PAR-Clip - um método para identificar em toda a Transcriptoma Sítios de Ligação de Proteínas RNA Binding
2 de julho de 2010
Transcrições RNA estão sujeitos à regulamentação posttranscriptional extensa que é mediada por uma multidão de proteínas RNA-binding trans-acting (RBPs). Aqui apresentamos um método generalizado para identificar com precisão e em escala transcriptoma-wide os sites ligação do RNA RBPs.
O objetivo geral deste procedimento é determinar os amplos locais de ligação do transcriptoma de proteínas de ligação ao RNA ou RVPs. Isso é feito primeiro usando análogos de nucleosídeos fotorreativos para rotulagem in vivo de transcritos nascentes. A segunda etapa do procedimento é reticular o RNA e as proteínas de ligação ao RNA por luz UV de 365 nanômetros.
A terceira etapa do procedimento é imunoprecipitar a proteína de ligação ao RNA investigada e recuperar a ligação cruzada com o RNA. A etapa final do procedimento é converter o RNA em uma biblioteca de CD NA e sequência profunda. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram os amplos sítios de ligação do transcriptoma dos RVPs e permitem a definição do elemento de reconhecimento de RNA e suas preferências de ligação.
Olá, meu nome é Marcus Hoffner, do laboratório de Tom SEL na Universidade Rockefeller em Nova York. Hoje mostraremos um método chamado par lip ou análogo fotologizável do nucleosídeo da costela reticulação aprimorada e imunoprecipitação. Usamos este procedimento em nosso laboratório para identificar em um transcriptoma por sua escala locais de ligação de proteínas de ligação a RNA e seus motivos e preferências de ligação.
Ok, então vamos começar. A reticulação UV in vivo começa em uma capela de fluxo laminar. Neste protocolo, usaremos IGF marcado com duas células BP uma como um modelo exemplar usando técnica estéril.
Expanda HEK 2 93 células expressando de forma estável bandeira HA marcada com IGF dois BP um sob controle de um repressor Tet em meio de cultura de células HEK 2 93 use entre 100 e 400 vezes 10 para as sextas células e cresça-as para aproximadamente 80% de fluência co. Às 14 horas antes da reticulação, as células tinham o análogo de ribosídeo fotorreativo para tiouridina ou para SU diretamente no meio de cultura celular. Alternativamente, seis th guine ou seis SG podem ser usados após a adição do ribosídeo fotorreativo induzir a expressão da bandeira HA marcada com IGF dois BP um pela adição de células de doxiciclina são então incubados durante a noite na incubadora de células.
Em seguida, transvase o meio de crescimento. Em seguida, lave as células uma vez com 10 mililitros de solução salina tamponada com fosfato gelado por placa. Em seguida, remova o PBS completamente por decantação.
Coloque as placas descobertas em uma bandeja com gelo e irradie-as com luz UV de 365 nanômetros em um reticulador de 2.400 UV ou equivalente subsequente à radiação UV, raspe as células com um policial de borracha em um mililitro de PBS por placa. Transferir as células para tubos de centrifugação de 50 mililitros e centrifugar a 500 G durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Descarte o super nome e guarde o pellet da célula.
Neste ponto, os pellets celulares podem ser congelados rapidamente em nitrogênio líquido e armazenados a menos 80 por pelo menos 12 meses. Para continuar com o procedimento, suspender o pellet em três volumes de um tampão de lise X NP 40 e incubar em gelo por 10 minutos. Limpar o lisado celular por centrifugação a 13 000 g durante 15 minutos a quatro graus Celsius.
Após a centrifugação, limpe ainda mais o lisado filtrando-o através de um filtro de seringa de membrana de cinco mícrons. Finalmente, adicione RNAs T um a uma concentração final de uma unidade por microlitro e incube em banho-maria a 22 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, resfrie a reação no gelo por cinco minutos.
Seguindo a reticulação UV in vivo. Prepare as esferas magnéticas para imunoprecipitação. Transfira 10 microlitros de partículas magnéticas de proteína G de esferas dyna por mil de lisado celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Em seguida, coloque o tubo contendo as contas em um suporte magnético por um a dois minutos. Remova o sobrenadante e adicione um mililitro de tampão fosfato de citrato ao tubo enquanto estiver no separador magnético. Em seguida, tampe o tubo e vortex a amostra para ressuspender as contas.
