Name: PAR-Clip - um método para identificar em toda a Transcriptoma Sítios de Ligação de Proteínas RNA Binding (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Aprenda o método PAR-CLIP para identificar sítios de ligação de proteínas de RNA em escala transcriptômica usando nucleosídeos fotoreativos e UV. Esta técnica permite estudar interações RBP-RNA com alta precisão.

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Agradecemos a membros do laboratório Tuschl para discussões úteis. MH é suportado pelo Deutscher Akademischer Austauschdienst (DAAD). Este trabalho foi financiado pelo Fundo Nacional Suíço Grant # 3100A0-114001 a MZ; TT é um investigador HHMI, e trabalhar em seu laboratório foi apoiado pelo NIH concede GM073047 e MH08442 ea Fundação Starr.

O protocolo a seguir descreve o procedimento PAR-clip para HEK293 células que expressam FLAG / HA-tagged IGF2BP1 após indução com doxiciclina. Vamos usar um anticorpo anti-FLAG para imunoprecipitação. PAR-Clip irá funcionar com qualquer linha de células expressando níveis detectáveis ​​do endógeno, untagged RNA binding protein (RBP) de juros, se um anticorpo eficiente para imunoprecipitação está disponível. Células expansão <ol><li> Expandir FlpIn-HEK293/TO/FLAG/HA-IGF2BP1 células em meio de crescimento. Recomendamos o uso de entre 100-400 x 10 6 células (aprox. 10-40 15 centímetros placas de cultura de células) como ponto de partida. Cultivá-las a aproximadamente 80% confluência. </li><li> 14 h antes de adicionar um crosslinking) 4 Tiouridina a uma concentração final de 100 mM (1:1000 v / v de um M-1 4 Tiouridina solução estoque) diretamente para o meio de cultura celular e b) induzir a expressão do FLAG / HA tagged IGF2BP1 pela adição de 1 mg / ml de doxiciclina (1:10.000 v / v da solução estoque 10 mg / ml doxiciclina). NOTA: em vez de 4-Tiouridina você também pode usar 100 mM de 6 thioguanosine. </li></ol> UV-Crosslinking <ol><li> Lave as células uma vez com 10 ml gelada PBS por placa e remover completamente PBS. </li><li> Placas lugar em uma bandeja com gelo e irradiar descoberto com 0,15 J / cm 2 de 365 nm de luz UV em um Stratalinker 2400 (Stratagene) ou dispositivo similar. </li><li> Raspe as células com um policial de borracha em 1 ml de PBS por transferência de placas, para 50 tubos de centrifugação ml e recolher por centrifugação a 500 xg por 5 min a 4 ° C e desprezar o sobrenadante. 100 x 10 6 células HEK293 (10 15 pratos cm) vai render aprox. 1 ml de pellet celular molhado. </li><li> (Opcional) menos que você queira continuar diretamente com a lise celular, choque congelar o pellet celular em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C. Pellets de células podem ser armazenadas por pelo menos 12 meses. </li></ol> Lise celular e RNaseT1 digest <ol><li> Tome-se pellet celular de células reticuladas em 3 volumes de 1x tampão de lise NP40 e incubar no gelo por 10 min. </li><li> Lisado de células claras por centrifugação a 13.000 xg por 15 min a 4 ° C. </li><li> Limpar o lisado ainda filtrando-a através de uma membrana de 0,2 mm seringa filtro (Acrodisc Pall ou equivalente). </li><li> Adicionar RNase T1 (Fermentas, 10.000 U / mL) para uma concentração final de C. ° 1 U / mL e incubar em banho-maria por 15 min a 22 Reação fria posteriormente por 5 min no gelo antes de prosseguir. </li></ol> Imunoprecipitação e recuperação de fragmentos de RNA alvo reticulado Usando o separador magnético Siga estas orientações ao longo da preparação da amostra para evitar a esferas magnéticas de secar. <ol><li> Coloque o tubo que contém as contas sobre o suporte magnético para 1 2 