Detecção de imunofluorescência de dois análogos da timidina (CldU e UDI), em tecido primário
7 de dezembro de 2010
Temos uma estratégia de derivados para detectar incorporação seqüencial de análogos da timidina (CldU e UDI) em tecidos de camundongos adultos para quantificar duas rodadas sucessivas de divisão celular. Esta estratégia é útil para detectar renovação celular de longa duração tecidos, transformação oncogênicos, ou de trânsito ampliando-células.
Olá e bem-vindo ao protocolo de coloração Calor D-U-I-D-U. Hoje, nosso vídeo começará com a etapa três: reidratação, permeabilização e recuperação de antígeno. Comece carregando suas lâminas no porta-lâminas.
Uma vez que suas lâminas estejam carregadas, coloque-as em um banho de xilol por cinco minutos. Em seguida, realize um segundo banho de xilol, novamente por cinco minutos.
Continue a hidratar seus lâminas transferindo-os para solução de etanol, começando com solução a 100% e terminando em 50%. Em seguida, complete a hidratação dos lâminas colocando-os por cinco minutos em uma solução de XPBS para permeabilizar as membranas celulares. Mergulhe seus lâminas em solução de Triton X 0,2% por cinco minutos. Prepare seus lâminas para a recuperação de antígenos teciduais por micro-ondas colocando-os em um recipiente de vidro com volume suficiente de tampão de citrato de sódio 0,01 molar, de modo que a solução cubra cinco centímetros acima do topo dos lâminas.
Para compensar a perda por evaporação, aqueça os lâminas no micro-ondas até que a solução entre em ebulição. Isso deve levar de três a dez minutos na potência máxima. Verifique se os lâminas estão em ebulição.
Reduza a potência do micro-ondas entre 10 e 80% e continue fervendo lentamente as lâminas por mais 20 minutos. Após a fervura, coloque o béquer contendo as lâminas sobre a bancada para que esfriem lentamente por aproximadamente duas horas, até atingirem a temperatura ambiente. Confirme que as lâminas estão à temperatura ambiente.
Mergulhe as lâminas em ácido clorídrico natural 1,5 por 40 minutos à temperatura ambiente. Retire as lâminas do ácido clorídrico e coloque-as por cinco minutos em uma lavagem com XPBS. Em seguida, realize uma segunda lavagem com XPBS.
Retire seus lâminas da solução de PBS 1x usando uma caneta de cera bloqueadora de líquidos. Contorne cada seção de tecido e recoloque o lâmina de volta no PBS. Prepare uma câmara de incubação úmida colocando uma toalha de papel umedecida no fundo de um recipiente hermético.
Prepare uma solução bloqueadora contendo 10% de soro de bloqueio diluído em XPBS. É importante cobrir completamente cada seção de tecido com a solução, especialmente para sessões de tecido típicas de cerca de um por 1,5 centímetros. Um volume de 50 microlitros de solução bloqueadora é suficiente.
Prepare o anticorpo primário IDU diluindo o antissoro anti-BRDU de camundongo em soro de jumento a 5%. Adicione uma concentração de um para 250. Pipete a solução primária sobre cada seção dos lâminas.
Coloque suas lâminas em um refrigerador a quatro graus Celsius. Para uma incubação durante a noite, prepare uma lavagem de alta rigorosidade. O TBST funciona bem.
Oriente os lâminas de costas com costas. Coloque os lâminas em cerca de 35 a 40 mililitros de Solução TBST. Coloque os tubos em um incubador de cultura bacteriana com agitação a 37 graus Celsius.
Deixe-os agitar por 20 minutos a 2 25 RPM. Agora, coloque suas lâminas em um porta-lâminas. Coloque as lâminas em um XPBS para uma lavagem com PBS de cinco minutos.
Isso será feito por uma segunda lavagem com XPBS por cinco minutos. Prepare a solução primária de anticorpo CLDU diluindo o anticorpo rat anti-BRDU em soro de jumento a 5%. Adicione uma concentração de um para 250 nas lâminas sobre uma toalha de papel e, em seguida, delimite com uma caneta de cera.
Utilize uma pipeta para cobrir cada seção tecidual com a solução primária de CLDU. Use cerca de 50 microlitros da solução para garantir que cada seção tecidual seja completamente coberta. Coloque suas lâminas em uma geladeira a quatro graus Celsius para uma incubação durante a noite.
Coloque suas lâminas em um porta-lâminas e, em seguida, coloque-as em uma lavagem com XPBS 1x por cinco minutos. Coloque suas lâminas em uma segunda lavagem com XPBS 1x por cinco minutos. Prepare os anticorpos secundários diluindo os anticorpos CY dois de jumento anti RAD e PS cinco de jumento anti muse em soro de jumento a 5%. DPI também será usado para coloração nuclear, cobrindo completamente as secções de tecido com os anticorpos secundários.
50 microlitros de solução devem ser suficientes para cobrir completamente seu tecido. Coloque a câmara de reidratação em local escuro à temperatura ambiente para uma incubação de uma hora. Coloque seus lâminas em um porta-lâminas e, em seguida, mergulhe-os em uma lavagem com XPBS 1x por cinco minutos.
Coloque seus lâminas em uma segunda lavagem com XPBS por cinco minutos. Remova o excesso de solução de XPBS em uma toalha de papel. Em seguida, pegue o meio de montagem prolongador dourado com ação antidesbotamento e coloque uma pequena gota sobre cada seção de tecido.
Retire um lamínula e coloque-o suavemente sobre as seções do seu lâmina. Use o papel toalha como uma prensa para remover quaisquer bolhas de ar em excesso que possam ter ficado presas entre as seções do lâmina e o lamínula. Por fim, use a ponteira de uma pipeta para remover quaisquer bolhas de ar residuais que ainda permaneçam. Imagem do seu tecido de interesse utilizando um microscópio fluorescente equipado com uma fonte de luz de alta energia e múltiplos canais fluorescentes para quantificar os resultados.