Centrifugue brevemente para coletar quaisquer contas restantes na tampa do tubo. Repita esta lavagem com mais um mililitro de tampão fosfato de citrato. Após a lavagem resus, suspenda as esferas e o tampão fosfato de citrato a um volume duas vezes maior do que o volume original da suspensão de beterraba.
Em seguida, adicione 0,25 miligramas de Anti-Flag M, dois anticorpos monoclonais por um mililitro de suspensão batida. Incube a suspensão em uma roda giratória por 40 minutos em temperatura ambiente após a incubação, lave os grânulos duas vezes em um mililitro de tampão fosfato de citrato conforme descrito anteriormente, esta lavagem serve para remover qualquer anticorpo não ligado após a lavagem Resus, suspenda os grânulos e tampão de fosfato de citrato como antes de quatro. Para iniciar a imunoprecipitação, adicione as esferas magnéticas conjugadas com anticorpos recém-preparados ao lisado de células tratadas com RNAs T one.
Transfira a mistura para tubos de centrifugação de 15 mililitros e gire por uma hora a quatro graus Celsius. Após a incubação, colete os grânulos magnéticos, descarte os grânulos de ressuspensão sobrenadante em um mililitro de tampão de lavagem IP e transfira-os para tubos de centrífuga de 1,5 mililitro. Lave as contas conforme descrito anteriormente duas vezes em um mililitro de tampão de lavagem IP.
Após a lavagem final, ressus, suspenda os grânulos no volume original do grânulo do tampão de lavagem IP. Em seguida, adicione RNAT um a uma concentração final de 100 unidades por microlitro. Incube a suspensão do cordão em banho-maria a 22 graus Celsius por 15 minutos.
Em seguida, arrefecer a suspensão no gelo durante cinco minutos. Em seguida, lave as contas três vezes em um mililitro de tampão de lavagem com alto teor de sal. Em seguida, ressuspenda os grânulos em um volume original de tampão de desfosforilação.
Adicione a fosfatase alcalina intestinal de bezerro a uma concentração final de 0,5 unidades por microlitro e incube a suspensão por 10 minutos a 37 graus Celsius. Lave as esferas duas vezes em um mililitro de tampão de lavagem de fosfatase e depois mais duas vezes em polinucleotídeo quinase ou tampão PNK sem DTT. Por fim, ressuspenda os grânulos em um volume de grânulo original do buffer PNK.
Para iniciar a marcação de rádio do RNA reticulado. Adicione gama 32 PATP e T quatro PNK a um volume de cordão original da suspensão de cordão recém-preparada. Incube a suspensão por 30 minutos a 37 graus Celsius.
Em seguida, adicione um TP não radioativo à suspensão e incube-o por mais cinco minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, lave as esferas magnéticas cinco vezes com 800 microlitros de tampão PNK sem TDT. Por fim, ressuspenda as esferas em 70 microlitros de página SDS.
O tampão de carregamento incuba a suspensão do marcador de rádio por cinco minutos em um bloco de calor a 95 graus Celsius para desnaturar e liberar as proteínas de ligação ao RNA imunoprecipitadas com o RNA reticulado. Em seguida, remova os grânulos magnéticos do separador e transfira o super natin para um tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 mililitro Carregue 40 microlitros da casula por poço de um gel de poliacrilamida novox bis triss quatro a 12% pré-moldado e execute o gel por 55 minutos a 200 volts. Assim que o gel escorrer, desmonte a câmara de gel e desmonte as placas, deixando o gel montado em uma placa para facilitar o alinhamento do gel com a impressão em papel do gerador de imagens de fosfo.
Implante três pequenos pedaços de gel radioativo assimetricamente nos cantos do gel. Enrole o gel em um filme plástico, como filme plástico, para evitar contaminação. Exponha o gel a uma tela de fosfato em branco por uma hora e em um gerador de fosfo.
Em seguida, alinhe o gel na parte superior da impressão do gerador de imagens de fosfato usando as peças de gel implantadas para orientação. Corte as bandas que correspondem ao tamanho esperado da proteína de ligação ao RNA ou RBP. Transfira as bandas para um tubo MIDI dialisador dtu e adicione 800 microlitros de um eletroeluidor de buffer XSDS.