minutos. </li><li> Adicione o buffer para o tubo enquanto que o tubo está no separador magnético. </li><li> Tampe o tubo, remova-o do separador magnético, e ressuspender as esferas. Você pode voltar a suspender as contas sacudindo o tubo com o dedo ou usar um vortexer fixado em 5 6. </li><li> Centrifugar brevemente para coletar todas as pérolas que podem permanecer na tampa do tubo. </li><li> Repita os passos 1 a 4, conforme necessário. </li></ol> Preparação de esferas magnéticas <ol><li> Transferência de 10 ml de partículas de proteínas Dynabeads G magnética (Invitrogen) por lisado celular ml (para uma experiência típica que deve ser aprox. 40 50 ul de contas) para um microtubo de 1,5 ml. Lavar contas duas vezes com 1 ml de tampão citrato-fosfato. </li><li> Ressuspender em duas vezes o volume de tampão citrato-fosfato em relação ao volume original de suspensão de esferas. </li><li> Adicionar 0,25 mg de anticorpo anti-FLAG M2 monoclonal (Sigma) por ml de suspensão e incubar em uma roda giratória por 40 min em temperatura ambiente. </li><li> Lavar contas duas vezes em 1 ml de tampão citrato-fosfato para remover anticorpos não ligados. </li><li> Ressuspender contas em duas vezes o volume de tampão citrato-fosfato em relação ao volume original de suspensão de esferas. </li></ol> Imunoprecipitação (IP), segundo a digestão RNase T1 e desfosforilação <ol><li> Adicionar 20 l de recém-preparados anticorpos conjugados esferas magnéticas por ml de RNase T1 parcial lisado celular tratados e incubar em 15 tubos de centrifugação ml em uma roda giratória por 1 hora a 4 ° C. </li><li> Colete esferas magnéticas em um coletor de partículas magnéticas para 15 e 50 tubos de centrifugação ml (Invitrogen) e transferir para tubos de 1,5 ml de microcentrífuga. </li><li> Lavar contas 3 vezes em 1 ml de tampão de lavagem IP. </li><li> Adicionar RNaseT1 (Fermentas, 10.000 U / mL) a uma concentração final de 100 U / mL e incubar a suspensão de esferas em banho-maria por 15 min a 22 ° C. Legal posteriormente no gelopor 5 min. </li><li> Lavar contas 3 vezes em 1 ml de alto-sal tampão de lavagem. </li><li> Contas ressuspender em 1 volume de tampão desfosforilação </li><li> Adicionar fosfatase alcalina intestinal bezerro (CIAP, NEB) para uma concentração final de 0,5 U / mL, e incubar a suspensão por 10 min a 37 ° C. </li><li> Lavar contas duas vezes em 1 ml de fosfatase tampão de lavagem </li><li> Lavar contas duas vezes em polinucleotídeo quinase buffer (PNK) sem TDT (televisão digital terrestre a concentração necessária para a reação enzimática é alta o suficiente para danificar a esferas magnéticas). </li><li> Contas ressuspender em um volume original talão de PNK tampão </li></ol> Radiomarcação dos segmentos de RNA reticulado às proteínas immunoprecipitated <ol><li> À suspensão de esferas descrito acima, adicione Υ-32 P-ATP para uma concentração final de 0,5 PNK μCi / mL e T4 (NEB) a 1 U / mL em um volume original talão. Incubar a suspensão por 30 min a 37 ° C. </li><li> Adicionar não-radioativo ATP para obter uma concentração final de 100 mM e incubar por mais 5 minutos a 37 ° C. </li><li> Lavar a esferas magnéticas 5 vezes com 800 mL de tampão PNK sem DTT. </li><li> Volte a suspender as contas em 70 mL de SDS-PAGE tampão de carregamento. </li></ol> SDS-PAGE e eletroeluição reticulado de RNA-proteína complexos de fatias de gel <ol><li> Incubar a suspensão radiolabeled por 5 min em um bloco de aquecimento a 95 ° C para desnaturar e solte o RBP immunoprecipitated com RNA reticulado e vortex. </li><li> Remova a esferas magnéticas sobre o separador e transferir o sobrenadante