Inicie contando o número de células positivas para Dabi. Conte o número de células positivas para CLDU utilizando a imagem de dois canais SI. Conte o número de células positivas para IDU utilizando a imagem de cinco canais SCI.
Por fim, conte as células duplamente marcadas positivamente alternando entre o arquivo de imagem do canal SCI dois e o canal SCI cinco.
Visão Geral
Este artigo apresenta um método para detectar a incorporação sequencial de análogos da timidina (CldU e IdU) em tecidos de camundongos adultos, permitindo a quantificação de duas rodadas sucessivas de divisão celular. Esta técnica é valiosa para o estudo da renovação celular em tecidos de longa duração, transformação oncogênica e células amplificadoras de trânsito.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Biologia celular
- Neurociência
- Oncologia
Contexto
- Os análogos de timidina são utilizados para marcar células em divisão.
- Compreender a divisão celular é fundamental para estudar a regeneração tecidual.
- A renovação celular é importante tanto na fisiologia normal quanto em estados patológicos.
- A marcação sequencial pode fornecer informações sobre a dinâmica das populações celulares.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para quantificar a divisão celular em tecidos.
- Avaliar as implicações da renovação celular em diversos contextos biológicos.
- Aprimorar a compreensão dos processos oncogênicos por meio da análise da divisão celular.
Métodos Utilizados
- Incorporação sequencial de CldU e IdU em tecidos de camundongo.
- Microscopia fluorescente para visualização de células marcadas.
- Quantificação de células positivas para DAB, CldU e IdU.
- Uso de anticorpos específicos para detecção de análogos da timidina.
Resultados Principais
- Detecção bem-sucedida de divisões celulares sequenciais em amostras de tecido.
- Análise quantitativa das taxas de renovação celular.
- Identificação de marcadores potenciais de transformação oncogênica.
- Compreensão do comportamento de células transitórias amplificadoras.
Conclusões
- O método desenvolvido fornece uma abordagem robusta para o estudo da divisão celular.
- Os achados contribuem para a compreensão da dinâmica tecidual na saúde e na doença.
- Essa técnica pode ser aplicada a diversas áreas de pesquisa, incluindo oncologia e medicina regenerativa.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A quantificação precisa da divisão celular sequencial permite a redução de riscos mecanicistas na validação de alvos ao esclarecer a dinâmica proliferativa em sistemas relevantes para doenças. Essa abordagem reforça a confiança preditiva em modelos pré-clínicos ao distinguir respostas proliferativas transitórias de respostas sustentadas, orientando a identificação de compostos promissores e a triagem de portfólios. A aplicabilidade do método a tecidos de longa duração potencializa a descoberta de biomarcadores translacionais em oncologia e medicina regenerativa.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Avalia hipóteses terapêuticas mediante a medição de duas rodadas sucessivas de divisão celular em tecido primário.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos por meio da visualização direta da cinética proliferativa em modelos de doenças.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos mecanicistas ao quantificar taxas de renovação celular que informam a confiança no alvo e a modulação de vias.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Prepara sistemas biológicos validados para avaliação de compostos em etapas subsequentes por meio de protocolos padronizados de imunomarcação.
- Saída Quantitativa: Gera contagens mensuráveis de células positivas para DAB, CldU e IdU como pontos finais reprodutíveis para triagem.
- Escalabilidade: Otimizado para administração de análogos de timidina em baixa dose pela água de bebida, permitindo estudos com administração crônica em modelos pré-clínicos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Aplicado para identificar a transformação oncogênica e avaliar as contribuições das células de amplificação transitória para o crescimento tecidual.
- Continuidade Translacional: Conecta a descoberta à validação pré-clínica ao fornecer dados quantitativos de proliferação em diferentes tipos de tecidos.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Orienta estratégias de avanço ao esclarecer se o crescimento observado decorre da atividade de células-tronco ou da expansão de células de amplificação transitória.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos líderes e a eficácia pré-clínica, fornecendo métricas de proliferação que apoiam decisões de avançar ou interromper em cada etapa.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante a quantificação da síntese sequencial de DNA em resposta a perturbações farmacológicas ou genéticas.
- Triagem: Fornece seções de tecido prontas para ensaios com detecção padronizada da incorporação de análogos de timidina para triagem de compostos.
- Análises: Permite a comparação de índices proliferativos entre diferentes condições por meio da separação de canais fluorescentes e quantificação de células duplo-positivas.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas iniciais à validação pré-clínica ao rastrear a dinâmica da linhagem celular em tecidos relevantes para doenças humanas.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para estudos longitudinais de proliferação em diversas áreas terapêuticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos ao fornecer evidência direta do histórico de divisão celular.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de protocolos padronizados de permeabilização, recuperação de antígenos e imunomarcação múltipla.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir a eliminação precoce de riscos associados a alvos com base na sua responsabilidade proliferativa.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao distinguir os efeitos terapêuticos sobre compartimentos de células-tronco versus progenitoras.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em imunohistoquímica e microscopia fluorescente para detecção multiplex.
- Depende do acesso a infraestrutura de recuperação de antígenos (micro-ondas, tampão citrato) e capacidade de incubação sequencial de anticorpos.
- Necessita padronização entre equipes nos protocolos de bloqueio, lavagem e montagem para minimizar efeitos de lote.
- A adaptação entre sistemas modelo requer validação da especificidade dos anticorpos e da permeabilidade tecidual em cada contexto.
- Limitações práticas incluem o mascaramento potencial de epítopos e a necessidade de otimização dos esquemas de administração de análogos para evitar toxicidade.