O complexo R-N-A-R-B-P reticulado a 100 volts por duas horas de acordo com as instruções do fabricante. Após a eletroeluição. Adicione tampão de proteinase K e proteinase K incube a solução por 30 minutos a 55 graus Celsius.
Recuperar o RNA por extração ácida de fenol clorofórmio isoamílico álcool, seguida de extração de clorofórmio. Em seguida, adicione um microlitro de glicogênio e precipite o RNA adicionando três volumes de etanol. Por fim, dissolva o pellet resultante em 10,5 microlitros de água.
Uma vez recuperado o RNA, subaja-o a um protocolo padrão de preparação de biblioteca de CDNA e realize uma análise bioinformática cuidadosa das leituras de sequência. Resultados representativos para um clipe par realizado com HK 2 93 células expressando bandeira H ha marcado com IGF dois BP um são mostrados com os análogos de nucleosídeos fotorreativos quatro SU e seis SG A eficiência de reticulação do ribosídeo fotorreativo alternativo seis SG é geralmente menor do que para quatro su. A menor eficiência de reticulação pode resultar em um maior fundo de sequências derivadas de fragmentos de RNAs celulares abundantes e, portanto, mais células devem ser usadas inicialmente para o experimento.
Diferentes análogos de uridina fotorreativos de clipe par são comparados à reticulação ou clipe tradicional de 2 54 nanômetros, como visto aqui. A reticulação da proteína de RNA UV 2 de 54 nanômetros tem eficiência de reticulação limitada. A intensidade da banda radioativa de tamanho apropriado indica se o experimento do clipe par funcionou e se RNA suficiente foi isolado para realizar um pequeno protocolo de sequenciamento de RNA.
As frequências de mutações características nas leituras sequenciadas após a análise bioinformática são indicativas de sequências reticuladas com sucesso. Essas mutações são transições T duas C ao usar quatro transições SU e G duas A ao usar o sucesso. G. A característica definidora do park lip é a possibilidade de derivar a localização da ligação cruzada marcando uma mutação característica residente nas bibliotecas CD NA preparadas a partir dos RNAs recuperados.
Isso permite a fácil separação do sinal derivado de RNAs especificamente ligados, do ruído de sequências derivadas de fragmentos co-isolados de RNAs celulares abundantes. Então, mostramos hoje como isolar segmentos de RNA, especificamente reconhecidos por proteínas de ligação a RNA. Ao fazer este procedimento.
É importante trabalhar RNAs livres. Então foi isso. Obrigado por assistir e boa sorte com os experimentos.
Visão Geral
Este artigo apresenta um método para identificar os sítios de ligação de RNA em proteínas que ligam RNA (RBPs) em escala transcriptômica. O procedimento utiliza análogos de nucleosídeos fotorreativos e reticulação por UV para facilitar o estudo das interações entre RBPs e RNA.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Biologia Molecular
Antecedentes
- Os transcritos de RNA sofrem extensa regulação pós-transcricional.
- Proteínas que ligam RNA (RBPs) desempenham um papel crucial nessa regulação.
- A identificação dos sítios de ligação das RBPs é essencial para compreender a biologia do RNA.
- Os métodos atuais podem apresentar falta de precisão ou aplicabilidade em todo o transcriptoma.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método generalizável para identificar sítios de ligação de proteínas que ligam RNA.
- Aprimorar a compreensão dos elementos de reconhecimento de RNA e preferências de ligação.
- Fornecer um protocolo que possa ser aplicado a diversas proteínas que ligam RNA.
Métodos Utilizados
- Marcação in vivo de transcritos recém-sintetizados utilizando análogos de nucleosídeos fotoreativos.
- Reticulação de RNA e PBPs com luz UV.
- Imunoprecipitação de PBPs para recuperar RNA reticulado.
- Sequenciamento profundo de RNA para identificar sítios de ligação.
Resultados Principais
- Identificação bem-sucedida de sítios de ligação em todo o transcriptoma para PBARs.
- Definição de elementos de reconhecimento de RNA e suas preferências de ligação.
- Demonstração da aplicabilidade do método a diversos tipos celulares.
Conclusões
- O método desenvolvido fornece uma abordagem robusta para o estudo das interações de RBP.
- Ele aprimora a compreensão dos mecanismos de regulação pós-transcricional.