para um tubo limpo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Carga 40 mL do sobrenadante por poço de uma Novex Bis-Tris 4-12% (Invitrogen) em gel de poliacrilamida pré-moldados e executar o gel por 55 min em 200 V. </li><li> Desmonte a câmara de gel e desmantelar o gel, deixando-a montada em uma placa. Para facilitar o alinhamento do gel para a impressão em papel phosphorimager, recomendamos implantar três minúsculos pedaços gel radioativos assimetricamente menos três dos quatro cantos do gel. Peças gel radioativos podem ser coletados a partir de géis que foram anteriormente utilizadas para purificar radiolabeled oligonucleotídeos sintéticos. Embrulhe o gel em filme plástico (por exemplo, Saran wrap) para evitar a contaminação. </li><li> Expõe o gel a uma tela phosphorimager blanked para 1 h e visualizar em um phosphorimager. </li><li> Alinhar o gel na parte superior da impressão phosphorimager usando as peças gel implantado para orientação. Cortar as bandas que correspondem ao tamanho esperado de RBP (IGF2BP1, aprox. 75 kDa) e transferir para um D-Tube Midi dialisadores e adicionar 800 mL 1x tampão SDS execução. </li><li> Electroelute o reticulado RNA-RBP complexo em 1x SDS tampão de corrida a 100 V por 2 h. excisadas do gel e electroeluted em uma D-Tube de dialisadores Midi (Novagen) em 800 mL de buffer SDS execução de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol> Digestão por proteinase K <ol><li> Adicionar um volume igual de tampão 2x proteinase K em relação ao electroeluate, seguido pela adição de proteinase K (Roche) para uma concentração final de 1,2 mg / ml. Incubar por 30 min a 55 ° C. </li><li> Recuperar o RNA por ácido fenol / clorofórmio / extração IAA (25:24:1, pH 4,0), seguido por uma extração de clorofórmio. Adicionar 1 ml de glicogênio (estoque 10 mg / ml) precipitar o RNA, adicionando 3 volumes de etanol. Dissolver o sedimento em 10,5 mL de água. </li></ol> preparação biblioteca de cDNA e sequenciamento de profundidade Levar o RNA recuperados através de um protocolo de preparação de cDNA da biblioteca padrão originalmente descrita para a clonagem de pequenos RNAs reguladores 19. O primeiro passo, a ligadura 3 'adaptador, foi realizado como descrito em uma escala de 20 l utilizando 10,5 mL do RNA recuperado. Use o seqüenciamento Solexa adaptador conjuntos descritos. Dependendo da quantidade de RNA recuperado, 5'-adaptador-3'-adaptador produtos sem inserções podem ser detectados após a amplificação do cDNA como faixas adicionais PCR. Em tais casos, o produto mais impostos PCR de tamanho esperado de um NuSieve 3% de baixo ponto de fusão agarose gel, eluída do produto da PCR do gel peças usando o kit GelElute (Qiagen) e seqüência usando a tecnologia Solexa. Um Solexa seqüenciamento executar normalmente oferece, entre 6 e 10 milhões seqüência lê-se que são suficientes para uma cobertura ampla do transcriptoma sítios de ligação das proteínas RNA vinculativo. Análise bioinformática Análise bioinformática cuidadosa da seqüência lê precisa ser feito para obter insights significativos para os locais de ligação para o RNA RBP examinados, como o elemento de reconhecimento de RNA, as regiões preferenciais de ligação a RBP tem (exônico vs intrônicos, codificação seqüência vs não traduzidas seqüência). A seqüência lê precisam ser alinhados contra as bases de dados do genoma e EST. Nós usamos geralmente lê mapping exclusivamente ao genoma com até um desencontro de inserção ou exclusão de construir clusters de seqüência de leituras que podem então ser analisados. A freqüência de mutações características na seqüência cluster lê, T a transições C ao usar 4-SU e G para A transição quando utilizando 6-SG, são indicativos de seqüências de sucesso reticulado. Em nossa experiência RNAs uncrosslinked rotulados com 4-SU mostram uma taxa de mutação de fundo de cerca de 20%. Esta taxa é aumenta para aprox. 