenciação fresco. Colete as células nos pontos de tempo desejados para verificar a eficiência de interrupção gênica utilizando RT-PCR quantitativa. Por fim, para colher as células, adicione um mililitro de tripsina 0,05% por poço e incube as células.Adicione cinco mililitros de meio MEF por poço para neutralizar a tripsina. Centrifugue as células a 200 × g durante cinco minutos e use o pellet celular para o isolamento de RNA. Com esta técnica, alterações morfológicas são claramente observadas.As células no primeiro dia de diferenciação são maiores do que as células do dia zero. À medida que a diferenciação progride, as células se dividem e se expandem a partir do centro da colônia, crescendo em direção à periferia. As colônias individuais se fundem até o quinto dia de diferenciação, com células crescendo umas sobre as outras.A análise de QRT-PCR revela que os níveis relativos de expressão do marcador de pluripotência NANOG são reduzidos em 75% após um dia de diferenciação quando as células são cultivadas com BMP4 e reduzidos em 90% na presença de BMP4/A/P. No segundo dia de diferenciação, os níveis de NANOG são muito baixos em células cultivadas com BMP4 isoladamente ou com BMP4/A/P, em comparação com aqueles cultivados em meio CM de hESC contendo beta FGF. Transfecções realizadas usando um plasmídeo GFP e introduzidas em células tratadas com BMP4/A/P no primeiro e terceiro dia de diferenciação obtiveram eficiência de transfeção entre 30 e 50% após 24 horas da transfeção.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como diferenciar células pluripotentes humanas em células trofoblásticas in vitro e como introduzir construtos de DNA para manipular a expressão gênica.

in-vitro-differentiation-human-pluripotent-stem-cells-into

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de blastocistos mouse ea derivação de células-tronco de blastocistos trofoblasto. Descrevemos também condições para a manutenção da propriedade de célula-tronco, bem como a indução de diferenciação em cultura.

Derivação de células-tronco do rato trofoblasto de blastocistos

Neste protocolo, descreve-se a dissecção de placenta de rato sobre a gravidez d10.5, seguido de isolamento das células trofoblásticas, utilizando um gradiente de Percoll. Em seguida, demonstrar o uso de células isoladas, num ensaio de invasão de Matrigel.

Isolamento de células primário do mouse trofoblasto e Ensaio invasão do trofoblasto

Tradicionais, duas técnicas de cultura de células dimensional muitas vezes resultam em características alteradas com relação a marcadores de diferenciação, citocinas e fatores de crescimento. Tridimensional de cultura de células no sistema de rotação de cultura de células (CCRs) restabelece a expressão de muitos destes fatores, como mostrado aqui com uma linha extravilosas trofoblasto celular.

Sistemas Célula de rotação de cultura para cultura de células humanas: células trofoblásticas Humanos como um modelo

Este manuscrito apresenta um modelo in vitro único de células citotrofoblásticas vilosas humanas imunopurificadas cultivadas sob hipóxia/reoxigenação. Este modelo é adequado para estudar os efeitos protetores de tratamentos promissores, como a melatonina, nas complicações da gravidez associadas ao aumento do estresse oxidativo e à alteração da função placentária.

Trophoblast primário humano Cultura celular modelo para estudar os efeitos protetores da melatonina contra a hipóxia / Disruption induzida pela reoxigenação

Aqui apresentamos um protocolo para a conversão direta de fibroblastos embrionários murinos em células-tronco trofoblásticas totalmente funcionais e estáveis por meio da superexpressão de dez dias de Tfap2c, Gata3, Eomes e Ets2.

Protocolo para a conversão directa de murino embrionárias fibroblastos em células-tronco trofoblásticas

As células gigantes trofoblásticas (TGCs) desempenham um papel fundamental na placenta para garantir uma gravidez saudável. Apresentamos um protocolo para avaliar o estado transcricional de genes em TGCs por hibridização in situ fluorescente nascente em cortes de criostato de embriões pós-implantação ou culturas de curto prazo de cones ectoplacentários embrionários do dia 7.

Análise transcricional por RNA Nascente PEIXES de<em&gt; In Vivo</em&gt; Células trofoblásticas gigantes ou<em&gt; In Vitro</em&gt; Culturas de curto prazo de Ectoplacental Cone explantes

Aqui, apresentamos um protocolo altamente acessível para avaliar o movimento de célula em células do trofoblasto humana usando três ensaios in vitro: ensaio de zero, o ensaio de invasão transwell e o ensaio de proliferação celular.

Em Vitro ensaios para avaliar a migração, invasão e proliferação de linhas de células humanas imortalizado primeiro trimestre trofoblasto

Aqui, descrevemos um método para aquecer blastocistos humanos vitrificados, culminando-os através do período de implantação in vitro, digerindo-os em células únicas e coletando células trophoblastas precoces para uma investigação mais aprofundada.

Coleção celular única de células trophoblastos em embriões humanos de estágio de peri-implantação

Um protocolo delineando a formação de blastóides humanos que, eficientemente, oportuna e sequencialmente geram células semelhantes a blastocistos.

Protocolo para blastóides humanos modelando desenvolvimento e implantação de blastocisto

O presente protocolo permite a recuperação de estruturas semelhantes a tubos formadas no ensaio clássico de formação de tubos de angiogênese in vitro , onde células, como células trofoblásticas, se organizam em estruturas semelhantes a capilares sobre uma camada de matriz de membrana basal extracelular. As estruturas recuperadas são usadas para isolamento de RNA e proteínas para várias análises bioquímicas.

Recuperação de células trofoblásticas do ensaio de formação de tubos de angiogênese para análise de expressão de marcadores de diferenciação

Aprenda a diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas em células trofoblásticas usando BMP4 e inibidores de vias de sinalização. Este método eficiente permite estudar a formação placentária e realizar manipulações genéticas.

Na diferenciação in vitro de pluripotentes humanas Células-tronco em células Trofoblásticas

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