- Essa técnica pode ser utilizada em diversos contextos de pesquisa para explorar a biologia do RNA.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A identificação de interações RNA-proteína em todo o transcriptoma permite a desmistificação mecanicista de alvos de proteínas que ligam RNA na fase inicial de descoberta. O PAR-CliP fornece discriminação de sinal baseada em mutações para melhorar a confiança no alvo e reduzir falsos positivos nos fluxos de trabalho de validação de RBP. Isso sustenta a confiança preditiva na identificação de compostos líderes, esclarecendo elementos de reconhecimento de RNA e preferências de ligação em sistemas relevantes para doenças.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da identificação de locais diretos de ligação ao RNA de PBPs envolvidas na regulação pós-transcricional.
- Valor operacional: Utiliza análogos de nucleosídeos fotoreativos (4-SU, 6-SG) e reticulação com UV a 365 nm para capturar interações transitórias e estáveis em células vivas.
- Valor científico: Define elementos de reconhecimento de RNA e preferências de ligação por meio de mutações T→C ou G→A em sequências de cDNA, separando sinal verdadeiro de ruído de fundo.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera bibliotecas quantitativas de cDNA marcadas por mutação para sequenciamento profundo, permitindo a detecção reprodutível de fragmentos de RNA ligados a proteínas reguladoras de RNA (RBP).
- Valor Operacional: Produz insumos padronizados e escaláveis para análise bioinformática, apoiando a preparação do ensaio para triagem de interação com alvos.
- Valor Científico: Caracteriza preferências de ligação e enriquecimento de motivos, orientando o design de moléculas pequenas ou oligonucleotídeos direcionados ao RNA.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Relaciona sítios de ligação de PBPs com resultados funcionais em sistemas relevantes para doenças, apoiando o alinhamento translacional de biomarcadores.
- Valor Operacional: Funciona em diferentes tipos celulares (por exemplo, HEK293) e pode ser adaptado a células primárias ou modelos celulares de doenças que expressem PBPs marcadas.
- Valor Científico: Permite decisões de avanço ajustadas ao risco, esclarecendo os papéis mecanicistas das PBPs na estabilidade do RNA, no splicing ou na tradução.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
PAR-CliP insere-se no continuum de descoberta, desde a validação de alvos até a identificação de compostos iniciais e estudos mecanicistas pré-clínicos, fornecendo resolução dos sítios de ligação que orientam estratégias de modulação downstream.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao identificar alvos diretos de RNA em proteínas ligadoras de RNA que regulam transcritos relevantes para doenças.
- Triagem: Fornece saídas quantitativas prontas para sequenciamento, permitindo a comparação de ligação entre diferentes condições, mutantes ou perturbações terapêuticas.
- Análise: Baseia-se na pontuação bioinformática de mutações características (T→C, G→A) para distinguir o RNA reticulado do fundo, possibilitando a identificação precisa de picos.
- Pesquisa Translacional: Conecta dados moleculares de ligação à continuidade funcional ao associar locais de proteínas ligadoras de RNA ao destino do RNA em modelos pré-clínicos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para o perfilamento de diversas proteínas ligadoras de RNA (por exemplo, IGF2BP1) em diferentes projetos, reduzindo o desenvolvimento metodológico redundante.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos, redução da ambiguidade mecanicista no mapeamento de regulons de RNA.
- Valor Operacional: Padronização por meio de condições definidas de reticulação, filtragem baseada em mutações e preparação reprodutível de bibliotecas.
- Valor Estratégico: Tomada de decisões mais eficaz sobre prosseguir ou não, esclarecendo a força e especificidade das interações RBP-RNA, reduzindo riscos biológicos em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco de terapêuticas direcionadas ao RNA com base em sítios de ligação validados e preferências de motivos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em clonagem molecular, cultivo celular e protocolos de reticulação por UV.
- Exige acesso a reticulador UV de 365 nm, reagentes para imunoprecipitação e infraestrutura de sequenciamento profundo.
- Exige padronização entre equipes quanto à dosagem do análogo, tempo de reticulação e rigorosidade das lavagens.
- Requer adaptação ao mudar de modelos de superexpressão com marcação para sistemas celulares endógenos ou primários.
- Limitação prática: o 6-SG apresenta eficiência de reticulação inferior ao 4-SU, exigindo maior quantidade de células para superar o fundo proveniente de RNAs celulares abundantes.