50-80% em cima de reticulação. A descrição detalhada da análise bioinformática pode ser encontrado no material suplementar da publicação por Hafner et al. 18 Passos opcional Determinação dos níveis de incorporação de 4-Tiouridina em RNA total Isolar RNA total a partir da linha celular estável expressando a RBP de interesse depois de crescer em meio suplementado com 100 mM 4SU 16 h antes da colheita. Como controle, as células cultivadas sem adição de colheita 4SU. Isolar RNA total através da adição de 3 volumes de reagente Trizol (Sigma) para as pelotas de células lavadas seguindo as instruções do fabricante s. Além disso foi purificar RNA total usando Qiagen RNeasy acordo com o protocolo do fabricante. Para evitar oxidação da 4SU durante RNA isolamento e análise, adicionar 0,1 mM ditiotreitol (TDT) para os buffers de lavar e subseqüentes passos enzimáticos. Digerir e desfosforilada RNA total de nucleosídeos único para a análise de HPLC como descrito anteriormente 20. Brevemente, em um volume de 30 mL, incubar 40 mg de RNA total foram purificados por 16 horas a 37 ° C com 0,4 U de fosfatase alcalina bacteriana (Worthington Bioquímica) e 0,09 veneno de cobra U fosfodiesterase (Worthington Bioquímica). Como padrão de referência, use um RNA sintético 4SU marcado, (nós standardly uso CGUACGCGGAAUACUUCGA (4SU) U) e também submetê-lo para completar a digestão enzimática. Separar os misturas de ribonucleosídeos por HPLC em uma descoberta Supelco C18 (ligado partículas de sílica de fase M 5, 250 x 4,6 mm) coluna de fase reversa (Bellefonte PA, EUA). Buffers HPLC são 0,1 M TEAA em acetonitrila 3% (A) e acetonitrila 90% em água (B). Use um gradiente isocrático: 0 B% por 15 min, 0-10 B% por 20 min, 1-10 B% por 30 min. Aplicar a 5 min B 100% lavar aplicada entre corre para limpar a coluna de HPLC. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2034/2034fig1.jpg" alt="Figura 1"> Figura 1 (painel da direita) mostra um resultado representativo de um PAR-Clip realizado com linhagens de células expressando FLAG / HA-tagged IGF2BP1 com 4 e 6-SU-SG. Note-se que a eficiência de reticulação de 6-SG para IGF2BP1 é menor do que a eficiência de reticulação para 4-SU. A baixa eficiência de reticulação irá resultar em uma maior fundo de seqüências derivadas de fragmentos de RNAs celulares abundantes e, portanto, você deve considerar a expansão da experiência ao usar menos eficiente nucleosídeos fotorreativas. O painel esquerdo da Figura 1 mostra uma comparação do uso de diferentes análogos uridina fotorreativas que poderia ser potencialmente usada para PAR-Clip em comparação com crosslinking nm tradicional UV 254. A intensidade da banda radioativo do comprimento correto lhe dá uma boa idéia se o experimento PAR-Clip tem trabalhado e tem isolado RNA suficiente para realizar um pequeno RNA seqüenciamento protocolo (passo-a-passo para a preparação descrição biblioteca de cDNA de pequenas seqüenciamento RNAs podem ser encontrados em 19). A freqüência de mutações características lê na seqüência, T a transições C ao usar 4-SU e G para A transição quando utilizando 6-SG, são indicativos de seqüências de sucesso reticulado. Em nossa experiência RNAs uncrosslinked rotulados com 4-SU mostram uma taxa de mutação de fundo de cerca de 20%. Esta taxa é aumenta para aprox. 50-80% em cima de reticulação.

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</ol>

TT é um conselheiro co-fundador e científicos para Alnylam Pharmaceuticals e um assessor de Regulus Therapeutics.

Tampões e reagentes Crescimento a médio HEK293 células <ul><li> DMEM </li><li> 10% FBS </li><li> 2 mM L-Glutamina </li><li> 100 U / ml de penicilina </li><li> Estreptomicina 100 U / ml </li><li> Higromicina 100 mg / ml </li><li> 15 mcg / ml blasticidin </li></ul> 4 Tiouridina solução estoque (1 M) <ul><li> 260,27 mg de 4 Tiouridina </li><li> 1 ml DMSO </li></ul> Doxiciclina estoque (10 mg / ml) <ul><li> 10 mg doxiciclina </li><li> 1 ml DMSO </li></ul> 1x tampão de lise NP40 Prepare um estoque de tampão 5x sem TDT e os inibidores da protease. Adicionar TDT e inibidor da protease diretamente antes do experimento. <ul><li> 50 mM HEPES, pH 7.5 </li><li> 150 mM KCl </li><li> 2 mM EDTA </li><li> 1 mM NaF </li><li> 0,5% (v / v) NP40 </li><li> 0,5 mM DTT </li><li> completa EDTA livre coquetel inibidor de protease (Roche) </li></ul> Tampão citrato-fosfato <ul><li> 4,7 g / l de ácido cítrico </li><li> 9,2 g / l Na 2 HPO 4 </li><li> pH 5,0 </li></ul> IP lave-buffer <ul><li> 50 mM HEPES-KOH, pH 7,5 </li><li> 300 mM KCl </li><li> 0,05% (v / v) NP40 </li><li> 0,5 mM DTT (adicionar diretamente antes de experiência) </li><li> completa EDTA livre coquetel inibidor de protease (Roche) (adicionar diretamente antes da experiência) </li></ul> Alto-sal tampão de lavagem <ul><li> 50 mM HEPES-KOH, pH 7,5 </li><li> 500 mM KCl </li><li> 0,05% (v / v) NP40 </li><li> 0,5 mM DTT (adicionar diretamente antes do experimento) </li><li> completa EDTA livre coquetel inibidor de protease (Roche) (adicionar diretamente antes do experimento) </li></ul> Buffer de desfosforilação <ul><li> 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 </li><li> 100 mM NaCl </li><li> 10 mM MgCl 2 </li><li> 1 mM DTT </li></ul> Fosfatase tampão de lavagem <ul><li> 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 </li><li> 20 mM EGTA </li><li> 0,5% (v / v) NP40 </li></ul> Polinucleotídeo quinase buffer (PNK) sem TDT <ul><li> 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 </li><li> 50 mM NaCl </li><li> 10 mM MgCl 2 </li></ul> PNK tampão <ul><li> 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 </li><li> 50 mM NaCl </li><li> 10 mM MgCl 2 </li><li> 5 mM DTT </li></ul> SDS PAGE tampão de carregamento <ul><li> Glicerol 10% (v / v) </li><li> 50 mM Tris-HCl, pH 6,8 </li><li> 2 mM EDTA </li><li> 2% SDS (w / v) </li><li> 100 mM DTT </li><li> 0,1% azul de bromofenol </li></ul> 2x tampão proteinase K <ul><li> 100 mM Tris-HCl, pH 7,5 </li><li> 150 mM NaCl </li><li> 12,5 mM EDTA </li><li> 2% (w / v) SDS </li></ul>

par-clip - um método para identificar em toda a transcriptoma sítios de ligação de proteínas rna binding

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

Transcrições de RNA são submetidos a pós-transcricional de regulação gênica, interagindo com centenas de RNA-proteínas de ligação (RBPs) e microRNA contendo complexos de ribonucleoproteínas (miRNPs) que muitas vezes são expressos em uma célula do tipo dependente. Para entender como a interação desses fatores RNA-binding afeta a regulação da transcrição individual, mapas de alta resolução de in vivo da proteína-RNA interações são necessárias 1. Uma combinação de fatores genéticos, bioquímicos e abordagens computacionais são tipicamente aplicados para identificar RNA-RBP ou RNA-RNP interações. Microarray perfis de RNAs associados RBPs immunopurified (RIP-Chip) 2 define metas em nível de transcriptoma, mas sua aplicação é limitada para a caracterização das interações cineticamente estável e somente em casos raros 3,4 permite identificar o elemento de reconhecimento de RBP (RRE ) dentro do RNA alvo de comprimento. Mais direta RBP informações do site-alvo é obtido através da combinação in vivo crosslinking UV 5,6 imunoprecipitação com 7-9 seguido pelo isolamento de segmentos de RNA reticulado e seqüenciamento de cDNA (CLIP) 10. CLIP foi usado para identificar alvos de uma série de RBPs 11-17. No entanto, CLIP é limitada pela baixa eficiência de UV 254 nm crosslinking RNA-proteína, e da localização do crosslink não é facilmente identificável dentro dos fragmentos seqüenciados reticulado, o que torna difícil separar segmentos de UV-reticulado RNA alvo de fundo não-reticulado RNA também fragmentos presentes na amostra. Nós desenvolvemos uma abordagem crosslinking poderosa baseada em células para determinar em alta resolução e transcriptoma-wide os sítios de ligação de celular e RBPs miRNPs que chamamos de PAR-Clip (Photoactivatable-ribonucleosídeo-Enhanced Crosslinking e imunoprecipitação) (ver fig. 1A para um esboço do método). O método baseia-se na incorporação de análogos de ribonucleosídeo fotorreativas, tais como 4-Tiouridina (4-SU) e 6-thioguanosine (6-SG) em transcrições de RNA nascente por células vivas. Irradiação das células pela luz UV de 365 nm induz crosslinking eficiente de fotorreativas nucleosídeos marcado RNAs celulares para RBPs interagindo. Imunoprecipitação da RBP de interesse é seguido pelo isolamento do RNA reticulado e coimmunoprecipitated. O RNA isolado é convertida em uma biblioteca de cDNA e profundo seqüenciado usando a tecnologia Solexa. Um traço característico de bibliotecas de cDNA preparados por PAR-Clip é que a posição precisa de reticulação podem ser identificados por mutações que residem no cDNA seqüenciado. Ao usar 4-SU, timidina seqüências reticulado para a transição da citidina, enquanto usando 6-SG resulta em guanosina à adenosina mutações. A presença das mutações em seqüências reticulado torna possível separá-las do fundo de seqüências derivadas de abundantes RNAs celulares. Aplicação do método a um número de diversas proteínas de ligação RNA foi relatada em Hafner et al. 18

Transcrições RNA estão sujeitos à regulamentação posttranscriptional extensa que é mediada por uma multidão de proteínas RNA-binding trans-acting (RBPs). Aqui apresentamos um método generalizado para identificar com precisão e em escala transcriptoma-wide os sites ligação do RNA RBPs.

PAR-Clip - um método para identificar em toda a Transcriptoma Sítios de Ligação de Proteínas RNA Binding

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

O objetivo geral deste procedimento é determinar os amplos locais de ligação do transcriptoma de proteínas de ligação ao RNA ou RVPs. Isso é feito primeiro usando análogos de nucleosídeos fotorreativos para rotulagem in vivo de transcritos nascentes. A segunda etapa do procedimento é reticular o RNA e as proteínas de ligação ao RNA por luz UV de 365 nanômetros.A terceira etapa do procedimento é imunoprecipitar a proteína de ligação ao RNA investigada e recuperar a ligação cruzada com o RNA. A etapa final do procedimento é converter o RNA em uma biblioteca de CD NA e sequência profunda. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram os amplos sítios de ligação do transcriptoma dos RVPs e permitem a definição do elemento de reconhecimento de RNA e suas preferências de ligação.Olá, meu nome é Marcus Hoffner, do laboratório de Tom SEL na Universidade Rockefeller em Nova York. Hoje mostraremos um método chamado par lip ou análogo fotologizável do nucleosídeo da costela reticulação aprimorada e imunoprecipitação. Usamos este procedimento em nosso laboratório para identificar em um transcriptoma por sua escala locais de ligação de proteínas de ligação a RNA e seus motivos e preferências de ligação.Ok, então vamos começar. A reticulação UV in vivo começa em uma capela de fluxo laminar. Neste protocolo, usaremos IGF marcado com duas células BP uma como um modelo exemplar usando técnica estéril.Expanda HEK 2 93 células expressando de forma estável bandeira HA marcada com IGF dois BP um sob controle de um repressor Tet em meio de cultura de células HEK 2 93 use entre 100 e 400 vezes 10 para as sextas células e cresça-as para aproximadamente 80% de fluência co. Às 14 horas antes da reticulação, as células tinham o análogo de ribosídeo fotorreativo para tiouridina ou para SU diretamente no meio de cultura celular. Alternativamente, seis th guine ou seis SG podem ser usados após a adição do ribosídeo fotorreativo induzir a expressão da bandeira HA marcada com IGF dois BP um pela adição de células de doxiciclina são então incubados durante a noite na incubadora de células.Em seguida, transvase o meio de crescimento. Em seguida, lave as células uma vez com 10 mililitros de solução salina tamponada com fosfato gelado por placa. Em seguida, remova o PBS completamente por decantação.Coloque as placas descobertas em uma bandeja com gelo e irradie-as com luz UV de 365 nanômetros em um reticulador de 2.400 UV ou equivalente subsequente à radiação UV, raspe as células com um policial de borracha em um mililitro de PBS por placa. Transferir as células para tubos de centrifugação de 50 mililitros e centrifugar a 500 G durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Descarte o super nome e guarde o pellet da célula.Neste ponto, os pellets celulares podem ser congelados rapidamente em nitrogênio líquido e armazenados a menos 80 por pelo menos 12 meses. Para continuar com o procedimento, suspender o pellet em três volumes de um tampão de lise X NP 40 e incubar em gelo por 10 minutos. Limpar o lisado celular por centrifugação a 13 000 g durante 15 minutos a quatro graus Celsius.Após a centrifugação, limpe ainda mais o lisado filtrando-o através de um filtro de seringa de membrana de cinco mícrons. Finalmente, adicione RNAs T um a uma concentração final de uma unidade por microlitro e incube em banho-maria a 22 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, resfrie a reação no gelo por cinco minutos.Seguindo a reticulação UV in vivo. Prepare as esferas magnéticas para imunoprecipitação. Transfira 10 microlitros de partículas magnéticas de proteína G de esferas dyna por mil de lisado celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.Em seguida, coloque o tubo contendo as contas em um suporte magnético por um a dois minutos. Remova o sobrenadante e adicione um mililitro de tampão fosfato de citrato ao tubo enquanto estiver no separador magnético. Em seguida, tampe o tubo e vortex a amostra para ressuspender as contas.Centrifugue brevemente para coletar quaisquer contas restantes na tampa do tubo. Repita esta lavagem com mais um mililitro de tampão fosfato de citrato. Após a lavagem resus, suspenda as esferas e o tampão fosfato de citrato a um volume duas vezes maior do que o volume original da suspensão de beterraba.Em seguida, adicione 0,25 miligramas de Anti-Flag M, dois anticorpos monoclonais por um mililitro de suspensão batida. Incube a suspensão em uma roda giratória por 40 minutos em temperatura ambiente após a incubação, lave os grânulos duas vezes em um mililitro de tampão fosfato de citrato conforme descrito anteriormente, esta lavagem serve para remover qualquer anticorpo não ligado após a lavagem Resus, suspenda os grânulos e tampão de fosfato de citrato como antes de quatro. Para iniciar a imunoprecipitação, adicione as esferas magnéticas conjugadas com anticorpos recém-preparados ao lisado de células tratadas com RNAs T one.Transfira a mistura para tubos de centrifugação de 15 mililitros e gire por uma hora a quatro graus Celsius. Após a incubação, colete os grânulos magnéticos, descarte os grânulos de ressuspensão sobrenadante em um mililitro de tampão de lavagem IP e transfira-os para tubos de centrífuga de 1,5 mililitro. Lave as contas conforme descrito anteriormente duas vezes em um mililitro de tampão de lavagem IP.Após a lavagem final, ressus, suspenda os grânulos no volume original do grânulo do tampão de lavagem IP. Em seguida, adicione RNAT um a uma concentração final de 100 unidades por microlitro. Incube a suspensão do cordão em banho-maria a 22 graus Celsius por 15 minutos.Em seguida, arrefecer a suspensão no gelo durante cinco minutos. Em seguida, lave as contas três vezes em um mililitro de tampão de lavagem com alto teor de sal. Em seguida, ressuspenda os grânulos em um volume original de tampão de desfosforilação.Adicione a fosfatase alcalina intestinal de bezerro a uma concentração final de 0,5 unidades por microlitro e incube a suspensão por 10 minutos a 37 graus Celsius. Lave as esferas duas vezes em um mililitro de tampão de lavagem de fosfatase e depois mais duas vezes em polinucleotídeo quinase ou tampão PNK sem DTT. Por fim, ressuspenda os grânulos em um volume de grânulo original do buffer PNK.Para iniciar a marcação de rádio do RNA reticulado. Adicione gama 32 PATP e T quatro PNK a um volume de cordão original da suspensão de cordão recém-preparada. Incube a suspensão por 30 minutos a 37 graus Celsius.Em seguida, adicione um TP não radioativo à suspensão e incube-o por mais cinco minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, lave as esferas magnéticas cinco vezes com 800 microlitros de tampão PNK sem TDT. Por fim, ressuspenda as esferas em 70 microlitros de página SDS.O tampão de carregamento incuba a suspensão do marcador de rádio por cinco minutos em um bloco de calor a 95 graus Celsius para desnaturar e liberar as proteínas de ligação ao RNA imunoprecipitadas com o RNA reticulado. Em seguida, remova os grânulos magnéticos do separador e transfira o super natin para um tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 mililitro Carregue 40 microlitros da casula por poço de um gel de poliacrilamida novox bis triss quatro a 12% pré-moldado e execute o gel por 55 minutos a 200 volts. Assim que o gel escorrer, desmonte a câmara de gel e desmonte as placas, deixando o gel montado em uma placa para facilitar o alinhamento do gel com a impressão em papel do gerador de imagens de fosfo.Implante três pequenos pedaços de gel radioativo assimetricamente nos cantos do gel. Enrole o gel em um filme plástico, como filme plástico, para evitar contaminação. Exponha o gel a uma tela de fosfato em branco por uma hora e em um gerador de fosfo.Em seguida, alinhe o gel na parte superior da impressão do gerador de imagens de fosfato usando as peças de gel implantadas para orientação. Corte as bandas que correspondem ao tamanho esperado da proteína de ligação ao RNA ou RBP. Transfira as bandas para um tubo MIDI dialisador dtu e adicione 800 microlitros de um eletroeluidor de buffer XSDS.O complexo R-N-A-R-B-P reticulado a 100 volts por duas horas de acordo com as instruções do fabricante. Após a eletroeluição. Adicione tampão de proteinase K e proteinase K incube a solução por 30 minutos a 55 graus Celsius.Recuperar o RNA por extração ácida de fenol clorofórmio isoamílico álcool, seguida de extração de clorofórmio. Em seguida, adicione um microlitro de glicogênio e precipite o RNA adicionando três volumes de etanol. Por fim, dissolva o pellet resultante em 10,5 microlitros de água.Uma vez recuperado o RNA, subaja-o a um protocolo padrão de preparação de biblioteca de CDNA e realize uma análise bioinformática cuidadosa das leituras de sequência. Resultados representativos para um clipe par realizado com HK 2 93 células expressando bandeira H ha marcado com IGF dois BP um são mostrados com os análogos de nucleosídeos fotorreativos quatro SU e seis SG A eficiência de reticulação do ribosídeo fotorreativo alternativo seis SG é geralmente menor do que para quatro su. A menor eficiência de reticulação pode resultar em um maior fundo de sequências derivadas de fragmentos de RNAs celulares abundantes e, portanto, mais células devem ser usadas inicialmente para o experimento.Diferentes análogos de uridina fotorreativos de clipe par são comparados à reticulação ou clipe tradicional de 2 54 nanômetros, como visto aqui. A reticulação da proteína de RNA UV 2 de 54 nanômetros tem eficiência de reticulação limitada. A intensidade da banda radioativa de tamanho apropriado indica se o experimento do clipe par funcionou e se RNA suficiente foi isolado para realizar um pequeno protocolo de sequenciamento de RNA.As frequências de mutações características nas leituras sequenciadas após a análise bioinformática são indicativas de sequências reticuladas com sucesso. Essas mutações são transições T duas C ao usar quatro transições SU e G duas A ao usar o sucesso. G. A característica definidora do park lip é a possibilidade de derivar a localização da ligação cruzada marcando uma mutação característica residente nas bibliotecas CD NA preparadas a partir dos RNAs recuperados.Isso permite a fácil separação do sinal derivado de RNAs especificamente ligados, do ruído de sequências derivadas de fragmentos co-isolados de RNAs celulares abundantes. Então, mostramos hoje como isolar segmentos de RNA, especificamente reconhecidos por proteínas de ligação a RNA. Ao fazer este procedimento.É importante trabalhar RNAs livres. Então foi isso. Obrigado por assistir e boa sorte com os experimentos.

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Um método rápido de alta capacidade para Ribonucleoproteínas Mapping (RNPs) no pré-mRNA Humanos

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as interações RNA-proteína estão no centro de muitos processos celulares. Aqui, descrevemos um método in vivo para isolar RNA específico e identificar novas proteínas associadas a ele. Isso pode lançar uma nova luz sobre como os RNAs são regulados na célula.

Novel de Ligação a RNA Proteínas Isolamento pelo rápido Metodologia

Descreveremos um protocolo para identificar proteínas RNA-obrigatórias e mapear suas regiões de ligação de RNA em células vivas, usando photocrosslinking UV-mediada e espectrometria de massa.

Preparação da amostra para identificação de espectrometria de massa-baseada das regiões de ligação de RNA

Aqui, apresentamos um protocolo de captura interativo aplicado aos protoplastos de mesofila da folha de Arabidopsis thaliana . Este método baseia-se criticamente na reticulação UV in vivo e permite o isolamento e identificação de proteínas de ligação a mRNA de plantas a partir de um ambiente fisiológico.

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Captura e identificação de proteínas de ligação de RNA usando clique química assistida RNA-interactome capturam estratégia (CARIC)

A especificidade da sequência é fundamental para a regulação genética. As proteínas reguladoras que reconhecem sequências específicas são importantes para a regulação genética. Definir locais de ligação funcionais para essas proteínas é um problema biológico desafiador. Uma aproximação iterativo para a identificação de um local obrigatório para uma proteína RNA-obrigatória é descrita aqui e é aplicável a todas as proteínas RNA-obrigatórias.

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PAR-Clip - um método para identificar em toda a Transcriptoma Sítios de Ligação de Proteínas RNA Binding

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